Nepřímá (pasivní) hemaglutinační reakce (IRHA) je založena na tom, že červené krvinky, pokud je na jejich povrchu adsorbován rozpustný antigen, získávají schopnost aglutinace při interakci s protilátkami proti adsorbovanému antigenu. Schéma RNGA je na Obr. 34. RNGA se široce používá při diagnostice řady infekcí.
Rýže. 34. Schéma pasivní hemaglutinační reakce (RPHA). A - získání diagnostického erytrocytu: B - RPGA: 1 - erytrocyt: 2 - zkoumaný antigen; 3 - diagnostika erytrocytů; 4 - protilátka ke studovanému antigenu: 5 - aglutinovat
Nastavení reakce. Testované sérum se zahřeje po dobu 30 minut na 56 °C, zředí se postupně v poměru 1:10 - 1:1280 a nalije se do 0,25 ml do zkumavek nebo jamek, kde se nakapají 2 kapky erytrocytárního diagnosticum (erytrocyty s adsorbovaným antigenem ) jsou poté přidány.
Kontroly: suspenze erytrocytárního diagnostica se známým imunitním sérem; suspenze diagnostika normálním sérem; suspenze normálních červených krvinek s testovacím sérem. V první kontrole by mělo dojít k aglutinaci, ve druhé a třetí by k ní nemělo dojít.
Pomocí RIGA můžete detekovat neznámý antigen, pokud jsou známé protilátky adsorbovány na červené krvinky.
Hemaglutinační reakci lze provést v objemu 0,025 ml (mikrometoda) za použití mikrotitrátoru Takachi.
1. Co ukazuje pozitivní výsledek rentgenové analýzy mezi červenými krvinkami a materiálem, který je testován na přítomnost viru?
2. Dojde k aglutinaci červených krvinek, pokud se k nim přidá virus a jemu odpovídající sérum? Jak se nazývá reakce, která tento jev odhaluje?
Cvičení
Vezměte v úvahu a zaregistrujte výsledek RIGA.
Srážková reakce
Při precipitační reakci dochází k vysrážení specifického imunitního komplexu skládajícího se z rozpustného antigenu (lyzátu, extraktu, haptenu) a specifické protilátky za přítomnosti elektrolytů.
Zakalený prstenec nebo sraženina vzniklá v důsledku této reakce se nazývá sraženina. Tato reakce se od aglutinační reakce liší především velikostí částic antigenu.
Precipitační reakce se obvykle používá ke stanovení antigenu při diagnostice řady infekcí ( antrax meningitida atd.); v soudním lékařství - určit druh krve, spermatu atd.; v sanitárních a hygienických studiích - při zjišťování padělání výrobků; s jeho pomocí se zjišťuje fylogenetický vztah živočichů a rostlin. Pro reakci potřebujete:
1. Protilátky (precipitiny) - imunitní sérum s vysokým titrem protilátek (ne nižším než 1:100 000). Titr precipitujícího séra je určen nejvyšším ředěním antigenu, se kterým reaguje. Sérum se obvykle používá neředěné nebo v ředění 1:5 - 1:10.
2. Antigen - rozpuštěné látky proteinové nebo lipoidní polysacharidové povahy (plné antigeny a hapteny).
3. Izotonický roztok.
Hlavní metody pro provedení srážecí reakce jsou: kruhová srážecí reakce a srážecí reakce na agaru (gelu).
Pozornost! Všechny složky podílející se na srážecí reakci musí být zcela průhledné.
Reakce srážení kruhu. Pomocí Pasteurovy pipety přidejte 0,2-0,3 ml (5-6 kapek) séra do precipitační zkumavky (sérum by se nemělo dostat na stěny zkumavky). Antigen ve stejném objemu se opatrně navrství na sérum a nalije ho tenkou Pasteurovou pipetou podél stěny zkumavky. Zkumavka se udržuje v nakloněné poloze. Při správném vrstvení by měla být jasná hranice mezi sérem a antigenem. Opatrně, aby nedošlo k promísení kapaliny, umístěte zkumavku do stojanu. Pokud je reakce pozitivní, na rozhraní antigenu a protilátky se vytvoří zakalený „prstenec“ - sraženina (viz obr. 48).
Reakce je doprovázena řadou kontrol (tabulka 18). Pořadí přidávání reakčních složek do zkumavky je velmi důležité. Na antigen nelze navrstvit sérum (v kontrole - na izotonický roztok), protože relativní hustota séra je větší, klesne na dno zkumavky a hranice mezi kapalinami nebude odhalena.
Tabulka 18. Schéma pro nastavení reakce srážení kruhu
Poznámka. + přítomnost „kroužku“; - nepřítomnost „kroužku“.
