Реакцията на фиксиране на комплемента (CFR) се основава на факта, че специфичен комплекс антиген-антитяло винаги адсорбира (свързва) комплемента към себе си.
Тази реакция се използва широко при идентифицирането на антигени и при серодиагностиката на инфекции, особено заболявания*, причинени от спирохети (реакция на Васерман), рикетсии и вируси.
RSC е сложна серологична реакция. Включва комплемент и две системи антиген-антитяло. По същество това са две серологични реакции.
Първата система - основната се състои от антиген и антитяло (едното е известно, другото не). Към него се добавя известно количество комплемент. Ако антигенът и антитялото на тази система съвпадат, те ще свържат и свържат комплемента. Полученият комплекс е фино диспергиран и невидим.
Образуването на този комплекс се открива с помощта на втора хемолитична или индикаторна система. Той включва овчи червени кръвни клетки (антиген) и съответния хемолитичен серум (антитела), т.е. готов имунен комплекс. В тази система лизисът на червените кръвни клетки може да настъпи само в присъствието на комплемент. Ако комплементът е свързан с първата система (ако антигенът и антитялото съответстват в него), тогава във втората система няма да има хемолиза - тъй като няма свободен комплемент. Липсата на хемолиза (съдържанието на епруветката е мътна или има утайка от еритроцити на дъното) се записва като положителен резултат от RSC.
Ако в първата система антигенът не съвпада с антитялото, тогава имунният комплекс няма да се образува и комплементът ще остане свободен! Оставайки свободен, комплементът участва във втората система, причинявайки хемолиза; резултатът от RSC е отрицателен (съдържанието на епруветките е прозрачно - „лакова кръв“).
Компоненти на реакцията на фиксиране на комплемента:
Антиген – обикновено лизат, екстракт, хаптен; по-рядко окачване.
1. Антитяло-серум на системата на пациента
2. Комплемент - серум морски свинчета
3. Антиген - овчи червени кръвни клетки
4.Антитела - хемолизин към овчи червени кръвни клетки
5.Изотоничен разтвор
Поради факта, че голям брой сложни компоненти участват в RSC, те трябва първо да бъдат титрувани и взети в реакцията в точни количества и в равни обеми: 0,5 или 0,25, по-рядко 0,2 ml. Съответно, целият експеримент се провежда в обеми от 2,5, 1,25 или 1,0 ml (по-големите обеми дават по-точен резултат). Титруването на реакционните компоненти се извършва в същия обем като експеримента, като липсващите съставки се заместват с изотоничен разтвор.
Подготовка на съставките
Хемолитичен серум (хемолизин). Серумът се разрежда 3 пъти по-малко от неговия титър (виж стр. 211). Пригответе общо разреждане на серума за целия експеримент, чийто обем се определя чрез умножаване на обема на серума в една епруветка (например 0,5 ml) по броя на епруветките, леко надвишаващ броя в експеримента.
2. Овчи червени кръвни клетки. Пригответе 3% суспензия от промити овчи еритроцити (виж стр. 211) за целия брой епруветки в опита. За да подготвите хемолитичната система, 30 минути преди да я добавите към експеримента, смесете равни обеми разреден хемолизин и суспензия от червени кръвни клетки, като добавите серума към червените кръвни клетки, разбъркайте добре и инкубирайте за 30 минути при 37˚C.
3.Комплементът обикновено се разрежда 1:10. Трябва да се титрира преди всеки опит. Титърът на комплемента е най-малкото му количество, когато се добави към хемолитичната система, пълната хемолиза настъпва в рамките на 1 час при 37˚C. Схемата за титруване на комплемента е представена в таблица 21.
внимание! Титруйте комплимента в същия обем като основния експеримент, като замените липсващите съставки с изотоничен разтвор.
Отчитане на резултатите. В контролите не трябва дори да има следи от хемолиза, тъй като едната от тях не съдържа комплемент, а другата не съдържа хемолизин. Контролите показват, че реакционните компоненти нямат хемотоксичност (способността спонтанно да лизират червените кръвни клетки).
