Reakcija aglutinacije (od lat. agglutinatio- lijepljenje) - lijepljenje tjelešca (bakterija, crvenih krvnih zrnaca, itd.) antitijelima u prisustvu elektrolita.
Reakcija aglutinacije manifestira se u obliku pahuljica ili sedimenta koji se sastoji od tjelešca (na primjer, bakterija) "zalijepljenih zajedno" antitijelima (slika 7.37). Reakcija aglutinacije se koristi za: određivanje patogena izolovanog od pacijenta; određivanje antitijela u krvnom serumu pacijenta; određivanje krvnih grupa.
Rice. 7.37 a, b. Reakcija aglutinacije saIgM-antitijela (a) iIgG-antitela (b)
1. Određivanje patogena izolovanog od pacijenta Približna reakcija aglutinacija na staklu (slika 7.38). Kapljici aglutinirajućeg seruma (razrjeđenje 1:20) dodaje se suspenzija bakterija izoliranih od pacijenta. Formira se flokulantni talog.
Rice. 7.38.
Ekstenzivna reakcija aglutinacije sa patogenom izolovanim od pacijenta (slika 7.39). Razrijeđenjima aglutinirajućeg seruma dodaje se suspenzija bakterija izoliranih od pacijenta.
Rice. 52
2. Određivanje antitijela u krvnom serumu pacijenta
Detaljna reakcija aglutinacije sa pacijentovim krvnim serumom (slika 7.39). Dijagnostikum se dodaje razblaženjima pacijentovog seruma.
- Aglutinacija sa O-diagnosticumom (bakterije ubijene toplotom, zadržavajući O-antigen) se javlja u obliku sitnozrnate aglutinacije.
- Aglutinacija sa H-diagnosticumom (bakterije ubijene formaldehidom, zadržavajući flagelarni H-antigen) je velika i odvija se brže.
3. Reakcija aglutinacije za određivanje krvnih grupa Reakcija aglutinacije za određivanje krvnih grupa koristi se za uspostavljanje ABO sistema (tabela b) pomoću aglutinacije eritrocita sa antitijelima imunog seruma protiv antigena krvne grupe A (I), B (III). Kontrola je: serum koji ne sadrži antitela, tj. serum AB (IV) krvna grupa; antigeni sadržani u crvenim krvnim zrncima grupa A (II), B (III). Negativna kontrola ne sadrži antigene, odnosno koriste se eritrociti grupe O (I).
Tabela 7.6. Određivanje ABO krvnih grupa
| Rezultati reakcije |
Grupa |
|
|
pripadanje |
||
|
istraživao |
||
|
crvenih krvnih zrnaca sa |
serum (plazma) |
|
|
standard |
sa standardom |
|
|
serumi | ||
Detaljna reakcija aglutinacije (RA). Za određivanje AT u krvnom serumu pacijenta, a ekstenzivna reakcija aglutinacije (RA). Da bi se to postiglo, nizu razrjeđenja krvnog seruma dodaje se dijagnostikum - suspenzija ubijenih mikroorganizama ili čestica sa sorbiranim Ag. Maksimalno davanje razblaženja aglutinacija Ag se naziva titar seruma.
Vrste reakcija aglutinacije (RA) za otkrivanje AT - test kapi krvi na tularemiju (sa dijagnostikom nanesenom na kap krvi i pojavom vidljivih bjelkastih aglutinata) i Huddlesonov test za brucelozu (sa dijagnostikumom obojenim gencijan violetom nanesenim na kap krvi serum).
Približna reakcija aglutinacije (RA)
Za identifikaciju izolovanih mikroorganizama, približni RA se stavlja na staklena stakalca. Da bi se to postiglo, kultura patogena se dodaje kapi standardnog dijagnostičkog antiseruma (razrijeđenog 1:10, 1:20). At pozitivan rezultat izvršiti detaljnu reakciju sa povećanjem razrjeđenja antiseruma.
Reakcija smatra se pozitivnim ako se primijeti aglutinacija u razrjeđenjima koja su blizu titra dijagnostičkog seruma.
OAS. Somatski O-Ags stabilni su na toplinu i mogu izdržati ključanje 2 sata.U interakciji sa AT formiraju sitnozrnate agregate.