Výsledky se zaznamenávají po 5-30 minutách, v některých případech po hodině, jako vždy počínaje kontrolami. „Kruh“ ve 2. zkumavce označuje schopnost imunitního séra vstoupit dovnitř specifická reakce s odpovídajícím antigenem. Ve 3-5 zkumavkách by neměly být žádné „kroužky“ - neexistují žádné navzájem odpovídající protilátky a antigeny. „Kružek“ v 1. zkumavce – výsledek pozitivní reakce – značí, že testovací antigen odpovídá odebranému imunitnímu séru, nepřítomnost „kroužku“ („kroužek“ pouze ve 2. zkumavce) ukazuje na jejich nekonzistenci – negativní výsledek reakce.
Srážecí reakce v agaru (gelu). Zvláštností reakce je, že k interakci antigenu a protilátky dochází v hustém médiu, tj. v gelu. Výsledná sraženina vytváří zakalený pruh v tloušťce média. Absence proužku ukazuje na nesrovnalost mezi reakčními složkami. Tato reakce je široce používána v biomedicínském výzkumu, zejména při studiu tvorby toxinu u původce záškrtu.
Kontrolní otázky
1. Jaký je hlavní rozdíl mezi aglutinační a precipitační reakcí?
2. Proč nelze při srážecí reakci použít zakalené přísady?
Cvičení
1. Nastavte reakci srážení prstence a načrtněte výsledek.
2. Prostudujte si povahu interakce antigenu s protilátkou při precipitační reakci v agaru, načrtněte výsledek (pořiďte si kelímek od učitele).
Lytická reakce (imunitní cytolýza)
Imunitní lýza je rozpouštění buněk pod vlivem protilátek při povinná účast doplněk. Pro reakci potřebujete:
1. Antigen - mikroby, červené krvinky nebo jiné buňky.
2. Protilátka (lysin) - imunitní sérum, méně často pacientské sérum. Bakteriolytické sérum obsahuje protilátky podílející se na lýze bakterií; hemolytické - hemolyziny, které podporují lýzu červených krvinek; pro lýzu spirochet jsou potřeba spirochetolysiny, buňky - itolysiny atp.
3. Doplňovat. Nejvíce se doplňuje v séru morčata. Toto sérum (směs z několika zvířat) se obvykle používá jako doplněk. Čerstvý (nativní) doplněk je nestabilní a snadno se zničí zahříváním, protřepáváním nebo skladováním, takže jej nelze použít déle než dva dny po obdržení. Pro zachování komplementu se k němu přidávají 2 %. kyselina boritá a 3% síran sodný. Tento doplněk lze skladovat při teplotě 4 °C po dobu až dvou týdnů. Nejčastěji se používá suchý komplement. Před použitím se rozpustí v izotonickém roztoku na původní objem (uvedený na etiketě).
4. Izotonický roztok.
Hemolýzní reakce(Tabulka 19). Pro reakci potřebujete:
1. Antigen - 3% suspenze promytých ovčích erytrocytů v poměru 0,3 ml sedimentu erytrocytů a 9,7 ml izotonického roztoku.
2. Protilátka - hemolytické sérum (hemolyzin) proti ovčím erytrocytům; obvykle připravené ve výrobě, lyofilizované a titr uvedený na štítku.
Titr hemolyzinu je nejvyšší ředění séra, při kterém dochází k úplné hemolýze 3% suspenze červených krvinek v přítomnosti komplementu. Pro hemolytickou reakci se hemolyzin odebírá v trojitém titru, tj. zředěný 3krát méně než před titrem. Například při sérovém titru 1:1200 se sérum ředí 1:400 (0,1 ml séra* a 39,9 ml izotonického roztoku). Nadbytek hemolyzinu je nezbytný, protože část z něj může být adsorbována jinými reakčními složkami.
* (Neměli byste brát méně než 0,1 ml séra – utrpí tím přesnost měření.)
3. Komplement se zředí 1:10 (0,2 ml komplementu a 1,8 ml izotonického roztoku).
4. Izotonický roztok.
Tabulka 19. Schéma hemolytické reakce
Účtování výsledků. Při správném provedení reakce dojde v 1. zkumavce k hemolýze – její obsah zprůhlední. V kontrolách zůstává kapalina zakalená: ve 2. zkumavce není dostatek komplementu, aby došlo k hemolýze, ve 3. zkumavce není hemolyzin, ve 4. zkumavce není hemolyzin ani komplement, v 5. zkumavce antigen ano. neodpovídají protilátkám,
V případě potřeby se hemolytické sérum titruje dle následující schéma(Tabulka 20).
Před titrací připravte počáteční ředění séra 1:100 (0,1 ml séra a 9,9 ml izotonického roztoku), ze kterého potřebná ředění, Například:
Z těchto ředění přidejte 0,5 ml séra do titračních zkumavek, jak je uvedeno v tabulce. 20.
Tabulka 20. Titrační schéma pro hemolytické sérum (hemolyzin)
V příkladu uvedeném v tabulce. 20, titr hemolytického séra je 1:1200.
Při použití čerstvého hemolytického séra musí být inaktivováno, aby se zničil komplement v něm přítomný. K tomu se zahřívá 30 minut na 56 °C ve vodní lázni nebo v inaktivátoru s termostatem. Druhý způsob je lepší: eliminuje možnost přehřátí syrovátky, tedy její denaturaci. Denaturovaná séra jsou pro testování nevhodná.
