Реакция связывания комплемента (РСК) основана на том, что специфический комплекс антиген - антитело всегда адсорбирует на себе (связывает) комплемент.
Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов и в серодиагностике инфекций особенно заболеваний* вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиямй и вирусами.
РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген - антитело. По существу, это две серологические реакции.
Первая система - о с н о в н а я состоит из антигена и антитела (один известный, другой нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплемент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.
Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т. е. готовый, иммунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой (при соответствии в ней антигена и антитела), то во второй системе гемолиза не будет - так как нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.
Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то иммунный комплекс не образуется и комплемент останется свободным! Оставшийся свободным, комплемент участвует во второй системе, вызывая гемолиз,- результат РСК отрицательный (содержимое пробирок прозрачно - «лаковая кровь»).
Компоненты реакции связывания комплемента:
Антиген - обычно лизат, экстракт, гаптен; реже взвесь.
1.Антитело-сыворотка больного система
2. Комплемент - сыворотка морских свинок
3.Антиген - эритроциты барана
4.Антитело - гемолизин к эритроцитам барана
5.Изотонический раствор
Ввиду того что в РСК участвует большое количество сложныхкомпонентов, они должны быть предварительно оттитрованы ивзяты в реакцию в точных количествах и в равных объемах: по 0,5или 0,25, реже по 0,2 мл. Соответственно весь опыт проводят вобъемах 2,5, 1,25 или 1,0 мл (большие объемы дают болееточный результат). Титрование компонентов реакции проводят втом же объеме, в каком ставят опыт, заменяя недостающиеингредиенты изотоническим раствором.
Подготовка ингредиентов
Гемолитическая сыворотка (гемолизин). Сыворотку разводят 3 раза меньше ее титра (см. с. 211). Готовят общее разведение сыворотки для всего опыта, объем которого определяют, умножив объем сыворотки в одной пробирке (например, 0,5 мл) на число пробирок, немного превышающее число их в опыте.
2.Эритроциты барана. Готовят 3% взвесь отмытых эритроцитов барана (см. с. 211) на все количество пробирок в опыте. Для приготовления гемолитической системы за 30 мин до внесения ее в опыт смешивают равные объемы разведенного гемолизина и взвеси эритроцитов, приливая сыворотку к эритроцитам, тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37˚С.
3.Комплемент обычно разводят 1:10. перед каждым опытом его обязательно титруют. Титр комплемента – это его наименьшее количество, при добавлении которого к гемолитической системе происходит полный гемолиз в течение 1ч при 37˚С. Схеме титрования комплемента представлена в таблице 21.
Внимание! Титруют комплимент в таком же объеме, в каком ставят основной опыт, заменяя изотоническим раствором недостающие ингредиенты.
Учет результатов. В контролях не должно быть даже следов гемолиза, так как в одном из них нет комплемента, в другом – гемолизина. Контроли свидетельствуют об отсутствии у компонентов реакции гемотоксичности (способности спонтанно лизировать эритроциты).
В приведенном в табл. 21 примере титр комплемента в разведении 1:10 равен 0,15 мл. В опыте активность комплемента может снизиться за счет неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции, поэтому для опыта количество комплимента увеличивают: берут следующую за титром дозу. Это – рабочая доза. В приведенном примере она равна 0,2 комплемента в разведении 1:10. Так как все компоненты, участвующие в РСК, должна быть взята в равных объемах (в нашем примере он равен 0:5 мл), необходимо к рабочей дозе комплемента (0,2 мл1:10) добавить 0,3 мл изотонического раствора. Для всего опыта объем каждого из них (комплемента и изотонического раствора.
Для всего опыта объем каждого из них (комплемента и изотонического раствора) умножают на число пробирок, участвующих в РСК. Например, для проведения опыта в 50 пробирках нужно взять 10 мл комплемента 1:10 (0,2 млх50) и 15 мл изотонического раствора (0,3 млх50).
