Reakcija aglutinacije (RA) je adhezija i precipitacija mikroba ili drugih ćelija pod uticajem antitela u prisustvu elektrolita. Nastali talog naziva se aglutinat.
RA se koristi:
1. Otkrivanje antitijela u krvnom serumu pacijenta (serodijagnostika).
2. Odrediti vrstu i serovar čiste kulture patogenih mikroorganizama izolovanih od pacijenta (serotipizacija).
Reakcija aglutinacije se koristi za određivanje antitijela u krvnom serumu pacijenata, na primjer, kod trbušnog tifusa i paratifusa (Vidalova reakcija), bruceloze (reakcija Wright, Heddlesonova reakcija), tularemije, leptospiroze i dr. zarazne bolesti, kao i za određivanje patogena izolovanog od pacijenta (crevne infekcije, veliki kašalj itd.). RA se koristi za određivanje krvnih grupa, Rh faktora itd.
Za reakciju su potrebne sljedeće komponente:
1. Antigen (aglutinogen) mora biti korpuskularan, odnosno, to je suspenzija živih ili ubijenih mikroorganizama (dijagnostika m), eritrocita ili drugih ćelija. Obično se koristi svakodnevna kultura mikroorganizama uzgojenih na agarima. Kultura se ispere sa 3 - 4 ml izotonične otopine, prenese u sterilnu epruvetu i odredi se gustina. Suspenzija mora biti homogena i sadržavati do 3 milijarde mikrobnih ćelija po 1 ml. Upotreba suspenzije ubijenih mikroba - dijagnostikuma - olakšava rad (pripremljene u proizvodnji).
2. Antitijela (aglutinini) se nalaze u pacijentovom serumu (tokom serodijagnostike) ili u aglutinirajućem serumu (tokom serotipizacije). Aglutinirajući serumi se dobijaju imunizacijom zečeva ubijenim bakterijama.
Titar aglutinacije serum se naziva njegovim najvećim razrjeđenjem, u kojem reagira s odgovarajućim antigenom pod određenim eksperimentalnim uvjetima.
Aglutinirajući serumi mogu biti nativni (neadsorbirani) i adsorbirani. Nativni serumi u malim razrjeđenjima djeluju ne samo s vrstom mikroorganizama s kojima je životinja imunizirana da bi se dobio serum, već i sa srodnim vrstama mikroorganizama, budući da sadrže grupna antitijela (antitijela na mikroorganizme koji imaju zajedničke antigene). Nativni serumi se koriste za detaljnu reakciju aglutinacije (za serodijagnostiku), koja uzima u obzir ne samo prisustvo reakcije, već i dinamiku povećanja titra antitijela.
Ako se grupna antitijela ekstrahuju (adsorbiraju) iz nativnog seruma interakcijom sa srodnim bakterijama koje imaju grupne antigene, dobijaju se adsorbirani serumi. Adsorbirani serumi mogu biti monoreceptorski (ili tip-specifični), koji sadrže antitijela samo na jedan antigenski receptor. Polivalentni serumi se sastoje od mješavine nekoliko adsorbiranih ili neadsorbiranih seruma. Za reakciju aglutinacije stakla koriste se adsorbirani serumi.
Kada se životinje imuniziraju pokretnim bakterijama s H-antigenom, dobivaju se serumi koji sadrže H-antitijela koja sadrže H-aglutinaciju (na primjer, H-aglutinirajući serum sa monoreceptorom Salmonella). Imunizacijom O-antigenom dobijaju se O-aglutinirajući serumi koji sadrže O-antitijela (na primjer, O-aglutinirajući serum adsorbirani salmonelom, O-aglutinirajući serum protiv kolere). Imunizacijom H- i O-antigenima dobijaju se serumi sa H- i O-antitelima.
Štaviše, O-aglutinini proizvode sitnozrnati aglutinat, a H-aglutinini proizvode krupnozrnati sediment.
3. Elektrolit - izotonični rastvor NaCl (0,9% rastvor natrijum hlorida pripremljen u destilovanoj vodi).
Postoje dvije glavne metode za izvođenje reakcije aglutinacije: reakcija na staklu (ponekad nazvana indikativna ili pločasta reakcija) i detaljna reakcija (u epruvetama)
Postavljanje reakcije aglutinacije na staklu. Dvije kapi seruma i kap izotonične otopine natrijum hlorida nanose se na staklo bez masti. Dijagnostički aglutinirajući serum uzima se u jednom razrjeđivanju, koje, ovisno o njegovom titru, iznosi 1:10, 1:25, 1:50 ili 1:100. Kultura mikroorganizma koji se proučava dodaje se u jednu kap seruma i kap izotonične otopine pomoću petlje i temeljito promiješa. Kap natrijum hlorida sa mikroorganizmima je kontrola antigena, kap seruma bez mikroorganizama je kontrola seruma. Ne možete prenijeti kulturu iz kapi sa serumom u kap s NaCl. Reakcija se odvija na sobnoj temperaturi 1-3 minuta. Ako kontrola seruma ostane bistra, uočena je ujednačena zamućenost u kontroli antigena, a aglutinatne ljuspice se pojavljuju u kapi gdje je kultura pomiješana sa serumom, onda se rezultat smatra pozitivnim. Ako postoji ujednačena zamućenost kapi sa serumom i antigenom, onda je to negativan rezultat. Reakcija je jasnije vidljiva na tamnoj pozadini.
Serum
1. kontrola antigena
2. kontrola seruma
13.1. Reakcije antigen-antitijelo i njihova primjena
Kada se unese antigen, u tijelu se stvaraju antitijela. Antitijela su komplementarna antigenu koji je izazvao njihovu sintezu i sposobna su da se vežu za njega. Vezivanje antigena za antitela sastoji se od dve faze. Prva faza je specifična, u kojoj dolazi do brzog vezivanja antigenske determinante za aktivni centar Fab fragmenta antitijela. Treba napomenuti da je vezivanje posljedica van der Waalsovih sila, vodonika i hidrofobnih interakcija. Snaga veze određena je stepenom prostorne korespondencije između aktivnog mjesta antitijela i epitopa antigena. Nakon specifične faze počinje sporija faza – nespecifična, koja se manifestuje vidljivim fizičkim fenomenom (npr. stvaranje ljuskica tokom aglutinacije i sl.).