N-Ag. N-Ag (flagelati) termolabilni su i brzo se razgrađuju na 100 °C, kao i pod uticajem etanola. U reakcijama s H-antiserumom, nakon 2 sata inkubacije, formiraju se labave velike pahuljice (nastale od bakterija koje se lijepe sa flagelama).
Vi-Ar tifusna bakterija je relativno toplotno stabilna (podnosi temperaturu od 60-62 °C 2 sata); Kada se inkubira sa Vi antiserumom, formira se sitnozrnasti aglutinat.
Direktne reakcije hemaglutinacije
Najjednostavniji od ovih reakcije - aglutinacija crvena krvna zrnca, ili hemaglutinacija, koja se koristi za određivanje krvnih grupa u ABO sistemu. Za utvrđivanje aglutinacija(ili nedostatak istih) koristite standardne antiserume sa anti-A i anti-B aglutininima. Reakcija se naziva direktna, jer su Ags koji se proučavaju prirodne komponente crvenih krvnih zrnaca.
Zajedničko sa direktna hemaglutinacija virusna hemaglutinacija ima mehanizme. Mnogi virusi su sposobni spontano aglutinirati eritrocite ptica i sisara; njihov dodatak suspenziji eritrocita uzrokuje stvaranje agregata iz njih.
Reakcija aglutinacije Reakcija aglutinacije
(RA) - metoda identifikacije i kvantifikacija Ag i At, na osnovu njihove sposobnosti da formiraju aglomerate vidljive golim okom. Na odjelu za infektivne bolesti. bolesti ili u druge svrhe koristi se za identifikaciju nepoznatih mikroba i ćelija, za određivanje prisustva i količine Ab u krvi i drugim tečnostima. Princip određivanja zasniva se na specifičnosti interakcije između Ag i Ab i sastoji se u pronalaženju poznatog od nepoznatog. Postoji mnogo opcija za RA: kvantitativne i kvalitativne, epruvete i stakla, volumetrijske i kapljične, konvencionalne, ubrzane i ekspresne metode. Za stadijum RA potrebno vam je: 1) s-ka krv. U varijanti sa određivanjem vrste (var) bakterija koriste se industrijski testovi aglutinacije, proizvedeni imunizacijom zečeva. U varijanti sa određivanjem tipa Ab, iz testa se uzima uzorak krvi. ljudi ili životinje. Rastvor mora biti sterilan i bez suspendiranih čestica. Pripremite osnovno razrjeđenje u fiziološkom rastvoru. Trebao bi biti 2-4 puta manji od dijagnostičkog titra za ovu bolest; 2) Ag. U verziji reakcije sa određivanjem Ab tipa koriste se industrijski dijagnostički kompleti; u varijanti sa određivanjem Ag dijagnostikumi se sami pripremaju u obliku suspenzije od 1-3 milijarde u fiziološkom rastvoru 18-20-satnog agar (rjeđe bujon) testa. mikrob inaktiviran zagrijavanjem u vodenom kupatilu na 70°C u trajanju od 1 sata ili 24-satnom inkubacijom na 37°C sa formaldehidom (konačna koncentracija 0,2%); 3) elektrolita u obliku fiziološke otopine. Tehnika inscenacije volumetrijska serijska cijev RA za određivanje Ab titra u s-ki: nekoliko redova radnih razblaženja priprema se od glavnog razblaženja s-ki. Broj redova zavisi od broja dijagnostikuma uzetih u eksperiment, a broj i faktori razblaženja određuju se dijagnostičkim titrom sumnjive bolesti. Serija mora sadržavati najmanje razrjeđenje koje odgovara dijagnostičkom Ab titru, dva razrjeđenja ispod i dva razrjeđenja iznad. na primjer, ako je dijagnostički titar 1:100, tada se volumetrijskom metodom stadijuma RA pripremaju sljedeća razrjeđenja: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; sa drip metodom, prvo razrjeđivanje (1:25) nije potrebno, ali je potrebno drugo veće razrjeđivanje - 1:800. naučno istraživanje s-ku se titrira na negativnu reakciju. Razrjeđuje se na sljedeći način: 0,25 ml fiziološkog rastvora se sipa u sve epruvete, osim u prvu, kada se reakcija izvodi u zapremini od 0,5 ml, i 0,5 ml kada se reakcija izvodi u zapremini od 1. ml. Sipati 0,25 (0,5) ml glavnog razblaženja u 1. i 2. epruvetu, iz 2. epruvete, u izrezanu zapreminu i uzgoj s-k i povećana 2 puta, 0,25 (0,5) ml se prenosi u 3., sa 3. na 4. itd. do zadnjeg, od reza se u sve ulije 0,25 (0,5) ml kako bi se izbalansirale