В дадената таблица В пример 21 титърът на комплемента при разреждане 1:10 е 0,15 ml. В експеримента активността на комплемента може да намалее поради неговата неспецифична адсорбция от други компоненти на реакцията, следователно за експеримента количеството на комплемента се увеличава: взема се дозата, следваща титъра. Това е работната доза. В дадения пример той е равен на 0,2 комплемент в разреждане 1:10. Тъй като всички компоненти, участващи в RSC, трябва да се приемат в равни обеми (в нашия пример това е 0:5 ml), към работната доза на комплемента (0,2 ml1:10) е необходимо да се добавят 0,3 ml изотоничен разтвор. За целия експеримент обемът на всеки от тях (комплемент и изотоничен разтвор.
За целия експеримент обемът на всеки от тях (комплемент и изотоничен разтвор) се умножава по броя на епруветките, участващи в RSC. Например, за да проведете експеримент в 50 епруветки, трябва да вземете 10 ml комплемент 1:10 (0,2 mlx50) и 15 ml изотоничен разтвор (0,3 mlx50).
4. Антигенът обикновено се получава готов с посочен титър, т.е. количеството, което след разреждане на антигена трябва да се съдържа в 1 мл. например, с титър 0,4, той се разрежда в 0,96 ml изотоничен разтвор. За експеримента вземам количество антиген, равно на половината от титъра (0,5 ml). Това е работната му доза. Изчислете общото разреждане на антигена за целия експеримент, като умножите 0,5 ml по броя на епруветките в експеримента.
5. Антитяло – серум на пациента. Пресният серум се инактивира преди експеримента, за да се унищожи присъстващият в него комплемент. За целта се загрява 30 минути при 56˚C на водна баня или в инактиватор с термостат. Последният метод е за предпочитане: той елиминира възможността за прегряване на суроватката, т.е. нейната денатурация. Денатурираните серуми не са подходящи за тестване. Серумът на пациента обикновено се използва в разреждане от 1:10 до 1:160.
Таблица № 14
| Състав, мл | епруветки | |||||||||||
| опит | контрол | |||||||||||
| Хемолитична система | червени кръвни телца | |||||||||||
| Изотоничен разтвор | 1,45 | 1,4 | 1,35 | 1,3 | 1,25 | 1,2 | 1,15 | 1,1 | 1,05 | 1,0 | 1,5 | 1,5 |
| Допълнение 1:10 | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,35 | 0,4 | 0,45 | 0,5 | ― | 0,5 |
| Хемолитична система | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | ― |
| 3% суспензия от овчи червени кръвни клетки | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | 0,5 |
| Епруветките се разклащат старателно и се инкубират при 37˚C за 1 час. | ||||||||||||
| резултат | Няма хемолиза | Хемолиза | Няма хемолиза |
Имунните серуми най-често се приготвят в производствени условия и се освобождават инактивирани. Разреждат се 1:50 и по-високо.
Всички съставки се приготвят в лек излишък.
| Състав, мл | Епруветки | |||||||
| Контрол на опита | ||||||||
| серум | антиген | Хемолитична система | Добавка в работна доза | |||||
| ½ | ||||||||
| Фаза 1 Изотоничен разтвор | ― | 0,5 | 0,5 | 1,5 | 1,25 | 1,0 | 0,5 | |
| Тест серум, разреден 1:10 | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ― | |
| Антиген в работна доза | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ||
| Добавка 1:10 в работна доза | 0,5 | 0,5 | 0,5 | ― | 0,25 | 0,5 | 1,0 | |
| Епруветките се разклащат старателно и се инкубират при 37°C за 45 минути 1 час или 4°C за 18 часа | ||||||||
| Фаза 2 хемолитична система | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | |
| Епруветките се разклащат старателно и се инкубират при 37˚C до пълна хемолиза в епруветки 2, 3, 6 и 7 | ||||||||
| Резултат | Положителен или отрицателен | ― | ― | ++++ | (+) | ― | ― | |
Таблица № 15
Провеждане на основния експеримент
При настройката на експеримента е изключително; Редът, в който се добавят компонентите, е важен. Експериментът се провежда в две фази.