Imunološke reakcije su interakcija između antitijela i antigena, a ove reakcije su specifične i imaju visoka osjetljivost. Široko se koriste u medicinska praksa. Uz pomoć imunoloških reakcija mogu se riješiti sljedeći problemi:
Određivanje nepoznatih antitela poznatim antigenima (antigenski dijagnostikum). Ovaj zadatak se javlja kada je potrebno odrediti antitijela na patogen u krvnom serumu pacijenta (serodijagnostika). Pronalaženje antitijela omogućava vam da potvrdite dijagnozu;
Određivanje nepoznatih antigena korištenjem poznatih antitijela (dijagnostički serum). Ova studija se provodi prilikom identifikacije kulture patogena izolirane iz materijala pacijenta (serotipizacija), kao i prilikom otkrivanja
antigeni mikroba i njihovi toksini u krvi i drugo biološke tečnosti. Postoji mnogo vrsta imunoloških reakcija koje se razlikuju po tehnici insceniranja i zabilježenom efektu. To su reakcije aglutinacije (RA), reakcije precipitacije (RP), reakcije koje uključuju komplement (RSC), reakcije koje koriste označene komponente (RIF, ELISA, RIA).
13.2. Reakcija aglutinacije
Reakcija aglutinacije (RA) je imunološka reakcija interakcija antigena sa antitijelima u prisustvu elektrolita, a antigen je u korpuskularnom stanju (eritrociti, bakterije, čestice lateksa sa adsorbiranim antigenima). Tokom aglutinacije, korpuskularni antigeni su zalijepljeni antitijelima, što se manifestira stvaranjem flokulantnog taloga. Do stvaranja pahuljica dolazi zbog činjenice da antitijela imaju dva aktivna centra, a antigeni su polivalentni, tj. imaju nekoliko antigenskih determinanti. RA se koristi za identifikaciju patogena izoliranog iz pacijentovog materijala, kao i za otkrivanje antitijela na patogen u krvnom serumu pacijenta (na primjer, Wrightove i Heddlesonove reakcije za brucelozu, Widalovu reakciju za trbušni tifus i paratifusnu groznicu).
Najjednostavniji način za dijagnosticiranje RA je reakcija na staklu, ovo je približni RA, koji se koristi za određivanje patogena izolovanog od pacijenta. Kada se uspostavi reakcija, dijagnostički aglutinirajući serum se nanese na predmetno staklo (u razrjeđenju 1:10 ili 1:20), zatim se dodaje kultura pacijenta. Reakcija je pozitivna ako se u kapi pojavi flokulantni sediment. U blizini se postavlja kontrola: umjesto seruma nanosi se kap otopine natrijum hlorida. Ako dijagnostički aglutinirajući serum nije adsorbiran 1, onda se razrjeđuje (do titra - razrjeđenja do kojeg treba doći do aglutinacije), tj. stavite prošireni RA u epruvete sa povećanjem
1 Neadsorbirani aglutinirajući serum može aglutinirati srodne bakterije koje imaju zajedničke (unakrsne) antigene. Stoga koristeadsorbirani aglutinirajući serumi, iz kojih su ukrštena antitijela uklonjena adsorpcijom na srodne bakterije. Takvi serumi zadržavaju antitijela specifična samo za ovu bakteriju.
razrjeđenja aglutinirajućeg seruma, u koje se dodaju 2-3 kapi suspenzije patogena izoliranog od pacijenta. Aglutinacija se uzima u obzir količinom sedimenta i stepenom bistrenja tečnosti u epruvetama. Reakcija se smatra pozitivnom ako se primijeti aglutinacija u razrjeđenju bliskom titru dijagnostičkog seruma. Reakcija je praćena kontrolama: serum razrijeđen izotoničnim rastvorom natrijum hlorida treba da bude providan, suspenzija mikroba u istom rastvoru treba da bude jednolično zamućena, bez sedimenta.
Da bi se odredila antitijela na patogen u krvnom serumu pacijenta, koristi se RA u punom opsegu. Prilikom postavljanja, pacijentov krvni serum se razrjeđuje u epruvetama i u epruvete se dodaje jednaka količina suspenzije dijagnostikuma (suspenzije ubijenih mikroba). Nakon inkubacije određuje se najveće razrjeđenje seruma pri kojem je došlo do aglutinacije, tj. formiran je talog (titar seruma). U ovom slučaju, reakcija aglutinacije sa O-diagnosticumom (bakterije ubijene zagrijavanjem, zadržavajući termostabilni O-antigen) se javlja u obliku sitnozrnate aglutinacije. Reakcija aglutinacije sa H-diagnosticumom (bakterije ubijene formaldehidom, zadržavajući termolabilni flagelarni H-antigen) je gruba i teče brže.
Indirektna (pasivna) reakcija hemaglutinacije(RNGA ili RPGA) je vrsta RA. Ova metoda je vrlo osjetljiva. Uz pomoć RNGA mogu se riješiti dva problema: odrediti antitijela u krvnom serumu pacijenta, čemu se dodaje antigenski eritrocitni dijagnostikum, a to su eritrociti na kojima su adsorbirani poznati antigeni; utvrdi prisustvo antigena u test materijalu. U ovom slučaju, reakcija se ponekad naziva reakcija reverzne indirektne hemaglutinacije (RONHA). Tokom postupka testnom materijalu se dodaje eritrocitni dijagnostikum antitijela (eritrociti sa adsorbiranim antitijelima na njihovoj površini). U ovoj reakciji crvena krvna zrnca djeluju kao nosioci i pasivno su uključena u formiranje imunoloških agregata. Uz pozitivnu reakciju, pasivno zalijepljena crvena krvna zrnca prekrivaju dno rupe u ravnom sloju sa nazubljenim rubovima („kišobran“); u nedostatku aglutinacije, crvena krvna zrnca se akumuliraju u središnjem udubljenju rupe, tvoreći kompaktno "dugme" s oštro definiranim rubovima.