4. Антиген обычно получают готовым с указанием его титра, т.е. того количества, которое после разведения антигена должно содержаться в 1 мл. например, при титре 0,4 его разводят в 0,96 мл изотонического раствора. В опыт беру количество антигена, равное половине титра (0,5 мл). Это его рабочая доза. Говорят общее разведение антигена для всего опыта, умножая 0,5 мл на число пробирок в опыте.
5. Антитело – сыворотка больного. Свежую сыворотку перед опытом инактивируют, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56˚С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ предпочтительнее: он исключает возможность перегрева сыворотки, т. е. ее денатурации. Денатурированные сыворотки не пригодны для опыта. Сыворотку больного обычно применяют в разведении от 1:10 до 1:160.
Таблица №14
| Ингредиенты, мл | пробирки | |||||||||||
| опыт | контроль | |||||||||||
| Гемолитической системы | эритроцитов | |||||||||||
| Изотонический раствор | 1,45 | 1,4 | 1,35 | 1,3 | 1,25 | 1,2 | 1,15 | 1,1 | 1,05 | 1,0 | 1,5 | 1,5 |
| Комплемент 1:10 | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,35 | 0,4 | 0,45 | 0,5 | ― | 0,5 |
| Гемолитическая система | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | ― |
| 3% взвесь эритроцитов барана | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | 0,5 |
| Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37˚С 1 ч | ||||||||||||
| результат | Нет гемолиза | Гемолиз | Нет гемолиза |
Иммунные сыворотки чаще всего готовят в производственных условиях и выпускают инактивированными. Их разводят 1:50 и выше.
Все компоненты готовят с небольшим избытком.
| Ингредиенты, мл | Пробирки | |||||||
| Опыт контроль | ||||||||
| сыворотки | антигена | Гемолитической системы | Комплемент в рабочей дозе | |||||
| ½ | ||||||||
| Фаза 1 Изотонический раствор | ― | 0,5 | 0,5 | 1,5 | 1,25 | 1,0 | 0,5 | |
| Испытуемая сыворотка в разведении 1:10 | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ― | |
| Антиген а рабочей дозе | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ||
| Комплемент 1:10 в рабочей дозе | 0,5 | 0,5 | 0,5 | ― | 0,25 | 0,5 | 1,0 | |
| Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37˚С 45 мин 1ч или 4˚С 18 ч | ||||||||
| Фаза 2 гемолитическая система | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | |
| Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37˚С до полного гемолиза во 2, 3, 6 и 7 пробирках | ||||||||
| Результат | Положит. или отрицательный | ― | ― | ++++ | (+) | ― | ― | |
Таблица №15
Проведение основного опыта
При постановке опыта крайне; важна последовательность добавления компонентов. Опыт проводят в две фазы.
Фаза I. В пробирки наливают требуемое количество изотонического раствора натрия хлорида, затем - требуемый объем разведенной сыворотки и в таком же объеме рабочие дозы антигена и комплемента. Опыт обязательно сопровождают контролем всех участвующих в нем ингредиентов: сыворотки, антигена, гемолитической системы и комплемента.
Пробирки тщательно встряхивают и инкубируют при 37°С 45 мин- 1 ч или при 4 °С («РСК на холоде») 18 ч. За это время при наличии специфического комплекса происходит связывание комплемента. Проведение реакции «на холоде» значительно повышает ее чувствительность и специфичность.
Фаза II. По окончании инкубации во все пробирки добавляют по 1 мл гемолитической системы, которую предварительно выдерживают в термостате 30 мин (сенсибилизируют). Пробирки встряхивают и снова ставят в термостат.
Учет результат о в. Пробирки оставляют в термостате до полного гемолиза в 2, 3, 6 и 7-й пробирках (контроль сыворотки, антигена и комплемента на одну и две дозы). Раньше всего гемолиз наступит в 7-й пробирке, в которой находится двойное количество комплемента. После того как в этой пробирке произойдет гемолиз и содержимое ее станет совершенно прозрачным, нужно особенно внимательно следить за остальными контролями. Как только жидкость в 2, 3 и 6-й пробирках станет прозрачной, -следует немедленно вынуть штатив с пробирками из термостата. О том, что опыт не задержали в термостате дольше, чем нужно, говорит наличие легкой мути (неполного гемолиза) в 5-й пробирке - в ней находится только половина рабочей дозы комплемента и полного гемолиза при правильной постановке опыта быть не может.