Bakteriolýzní reakce. Při této reakci komplement lyžuje bakterie v přítomnosti vhodného (homologního) séra. Reakční schéma je v zásadě podobné schématu hemolytické reakce. Rozdíl je v tom, že po dvouhodinové inkubaci se všechny zkumavky naočkují na Petriho misky s prostředím příznivým pro mikroorganismus odebraný do experimentu, aby se zjistilo, zda je lyžován. Pokud je experiment proveden správně, měly by kultury ze 2-5 zkumavek (kontrol) vykazovat bohatý růst. Nedostatek růstu nebo slabý růst v inokulaci z 1. zkumavky (experimentu) indikuje smrt mikrobů, tj. že jsou homologní s protilátkou.
Pozornost! Bakteriolytická reakce musí být provedena za aseptických podmínek.
Kontrolní otázky
1. Co se stane s červenými krvinkami, když se místo izotonického roztoku chloridu sodného použije destilovaná voda? Co je základem tohoto jevu?
2. K jaké reakci dojde, když erytrocyty interagují s homologním imunitním sérem v nepřítomnosti komplementu?
Cvičení
Nastavte hemolytickou reakci. Výsledek zaznamenejte a načrtněte.
Související informace.
Používá červené krvinky nebo neutrální syntetické materiály(například latexové částice), na jejichž povrchu se sorbují antigeny (bakteriální, virové, tkáňové) nebo protilátky. K jejich aglutinaci dochází po přidání vhodných sér nebo antigenů. Červené krvinky senzibilizované antigeny se nazývají antigenní erytrocytární diagnosticum a používají se k detekci a titraci protilátek. Erytrocyty senzibilizované protilátkami. se nazývají imunoglobulinové erytrocytární diagnosticum a používají se k identifikaci antigenů.
Pasivní hemaglutinační reakce se používá k diagnostice onemocnění způsobených bakteriemi (tyfus a paratyfus, úplavice, brucelóza, mor, cholera atd.), prvoky (malárie) a viry (chřipka, adenovirové infekce, virová hepatitida B, spalničky, klíšťová encefalitida, krymská hemoragická horečka atd.), jakož i pro stanovení některých hormonů, identifikaci přecitlivělost trpělivý léky a hormony, jako je penicilin a inzulín.
Pasivní hemaglutinační reakce (RPHA). Pasivní hemaglutinační test je citlivá metoda sérologické diagnostiky a používá se jak pro časnou a retrospektivní diagnostiku, tak i pro stanovení imunopogického stavu očkovaných osob. U pacientů s tularémií jsou protilátky detekovány obvykle na konci 1. nebo 2. týdne onemocnění, po 1-1,5 měsíci dosahují titry RPHA maximální výkon(1:100000-1:20000, výjimečně vyšší), načež klesají a zůstávají dlouho na úrovni 1:100-1:200.
U očkovaných osob jsou protilátky také trvale detekovány, avšak v nižších titrech, nepřesahujících 1:2000-1:5000 1-1,5 měsíce po očkování, a zůstávají několik let na nízké úrovni 1:20-1:80.
Antigen pro staging RPHA je tularemia erythrocyte diagnosticum (antigenní). Lékem jsou formalinizované ovčí červené krvinky, senzibilizované antigenem tularemie, dostupné v tekuté a suché formě. Tekutý přípravek - 10% suspenze červených krvinek v roztoku formaldehydu o 10% koncentraci. Suchý lyofilizovaný přípravek je vakuově sušená 10% suspenze červených krvinek bez konzervantů. Před použitím se ředí podle pokynů na etiketě. Pro nastavení reakce v polystyrenových deskách se obě léčiva používají v koncentraci 2,5% a při nastavení reakce v mikroobjemech - v koncentraci 0,5%.
Technika pro nastavení RPGA. Testovaná séra se zředí fyziologickým roztokem 1:5 (1:10) a zahřejí se na 56 °C po dobu 30 minut. Poté, aby se odstranily heterogenní protilátky proti ovčím erytrocytům, jsou séra ošetřena 50% suspenzí formalinizovaných ovčích erytrocytů. K tomu přidejte červené krvinky rychlostí 2 kapky (0,05 ml) na 1 ml séra a důkladně promíchejte protřepáním. Sérum se ponechá, dokud se erytrocyty úplně neusadí, nebo se po jedné hodině při pokojové teplotě odstředí, poté je připraveno k vyšetření.