Reakcija koaglutinacije koristi se za određivanje ćelija patogena (antigena) korištenjem antitijela adsorbiranih na Staphylococcus aureus, koji sadrže protein A. Protein A ima afinitet za Fc fragment imunoglobulina. Zahvaljujući tome, antitijela se vezuju za stafilokok indirektno preko Fc fragmenta, a Fab fragmenti su orijentirani prema van i mogu stupiti u interakciju s odgovarajućim mikrobima izoliranim od pacijenata. U tom slučaju nastaju pahuljice.
Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HAI) koristi se u dijagnostici virusne infekcije i samo infekcije uzrokovane hemaglutinirajućim virusima. Ovi virusi na svojoj površini sadrže protein - hemaglutinin, koji je odgovoran za reakciju hemaglutinacije (HRA) kada se crvena krvna zrnca dodaju virusima. RTGA uključuje blokiranje virusnih antigena antitijelima, zbog čega virusi gube sposobnost aglutinacije crvenih krvnih stanica.
Coombsova reakcija - RA za određivanje nekompletnih antitijela. Kod nekih zaraznih bolesti, kao što je bruceloza, nepotpuna antitijela na patogen cirkuliraju u krvnom serumu pacijenta. Nepotpuna antitijela se nazivaju blokirajućim antitijelima jer imaju jedno mjesto vezanja antigena, a ne dva, kao punopravna antitijela. Stoga, kada se doda antigenski dijagnostikum, nekompletna antitijela se vežu za antigene, ali ih ne lijepe zajedno. Za ispoljavanje reakcije dodaje se antiglobulinski serum (antitijela na humane imunoglobuline), što će dovesti do aglutinacije imunih kompleksa (antigenski dijagnostikum + nepotpuna antitijela) nastalih u prvoj fazi reakcije.
Indirektna Coombsova reakcija se koristi kod pacijenata sa intravaskularnom hemolizom. Kod nekih od ovih pacijenata otkrivena su nepotpuna monovalentna anti-Rhesus antitijela. Oni specifično stupaju u interakciju s Rh-pozitivnim eritrocitima, ali ne uzrokuju njihovu aglutinaciju. Zbog toga se u sistem anti-Rh antitela + Rh-pozitivni eritrociti dodaje antiglobulinski serum, što izaziva aglutinaciju eritrocita. Za dijagnozu se koristi Coombsov test patološka stanja, povezana s intravaskularnom lizom eritrocita imunog porijekla, na primjer, hemolitička bolest novorođenčadi uzrokovana Rh konfliktom.
RA za određivanje krvnih grupa zasniva se na aglutinaciji eritrocita antitijelima imunološkog seruma na antigene krvne grupe A(II), B(III). Kontrola je serum koji ne sadrži antitijela, tj. serumske AB(IV) krvne grupe i eritrocitnih antigena grupa A(P) i B(III). Crvena krvna zrnca grupe 0(I) koriste se kao negativna kontrola jer nemaju antigene.
Za određivanje Rh faktora koriste se anti-Rh serumi (najmanje dvije različite serije). Ako na membrani ispitivanih eritrocita postoji Rh antigen, dolazi do aglutinacije ovih stanica.
13.3. Reakcija precipitacije
RP je imunološka reakcija interakcije antitijela sa antigenima u prisustvu elektrolita, a antigen je u rastvorljivom stanju. Tokom precipitacije, rastvorljivi antigeni se precipitiraju antitelima, što se manifestuje zamućenjem u obliku taložnih traka. Stvaranje vidljivog taloga se opaža kada se oba reagensa pomiješaju u ekvivalentnim omjerima. Višak jednog od njih smanjuje broj precipitiranih imunoloških kompleksa. Postoje različiti načini za izvođenje reakcije precipitacije.
Prstenasta reakcija precipitacije smeštene u taložne cevi malog prečnika. Imuni serum se dodaje u epruvetu i rastvorljivi antigen se pažljivo slojeva. Ako je rezultat pozitivan, na granici između dva rješenja formira se mliječni prsten. Reakcija prstenaste precipitacije, koja se koristi za određivanje prisustva antigena u organima i tkivima, čiji se ekstrakti kuhaju i filtriraju, naziva se reakcija termoprecipitacije (Ascolijeva reakcija za određivanje termostabilnog antigena antraksa).
Ouchterlony dvostruka imunodifuzijska reakcija. Ova reakcija se izvodi u agar gelu. U sloju gela ujednačene debljine, jažice se izrezuju na određenoj udaljenosti jedna od druge i pune antigenom, odnosno imunološkim serumom. Nakon toga, antigeni i antitijela difundiraju u gel, susreću se i formiraju imunološke komplekse, koji se talože u gelu i postaju vidljivi kao precizne linije.
ishrana. Ova reakcija se može koristiti za identifikaciju nepoznatih antigena ili antitela, kao i za testiranje sličnosti između različitih antigena: ako su antigeni identični, linije precipitacije se spajaju, ako antigeni nisu identični, linije precipitacije se ukrštaju, ako su antigeni delimično identično, formira se ostruga.
Radijalna imunodifuzijska reakcija. U rastopljeni agar gel se dodaju antitijela i gel se nanosi u ravnomjernom sloju na staklo. Jažice se izrezuju u gelu i u njih se dodaje standardni volumen otopina antigena različitih koncentracija. Tokom inkubacije, antigeni difundiraju radijalno iz bunara i, susrećući se s antitijelima, formiraju precipitacijski prsten. Sve dok višak antigena ostaje u bušotini, dolazi do postepenog povećanja prečnika precipitacionog prstena. Ova metoda se koristi za određivanje antigena ili antitijela u test otopini (na primjer, za određivanje koncentracije imunoglobulina različitih klasa u krvnom serumu).