zapremine. Svako razrjeđivanje se provodi pomoću posebne pipete. Ako se u eksperiment uzme više dijagnostikuma, onda se za svaki od njih na isti način priprema vlastita serija razrjeđenja. U svako razrjeđenje epruvete dodaje se Diagnosticum u zapremini jednakoj zapremini epruvete, zbog čega se razrjeđenje u svakoj epruveti udvostručuje. Eksperiment odgovara s-ki kontroli (0,25 - 0,5 ml glavnog razblaženja s-ki i ista količina fiziološkog rastvora) i Ag kontroli (0,25 - 0,5 ml dijagnostikuma i ista količina fiziološkog rastvora). Ako se u eksperimentu koristi više dijagnostikuma, onda svaki ima svoju kontrolu antigena. Stalak sa epruvetama se dobro promućka i stavlja u termostat na 37°C na 4 sata, a zatim ostavi na sobnoj temperaturi do sledećeg dana, nakon čega se beleži PA na osnovu količine taloga i stepena pročišćenosti. tečnost. Određivanje ovih indikatora, ovisno o prirodi aglutinata, provodi se golim okom na tamnoj pozadini, u aglutinoskopu ili preko konkavne površine ogledala mikroskopa. Računovodstvo počinje kontrolama: kontrola C treba da bude providna, Ag treba da bude jednolično zamućen (nakon protresanja epruvete). Ako su kontrole dobre, utvrditi prisustvo i stepen aglutinacije u svim epruvetama, koje su označene plusovima: veliki sediment i potpuno čišćenje tečnosti - 4 plusa; veliki talog i nepotpuno čišćenje tečnosti - 3 plusa; primjetan sediment i primjetno pročišćavanje tekućine su 2 plusa. Nakon toga se određuje titar: najveće razrjeđenje s intenzitetom aglutinacije od najmanje 2 plusa. Istraživanje titra s-ki se upoređuju sa dijagnostičkim titrom za ovu bolest. Ako se ispituje titar. s-ki je 2 puta niži od dijagnostičke vrijednosti, reakcija se procjenjuje kao sumnjiva; ako je titar jednak dijagnostika - kako slabo pozitivan; ako je 2-4 puta veći, smatra se pozitivnim; ako je 8 ili više puta veći, smatra se oštro pozitivnim. Sa široko rasprostranjenom distribucijom Ab zdravi ljudi Za procjenu RA koristi se povećanje Ab titra. Da bi se odredio tip Ar u serijskom RA, broj redova mora odgovarati broju uzetom za identifikaciju dijagnostičkih testova. Od glavnog razblaženja dijagnostičkog testa, priprema se serija uzastopnih dvostrukih razblaženja na isti način kao kod RA da bi se odredio Ab titar. Faktori razblaženja zavise od titra aglutinacionog testa.U eksperimentu je neophodno prisustvo razblaženja jednakog titru testa, kao i 2, 4, 6, 8 puta nižeg od njega. titar dijagnostičkog testa je 1 3200, tada treba koristiti razrjeđenja 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 Ista zapremina testiranog Ag se dodaje u razrjeđenja testa, kao rezultat toga, razrjeđenje test se povećava za 2 puta.Opitu se dodaju 2 kontrole testa i Ag.Ako je u eksperimentu uključeno nekoliko s-k onda je svakom od njih potrebna vlastita kontrola.Po završetku reakcije stalak se snažno protrese i postavi u termostatu na 37°C Rezultati se uzimaju u obzir kao što je gore opisano.Procjena reakcije ima karakteristike.Da bi se izveo zaključak o usklađenosti studije. Ag uzet u eksperiment, titar reakcije mora odgovarati najmanje polovini titra standardnog dijagnostičkog testa.Titri od 1 4 i ispod smatraju se grupnom reakcijom Drip md Stadiranje RA se razlikuje od volumetrijskog po tome što se s-ku razblaži u zapremini od 1 ml, a koristi se Ag u višoj koncentraciji (10 milijardi/ml) i dodaje se 1 - 2 kapi u epruvetu Razblaživanje leka nakon dodavanja Ag smatra se nepromenjenim.U suprotnom, način postavljanja, evidentiranja i evaluacije je sličan volumetrijskoj metodi
(Izvor: Rječnik mikrobioloških pojmova)
IMUNOMIKROBIOLOŠKE STUDIJE
Imunološke metode se koriste za rješavanje mnogih problema:
1. Procjena stanja imunološki sistem osoba ( imunološki status) po definiciji kvantitativnog i funkcionalne karakteristikećelije imunog sistema i njihovi proizvodi.