Гемолиз в контроле сыворотки и антигена (пробирки 2 и 3) указывает на то, что дозы их были выбраны правильно и что сами по себе ни сыворотка, ни антиген комплемент не связывают.
В контроле гемолитической системы (пробирка 4) при ее правильной работе не должно быть даже следов гемолиза - в ней отсутствует комплемент.
Убедившись в том, что контроли прошли правильно, можно учитывать опыт. Отсутствие гемолиза в пробирках опыта расценивают как положительный результат реакции. Он свидетельствует о том, что в сыворотке есть антитела, специфичные в отношении взятого антигена. Образованный ими комплекс связал комплемент и воспрепятствовал его участию в реакции гемолиза. Если в опытных пробирках наступит гемолиз, результат реакции оценивают как отрицательный. В данном случае нет соответствия между антигеном и антителом, комплемент не связан и участвует в реакции гемолиза.
Параллельно с сывороткой больного ставят такой же опыт с заведомо положительной сывороткой (т. е. с сывороткой, в которой есть антитела к данному антигену) и заведомо отрицательной, в которой нет специфических антител. При правильной постановке опыта в первом случае должна быть задержка гемолиза, а во втором случае, будет гемолиз.
Интенсивность реакции выражают следующим образом:
Полная задержка гемолиза. Эритроциты образуют равномерную муть или оседают на дно. В этом случае жидкость в пробирке становится бесцветной;
Лизировано примерно 25% эритроцитов. Осадок меньше, жидкость над ним слегка розовая. Результат РСК также оценивают как резко положительный;
Лизировано примерно 50% эритроцитов. Осадок небольшой, жидкость розовая. Положительный результат РСК;
Лизировано примерно 75% эритроцитов. Незначительный осадок, над ним интенсивно окрашенная жидкость. Сомнительный результат РСК;
Лизированы все эритроциты. Жидкость интенсивно окрашена и совершенно прозрачна. Отрицательный результат РСК.
Эту реакцию применяют для обнаружения антител в сыворотке крови больных при бактериальных, вирусных, протозойных инфекциях, а также для определения и типирования вирусов, выделенных у больных.
РСК относится к сложным серологическим реакциям, в которых, кроме антигена, антитела и комплемента, участвует еще и гемолитическая система, выявляющая результаты реакции. РСК протекает в две фазы: первая — взаимодействие антигена с антителом при участии комплемента и вторая — выявление степени связывания комплемента при помощи гемолитической системы. Эта система состоит из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, полученной путем иммунизации лабораторных животных, эритроцитами. Эритроциты обрабатывают — сенсибилизируют, присоединяя к ним сыворотку при температуре 37°С, в течение 30 мин. Лизис сенсибилизированных эритроцитов барана наступает только в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. В отсутствие его эритроциты не изменяются. Результаты РСК зависят от наличия в исследуемой сыворотке антител. Если сыворотка содержит антитела, гомологичные антигену, используемому в реакции, то образующийся комплекс антиген — антитело присоединяет, связывает комплемент. При добавлении гемолитической системы в этом случае гемолиза не произойдет, так как весь комплемент расходуется на специфическую связь комплекса антиген — антитело.
Эритроциты остаются не измененными, поэтому отсутствие гемолиза в пробирке регистрируют как положительную РСК. При отсутствии в сыворотке антител, соответствующих антигену, специфический комплекс антиген — антитело не образуется и комплемент остается свободным. При добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней и вызывает гемодиз эритроцитов. Разрушение эритроцитов, их гемолиз характеризует отрицательную реакцию.
Для постановки РСК необходимы: сыворотка больного, комплемент, гемолитическая система, состоящая из эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, а также изотонический раствор хлорида натрия.