Imunoelektroforeza. Smjesa antigena se prvo elektroforetski odvaja, a zatim se taložni antiserum dodaje u žlijeb koji ide u smjeru kretanja proteina. Antigeni i antitela difunduju u gel jedni prema drugima; u interakciji, formiraju lučne linije padavina.
Reakcija flokulacije(prema Ramonu) - vrsta precipitacijske reakcije koja se koristi za određivanje aktivnosti antitoksičnog seruma ili toksoida. Reakcija se izvodi u epruvetama. U epruveti u kojoj su toksoid i antitoksin u ekvivalentnom omjeru, uočava se zamućenost.
13.4. Reakcija fiksacije komplementa
Antitela, u interakciji sa odgovarajućim antigenom, vezuju dodat komplement (1. sistem). Indikator fiksacije komplementa su eritrociti senzibilizirani hemolitičkim serumom, tj. antitela na crvena krvna zrnca (2. sistem). Ako komplement nije fiksiran u 1. sistemu, tj. Ako ne dođe do reakcije antigen-antitijelo, senzibilizirana crvena krvna zrnca se potpuno liziraju (negativna reakcija). Kada se komplement fiksira imunim kompleksima 1. sistema nakon dodavanja senzibiliziranih eritrocita, dolazi do hemolize iz
odsutan (pozitivna reakcija). Reakcija fiksacije komplementa koristi se za dijagnosticiranje zaraznih bolesti (gonoreja, sifilis, gripa, itd.).
13.5. Reakcija neutralizacije
Mikrobi i njihovi toksini štetno djeluju na organe i tkiva ljudskog tijela. Antitijela su u stanju da se vežu za ove štetne agense i blokiraju ih, tj. neutralisati. Dijagnostička reakcija neutralizacije zasniva se na ovoj osobini antitijela. Provodi se unošenjem mješavine antigen-antitijelo u životinje ili u osjetljive test objekte (ćelijske kulture, embrije). Na primjer, da bi se otkrili toksini u materijalu pacijenta, životinjama 1. grupe se ubrizgava materijal od pacijenta. Životinjama 2. grupe ubrizgava se sličan materijal, prethodno tretiran odgovarajućim antiserumom. Životinje grupe 1 uginu ako postoji toksin u materijalu. Druga grupa životinja preživi, štetni učinak toksina se ne manifestira, jer je neutraliziran.
13.6. Reakcije koje koriste obilježena antitijela ili antigene
13.6.1. Reakcija imunofluorescencije (RIF, Koons metoda)
Ova metoda se koristi za ekspresnu dijagnostiku. Može se koristiti za otkrivanje i mikrobnih antigena i antitijela.
Direktna RIF metoda- imunološka reakcija interakcije antitela sa antigenima, a antitela su obeležena fluorohromom - supstancom koja je sposobna da emituje kvante svetlosti određene talasne dužine kada je izložena svetlosti određene talasne dužine. Posebnost ove metode je potreba za uklanjanjem neizreagiranih komponenti kako bi se isključila detekcija nespecifične luminiscencije. Da biste to učinili, isperite nereagirana antitijela. Rezultati se procjenjuju pomoću fluorescentnog mikroskopa. Bakterije u razmazu tretiranom takvim luminiscentnim serumom svijetle na tamnoj pozadini duž periferije ćelije.
Indirektna RIF metoda koristi se češće od prethodnog. Ova reakcija se odvija u dvije faze. U prvoj fazi, antigeni međusobno
stupaju u interakciju s odgovarajućim antitijelima, formirajući imune komplekse. Sve komponente koje nisu reagirale (tj. nisu dio imunoloških kompleksa) moraju se ukloniti pranjem. U drugoj fazi, nastali kompleks antigen-antitijelo se detektuje korištenjem fluorohromiziranog antiglobulinskog seruma. Kao rezultat, formira se kompleks mikroba + antimikrobna zečja antitijela + antitijela na zečje imunoglobuline, označena fluorohromom. Rezultati se procjenjuju pomoću fluorescentnog mikroskopa.
13.6.2. Metoda ili test enzimskog imunoeseja
ELISA - najčešći savremena metoda, koji se koristi za dijagnozu virusnih, bakterijskih, protozoalnih infekcija, posebno za dijagnozu HIV infekcije, virusni hepatitis i sl.
Postoji mnogo ELISA modifikacija. Nekompetitivna ELISA u čvrstoj fazi se široko koristi. Izvodi se u polistirenskim pločama sa 96 jažica (čvrsta faza). Prilikom izvođenja reakcije potrebno je u svakoj fazi isprati neizreagovane komponente. Prilikom određivanja antitijela, u jažice na kojima se sorbiraju antigeni dodaje se testni serum krvi, zatim enzimom obilježen antiglobulinski serum. Reakcija se izvodi dodavanjem supstrata za enzim. U prisustvu enzima, supstrat se menja, a kompleks enzim-supstrat se bira tako da se proizvod koji nastaje u reakciji oboji. Dakle, uz pozitivnu reakciju, uočava se promjena boje otopine. Za određivanje antigena, nosač u čvrstoj fazi se senzibilizira antitijelima, zatim se antigenima uzastopno dodaje test materijal (antigeni) i enzimski obilježeni serum. Da bi se reakcija odvijala, dodaje se supstrat za enzim. Promjena boje otopine javlja se pozitivnom reakcijom.
13.6.3. Imunobloting
Ova metoda se zasniva na kombinaciji elektroforeze i ELISA. Prilikom izvođenja imunoblotinga (blotiranje sa engleskog. mrlja- spot) složena mješavina antigena se prvo podvrgava elektroforezi u poliakrilamidnom gelu. Dobijeni frakcionisani anti-
genski peptidi se prenose na nitroceluloznu membranu. Mrlje se zatim tretiraju enzimima označenim antitijelima na specifični antigen, tj. izvršiti ELISA blot. Imunobloting se koristi u dijagnostici infekcija kao što je HIV.