2. Određivanje sastava i karakteristika ljudskih tkiva: krvne grupe, Rh faktor, transplantacijski antigeni.
3. Dijagnoza infektivnih bolesti i rezistencije na njih otkrivanjem i utvrđivanjem titra antitela (serodijagnostika), identifikacijom antigena patogena u organizmu i određivanjem ćelijskih reakcija na te antigene.
4. Seroidna identifikacija kultura bakterija i virusa izoliranih iz tijela ljudi i životinja.
5. Detekcija u ljudskom tijelu i u spoljašnje okruženje sve supstance sa antigenskim ili haptenskim svojstvima (hormoni, enzimi, otrovi, lekovi, lekovi itd.).
6. Identifikacija imunopatoloških stanja, alergija, transplantacijskih i antitumorskih reakcija.
Proces interakcije između antigena i antitijela serološke reakcije odvija se u dvije faze:
1) specifično- faza interakcije u kojoj se javlja komplementarna kombinacija aktivnih centara antitijela (paratopa) i epitopa antigena. Obično ova faza traje nekoliko sekundi ili minuta;
2) nespecifičan- faza manifestacije, okarakterisana spoljni znaci formiranje imunoloških kompleksa. Ova faza se može razviti od nekoliko minuta do nekoliko sati.
Optimalna specifična interakcija antitijela sa antigenom javlja se u izotoničnom rastvoru sa pH blizu neutralnog. Reakcija antigen-antitijelo u in vitro sistemu može biti praćena pojavom nekoliko fenomena
· aglutinacija,
· padavine,
· liza.
Spoljne manifestacije reakcije zavise od fizičko-hemijskih svojstava antigena (veličina čestica, fizičko stanje), klasa i vrsta antitela (potpuna i nepotpuna), kao i eksperimentalni uslovi (srednja konzistencija, koncentracija soli, pH, temperatura).
Polivalentnost antigena i antitijela osigurava stvaranje agregata vidljivih golim okom. To se događa u skladu s teorijom formiranja mreže, prema kojoj su druga antitijela i molekuli antigena sekvencijalno vezani za rezultirajući kompleks antigen-antitijelo. Kao rezultat, formiraju se mrežne strukture koje se pretvaraju u agregate koji se talože. Priroda i težina reakcije zavise od kvantitativnog omjera antigena i antitijela. Najintenzivnije reakcije se javljaju kada su reagensi u ekvivalentnim proporcijama.
Preduvjet formiranje rešetke (mreže) - prisustvo više od tri antigenske determinante za svaki molekul antigena i dva aktivna centra za svaki molekul antitela. Molekuli antigena su rešetkasti čvorovi, a molekuli antitela su veze. Područje optimalnih omjera (zona ekvivalencije) koncentracija antigena i antitijela, kada se u supernatantu nakon formiranja sedimenta ne otkrivaju ni slobodni antigeni ni slobodna antitijela.
Agregati koji mogu precipitirati nastaju kada se antigeni kombinuju sa punim antitijelima. Nepotpuna antitijela(monovalentne) ne uzrokuju formiranje mrežnih struktura i velikih agregata. Da biste otkrili takva antitijela, koristite posebne metode baziran na upotrebi antiglobulina (Coombsova reakcija).
Serološke reakcije, zbog svoje visoke specifičnosti i osjetljivosti, koriste se za detekciju i kvantifikaciju antigena i antitijela. Količina imunoreagensa u reakcijama izražava se titrom - maksimalnim razrjeđenjem seruma ili antigena pri kojem se reakcija još uvijek opaža.