Фаза I. В епруветките се налива необходимото количество изотоничен разтвор на натриев хлорид, след това необходимото количество разреден серум и работните дози антиген и комплемент в същия обем. Експериментът трябва да бъде придружен от контрол на всички участващи в него съставки: серум, антиген, хемолитична система и комплемент.
Епруветките се разклащат старателно и се инкубират при 37°C за 45 min-1 час или при 4°C („RSC на студено“) за 18 часа. През това време, в присъствието на специфичен комплекс, настъпва свързване на комплемента. Провеждането на реакцията „на студено“ значително повишава нейната чувствителност и специфичност.
Фаза II. В края на инкубацията към всички епруветки се добавя 1 ml хемолитична система, която предварително се държи в термостат за 30 минути (сенсибилизирана). Епруветките се разклащат и се поставят обратно в термостата.
Счетоводен резултат около. Епруветките се оставят в термостата до пълна хемолиза в епруветки 2, 3, 6 и 7 (контрол на серум, антиген и комплемент за една и две дози). Хемолизата ще настъпи първо в 7-та епруветка, която съдържа двойно количество комплемент. След като в тази епруветка настъпи хемолиза и съдържанието й стане напълно прозрачно, трябва особено внимателно да наблюдавате останалите контроли. Веднага след като течността във 2-ра, 3-та и 6-та епруветки стане прозрачна, трябва незабавно да извадите стойката с епруветки от термостата. Фактът, че експериментът не е престоял в термостата по-дълго от необходимото, се показва от наличието на лека мътност (непълна хемолиза) в 5-та епруветка - тя съдържа само половината от работната доза комплемент и пълна хемолиза не може да настъпи, ако експериментът е настроен правилно.
Хемолизата в серумната и антигенната контрола (епруветки 2 и 3) показва, че техните дози са избрани правилно и че нито серумът, нито антигенът сами по себе си свързват комплемента.
При контрола на хемолитичната система (епруветка 4), ако работи правилно, не трябва да има дори следи от хемолиза - в нея няма комплемент.
След като сте сигурни, че контролите са изпълнени правилно, можете да вземете предвид опита. Отсъствието на хемолиза в епруветките се счита за положителен резултат от реакцията. Това показва, че серумът съдържа антитела, специфични за взетия антиген. Образуваният от тях комплекс свързва комплемента и предотвратява участието му в реакцията на хемолиза. Ако се появи хемолиза в епруветките, резултатът от реакцията се оценява като отрицателен. IN в такъв случайняма съответствие между антиген и антитяло, комплементът не е свързан и участва в реакцията на хемолиза.
Успоредно със серума на пациента, същият експеримент се провежда с очевидно положителен серум (т.е. със серум, който съдържа антитела към даден антиген) и очевидно отрицателен серум, който не съдържа специфични антитела. Ако експериментът е поставен правилно, в първия случай трябва да има забавяне на хемолизата, а във втория случай ще има хемолиза.
Интензивността на реакцията се изразява, както следва:
Пълно забавяне на хемолизата. Червените кръвни клетки образуват равномерна мътност или се утаяват на дъното. В този случай течността в епруветката става безцветна;
Приблизително 25% от червените кръвни клетки се лизират. Има по-малко утайка, течността над нея е леко розова. Резултатът от RSC също се оценява като силно положителен;
Приблизително 50% от червените кръвни клетки се лизират. Утайката е малка, течността е розова. Положителен резултат от RSC;
Приблизително 75% от червените кръвни клетки се лизират. Слаба утайка, над която има интензивно оцветена течност. Съмнителен резултат от RSC;
Всички червени кръвни клетки бяха лизирани. Течността е наситено оцветена и напълно прозрачна. Отрицателен RSK резултат.