13.6.4. Imunološka elektronska mikroskopija
Metoda se sastoji od mikroskopije u elektronski mikroskop virusi (rjeđe drugi mikrobi), prethodno tretirani odgovarajućim imunološkim serumom označenim elektronskim optički gustim preparatima, na primjer feritinom, proteinom koji sadrži željezo.
13.7. Protočna citometrija
Krvne ćelije se razlikuju na osnovu laserske citofluorometrije. Da bi se to postiglo, željene ćelije su obojene fluorescentnim monoklonskim antitelima na CD antigene. Uzorak krvi, nakon što je tretiran obilježenim antitijelima, prolazi kroz tanku cijev i kroz nju se propušta laserski snop koji pobuđuje fluorokrom da svijetli. Intenzitet fluorescencije je u korelaciji sa gustinom antigena na površini ćelije i može se kvantitativno meriti pomoću fotomultiplikatora. Dobijeni rezultati se pretvaraju u histogram.
Za određivanje se koristi protočna citometrija imunološki status(sadržaj glavnih populacija limfocita, sadržaj intracelularnih i ekstracelularnih citokina, funkcionalna aktivnost NK ćelija, aktivnost fagocitoze, itd.).
IMUNOMIKROBIOLOŠKE STUDIJE
Imunološke metode se koriste za rješavanje mnogih problema:
1. Procjena stanja imunološki sistem osobe (imuni status) određivanjem kvantitativnih i funkcionalne karakteristikećelije imunog sistema i njihovi proizvodi.
2. Određivanje sastava i karakteristika ljudskih tkiva: krvne grupe, Rh faktor, transplantacijski antigeni.
3. Dijagnoza infektivnih bolesti i rezistencije na njih otkrivanjem i utvrđivanjem titra antitela (serodijagnostika), identifikacijom antigena patogena u organizmu i određivanjem ćelijskih reakcija na te antigene.
4. Seroidna identifikacija kultura bakterija i virusa izoliranih iz tijela ljudi i životinja.
5. Detekcija u ljudskom tijelu i u spoljašnje okruženje sve supstance sa antigenskim ili haptenskim svojstvima (hormoni, enzimi, otrovi, lekovi, lekovi itd.).
6. Identifikacija imunopatoloških stanja, alergija, transplantacijskih i antitumorskih reakcija.
Proces interakcije između antigena i antitijela serološke reakcije odvija se u dvije faze:
1) specifično- faza interakcije u kojoj se javlja komplementarna kombinacija aktivnih centara antitijela (paratopa) i epitopa antigena. Obično ova faza traje nekoliko sekundi ili minuta;
2) nespecifičan- faza manifestacije, okarakterisana spoljni znaci formiranje imunoloških kompleksa. Ova faza se može razviti od nekoliko minuta do nekoliko sati.
Optimalna specifična interakcija antitijela sa antigenom javlja se u izotoničnom rastvoru sa pH blizu neutralnog. Reakcija antigen-antitijelo u in vitro sistemu može biti praćena pojavom nekoliko fenomena
· aglutinacija,
· padavine,
· liza.
Spoljne manifestacije reakcije zavise od fizičko-hemijskih svojstava antigena (veličina čestica, fizičko stanje), klasa i vrsta antitela (potpuna i nepotpuna), kao i eksperimentalni uslovi (srednja konzistencija, koncentracija soli, pH, temperatura).
Polivalentnost antigena i antitijela osigurava stvaranje agregata vidljivih golim okom. To se događa u skladu s teorijom formiranja mreže, prema kojoj su druga antitijela i molekuli antigena sekvencijalno vezani za rezultirajući kompleks antigen-antitijelo. Kao rezultat, formiraju se mrežne strukture koje se pretvaraju u agregate koji se talože. Priroda i težina reakcije zavise od kvantitativnog omjera antigena i antitijela. Najintenzivnije reakcije se javljaju kada su reagensi u ekvivalentnim proporcijama.
Preduvjet formiranje rešetke (mreže) - prisustvo više od tri antigenske determinante za svaki molekul antigena i dva aktivna centra za svaki molekul antitijela. Molekuli antigena su rešetkasti čvorovi, a molekuli antitela su veze. Područje optimalnih omjera (zona ekvivalencije) koncentracija antigena i antitijela, kada se u supernatantu nakon formiranja sedimenta ne otkrivaju ni slobodni antigeni ni slobodna antitijela.
Agregati koji mogu precipitirati nastaju kada se antigeni kombinuju sa punim antitijelima. Nepotpuna antitijela (monovalentna) ne uzrokuju stvaranje mrežnih struktura i velikih agregata. Da biste otkrili takva antitijela, koristite posebne metode baziran na upotrebi antiglobulina (Coombsova reakcija).
Serološki testovi se zbog svoje visoke specifičnosti i osjetljivosti koriste za otkrivanje i kvantifikacija antigena i antitela. Količina imunoreagensa u reakcijama izražava se titrom - maksimalnim razrjeđenjem seruma ili antigena pri kojem se reakcija još uvijek opaža.
Serološke reakcije u mikrobiološkim i imunološkim laboratorijama koriste se u dvije svrhe:
1) za seroidifikaciju mikroorganizama, toksina, antigena uopšte pomoću poznatog antitela (imuno dijagnostički serum),
2) za serodijagnostiku - utvrđivanje prirode antitijela u krvnom serumu pacijenta za bakterijske, virusne i rjeđe druge zarazne bolesti pomoću poznatog antigena (diagnosticum).
Da bi se odredio generički, vrsta i tip antigena, potrebni su poznati imunološki dijagnostički serumi. Dobivaju se ponovnim davanjem životinjama (obično zečevima) u sve većim dozama ubijenih ili živih mikroorganizama, produkata njihovog raspadanja, neutraliziranih ili nativnih toksina. Nakon određenog ciklusa imunizacije životinja, vrši se masovno puštanje krvi ili totalno krvarenje životinje. Krv prikupljena u sterilnu posudu prvo se stavlja u termostat na temperaturi od 37°C na 4 - 6 sati kako bi se ubrzalo zgrušavanje, a zatim u ledenicu na jedan dan. Dobijeni prozirni serum usisava se u sterilnu posudu, dodaju se konzervansi, određuje se titar antitijela, provjerava sterilnost i sipa u ampule.