Serološke reakcije u mikrobiološkim i imunološkim laboratorijama koriste se u dvije svrhe:
1) za seroidifikaciju mikroorganizama, toksina, antigena uopšte pomoću poznatog antitela (imuno dijagnostički serum),
2) za serodijagnostiku - utvrđivanje prirode antitijela u krvnom serumu pacijenta za bakterijske, virusne i rjeđe druge zarazne bolesti pomoću poznatog antigena (diagnosticum).
Da bi se odredio generički, vrsta i tip antigena, potrebni su poznati imunološki testovi. dijagnostički serumi. Dobivaju se ponovnim davanjem životinjama (obično zečevima) u sve većim dozama ubijenih ili živih mikroorganizama, produkata njihovog raspadanja, neutraliziranih ili nativnih toksina. Nakon određenog ciklusa imunizacije životinja, vrši se masovno puštanje krvi ili totalno krvarenje životinje. Krv prikupljena u sterilnu posudu prvo se stavlja u termostat na temperaturi od 37°C na 4 - 6 sati kako bi se ubrzalo zgrušavanje, a zatim u ledenicu na jedan dan. Dobijeni prozirni serum usisava se u sterilnu posudu, dodaju se konzervansi, određuje se titar antitijela, provjerava sterilnost i sipa u ampule.
Koriste se neadsorbovan I adsorbovan dijagnostički serumi. Neadsorbirani serumi imaju visoki titri antitijela, ali su sposobna da daju grupne (unakrsne) reakcije.
Adsorbirani serumi se odlikuju strogom specifičnošću djelovanja (reaguju samo sa homolognim antigenom). Zovu se serumi koji sadrže antitijela samo na jedan specifični antigen monoreceptor.
Takođe proizvode serume označene fluorohromima, enzimima i radioizotopima, koji omogućavaju detekciju čak i tragova antigena sa visokim stepenom tačnosti.
Kao antigeni (dijagnostikumi) u serološkim reakcijama koriste se suspenzije živih ili ubijenih bakterija, produkti njihovog razgradnje, toksini i virusi. U nekim slučajevima se koriste ekstrakti ili hemijski izolovani antigeni iz mikroorganizama i životinjskih tkiva.
Sve imunomikrobiološke metode mogu se podijeliti u 3 grupe:
1) na osnovu direktna interakcija antigena sa antitijelom(fenomeni aglutinacije, precipitacije, hemaglutinacije, imobilizacije, itd.);
2) na osnovu posredovana interakcija antigena sa antitijelom(reakcije indirektna hemaglutinacija, koaglutinacija, lateks aglutinacija, aglomeracija ugljika, aglutinacija bentonita, fiksacija komplementa, itd.);
3) korišćenje obeležena antitela ili antigeni(metoda fluorescentnih antitijela, enzimski imunosorbentni i radioimuni testovi i druge metode).
REAKCIJE AGLUTINACIJE
Ove reakcije uključuju antigene u obliku čestica (mikrobne ćelije, crvena krvna zrnca i drugi korpuskularni antigeni), koje se spajaju antitijelima i talože.
Za izvođenje reakcije aglutinacije(RA) potrebne su tri komponente: 1) antigen (aglutinogen);
2) antitelo (aglutinin)
3) elektrolit (izotonični rastvor natrijum hlorida).
Približna reakcija aglutinacije (RA)
Indikativni ili pločasti RA se stavlja na stakalnu pločicu na sobnoj temperaturi. Da biste to učinili, pomoću Pasteurove pipete nanesite kap seruma u razrjeđenju od 1:10 do 1:20 i kontrolnu kap izotonične otopine natrijum hlorida odvojeno na staklo. Kolonije ili dnevna kultura bakterija (kap dijagnostikuma) unose se u obje bakteriološke petlje i temeljito se miješaju. Reakcije se uzimaju u obzir vizuelno nakon nekoliko minuta, ponekad pomoću lupe (x5). Kod pozitivnog RA uočava se pojava velikih i malih pahuljica u kapi seruma, a kod negativnog RA serum ostaje ravnomjerno zamućen.