Тази реакция се използва за откриване на антитела в кръвния серум на пациенти с бактериални, вирусни, протозойни инфекции, както и за идентифициране и типиране на вируси, изолирани от пациенти.
RSC се отнася до сложни серологични реакции, в които освен антиген, антитяло и комплемент участва и хемолитичната система, разкриваща резултатите от реакцията. RSC протича в две фази: първата е взаимодействието на антигена с антитялото с участието на комплемента, а втората е откриването на степента на свързване на комплемента с помощта на хемолитичната система. Тази система се състои от овчи червени кръвни клетки и хемолитичен серум, получен чрез имунизиране на лабораторни животни с червени кръвни клетки. Еритроцитите се обработват - сенсибилизират чрез добавяне на серум към тях при температура 37°C за 30 минути. Лизис на сенсибилизирани овчи еритроцити възниква само ако те се присъединят към системата на хемолитичния комплемент. При липсата му червените кръвни клетки не се променят. Резултатите от RSC зависят от наличието на антитела в тестовия серум. Ако серумът съдържа антитела, хомоложни на антигена, използван в реакцията, тогава полученият комплекс антиген-антитяло се свързва и свързва комплемента. При добавяне на хемолитична система в този случай няма да настъпи хемолиза, тъй като целият комплемент се изразходва за специфичната връзка на комплекса антиген-антитяло.
Червените кръвни клетки остават непроменени, така че липсата на хемолиза в епруветката се записва като положителен RBC. При липса на антитела, съответстващи на антигена в серума, специфичен комплекс антиген-антитяло не се образува и комплементът остава свободен. Когато се добави хемолитична система, комплементът се прикрепя към нея и причинява хемолиза на червените кръвни клетки. Разрушаването на червените кръвни клетки и тяхната хемолиза характеризира отрицателна реакция.
За стадия на RSC са необходими: серум на пациента, комплемент, хемолитична система, състояща се от овчи еритроцити и хемолитичен серум, както и изотоничен разтвор на натриев хлорид.
Реакцията се провежда в серологични епруветки. Овчи червени кръвни клетки се получават от дефибринирана овча кръв чрез трикратно промиване с изотоничен разтвор на натриев хлорид. Хемолитичният серум се произвежда готов в ампули, чийто етикет показва неговия титър, т.е. максималното разреждане на серума, което все още причинява хемолиза, когато се добави към червените кръвни клетки в присъствието на комплемент. Хемолитичният серум се получава чрез имунизиране на животни, като зайци, с червени кръвни клетки на овце. При настройка на реакцията серумът се използва в троен титър. Например, титърът на хемолитичния серум е 1: 1200, а работното разреждане е 1: 400. Като допълнение се използва пресен кръвен серум от морско свинче (в рамките на 24-48 часа) или сух комплемент в ампули.
Преди извършване на RSC, комплементът се разрежда 1:10 и се титрира, за да се установи титърът - най-малкото количество комплемент, което се произвежда от хемолиза на червени кръвни клетки, когато се комбинира с хемолитичната система, използвана в тази реакция. Като се вземат предвид възможните антикомплементарни свойства на антигена, при поставяне на реакция се прави 20-30% увеличение на установения работен титър на комплемента.
Антигенът за RSC са суспензии на убити бактерии, екстракти, приготвени от тези суспензии, и отделни химични фракции на микроби. Основното изискване за антиген е липсата на инхибиране на активността на комплемента. Не трябва да има антикомплементарни свойства. За да се идентифицират тези свойства на антигена, комплементът се титрува допълнително в присъствието на антигена, използван в реакцията. Има определени схеми за поставяне на RSC. Резултатите от реакцията се вземат предвид от наличието или отсъствието на хемолиза на червените кръвни клетки в хемолитичната система. RSC се използва при диагностицирането на сифилис (реакция на Васерман), гонорея (реакция на Борде-Женгоу), токсоплазмоза, рикетсиоза и вирусни заболявания.