Koriste se neadsorbovan I adsorbovan dijagnostički serumi. Neadsorbirani serumi imaju visoki titri antitijela, ali su sposobna da daju grupne (unakrsne) reakcije.
Adsorbirani serumi se odlikuju strogom specifičnošću djelovanja (reaguju samo sa homolognim antigenom). Zovu se serumi koji sadrže antitijela samo na jedan specifični antigen monoreceptor.
Oni također proizvode serume označene fluorohromima, enzimima i radioizotopima, koji omogućavaju da se čak i tragovi antigena detektuju sa visokim stepenom tačnosti.
Kao antigeni (dijagnostikumi) u serološkim reakcijama koriste se suspenzije živih ili ubijenih bakterija, produkti njihovog razgradnje, toksini i virusi. U nekim slučajevima se koriste ekstrakti ili hemijski izolovani antigeni iz mikroorganizama i životinjskih tkiva.
Sve imunomikrobiološke metode mogu se podijeliti u 3 grupe:
1) na osnovu direktna interakcija antigena sa antitijelom(fenomeni aglutinacije, precipitacije, hemaglutinacije, imobilizacije, itd.);
2) na osnovu posredovana interakcija antigena sa antitijelom(reakcije indirektna hemaglutinacija, koaglutinacija, lateks aglutinacija, aglomeracija ugljika, aglutinacija bentonita, fiksacija komplementa, itd.);
3) korišćenje obeležena antitela ili antigeni(metoda fluorescentnih antitijela, enzimski imunosorbentni i radioimuni testovi i druge metode).
REAKCIJE AGLUTINACIJE
Ove reakcije uključuju antigene u obliku čestica (mikrobne ćelije, crvena krvna zrnca i drugi korpuskularni antigeni), koje se spajaju antitijelima i talože.
Za izvođenje reakcije aglutinacije(RA) potrebne su tri komponente: 1) antigen (aglutinogen);
2) antitelo (aglutinin)
3) elektrolit (izotonični rastvor natrijum hlorida).
Približna reakcija aglutinacije (RA)
Indikativni ili pločasti RA se stavlja na stakalnu pločicu na sobnoj temperaturi. Da biste to učinili, pomoću Pasteurove pipete nanesite kap seruma u razrjeđenju od 1:10 do 1:20 i kontrolnu kap izotonične otopine natrijum hlorida odvojeno na staklo. Kolonije ili dnevna kultura bakterija (kap dijagnostikuma) unose se u obje bakteriološke petlje i temeljito se miješaju. Reakcije se uzimaju u obzir vizuelno nakon nekoliko minuta, ponekad pomoću lupe (x5). Kod pozitivnog RA uočava se pojava velikih i malih pahuljica u kapi seruma sa negativnim RA, serum ostaje jednolično zamućen.
Detaljna reakcija aglutinacije kako bi se utvrdio titar specifičnih antitijela kod pacijenta.
Potpuni RA za serodijagnostiku se pravi u serumu pacijenata. Takođe se razblažuje u izotoničnom rastvoru natrijum hlorida od 1:50 - 1:100 do 1:800 ili 1:1600. Budući da niži titri seruma mogu sadržavati normalne aglutinine koji se nalaze u zdravi ljudi ili pacijenti sa drugom dijagnozom (dijagnostički titar). Kao antigen u ovoj reakciji koriste se dijagnostikumi - poznate suspenzije, najčešće ubijenih bakterija.
U epruvete za aglutinaciju prvo se sipa 1 ml izotonične otopine natrijum hlorida. Prvom se dodaje 1 ml seruma razrijeđenog 1:100, a nakon miješanja 1 ml se prebacuje u drugi, iz drugog u treći itd. 1-2 kapi bakterijske suspenzije koja sadrži 3 milijarde mikrobnih tijela u 1 ml dodaju se u rezultirajuća dvostruka razrjeđenja seruma (od 1:100 do 1:1600 ili više). Epruvete se protresu i stave u termostat na 37°C 2 sata, a zatim drže na sobnoj temperaturi 24 sata.
Detaljna reakcija aglutinacije se uzima u obzir tako što se svaka epruveta procjenjuje uzastopno, počevši od kontrolnih, uz lagano protresanje. U kontrolnim epruvetama ne bi trebalo biti aglutinacije. Intenzitet reakcije aglutinacije označen je sljedećim znacima: ++++ - potpuna aglutinacija (aglutinirajuće pahuljice u apsolutno providnoj tekućini); +++ - nepotpuna aglutinacija (ljuspice u blago opalescentnoj tečnosti); ++ - djelomična aglutinacija (ljuspice su jasno vidljive, tečnost je blago zamućena); + - slaba, upitna aglutinacija - tečnost je vrlo zamućena, pahuljice u njoj se slabo razlikuju; - - odsustvo aglutinacije (tečnost je jednolično zamućena).