Detaljna reakcija aglutinacije kako bi se utvrdio titar specifičnih antitijela kod pacijenta.
Potpuni RA za serodijagnostiku se pravi u serumu pacijenata. Takođe se razblažuje u izotoničnom rastvoru natrijum hlorida od 1:50 - 1:100 do 1:800 ili 1:1600. Budući da niži titar seruma može sadržati normalne aglutinine koji se nalaze kod zdravih ljudi ili pacijenata sa drugom dijagnozom (dijagnostički titar). Kao antigen u ovoj reakciji koriste se dijagnostikumi - poznate suspenzije, najčešće ubijenih bakterija.
U epruvete za aglutinaciju prvo se sipa 1 ml izotonične otopine natrijum hlorida. Prvom se dodaje 1 ml seruma razrijeđenog 1:100, a nakon miješanja 1 ml se prebacuje u drugi, iz drugog u treći itd. 1-2 kapi bakterijske suspenzije koja sadrži 3 milijarde mikrobnih tijela u 1 ml dodaju se u rezultirajuća dvostruka razrjeđenja seruma (od 1:100 do 1:1600 ili više). Epruvete se protresu i stave u termostat na 37°C 2 sata, a zatim drže na sobnoj temperaturi 24 sata.
Detaljna reakcija aglutinacije se uzima u obzir tako što se svaka epruveta procjenjuje uzastopno, počevši od kontrolnih, uz lagano protresanje. U kontrolnim epruvetama ne bi trebalo biti aglutinacije. Intenzitet reakcije aglutinacije označen je sljedećim znacima: ++++ - potpuna aglutinacija (aglutinirajuće pahuljice u apsolutno providnoj tekućini); +++ - nepotpuna aglutinacija (ljuspice u blago opalescentnoj tečnosti); ++ - djelomična aglutinacija (ljuspice su jasno vidljive, tečnost je blago zamućena); + - slaba, upitna aglutinacija - tečnost je veoma zamućena, pahuljice u njoj se teško razlikuju; - - odsustvo aglutinacije (tečnost je jednolično zamućena).
Titar seruma se uzima kao njegovo posljednje razrjeđenje, u kojem se intenzitet aglutinacije procjenjuje kao najmanje dva plusa (++)
Predavanje br. 16
Rječnik
DIREKTNO – ravno dalje bez ičega, bez naknadnih veza.
INDIREKTNO– kroz druge ćelije, ne direktno.
SMANJENJE ≠ POVEĆANJE (aktivnost ćelije).
ODBIJA – ne prihvatiti, odbiti. Tijelo odbacuje presađeni organ.
Imune reakcije.
Imunske reakcije su reakcije specifične interakcije (vezivanja) antigena i antitijela ili antigena i senzibiliziranog T-limfocita.
Ove reakcije se javljaju in vitro (u epruveti) i in vivo (u živom organizmu).
Ove reakcije uključuju serum (serum), zbog čega se i nazivaju serološki.
Imuni odgovori su navikli dijagnostika zaraznih bolesti. U ovom slučaju, nepoznata komponenta je određena poznatom komponentom, koja se zasniva na specifičnosti interakcije antigena sa antitelom. Ako poznato antitelo, onda možeš identificirati (otkriti) nepoznati antigen. Ako poznati antigen, onda ga možete koristiti otkriti nepoznata antitijela.
Tako se koriste imunološke reakcije:
1) za serološka dijagnostika(serodijagnostika) bolesti - otkrivanje u krvnom serumu bolesnih ljudi antitijela na specifičnog uzročnika zarazne bolesti (poznati antigen); ako su u krvnom serumu bolesne osobe prisutna antitijela na bilo koji patogen, onda je to taj patogen uzrokovao ovo infekcija;
2) za serološka identifikacija (seroididentifikacija) mikroba - određivanje vrste patogena pomoću imunoloških dijagnostičkih seruma (poznata antitijela); ako antitijela vežu patogen izolovan od bolesne osobe, onda je ovaj mikrob identičan onom kojim je životinja imunizirana primanje imuno dijagnostički serum .