Реакцията на фиксиране на комплемента (CFR) е, че когато антигените и антителата съответстват едно на друго, те образуват имунен комплекс, към който комплементът (C) е прикрепен чрез Fc фрагмента на антителата, т.е. комплементът е свързан от комплекса антиген-антитяло. Ако комплексът антиген-антитяло не се образува, тогава комплементът остава свободен.
Специфичното взаимодействие на AG и AT е придружено от адсорбция (свързване) на комплемента. Тъй като процесът на фиксиране на комплемента не е визуално видим, J. Bordet и O. Zhangu предложиха да се използва хемолитичната система (овчи червени кръвни клетки + хемолитичен серум) като индикатор, който показва дали комплементът е фиксиран от AG-AT комплекса. Ако AG и AT съответстват един на друг, т.е. образуван е имунен комплекс, тогава комплементът е свързан с този комплекс и не настъпва хемолиза. Ако AT не съответства на AG, тогава комплексът не се образува и комплементът, оставайки свободен, се комбинира с втората система и причинява хемолиза.
Прогрес на реакцията
Реакцията протича в две фази, включващи две системи; бактериални и хемолитични. Първата реакция (специфична) включва антиген 4-+ антитяло + комплемент. Положителният резултат от реакцията, който възниква, когато антителата съвпадат с антиген, се характеризира с образуването на специфичен бактериален комплекс антиген-антитяло с адсорбиран или, както се казва, „свързан“ комплемент. Оставайки невидим, комплексът не предизвиква външни промени в средата, в която се е образувал. Отрицателен резултат от RSC възниква при липса на специфичен афинитет между антигена и серумното антитяло и се характеризира със запазване на свободен активен комплемент. Първата фаза на RSC може да се проведе в термостат при 37°C (1-2 часа) или в хладилник при 3-4°C (18-20 часа). При продължително образуване на имунния комплекс антиген-антитяло в студа се получава по-пълно свързване на комплемента и в резултат на това се повишава чувствителността на реакцията. При провеждане на сравнителни експерименти съветският имунолог акад. V.I. Ioffe и неговите ученици показаха, че при продължителна фиксация на комплемента в студа е възможно да се уловят 100-500 пъти по-малки количества антиген и да се получат положителни резултатипри по-високи разреждания на имунния серум, отколкото в експеримента за фиксиране на комплемента при температура 37 ° C за 1-2 часа. Втората фаза на реакцията (индикатор) настъпва между реагентите на хемолитичната система (смес от 3% суспензия от. еритроцити и хемолитичен серум в равни обеми) при температура 37 °C само в присъствието на комплемент, останал свободен от първата фаза на реакцията (отрицателна реакция). При липса на свободен активен комплемент не настъпва хемолиза на червените кръвни клетки под въздействието на специфични хемолизини (реакцията е положителна).
Компоненти
Реакцията на свързване на комплемента (CFR) е сложна серологична реакция. За осъществяването му са необходими 5 съставки, а именно: АГ, АТ и комплемент (първа система), овчи еритроцити и хемолитичен серум (втора система).
Антигенът за RSC може да бъде култури от различни убити микроорганизми, техни лизати, компоненти на бактерии, патологично променени и нормални органи, тъканни липиди, вируси и материали, съдържащи вируси.
Като добавка се използва пресен или изсушен серум от морски свинчета.
Механизъм на реакцията
RSK се провежда в две фази: 1-ва фаза - инкубиране на смес, съдържаща три компонента антиген + антитяло + комплемент; 2-ра фаза (индикатор) - откриване на свободен комплемент в сместа чрез добавяне към нея на хемолитична система, състояща се от овчи еритроцити и хемолитичен серум, съдържащ антитела към тях. В 1-вата фаза на реакцията, когато се образува комплексът антиген-антитяло, комплементът се свързва, а след това във 2-рата фаза няма да настъпи хемолиза на еритроцитите, сенсибилизирани от антитела; реакцията е положителна. Ако антигенът и антитялото не съвпадат (няма антиген или антитяло в тестовата проба), комплементът остава свободен и във 2-ра фаза ще се присъедини към комплекса еритроцит - антиеритроцитно антитяло, причинявайки хемолиза; реакцията е отрицателна.