Реакцию ставят в серологических пробирках. Эритроциты барана получают из дефибринированной крови барана путем троекратного отмывания их изотоническим раствором хлорида натрия. Гемолитическую сыворотку выпускают в готовом виде в ампулах, на этикетке которых указан ее титр, т. е. максимальное разведение сыворотки, которое еще вызывает гемолиз при добавлении к эритроцитам в присутствии комплемента. Гемолитическую сыворотку получают путем иммунизации животных, например кролика эритроцитами барана. При постановке реакции сыворотку используют в тройном титре. Например, титр гемолитической сыворотки 1: 1200, а рабочее разведение 1: 400. В качестве комплемента используют свежую сыворотку крови морской свинки (в течение 24—48 ч) или сухой комплемент в ампулах.
Предварительно перед постановкой РСК комплемент разводят 1: 10 и титруют для установления титра — наименьшего количества комплемента, которое дает гемолиз эритроцитов при соединении с гемолитической системой, используемой в данной реакции. Учитывая возможные антикомплементарные свойства антигена, при постановке реакции к установленному рабочему титру комплемента делают 20—30% надбавку.
Антигеном для РСК являются взвеси убитых бактерий, экстракты, приготовленные из этих взвесей, отдельные химические фракции микробов. Основное требование к антигену — отсутствие угнетения активности комплемента. Он не должен обладать антикомплементарными свойствами. Для выявления этих свойств антигена комплемент дополнительно титруют в присутствии используемого в реакции антигена. Существуют определенные схемы постановки РСК. Результаты реакции учитывают по наличию или отсутствию гемолиза эритроцитов в гемолитической системе. РСК применяют при диагностике сифилиса (реакция Вассермана), гонореи (реакция Борде—Жангу), токсоплазмоза, риккетсиозных и вирусных заболеваний.
Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген-антитело. Если же комплекс антиген-антитело не образуется, то комплемент остается свободным.
Специфическое взаимодействие АГ и AT сопровождается адсорбцией (связыванием) комплемента. Поскольку процесс связывания комплемента не проявляется визуально, Ж. Борде и О. Жангу предложили использовать в качестве индикатора гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолитическая сыворотка), которая показывает, фиксирован ли комплемент комплексом АГ-АТ. Если АГ и ATсоответствуют друг другу, т. е. образовался иммунный комплекс, то комплемент связывается этим комплексом и гемолиза не происходит. Если AT не соответствует АГ, то комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой и вызывает гемолиз.
Протекание реакции
Реакция протекает в две фазы с участием двух систем; бактериальной и гемолитической. В первой реакции (специфическая) участвуют антиген 4-+ антитело + комплемент. Положительный результат реакции, наступающий при соответствии антител антигену, характеризуется образованием специфического бактериального комплекса антиген - антитело с адсорбированным, или, как говорят, «связанным», комплементом. Оставаясь невидимым, комплекс не вызывает никаких внешних изменений той среды, в которой он образовался. Отрицательный результат РСК имеет место при отсутствии специфического сродства между антигеном и антителом сыворотки и характеризуется сохранением свободного активного комплемента. Первая фаза РСК может проводиться в термостате при 37°С (1-2 ч) или в холодильнике при 3-4°С (18-20 ч). При длительном образовании иммунного комплекса антиген-антитело на холоду происходит более полное связывание комплемента и вследствие этого чувствительность реакции увеличивается. При постановке сравнительных опытов советским иммунологом акад. В. И. Иоффе и его учениками было показано, что в условиях длительного связывания комплемента на холоду можно уловить в 100-500 раз меньшие количества антигена и получить положительные результаты при больших разведениях иммунной сыворотки, чем в опыте связывания комплемента при температуре 37 °С в течение 1-2 ч. Вторая фаза реакции (индикаторная) происходит между реагентами гемолитической системы (смесь 3% взвеси эритроцитов и гемолитической сыворотки в равных объемах) при температуре 37 °С только при наличии комплемента, оставшегося свободным от первой фазы реакции (реакция отрицательная). При отсутствии свободного активного комплемента гемолиза эритроцитов под действием специфических гемолизинов не наступает (реакция положительная).