Ředicí kapalina se nalije v objemu 0,5 ml do řady jamek na polystyrenové destičce. Během předběžné studie sér je vhodné je otestovat nastavením reakce v krátké řadě destičky (6 jamek). Pokud jsou protilátky detekovány v krátké sérii, séra se znovu testují v dlouhé sérii ředění (12 jamek). Po rozlití ředicí kapaliny přidejte 0,5 ml testovacího séra v ředění 1:5 do první jamky každé řady (krátké nebo dlouhé). Poté se stejné objemy séra titrují dvojnásobným ředěním. Tak se získají ředění séra v krátkých sériích od 1:10 do 1:320 a v dlouhých sériích od 1:10 do 1:20480. Po titraci séra se do každé jamky přidá jedna kapka (0,05 ml) pracovní 2,5% suspenze senzibilizovaných erytrocytů. Obsah destiček se důkladně protřepe, dokud se nezíská homogenní suspenze. Destičky se nechají při pokojové teplotě na stacionárním povrchu stolu. Předběžný záznam reakce se provádí po 2-3 hodinách, konečné stanovení titru se provádí po úplné sedimentaci červených krvinek v jamkách. Pro reakci jsou poskytnuty následující kontroly: 1) testovací sérum zředěné 1:10 v objemu 0,5 ml + 1 kapka 2,5% suspenze nesenzibilizovaných erytrocytů; 2) ředicí kapalina v objemu 0,5 ml + 1 kapka 2,5% suspenze nesenzibilizovaných erytrocytů; 3) ředicí kapalina v objemu 0,5 ml + 1 kapka 2,5% suspenze senzibilizovaných erytrocytů. Všechny kontroly by měly vykazovat jasně negativní reakci.
Účetnictví a hodnocení RPGA. Reakce se hodnotí podle následujícího schématu:
1) ostře pozitivní reakce(++++) - červené krvinky padají na dno otvoru v rovnoměrné vrstvě ve formě „deštníku“, který má často vroubkované roztavení okrajů;
2) pozitivní reakce (+++) - červené krvinky pokrývají alespoň 2/3 dna jamky;
3) slabě pozitivní reakce (++) - aglutinát je malý a nachází se v samém středu jamky;
4) diskutabilní reakce (+) - kolem sedimentu erytrocytů v samém středu jamky jsou jednotlivá zrnka aglutinátu;
5) negativní (-) - na dně otvoru se červené krvinky usazují ve formě „knoflíku“ nebo malého kroužku s hladkými, ostře ohraničenými okraji.
Sérový titr se bere v úvahu na základě posledního ředění séra, které poskytlo velmi jasnou reakci (alespoň tři plusy). Za diagnostický titr se považuje ředění 1:100 nebo vyšší, ale stejně jako u RA je nutné sledovat jeho nárůst.
RPGA pro tularemii je poměrně specifické a některé detekuje křížové reakce pouze se séry na brucelózu. Diferenciální diagnostika možnou výškou titrů v RPGA, které jsou významně vyšší u homologního antigenu.
Technika pro nastavení RPHA v mikroobjemech. RPGA lze provádět v mikroobjemech pomocí mikrotitrátoru typu Takachi (nebo mikrodestičky s kulatým dnem s mikropipetami), který umožňuje titraci materiálu v objemech 25 μl a 50 μl. Reakční technika a sled všech operací je stejný jako při studiu v polystyrenových deskách. Je však třeba mít na paměti, že citlivost mikrometody je obvykle o jedno ředění (tj. 2krát) nižší než citlivost makrometody.
Pro nastavení reakce v mikrotitrátoru se do každé jamky přidá ředicí kapalina o objemu 50 μl pomocí pipety s kapátkem. Poté se pomocí titrátorů s 50 μl hlavicí odebere testovací sérum ponořením hlavice do něj. Ujistěte se, že kapalina naplnila hlavu titrátoru. Titrátor se sérem se přenese do první jamky a drží se v ní vertikální poloze, udělat několik rotační pohyby okružní výlet. Poté se titrátor přenese do další jamky a manipulace se opakuje. Titraci lze provádět současně v několika řadách. Po titraci celé série se titrátor rotačními pohyby promyje destilovanou vodou (výměna 2 porcí), voda se z hlavice odstraní tampónem a spálí se na plameni hořáku.
Po titraci přidejte do jamek 25 μl diagnostické tekutiny pro erytrocyty. Koncentrace diagnostica pro RPHA v mikroobjemech by měla být 0,5 % (tj. 2,5% suspenze červených krvinek se navíc 5krát zředí). Po přidání červených krvinek je třeba destičky mírně protřepat, dokud se nezíská homogenní suspenze. Výsledky lze zaznamenat během 1-1,5 hodiny, což je významnou výhodou RPGA v mikrotitru. Navíc tato technika vyžaduje malá množství všech reakčních složek a testovacích sér.
Reakce se bere v úvahu podle následujícího schématu:
1) „+“ – úplná hemaglutinace, při které červené krvinky dopadají na dno jamky v rovnoměrné vrstvě ve formě „deštníku“, zabírajícího alespoň 2/3 dna;
2) „+-“ - částečná hemaglutinace, při které červené krvinky klesají na dno ve formě volného prstence malé velikosti;
3) „-“ – nepřítomnost hemaglutinace, kdy červené krvinky padají na dno ve formě malého knoflíku nebo kroužku s hladkým okrajem.
Specifičnost pozitivní výsledek, získaný v RPHA, lze testovat pomocí třísložkové reakce - reakce inhibice pasivní hemaglutinace (RPHA).