Приложение
Реакцията на фиксиране на комплемента може да се използва за:
1) идентифициране на специфични антитела в неизвестен серум въз основа на тяхното взаимодействие с антиген с известна природа;
2) изследване на свойствата на антигена в реакция с известен специфичен серум. Подготовка на съставките за поставяне на RSC.
1. Кръвният серум, получен за изследване, в навечерието на реакцията, се нагрява във водна баня при 56 ° C в продължение на 30 минути, за да инактивира собствения си комплемент. Инактивираният серум може да се съхранява при 3-4°C в продължение на 5-6 дни. В деня на експеримента серумът се разрежда с изотоничен разтвор на натриев хлорид в съотношение 1:5 (0,1 ml тестов серум + 0,4 ml изотоничен разтвор на натриев хлорид).
2. Антигенът за производството на CSC може да бъде култури от различни микроби, бактериални протеини и екстракти, получени от микробни култури, патологично променени и нормални органи и тъкани. Спецификата на подготовката на антигена се определя от естеството на инфекциозния процес и характеристиките на неговия патоген.
3. Комплементът е смес от серуми, получени от 3-5 здрави морски свинчета, или сух комплемент в ампули.
Непосредствено преди употреба серумът от морски свинчета се разрежда с изотоничен разтвор на натриев хлорид в съотношение 1:10, за да се получи изходен разтвор.
4. Преди извършване на експеримента хемолитичният серум се инактивира чрез нагряване при температура 56 °C в продължение на 30 минути. За извършване на основния RSC експеримент, както и за титриране на комплемента и антигена, се използва хемолитичен серум в троен титър. Например, ако титърът на хемолитичния серум е 1: 1800, в реакцията се използва серумно разреждане 1: 600.
5. Еритроцитите се получават от дефибринирана овча кръв. За да се отстранят фибриновите филми, кръвта се филтрира през трислоен филтър от марля. Полученият филтрат се центрофугира, серумът се изсмуква и отцежда, а еритроцитите се промиват чрез 3-4-кратно центрофугиране с изотоничен разтвор на натриев хлорид. Когато червените кръвни клетки се измият за последен път, супернатантният слой течност трябва да бъде напълно прозрачен. Приготвя се 3% суспензия от промити червени кръвни клетки в изотоничен разтвор на натриев хлорид. След като подготвите съставките, участващи в RSC по горния начин, преминете към титруване на хемолитичен серум, комплемент и антиген.
Учебникът се състои от седем части. Част първа – „Обща микробиология” – съдържа информация за морфологията и физиологията на бактериите. Част втора е посветена на генетиката на бактериите. Част трета – „Микрофлора на биосферата” – разглежда микрофлората заобикаляща среда, ролята му в кръговрата на веществата в природата, както и човешката микрофлора и нейното значение. Четвърта част - "Учението за инфекцията" - е посветена на патогенните свойства на микроорганизмите, тяхната роля в инфекциозен процес, а също така съдържа информация за антибиотиците и техните механизми на действие. Пета част – „Учението за имунитета” – съдържа съвременни представи за имунитета. Шестата част – „Вирусите и болестите, които причиняват” – предоставя информация за основните биологични свойства на вирусите и болестите, които причиняват. Част седма - „Частна медицинска микробиология“ - съдържа информация за морфологията, физиологията, патогенните свойства на патогените на много инфекциозни заболявания, а също и около съвременни методитяхната диагностика, специфична профилактикаи терапия.
Учебникът е предназначен за студенти, докторанти и преподаватели по висше медицинско образование образователни институции, университети, микробиолози от всички специалности и практикуващи лекари.