Компоненты
Реакция связывания комплемента (РСК) относится к сложным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система).
Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вирусосодержащие материалы.
В качестве комплемента используют свежую или сухую сыворотку морской свинки.
Механизм реакции
РСК проводят в две фазы: 1-я фаза - инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген-антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит - антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная.
Применение
Реакцию связывания комплемента можно применять для:
1) выявления специфических антител в неизвестной сыворотке на основании
взаимодействия их с антигеном известной природы;
2) изучения свойств антигена в реакции с известной специфической сывороткой.
Подготовка ингредиентов для постановки РСК.
1. Сыворотку крови, полученную для исследования, накануне постановки реакции прогревают в водяной бане при 56°С в течение 30 мин для инактивации ее собственного комплемента. Инактивированная сыворотка может храниться при температуре 3-4°С в течение 5-6 дней. В день постановки-опыта сыворотку разводят изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 1:5 (0,1 мл исследуемой сыворотки,+ 0,4 мл изотонического раствора хлорида натрия).
2. Антигеном для постановки РСК могут быть культуры разнообразных микробов, бактериальные белки и экстракты, полученные из микробных культур, патологически измененных и нормальных органов и тканей. Особенности приготовления антигена определяются характером инфекционного процесса и особенностями его возбудителя.
3. Комплементом является смесь сывороток, полученная от 3-5 здоровых морских свинок, или сухой комплемент в ампулах.
Непосредственно перед употреблением сыворотку морской свинки разводят изотоническим раствором хлорида «атрия в отношении 1: 10, получая основной раствор.
4. Гемолитическую сыворотку перед постанов кой опыта инактивируют прогреванием при температуре 56 °С в течение 30 мин. Для постановки основного опыта РСК, а также для титрования комплемента и антигена применяют гемолитическую сыворотку в тройном титре. Например, если титр гемолитической сыворотки 1: 1800, в реакции применя ют разведение сыворотки 1: 600.
5. Эритроциты получают из дефибринированной кро ви барана. Кровь для удаления пленок фибрина фильтруют через трехслойный марлевый фильтр. Полученный фильтрат центрифугируют, сыворотку отсасывают и сливают, а эритро циты промывают 3-4-кратным центрифугированием с изото - «ическим раствором хлорида натрия. При последнем промы вании эритроцитов надосадочный слой жидкости должен быть совершенно прозрачным. Из отмытых эритроцитов готовят 3% взвесь в изотоническом растворе хлорида натрия. Подготовив указанным выше способом ингредиенты, участвующие в РСК, приступают к титрованию гемолитической сыворотки, комплемента и антигена.
Учебник состоит из семи частей. Часть первая – «Общая микробиология» – содержит сведения о морфологии и физиологии бактерий. Часть вторая посвящена генетике бактерий. В части третьей – «Микрофлора биосферы» – рассматривается микрофлора окружающей среды, ее роль в круговороте веществ в природе, а также микрофлора человека и ее значение. Часть четвертая – «Учение об инфекции» – посвящена патогенным свойствам микроорганизмов, их роли в инфекционном процессе, а также содержит сведения об антибиотиках и механизмах их действия. Часть пятая – «Учение об иммунитете» – содержит современные представления об иммунитете. В шестой части – «Вирусы и вызываемые ими заболевания» – представлены сведения об основных биологических свойствах вирусов и о тех заболеваниях, которые они вызывают. Часть седьмая – «Частная медицинская микробиология» – содержит сведения о морфологии, физиологии, патогенных свойствах возбудителей многих инфекционных заболеваний, а также о современных методах их диагностики, специфической профилактики и терапии.
Учебник предназначен для студентов, аспирантов и преподавателей высших медицинских учебных заведений, университетов, микробиологов всех специальностей и практических врачей.