Technika pro nastavení RTPGA. Tato reakce se používá k potvrzení specifičnosti pozitivního výsledku RPGA v případě pochybností nebo zvláštního epidemiologického zájmu. Mechanismem reakce je specifická inhibice hemaglutinace, když se do testovaného séra přidá suspenze usmrcených bakterií tularemie. V reakci interagují tři složky: testované sérum, specifický antigen tularemie a antigenní erytrocytární diagnosticum RTPHA se obvykle umístí do řady po 7-8 jamkách. Je vhodné instalovat opakované RPGA paralelně s RTPGA. Do dvou řad jamek se nalije 0,25 ml ředící kapaliny, do prvních jamek obou řad se přidá testované sérum v objemu 0,25 ml a provede se titrace, čímž se získají dvě stejné řady ředění séra. Do všech jamek druhé řady přidejte 0,25 ml ředící kapaliny a do jamek první řady 0,25 ml suspenze bakterií tularemie. Používá se Tularemia diagnosticum (obsahující 25 miliard bakterií tularemia v 1 ml), předem naředěný 50x. Tato suspenze obsahuje 500 milionů bakterií v 1 ml nebo 125 milionů v objemu 0,25 ml. Po přidání antigenu se destička ponechá 1 hodinu při teplotě místnosti, poté se do všech jamek obou řad přidá jedna kapka (0,05 ml) erytrocytárního diagnosticum, destička se protřepe a nechá na rovném povrchu stolu. Účetnictví se provádí po 2-3 hodinách.
Účetnictví a hodnocení RTPGA. Pokud testované sérum obsahuje specifické protilátky proti tularemii, jsou neutralizovány přidaným antigenem a nedojde k hemaglutinaci v první řadě jamek, popř. vysoký titr sérum, bude hemaglutinace pozorována v menším (2-4) počtu jamek než v řadě s RPGA. V tomto případě byla potvrzena specifičnost výsledků. Pokud je hemaglutinace zaznamenána v obou řadách, tzn. Pokud se výsledky RTPGA a RPGA shodují, znamená to nepřítomnost protilátek proti tularémii v testovaném séru. V tomto případě je primární výsledek RPGA považován za nespecifický.
Technika inscenování RTHG v mikroobjemech. RTPGA, stejně jako RPGA, lze provádět v mikroobjemech pomocí mikrotitru typu Takachi. K tomu přidejte 0,25 μl ředící kapaliny do jamek mikrodestičky ve dvou řadách po 7-8 jamkách. Poté se pomocí titrátoru přidá 0,25 μl testovaného séra a titruje se v obou řadách. Poté se do každé jamky v první řadě přidá 25 μl antigenu tularemie (jehož koncentrace je 500 milionů bakterií tularemie v 1 ml) a do druhé řady se přidá 25 μl ředící kapaliny. Destičky se nechají 1 hodinu při pokojové teplotě, poté se do všech jamek obou řad přidá 25 μl antigenního zritrocytárního diagnostica (0,5% koncentrace). Účtování a vyhodnocování výsledků se provádí obdobně jako reakce v makroobjemech.
Obsah tématu "Imunomodulátory. Imunodiagnostika infekčních onemocnění.":Pasivní aglutinační reakce. Nepřímé aglutinační reakce. Nepřímá nebo pasivní hemaglutinační reakce (IRHA, RPHA). Reverzní RNGA. Reakce pasivní inhibice hemaglutinace (PHA).
Tyto reakce jsou nazývány nepřímý (pasivní), protože používají Ag (nebo AT) uměle sorbovaný na povrchu různých korpuskulárních částic.
Nepřímá nebo pasivní hemaglutinační reakce (RNGA, RPGA) je jednou z nejcitlivějších sérologických reakcí. Je založena na schopnosti AT interagovat s Ag fixovaným na různých červených krvinkách, které pak aglutinují. Pro větší stabilitu diagnostických přípravků jsou červené krvinky formalinizovány.
Reverzní RNGA používá se k detekci Ag v krevním séru; Za tímto účelem se na erytrocyty nefixují Ag, ale AT. Reakce tohoto typu jsou široce používány k diagnostice infekčních onemocnění, navázání těhotenství, zjištění přecitlivělosti na léky atd.
Reakce pasivní inhibice hemaglutinace (RTPGA) - další vývoj RNGA; v jistém smyslu řídí jeho specifičnost. Na rozdíl od RNGA obsahuje tři složky; Ag, AT a Ag (AT) adsorbované na erytrocytech. Nejprve Ag reaguje s AT (standardní antisérum), poté se do směsi přidají erytrocyty senzibilizované stejným Ag (nebo AT). Pokud během interakce Ag s AT nezůstane v systému žádný volný AT (nebo Ag), pak není pozorována aglutinace erytrocytárního diagnostica.
11621 0
Sérologické reakce jsou označovány v souladu s jevy provázejícími tvorbu komplexu antigen-protilátka při interakci složek s různými vlastnostmi. Dochází k reakcím aglutinace, precipitace a lýzy.