5-то издание, преработено и допълнено
Книга:
| <<< Назад
|
Напред >>> |
Реакция на фиксиране на комплемента
Установена е уникалната способност на комплемента да се свързва специфично с комплекси антиген + антитяло от различно естество широко приложениев реакцията на свързване на комплемента (CFR). Специално предимство на RSC е, че естеството на антигена, включен в него (корпускуларен или разтворим), няма значение, тъй като комплементът се свързва с Fc фрагмента на всяко антитяло, свързано с IgG и IgM, независимо от неговата специфичност на антитялото. В допълнение, RSA е много чувствителен: той ви позволява да откриете количеството антитела 10 пъти по-малко, отколкото, например, в реакцията на утаяване. RSC е предложен през 1901 г. от J. Bordet и O. Zhang. Основава се на две свойства на комплемента:
1) способността да се свързва с комплекса антиген + антитяло;
2) лизис на червени кръвни клетки, използвани за получаване на хемолитичен серум.
RSK се провежда на два етапа, като в него участват съответно две системи - експериментална, или диагностична, и индикаторна. Диагностичната система се състои от тестов (или диагностичен) серум, който се нагрява при 56 °C в продължение на 30 минути преди извършване на реакцията за инактивиране на комплемента и антигена, присъстващи в него. Към тази система се добавя стандартно допълнение. Неговият източник е прясна или изсушена суроватка от морско свинче. Сместа се инкубира при 37 °С за един час. Ако тестовият серум съдържа антитела, те ще взаимодействат с добавения антиген и получените комплекси антиген + антитяло ще свържат добавения комплемент. Ако в серума няма антитела, няма да се образува комплекс антиген + антитяло и комплементът ще остане свободен. На този етап от реакцията обикновено няма видими прояви на фиксация на комплемента. Следователно, за да се изясни въпросът дали е настъпила фиксация на комплемента или не, се добавя втора индикаторна система (инактивиран хемолитичен серум + овчи еритроцити) и сместа от всички RSC компоненти отново се инкубира при 37 °C за 30 - 60 минути, след като които се оценяват резултатите от реакцията. Ако комплементът е свързан на първия етап, в диагностичната система, т.е. има антитела в серума на пациента и комплементът е свързан от комплекса антитяло + + антиген, няма да има лизис на червени кръвни клетки - RBC е положителен: течността е безцветна, на дъното на епруветката има утайка от червени кръвни клетки. Ако в серума няма специфични антитела и в диагностичната система не се наблюдава свързване на комплемента, т.е. RSC е отрицателен, тогава неизразходваният в диагностичната система комплемент се свързва с комплекса от червени кръвни клетки + антитела на индикаторната система и хемолиза. възниква: в епруветката „лакирана кръв“, утайка от червени кръвни клетки No. Интензитетът на RSC се оценява с помощта на система с четири кръста в зависимост от степента на забавяне на хемолизата и наличието на утайка от червени кръвни клетки. Реакцията е придружена от подходящи контроли: серумен контрол (без антиген) и антигенен контрол (без серум), тъй като някои серуми и някои антигени имат антикомплементарен ефект. Преди извършване на RSC всички компоненти, участващи в него, с изключение на тестовия серум или антиген, подлежат на внимателно титруване. Особено важно е да се въведе точната доза комплемент в реакцията, тъй като неговата липса или излишък може да доведе до фалшиви резултати. Титърът на комплемента е минималното количество, което в присъствието на работна доза хемолитичен серум осигурява пълно разтваряне на червените кръвни клетки. За да поставите основния експеримент, вземете доза комплемент, увеличена с 20–25% в сравнение с установения титър. Титърът на хемолитичния серум е неговото максимално разреждане, което, когато се смеси с равен обем от 10% разтвор на комплемента, напълно хемолизира съответната доза червени кръвни клетки в рамките на 1 час при температура 37 ° C. Основният експеримент включва вземане на серум, разреден до 1/3 от неговия титър.
Реакцията на свързване на комплемента е една от традиционните серологични реакции, използван за диагностициране на много вирусни заболявания, а също така формира основата на някои други методи за откриване антивирусни антитела. Въпреки че реакцията на неутрализация, инхибиране на хемаглутинацията, индиректна хемаглутинация, свързан имуносорбентен анализнадминава реакцията на фиксиране на комплемента по чувствителност, но простотата на техниката, ранното откриване на антитела, както и откриването на вирусни антигени, които нямат хемаглутиниращи свойства, обясняват широкото му използване във вирусологичните изследвания.