Titar seruma se uzima kao njegovo posljednje razrjeđenje, u kojem se intenzitet aglutinacije procjenjuje kao najmanje dva plusa (++)
Reakcija aglutinacije Reakcija aglutinacije
(RA) je metoda za identifikaciju i kvantifikaciju Ag i Ab, zasnovanu na njihovoj sposobnosti da formiraju aglomerate vidljive golim okom. Na odjelu za infektivne bolesti. bolesti ili u druge svrhe koristi se za identifikaciju nepoznatih mikroba i ćelija, za određivanje prisustva i količine Ab u krvi i drugim tečnostima. Princip određivanja zasniva se na specifičnosti interakcije između Ag i Ab i sastoji se u pronalaženju poznatog od nepoznatog. Postoji mnogo opcija za RA: kvantitativne i kvalitativne, epruvete i stakla, volumetrijske i kapljične, konvencionalne, ubrzane i ekspresne metode. Za stadijum RA potrebno vam je: 1) s-ka krv. U varijanti sa određivanjem vrste (var) bakterija koriste se industrijski testovi aglutinacije, proizvedeni imunizacijom zečeva. U varijanti sa određivanjem tipa Ab, iz testa se uzima uzorak krvi. ljudi ili životinje. Rastvor mora biti sterilan i bez suspendiranih čestica. Pripremite osnovno razrjeđenje u fiziološkom rastvoru. Trebao bi biti 2-4 puta manji od dijagnostičkog titra za ovu bolest; 2) Ag. U verziji reakcije sa određivanjem Ab tipa koriste se industrijski dijagnostički kompleti; u varijanti sa određivanjem Ag dijagnostikumi se sami pripremaju u obliku suspenzije od 1-3 milijarde u fiziološkom rastvoru 18-20-satnog agar (rjeđe bujon) testa. mikrob inaktiviran zagrijavanjem u vodenom kupatilu na 70°C u trajanju od 1 sata ili 24-satnom inkubacijom na 37°C sa formaldehidom (konačna koncentracija 0,2%); 3) elektrolita u obliku fiziološke otopine. Tehnika inscenacije volumetrijska serijska cijev RA za određivanje Ab titra u s-ki: nekoliko redova radnih razblaženja priprema se od glavnog razblaženja s-ki. Broj redova zavisi od broja dijagnostikuma uzetih u eksperiment. Broj i faktori razblaženja određuju se prema dijagnostičkom titru sumnjive bolesti. Serija mora sadržavati najmanje razrjeđenje koje odgovara dijagnostičkom Ab titru, dva razrjeđenja ispod i dva razrjeđenja iznad. na primjer, ako je dijagnostički titar 1:100, tada se volumetrijskom metodom stadijuma RA pripremaju sljedeća razrjeđenja: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; sa drip metodom, prvo razrjeđivanje (1:25) nije potrebno, ali je potrebno drugo veće razrjeđivanje - 1:800 B. naučno istraživanje s-ku se titrira na negativnu reakciju. Razrjeđuje se na sljedeći način: 0,25 ml fiziološkog rastvora se sipa u sve epruvete, osim u prvu, kada se reakcija izvodi u zapremini od 0,5 ml, i 0,5 ml kada se reakcija izvodi u zapremini od 1. ml. Sipati 0,25 (0,5) ml glavnog razblaženja u 1. i 2. epruvetu, iz 2. epruvete, u izrezanu zapreminu i uzgoj s-k i povećana 2 puta, 0,25 (0,5) ml se prenosi u 3., sa 3. na 4. itd. do zadnjeg, od reza se u sve ulije 0,25 (0,5) ml kako bi se izbalansirale zapremine. Svako razrjeđivanje se provodi pomoću posebne pipete. Ako se u eksperiment uzme više dijagnostikuma, onda se za svaki od njih na isti način priprema vlastita serija razrjeđenja. U svako razrjeđenje epruvete dodaje se Diagnosticum u zapremini jednakoj zapremini epruvete, zbog čega se razrjeđenje u svakoj epruveti udvostručuje. Eksperiment odgovara s-ki kontroli (0,25 - 0,5 ml glavnog razblaženja s-ki i ista količina fiziološkog rastvora) i Ag kontroli (0,25 - 0,5 ml dijagnostikuma i ista količina fiziološkog rastvora). Ako se u eksperimentu koristi više dijagnostikuma, onda svaki ima svoju kontrolu antigena. Stalak sa epruvetama se dobro protrese i stavi u termostat na 37°C 4 sata, a zatim ostavi na sobnoj temperaturi do sledećeg dana, nakon čega se beleži PA na osnovu količine sedimenta i stepena pročišćenosti. tečnost. Određivanje ovih indikatora, ovisno o prirodi aglutinata, provodi se golim okom na tamnoj pozadini, u aglutinoskopu ili preko konkavne površine ogledala mikroskopa. Obračun počinje kontrolama: kontrola C treba da bude providna, Ag treba da bude jednolično zamućen (nakon protresanja epruvete). Ako su kontrole dobre, utvrditi prisustvo i stepen aglutinacije u svim epruvetama, koje su označene plusovima: veliki sediment i potpuno čišćenje tečnosti - 4 plusa; veliki talog i nepotpuno čišćenje tečnosti -3 plusa; primjetan sediment i primjetno pročišćavanje tekućine su 2 plusa. Nakon toga se određuje titar: najveće razrjeđenje s intenzitetom aglutinacije od najmanje 2 plusa. Istraživanje titra s-ki se upoređuju sa dijagnostičkim titrom za ovu bolest. Ako se ispituje titar. s-ki je 2 puta niži od dijagnostičke vrijednosti, reakcija se procjenjuje kao sumnjiva; ako je titar jednak dijagnostika - kako slabo pozitivan; ako je 2-4 puta veći, smatra se pozitivnim ako je 8 ili više puta veći, smatra se oštro pozitivnim. Kada je Ab široko rasprostranjen kod zdravih ljudi, povećanje titra Ab se koristi za procjenu RA. Da bi se odredio tip Ar u serijskom RA, broj redova mora odgovarati broju uzetom za identifikaciju dijagnostičkih testova. Od glavnog razblaženja dijagnostičkog testa, priprema se serija uzastopnih dvostrukih razblaženja na isti način kao kod RA da bi se odredio Ab titar. Faktori razblaženja zavise od titra aglutinacionog testa. U eksperimentu je neophodno prisustvo razblaženja jednakog titru testa, kao i 2, 4, 6, 8 puta nižeg od njega titar dijagnostičkog testa je 1 3200, tada treba koristiti razrjeđenja 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 Ista zapremina testiranog Ag se dodaje u razrjeđenja testa, kao rezultat toga, razrjeđenje test se povećava za 2 puta, a eksperimentu se dodaju 2 kontrole u termostatu na 37°C. Rezultati se uzimaju u obzir kako je gore opisano. Ag uzet u eksperiment, titar reakcije mora odgovarati najmanje polovini titra standardnog dijagnostičkog testa Drip md Stadiranje RA razlikuje se od volumetrijskog po tome što se s-ku razblaži u zapremini od 1 ml, a Ag se koristi u višoj koncentraciji (10 milijardi/ml) i dodaje se 1 po jedan - 2 kapi u epruvetu Razblaživanje leka nakon dodavanja Ag smatra se nepromenjenim. Inače, metoda formulacije, snimanja i evaluacije je slična volumetrijskoj metodi
(Izvor: Rječnik mikrobioloških pojmova)
Reakcija aglutinacije.