5-е издание, исправленное и дополненное
Книга:
| <<< Назад
|
Вперед >>>
|
Реакция связывания комплемента
Уникальная способность комплемента специфически связываться с различными по своей природе комплексами антиген + антитело нашла широкое применение в реакции связывания комплемента (РСК). Особое преимущество РСК состоит в том, что природа антигена, участвующего в ней (корпускулярный или растворимый), не имеет значения, так как комплемент связывается с Fc-фрагментом любого антитела, относящегося к IgG и IgM, независимо от его антительной специфичности. Кроме того, РСК очень чувствительна: она позволяет обнаружить количество антител в 10 раз меньшее, чем, например, в реакции преципитации. РСК была предложена в 1901 г. Ж. Борде и О. Жангу. В ее основе лежат два свойства комплемента:
1) способность связываться с комплексом антиген + антитело;
2) лизирование эритроцитов, использованных для получения гемолитической сыворотки.
РСК ставят в два этапа, и в ней соответственно участвуют две системы – опытная, или диагностическая, и индикаторная. Диагностическая система состоит из исследуемой (или диагностической) сыворотки, которую перед постановкой реакции прогревают при 56 °C в течение 30 мин для инактивации имеющегося в ней комплемента, и антигена. К этой системе добавляют стандартный комплемент. Его источником служит свежая или высушенная сыворотка морской свинки. Смесь инкубируют при 37 °C в течение одного часа. Если в исследуемой сыворотке имеются антитела, произойдет их взаимодействие с добавленным антигеном, и образующиеся комплексы антиген + антитело свяжут добавленный комплемент. Если же в сыворотке антитела отсутствуют, образования комплекса антиген + антитело не произойдет, и комплемент останется свободным. Никаких видимых проявлений связывания комплемента на этой стадии реакции обычно нет. Поэтому для выяснения вопроса, произошло или нет связывание комплемента, добавляют вторую, индикаторную систему (инактивированная гемолитическая сыворотка + эритроциты барана), и смесь всех компонентов РСК вновь инкубируют при 37 °C в течение 30 – 60 мин, после чего оценивают результаты реакции. В случае, если комплемент связался на первой стадии, в диагностической системе, т. е. в сыворотке больного имеются антитела, и произошло связывание комплемента комплексом антитело + + антиген, лизиса эритроцитов не будет – РСК положительна: жидкость бесцветна, на дне пробирки осадок эритроцитов. Если же в сыворотке специфические антитела отсутствуют и связывания комплемента в диагностической системе не произойдет, т. е. РСК отрицательна, то неизрасходованный в диагностической системе комплемент связывается с комплексом эритроциты + антитела индикаторной системы и произойдет гемолиз: в пробирке «лаковая кровь», осадка эритроцитов нет. Интенсивность РСК оценивают по четырехкрестной системе в зависимости от степени задержки гемолиза и наличия осадка эритроцитов. Реакция сопровождается соответствующими контролями: контроль сыворотки (без антигена) и контроль антигена (без сыворотки), так как некоторые сыворотки и некоторые антигены обладают антикомплементарным действием. Перед постановкой РСК все компоненты, участвующие в ней, за исключением исследуемой сыворотки или антигена, подвергаются тщательному титрованию. Особенно важно ввести в реакцию точную дозу комплемента, так как его нехватка или избыток могут привести к ложным результатам. Титром комплемента является то его минимальное количество, которое в присутствии рабочей дозы гемолитической сыворотки обеспечивает полное растворение эритроцитов. Для постановки основного опыта берут дозу комплемента, увеличенную на 20 – 25 % по сравнению с установленным титром. Титром гемолитической сыворотки является то ее максимальное разведение, которое, будучи смешано с равным объемом 10 % раствора комплемента, полностью гемолизирует соответствующую дозу эритроцитов в течение 1 ч при температуре 37 °C. В основной опыт берут сыворотку, разведенную до 1 / 3 своего титра.