Imunološke reakcije se javljaju u 2 faze:
1) specifična faza– povezivanje aktivnog centra antitela sa determinantnom grupom antigena sa formiranjem kompleksa antigen-antitelo; ova faza teče brzo, ali nema vidljivog efekta;
2) nespecifična faza– izgled vidljiv efekat interakcija antigena i antitela - gubitak nacrt(aglutinacija) ili oblačnost(padavine), što dozvoljava vidi obrazovanje kompleksa antigen-antitelo i izvući zaključak o usklađenost antigena i antitijela jedno na drugo.
Imunološke reakcije uključuju reakcija aglutinacije (RA), reakcija precipitacije (RP), reakcija fiksacije komplementa (CFR).
Reakcija aglutinacije- to je lijepljenje i taloženje mikrobnih ili drugih ćelija (eritrocita) pod utjecajem antitijela u prisustvu elektrolita. Vidljivi efekat reakcije (fenomen aglutinacije) je stvaranje precipitata tzv. aglutinirati.
Ova reakcija se koristi za serodijagnostika I seroididentifikacija. RA se koristi za serodijagnostiku (otkrivanje antitijela u krvnom serumu pacijenata) tifusna groznica i paratifus(Vidal reakcija), bruceloza(Wrightova reakcija) tularemija i leptospiroza. RA se koristi za seroidifikaciju (određivanje vrste patogena izolovanog od pacijenta) kada crijevne infekcije, veliki kašalj, kolera i sl.
Komponentereakcije:
1. A ntigen (aglutinogen) – to su cijele (ne uništene) mikrobne ili druge ćelije ( korpuskularno, nerastvorljivi antigen). Aglutinogeni- ovo je suspenzija živ ili ubijen mikrobne ćelije ili bilo koje druge ćelije. Antigeni mogu biti nepoznati ili poznati. Nepoznati aglutinogen je mikrobna kultura izolirana iz tijela pacijenta koju treba odrediti. Poznati antigen - diagnosticum– dijagnostički lijek – suspenzija mrtvih mikrobi poznate vrste u fiziološkom rastvoru. Ova suspenzija oblačno (providno), jer mikrobne ćelije se ne rastvaraju, već ostaju netaknute. Poznati aglutinogen će se koristiti za otkrivanje nepoznatih antitijela u krvnom serumu pacijenata.
2. Antitijelo (aglutinin)- nalazi se u krvnom serumu. Antitijela također mogu biti nepoznata ili poznata. U krvnom serumu nalaze se nepoznata antitijela koja treba odrediti bolesna osoba. Poznata antitela se nalaze u imunološki dijagnostički serumi koji se zovu aglutinirajući serumi. Koriste se za seroidentifikaciju, tj. za određivanje nepoznatog antigena – vrste mikrobne kulture.
3. Elektrolit– 0,9% rastvor natrijum hlorida.
Dobivanje dijagnostičkog testa.
Čista kultura patogena poznate vrste uzgajana na kosom agaru (npr. uzročnik trbušnog tifusa) se ispere sa 3-4 ml izotonične otopine, stavi se u sterilnu epruvetu, mikrobi se u nekim način (na primjer, ključanjem i određuje se gustina (u 1 ml bi trebalo biti 3 milijarde mikrobnih ćelija). Ako se mikrobne ćelije ubiju visoke temperature, tada dobijaju O-diagnosticum (O-antigen), ali ako se tretira formaldehidom, onda dobijaju H-diagnosticum (H-antigen).
Primjeri dijagnostike: salmonella diagnosticum, brucellosis diagnosticum, tularemia diagnosticum.
Priprema aglutinirajućih seruma.
Životinjama (obično zečevima) se parenteralno injektira mikrobna dijagnostika u rastućim dozama 5-7 puta u intervalima ( izvršiti hiperimunizaciju), a zatim im se uzima krvni serum koji sadrži antitijela na mikrobe od kojih se priprema dijagnostikum. Ako se imunizacija provodi O-diagnosticumom, onda se dobijaju O-aglutinirajući serumi (sadrže O-antitijela), ako se H-diagnosticumom dobijaju H-aglutinirajući serumi.
Aglutinirajući serumi mogu biti neadsorbovan ili domaći i adsorbovan.
Neadsorbirani serumi sadrže grupna antitijela na nekoliko blisko povezanih vrsta mikroba.