Reakcija aglutinacije je sljepljivanje i taloženje mikrobnih ili drugih stanica (eritrocita) pod utjecajem antitijela u prisustvu elektrolita. Vidljivi efekat reakcije (fenomen aglutinacije) je stvaranje taloga koji se naziva aglutinat.
Ova reakcija se koristi za serodijagnostika I seroididentifikacija. RA se koristi za serodijagnostiku (otkrivanje antitijela u krvnom serumu pacijenata) tifusne groznice i paratifus(Vidal reakcija), bruceloza(Wrightova reakcija) tularemija i leptospiroza. RA se koristi za seroidifikaciju (određivanje vrste patogena izolovanog od pacijenta) kada crijevne infekcije, veliki kašalj, kolera i sl.
Komponentereakcije:
1. A ntigen (aglutinogen) – to su cijele (ne uništene) mikrobne ili druge ćelije ( korpuskularno, nerastvorljivi antigen). Aglutinogeni- ovo je suspenzija živ ili ubijen mikrobne ćelije ili bilo koje druge ćelije. Antigeni mogu biti nepoznati ili poznati. Nepoznati aglutinogen je mikrobna kultura izolirana iz tijela pacijenta koju treba odrediti. Poznati antigen – diagnosticum– dijagnostički lijek – suspenzija mrtvih mikrobi poznate vrste u fiziološkom rastvoru. Ova suspenzija oblačno (providno), jer mikrobne ćelije se ne rastvaraju, već ostaju netaknute. Poznati aglutinogen će se koristiti za otkrivanje nepoznatih antitijela u krvnom serumu pacijenata.
2. Antitijelo (aglutinin)– nalazi se u krvnom serumu. Antitijela također mogu biti nepoznata ili poznata. U krvnom serumu nalaze se nepoznata antitijela koja treba odrediti bolesna osoba. Poznata antitela se nalaze u imun dijagnostičkih seruma koji se zovu aglutinirajući serumi. Koriste se za seroidentifikaciju, tj. za određivanje nepoznatog antigena – vrste mikrobne kulture.
3. Elektrolit– 0,9% rastvor natrijum hlorida.
Metode stadijuma RA.
1. Približni (lamelarni) RA– izvedeno na staklu. Nanesite 2 kapi seruma i 1 kap izotonične otopine na predmetno staklo. Mikrobna kultura se unosi u jednu od kapi seruma i u kapi izotonične otopine u petlji i miješa. Kap izotonične otopine sa klicama – kontrola antigena, kap serumi bez klica – kontrola antitela, kap serumi sa mikrobima – iskustvo. Ako serum sadrži antitijela koja odgovaraju mikrobnim antigenima koji se miješaju s njim, tada će se antitijela i antigeni specifično vezati jedni za druge i nakon 1-3 minute aglutinirajuće pahuljice će se pojaviti u test kapi. Kontrola antigena treba da bude mutna, a kontrola antitela bistra. Rezultati reakcije se bilježe na osnovu pojave aglutinatnih pahuljica . Ako ispadnu pahuljice, reakcija je pozitivna, tj. Antigen odgovara antitelu i antigen se može koristiti za određivanje antitela ili obrnuto. Ako zamućenost ostane, reakcija je negativna.
2. Detaljna reakcija aglutinacije - izvedeno u epruvetama. Prvo pripremite 2-struka razrjeđenja krvnog seruma bolesne osobe od 1:50 do 1:1600. 1 ml izotonične otopine natrijum hlorida se sipa u 6 epruveta. U prvu epruvetu se dodaje 1 ml pacijentovog krvnog seruma u razrjeđenju 1:50, miješa se i dobije se razrjeđenje 1:100, a zatim se 1 ml razrijeđenog 1:100 prenosi u drugu epruvetu. i dobije se razrjeđenje 1:200 itd. Za kontrolu antigena i seruma čuvaju se dvije epruvete. U kontrolu seruma dodajte samo serum u razrjeđenju 1:50, u kontrolu antigena - samo antigen. Dodati 0,1 ml antigena - diagnosticuma (O- ili H-) u sve ostale epruvete i staviti sve epruvete u termostat na 37°C na 18-20 sati. Rezultati reakcije se bilježe prema prirodi, količini nastalog taloga (aglutinata) i stepenu zamućenosti. Obračun se vrši samo sa sljedećim rezultatima u kontrolama: kontrola seruma - providna, kontrola antigena - zamućena. O-antitijela daju fino zrnati precipitat. H-antitijela – krupno zrnasta. Na osnovu posljednje epruvete u kojoj je reakcija aglutinacije još uvijek vidljiva, utvrđuje se dijagnostički titar.
Prilikom serodijagnostike bolesti važno je ne samo otkriti specifična antitijela na određeni patogen, već i identificirati njihovu količinu, tj. ustanoviti titar antitijela tako da možemo govoriti o prisutnosti bolesti uzrokovane ovim patogenom. Ovaj titar se naziva dijagnostički titar. Na primjer, da biste dijagnosticirali trbušni tifus, morate identificirati titar antitijela 1:400, ali ne manji. Još precizniji rezultati se dobijaju detekcijom porasta antitela u parnim serumima. Ako se titar antitijela poveća najmanje 4 puta, dakle, možemo govoriti o trenutnoj bolesti.