Производството му не изисква толкова висока степен на концентрация и чистота на антигенни лекарства, които са необходими за редица други имунологични реакции. В допълнение, груповата специфичност на антигените за фиксиране на комплемента на много вируси позволява използването на реакцията на фиксиране на комплемента в масовата диагностика: тази реакция не разкрива разлики в щамовете и е от особено значение при изучаване на антигенните връзки между вирусите.
Самото име до голяма степен отразява същността на метода, който се състои от две отделни реакции. На първия етап в реакцията участват антигени и антитела (един от тези компоненти е известен предварително), както и комплемент в титрирано количество. Ако антигенът и антителата съвпадат, техният комплекс свързва комплемента, който се открива на втория етап с помощта на индикаторна система (смес от овчи червени кръвни клетки и антисерум към тях). Ако комплементът е свързан по време на взаимодействието на антиген и антитела, тогава не настъпва лизис на овчи червени кръвни клетки ( положителна реакцияфиксация на комплемента). В случай на отрицателна реакция на фиксиране на комплемента, нефиксираният комплемент насърчава хемолизата, която се използва за оценка на резултатите от реакцията.
Основните компоненти на реакцията на фиксиране на комплемента са антигени (известни или откриваеми), антитела (известни антисеруми или тестови серуми), комплемент, хемолитичен серум и овчи червени кръвни клетки; Като разредител се използва изотоничен разтвор на натриев хлорид (pH 7,2-7,4) или различни буферни разтвори. Антигените и серумите могат да бъдат антикомплементарни, т.е. способността да адсорбира комплемента, което забавя хемолизата и изкривява резултата от реакцията.
Антигените за CSC се приготвят от органи на заразени животни, алантоична или амниотична течност на заразени пилешки ембриони, както и културална течност след култивиране на вируси в тъканни клетъчни култури. Антигенните препарати винаги съдържат много баластни вещества от животински клетки или тъканни култури, които също могат да изкривят резултатите от реакцията.
Получените вирусни антигени се инактивират, определя се работната доза, както и антикомплементарните и хемолитични свойства. След това антигенът се титрува в присъствието на комплемент.
Вторият основен компонент при поставянето на реакцията е комплементът. Този термин означава сложна системапротеини и фактори, присъстващи в кръвта на животни и хора. Обикновено в реакцията на свързване на комплемента се използва кръвен серум от морско свинче. Активността (титърът) на комплемента е най-малкото му количество, в присъствието на което хемолизинът причинява пълна хемолиза на използваната хемолитична система.
За да се идентифицират комплемент-фиксиращи антитела срещу вируси, се изисква серумът да бъде инактивиран, за да се елиминира комплементът при 560°С за 30 минути. Като референтни серуми обикновено се използват серуми от имунизирани животни. Освен това за имунизация се използват вирусни антигени, които са напълно пречистени от тъканни примеси, тъй като в противен случай възниква изразена неспецифична реакция.
Задължителен компонент на реакцията на фиксиране на комплемента е хемолитичната система, която включва овчи еритроцити и хемолитичен серум, получен чрез хиперимунизиране на зайци с овчи еритроцити.
За извършване на реакцията на свързване на комплемента се използват следните модификации: микрометодът на реакцията на свързване на комплемента в микротитратор на системата Takachi, дългосрочната реакция на фиксиране на комплемента, реакцията на индиректно свързване на комплемента, реакцията на фиксиране на комплемента в гел, микрокапката реакция на свързване на комплемента, реакция на фиксиране на комплемента на твърда основа.
Въпреки че чувствителността на реакцията на свързване на комплемента е ниска, тя има висока специфичност. В тази връзка той се използва широко за диагностика на вирусен пневмоентерит при млади говеда.