Реакция связывания комплемента является одной из традиционных серологических реакций, применяемых для диагностики многих вирусных заболеваний, а также составляет основу некоторых других методов выявления противовирусных антител. Хотя реакция нейтрализации, торможения гемагглютинации, непрямой гемагглютинации, иммуноферментный анализ превосходят реакцию связывания комплемента по чувствительности, однако простота методики, раннее обнаружение антител, а также выявление вирусных антигенов, не обладающих гемагглютинирующими свойствами, объясняют ее широкое применение в вирусологических исследованиях.
Для ее постановки не требуется такая высокая степень концентрации и чистоты антигенных препаратов, которые необходимы для ряда других иммунологических реакций. Кроме того, групповая специфичность комплементсвязывающих антигенов многих вирусов позволяет использовать реакцию связывания комплемента при массовой диагностике: эта реакция не выявляет штаммовых различий, приобретает особую ценность при изучении антигенных взаимосвязей между вирусами.
Само название в значительной мере отражает суть метода, состоящего из двух отдельных реакций. На первом этапе в реакции участвуют антигены и антитела (один из этих компонентов заранее известен), а также комплемент в оттитрованном количестве. При соответствии антигена и антител их комплекс связывает комплемент, что выявляется на втором этапе с помощью индикаторной системы (смесь бараньих эритроцитов и антисыворотки к ним). Если комплемент связался при взаимодействии антигена и антител, то лизис бараньих эритроцитов не происходит (положительная реакция связывания комплемента). При отрицательной реакция связывания комплемента несвязанный комплемент способствует гемолизу, по которому судят о результатах реакции.
Основными компонентами реакции связывания комплемента служат антигены (известные или выявляемые), антитела (известные антисыворотки или исследуемые сыворотки), комплемент, гемолитическая сыворотка и эритроциты барана; в качестве разбавителя используют изотонический раствор натрия хлорида (pH 7,2-7,4) или различные буферные растворы. Антигены и сыворотки могут обладать антикомплементарностью, т.е. способностью адсорбировать комплемент, что задерживает гемолиз и искажает результат реакции.
Антигены для РСК готовят из органов зараженных животных, аллантоисной или амниотической жидкости зараженных куриных эмбрионов, а также культуральной жидкости после культивирования вирусов в тканевых культурах клеток. В антигенных препаратах всегда содержится много балластных веществ из клеток животных или культур ткани, что может также исказить результаты реакции.
Полученные вирусные антигены инактивируют, определяют рабочую дозу, а также антикомплементарные и гемолитические свойства. После этого антиген титруют в присутствии комплемента.
Вторым основным компонентом при постановке реакции является комплемент. Этим термином обозначают сложную систему белков и факторов, присутствующих в крови животных и человека. Обычно в реакции связывания комплемента применяют сыворотку крови морских свинок. Активность (титр) комплемента - это его наименьшее количество, в присутствии которого гемолизин вызывает полный гемолиз используемой гемолитической системы.
Для выявления комплемент-связывающих антител к вирусам проводят обязательную инактивацию сыворотки для устранения комплемента при 560С в течение 30 мин. В качестве референс-сывороток обычно используют сыворотки иммунизированных животных. Причем для иммунизации применяют вирусные антигены, тщательно очищенные от тканевых примесей, так как к противном случае возникает выраженная неспецифическая реакция.
Обязательным компонентом реакции связывания комплемента является гемолитическая система, в которую входят эритроциты барана и гемолитическая сыворотка, полученная гипериммунизацией кроликов эритроцитами барана.
Для постановки реакции связывания комплемента используют следующие модификации: микрометод реакции связывания комплемента в микротитраторе системы Такачи, реакцию длительного связывания комплемента, реакцию непрямого связывания комплемента, реакцию связывания комплемента в геле, реакцию связывания комплемента микрокапельным методом, реакцию связывания комплемента на твердой основе.
Хотя чувствительность реакции связывания комплемента невысокая, однако она имеет высокую специфичность. В этой связи она широко применяется для диагностики вирусных пневмоэнтеритов молодняка крупного рогатого скота.