Aglutinační reakce (RA)
Aglutinační reakce (RA) je založena na použití korpuskulárního antigenu (suspenze bakterií, senzibilizovaných erytrocytů, latexových částic atd.) interagujícího se specifickými protilátkami, v důsledku čehož se vysráží vzniklý komplex antigen-protilátka. Tato reakce je široce používána v laboratorní praxi pro sérologickou diagnostiku. bakteriální infekce a pro identifikaci izolovaných mikroorganismů.
RA se používá k diagnostice mnoha infekčních onemocnění: brucelóza (Wright, Heddlesonova reakce), tularémie, leptospiróza (RAL - Leptospira aglutination and lysis reakce), listerióza, tyfus (RAR - Rickettsia aglutination reakce), shigelóza, yersinióza, pseudotuberkulóza atd.
Nepřímá nebo pasivní aglutinační reakce (RIGA nebo RPGA).
K fázi této reakce se používají červené krvinky zvířat (ovce, opice, morčata, někteří ptáci) senzibilizované protilátkami nebo antigenem, čehož se dosáhne inkubací suspenze červených krvinek a roztoku antigenu nebo imunitního séra.
Diagnostika získaná na základě erytrocytů senzibilizovaných antigeny se nazývají antigenní diagnostika erytrocytů. Jsou určeny pro stanovení protilátek v sériových ředěních krevních sér, např. erytrocytární shigella diagnosticums, erytrocytární salmonella O-diagnosticums.
Podle toho se nazývá diagnostika založená na erytrocytech senzibilizovaných specifickými imunoglobuliny protilátky(imunoglobulin) diagnostika a slouží k průkazu antigenů v různých materiálech, např. erytrocytární imunoglobulin diphtheria diagnosticum pro RIGA, používaný k průkazu difterického exotoxinu korynebakterií v tekutém živném médiu, když je do něj naočkován materiál z nosu a orofaryngu.
Hemaglutinační reakce slouží k diagnostice jak bakteriálních (tyfus, paratyfus, úplavice, brucelóza, mor, cholera aj.), tak virových (chřipka, adenovirové infekce, spalničky aj.) infekcí. Z hlediska citlivosti a specificity je RIGA lepší než RA.
Hemaglutinační inhibiční reakce (HAI)
Hemaglutinační inhibiční reakce (HAI) se používá k titraci antivirových protilátek v krevním séru a také ke stanovení typu izolovaných virových kultur. K jejich diagnostice lze použít RTGA virové infekce, jejichž patogeny mají hemaglutinační vlastnosti.
Princip metody spočívá v tom, že sérum obsahující protilátky proti specifickému typu viru potlačí jeho hemaglutinační aktivitu a červené krvinky zůstanou neaglutinované.
Pasivní hemaglutinační inhibiční (zpožděná) reakce (RPHA).
V RTPGA se účastní tři složky: imunitní sérum, antigen (testovaný materiál) a senzibilizované erytrocyty.
Pokud testovaný materiál obsahuje antigen, který specificky reaguje s imunitními protilátkami standardní sérum, pak je naváže a při následném přidání erytrocytů senzibilizovaných antigenem homologním se sérem k hemaglutinaci nedochází.
RTPHA se používá k detekci mikrobiálních antigenů, k jejich kvantitativnímu stanovení a také ke kontrole specificity RTPGA.
Latexová aglutinační reakce (RLA)
Latexové částice se používají jako nosič protilátek (imunoglobulinů). RLA je expresní metoda pro diagnostiku infekčních onemocnění s přihlédnutím k časové náročnosti (do 10 minut) a schopnosti detekovat antigen v malém objemu testovaného materiálu.
RLA se používá k indikaci antigenů Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae typu b, Neisseria meningitidis v mozkomíšním moku, k průkazu streptokoků skupiny A ve výtěrech z krku, k diagnostice salmonelózy, yersiniózy a dalších onemocnění. Citlivost metody je 1-10 ng/ml, neboli 10³-10⁶ bakteriálních buněk v 1 µl.
Koaglutinační reakce (CoA)
Koaglutinační reakce (CoA) je založena na schopnosti proteinu A stafylokoků vázat specifické imunoglobuliny. RCA - metoda expresní diagnostiky - slouží k identifikaci rozpustných termostabilních antigenů v lidských sekretech a ve složení cirkulujících imunitních komplexů (CIC). Detekce specifických antigenů ve složení CEC vyžaduje jejich předběžné vysrážení z krevního séra.
Srážková reakce
Při precipitační reakci (RP) vznikají v důsledku interakce protilátek s vysoce dispergovanými rozpustnými antigeny (proteiny, polysacharidy) za účasti komplementu - precipitáty komplexy. Je to citlivý test používaný k detekci a charakterizaci různých antigenů a protilátek. Nejjednodušším příkladem vysoce kvalitního RP je vytvoření neprůhledného precipitačního proužku ve zkumavce na hranici vrstvy antigenu na imunitním séru – prstencová precipitační reakce. Široce se používají různé typy RP v polotekutém agaru nebo agarózových gelech (dvojitá imunodifuzní metoda, radiální imunodifuzní metoda, imunoelektroforéza).