Adsorbirani serumi sadrže antitijela na jedan ili više antigena jedne vrste mikroba. Ako serumi sadrže antitijela samo na jedan antigen, oni se nazivaju monoreceptor ili jednovalentan, ako na nekoliko antigena – grupa adsorbirani serum .
Primjeri aglutinirajućih seruma:H-aglutinirajući serum sa monoreceptorom salmonele, O-aglutinirajući serum adsorbirani salmonelom, O-aglutinirajući serum protiv kolere itd..
Titar aglutinirajući serum - najveće razrjeđenje seruma pri kojem se još uvijek detektuje reakcija aglutinacije s antigenom (titar ovisi o količini antitijela u krvi: što je više antitijela, to je veći titar seruma).
Metode stadijuma RA.
1. Približni (lamelarni) RA– izvedeno na staklu. Nanesite 2 kapi seruma i 1 kap izotonične otopine na predmetno staklo. Mikrobna kultura se unosi u jednu od kapi seruma i u kapi izotonične otopine u petlji i miješa. Kap izotonične otopine sa klicama – kontrola antigena, kap serumi bez klica – kontrola antitela, kap serumi sa mikrobima – iskustvo. Ako serum sadrži antitijela koja odgovaraju mikrobnim antigenima koji se miješaju s njim, tada će se antitijela i antigeni specifično vezati jedni za druge i nakon 1-3 minute aglutinirajuće pahuljice će se pojaviti u kapi testa. Kontrola antigena treba da bude mutna, a kontrola antitela bistra. Rezultati reakcije se bilježe na osnovu pojave aglutinatnih pahuljica . Ako ispadnu pahuljice, reakcija je pozitivna, tj. Antigen odgovara antitelu i antigen se može koristiti za određivanje antitela ili obrnuto. Ako zamućenost ostane, reakcija je negativna.
2. Detaljna reakcija aglutinacije - izvedeno u epruvetama. Prvo pripremite 2-struka razrjeđenja krvnog seruma bolesne osobe od 1:50 do 1:1600. 1 ml izotonične otopine natrijum hlorida se sipa u 6 epruveta. U prvu epruvetu se dodaje 1 ml pacijentovog krvnog seruma u razrjeđenju 1:50, miješa se i dobije se razrjeđenje 1:100, a zatim se 1 ml razrijeđenog 1:100 prenosi u drugu epruvetu. i dobije se razrjeđenje 1:200 itd. Za kontrolu antigena i seruma čuvaju se dvije epruvete. U kontrolu seruma dodajte samo serum u razrjeđenju 1:50, u kontrolu antigena - samo antigen. Dodati 0,1 ml antigena - diagnosticuma (O- ili H-) u sve ostale epruvete i staviti sve epruvete u termostat na 37°C na 18-20 sati. Rezultati reakcije se bilježe prema prirodi, količini nastalog taloga (aglutinata) i stepenu zamućenosti. Obračun se vrši samo sa sljedećim rezultatima u kontrolama: kontrola seruma - providna, kontrola antigena - zamućena. O-antitijela daju fino zrnati precipitat. H-antitijela – grubo zrnasta. Na osnovu posljednje epruvete u kojoj je još uvijek vidljiva reakcija aglutinacije, utvrđeno je dijagnostički titar.
Tokom serodijagnostike bolesti, važno je ne samo otkriti specifična antitijela na određeni patogen, već i identificirati njihovu količinu, tj. ustanoviti takav titar antitela Kada možemo govoriti o prisutnosti bolesti uzrokovane ovim patogenom? . Ovaj titar se naziva dijagnostički titar. Na primjer, da biste dijagnosticirali trbušni tifus, morate identificirati titar antitijela 1:400, ali ne manji. Daje još preciznije rezultate detekcija porasta antitijela u uparenim serumima. Pacijentov serum se prikuplja na početku bolesti i nakon 3 do 5 ili više dana. Dakle, ako se titar antitijela poveća najmanje 4 puta, možemo govoriti o trenutna bolest.
Ako se radi detaljne reakcije aglutinacije radi seroididentifikacije, tada se koriste aglutinirajući dijagnostički serumi, razrijeđeni do titra ili do polovine svog titra. RA se smatra pozitivnim ako se otkrije aglutinacija pri razrjeđenju bliskom titru dijagnostičkog seruma.