Reakce fixace komplementu (CFR)
Reakce fixace komplementu (CFR) je založena na fenoménu hemolýzy za účasti komplementu, tzn. schopné detekovat pouze protilátky fixující komplement.
RSC je široce používán pro diagnostiku mnoha bakteriálních a virových infekcí, rickettsiových infekcí, chlamydií, infekční mononukleóza, protozoální infekce, helmintiáza. RSK je komplexní sérologické reakce, na kterém se podílejí dva systémy: testovací systém (krevní sérum), reprezentovaný systémem antigen-protilátka a komplement, a hemolytický systém (ovčí červené krvinky + hemolytické sérum). Hemolytické sérum je tepelně inaktivované králičí krevní sérum imunizované ovčími erytrocyty. Obsahuje protilátky proti ovčím červeným krvinkám.
Pozitivní výsledek RSC - nepřítomnost hemolýzy - je pozorován, pokud testované sérum obsahuje protilátky homologní s antigenem. V tomto případě výsledný komplex antigen-protilátka váže komplement a při absenci volného komplementu není přidání hemolytického systému doprovázeno hemolýzou. Pokud v séru nejsou protilátky odpovídající antigenu, nedochází k tvorbě komplexu antigen-protilátka, komplement zůstává volný a sérum způsobuje hemolýzu červených krvinek, tzn. přítomnost hemolýzy je negativním výsledkem reakce.
Yushchuk N.D., Vengerov Yu.Ya.
Aglutinační reakce - RA(z lat. aglutinatio- adheze) je jednoduchá reakce, při které protilátky vážou korpuskulární antigeny (bakterie, erytrocyty nebo jiné buňky, nerozpustné částice s na nich adsorbovanými antigeny a také makromolekulární agregáty). Vyskytuje se v přítomnosti elektrolytů, například když se přidá izotonický roztok chloridu sodného.
Aplikovat různé možnosti aglutinační reakce: rozsáhlé, indikativní, nepřímé aj. Aglutinační reakce se projevuje tvorbou vloček nebo sedimentu
RA se používá pro:
stanovení protilátek v krevním séru pacientů, například s brucelózou (Wrightova, Heddelsonova reakce), břišní tyfus a paratyfus (Vidalova reakce) a další infekční choroby;
stanovení patogenu izolovaného od pacienta;
stanovení krevních skupin pomocí monoklonálních protilátek proti aloantigenům erytrocytů.
Stanovení protilátek u pacienta dátrozšířený aglutinační reakce: přidat do ředění pacientova krevního séra diagnosticum(suspenze usmrcených mikrobů) a po několika hodinách inkubace při 37 °C je zaznamenáno nejvyšší ředění séra (sérový titr), při kterém došlo k aglutinaci, tj. vytvoření sraženiny.
Povaha a rychlost aglutinace závisí na typu antigenu a protilátek. Příkladem jsou zvláštnosti interakce diagnostik (O- a R-antigenů) se specifickými protilátkami. Aglutinační reakce s O-diagnostika(bakterie usmrcené teplem, udržující tepelně stabilní O-antigen) vyskytuje se ve formě jemnozrnné aglutinace. Aglutinační reakce s H-diagnosticum (bakterie usmrcená formaldehydem, zadržující termolabilní bičíkový H-antigen) je hrubá a probíhá rychleji.
Pokud je nutné určit patogen izolovaný od pacienta, dát indikativní aglutinační reakce, pomocí diagnostických protilátek (aglutinační sérum), tj. provádí se sérotypizace patogenu. Na podložním sklíčku se provádí indikativní reakce. Čistá kultura patogenu izolovaná od pacienta se přidá ke kapce diagnostického aglutinačního séra v ředění 1:10 nebo 1:20. Poblíž je umístěna kontrola: místo séra se aplikuje kapka roztoku chloridu sodného. Když se v kapce obsahující sérum a mikroby objeví vločkovitý sediment, a rozsáhlá aglutinační reakce ve zkumavkách se zvyšujícím se ředěním aglutinačního séra, do kterého se přidají 2-3 kapky suspenze patogenu. Aglutinace je zohledněna množstvím sedimentu a stupněm čirosti kapaliny. Reakce je považována za pozitivní, pokud je pozorována aglutinace v ředění blízkém titru diagnostického séra. Současně se berou v úvahu kontroly: sérum naředěné izotonickým roztokem chloridu sodného by mělo být průhledné, suspenze mikrobů ve stejném roztoku by měla být rovnoměrně zakalená, bez sedimentu.
Různé příbuzné bakterie mohou být aglutinovány stejným diagnostickým aglutinačním sérem, což ztěžuje jejich identifikaci. Proto používají adsorbovaná aglutinační séra, ze kterých byly zkříženě reagující protilátky odstraněny adsorpcí na příbuzné bakterie. Taková séra si uchovávají protilátky, které jsou specifické pouze pro danou bakterii. Produkci speciálních monoreceptorových diagnostických aglutinačních sér navrhl A. Castellani (1902).
Nepřímá (pasivní) hemaglutinační reakce(RNGA, RPGA) je založena na použití erytrocytů s antigeny nebo protilátkami adsorbovanými na jejich povrchu, jejichž interakce s odpovídajícími protilátkami nebo antigeny krevního séra způsobí, že se erytrocyty slepí a vypadnou na dno testu. trubice nebo článku PROTI ve formě vroubkovaného sedimentu (obr. 13.2). Na negativní reakcečervené krvinky se usazují ■ ve formě „knoflíku“. Typicky jsou protilátky detekovány v RNGA pomocí antigenního diagnostického erytrocytu, což jsou erytrocyty s adsorbovanými na je s antigeny. Někdy se používá anti-A erytrocytární diagnostika, na kterou se adsorbují protilátky. Například botulotoxin lze detekovat přidáním erytrocytární protilátky botulotoxinu (tato reakce je tzv. reverzní nepřímá hemaglutinační reakce- RONG). RNGA se používá k diagnostice infekčních onemocnění a stanovení gonadotropního hormonu PROTI moči při zakládání těhotenství, k identifikaci přecitlivělosti na léky, hormony a v některých dalších případech.
REAKCE HŘEBENU
(Coombsův test) - metoda stanovení Rh protilátek na povrchu červených krvinek, které způsobují vysrážení globulinů v krevním séru. Tento test se používá pro diagnostiku hemolytická anémie u kojenců s Rh inkompatibilitou, u kterých dochází k destrukci červených krvinek.
Koaglutinační reakce. Patogenní buňky jsou určeny pomocí stafylokoků předem ošetřených imunitním diagnostickým sérem. Stafylokoky obsahující bílkoviny A, mající afinitu k Fc fragmentu imunoglobulinů, nespecificky adsorbují antimikrobiální protilátky, které pak interagují s aktivními centry s odpovídajícími mikroby izolovanými od pacientů. V důsledku koagulace se tvoří vločky sestávající ze stafylokoků, diagnostických sérových protilátek a detekovaného mikroba.
Hemaglutinační inhibiční reakce(RTGA) je založena na blokádě, supresi virových antigenů imunitními sérovými protilátkami, v důsledku čehož viry ztrácejí schopnost aglutinovat červené krvinky (obr. 13.3). RTGA se používá k diagnostice mnoha virových onemocnění, jejichž původci (viry chřipky, spalničky, zarděnky, klíšťová encefalitida atd.) mohou aglutinovat červené krvinky různých zvířat.
- Skupina lékařů z WHO přijela do Indie, aby identifikovala pacienty s obrnou a pomohla při provádění všeobecného očkování proti obrně. V jedné ze zkoumaných vesnic byl k lékařům přivezen 6letý chlapec z velké rodiny, který před 5 dny onemocněl. Teplota náhle stoupla, dostavila se silná bolest hlavy, opakované zvracení, bolesti rukou a nohou. Při kontrole: teplo, těžká slabost, meningeální příznaky, na pravá noha snížena svalový tonus, šlachové reflexy jsou prudce oslabeny, noha visí dolů. Při punkci páteřního kanálu vytékal mozkomíšní mok pod vysoký krevní tlak, počet lymfocytů je zvýšený, bakterie nejsou izolovány. Doručeno předběžná diagnóza„paralytická forma dětské obrny“. Jak se mohl chlapec nakazit? Jak probíhá specifická aktivní prevence obrny? Existuje nebezpečí nakažení dalších dětí v této rodině, co je třeba dělat?
Odpovědět: Chlapec se mohl nakazit fekálně-orální cestou potravou, vodou a také vzdušnými kapénkami. Hlavním opatřením prevence obrny je imunizace živou kulturou vakcíny ze 3 sérotypů kmenů Sabin.V Rusku se používá očkování proti obrně pro perorální podání vyráběný Institutem pro poliomyelitidu a virovou encefalitidu pojmenovaný po. M.P. Čumaková. Vakcína je trivalentní přípravek atenuovaných Sabinových kmenů polioviru typu 1, 2, 3, získaný z primární kultury ledvinových buněk africké opice zelené. . Děti ve věku od 3 měsíců do 6 let podléhají běžnému očkování proti dětské obrně. Očkování perorální vakcínou proti dětské obrně se provádí 2 nebo 4 kapkami vakcíny perorálně třikrát ve 3, 4, 5 a 6 měsících se třemi přeočkování v 18, 20 a 14 letech. Nemocný chlapec musí být hospitalizován a všechny ostatní děti z této rodiny musí být očkovány živou vakcínou proti dětské obrně.
- Složení a použití trivalentní polymerové podjednotky kapalné vakcíny proti chřipce (chřipka)
Jedná se o molekulární vakcínu. Složení: povrchový Ag viru chřipky tří subtypů (A/H1N1, A/H3N2, B). Použití: k prevenci chřipky
Karta zkoušky č. 23
