Aglutinační reakce (RA) je adheze a precipitace mikrobů nebo jiných buněk pod vlivem protilátek v přítomnosti elektrolytu. Výsledná sraženina se nazývá aglutinát.
RA se používá:
1. K detekci protilátek v krevním séru pacienta (serodiagnostika).
2. Stanovit typ a sérovar čisté kultury patogenních mikroorganismů izolovaných od pacienta (sérotypizace).
Aglutinační reakce se používá ke stanovení protilátek v krevním séru pacientů např. s břišním tyfem a paratyfem (Vidalova reakce), brucelózou (Wrightova, Heddlesonova reakce), tularémií, leptospirózou a dalšími infekční choroby, jakož i ke stanovení patogenu izolovaného od pacienta (střevní infekce, černý kašel atd.). RA se používá k určení krevních skupin, Rh faktoru atd.
Reakce vyžaduje následující složky:
1. Antigen (aglutinogen) musí být korpuskulární, to znamená, že se jedná o suspenzi živých nebo usmrcených mikroorganismů (diagnostika m), erytrocytů nebo jiných buněk. Typicky se používá denní kultura mikroorganismů pěstovaných na šikmém agaru. Kultura se promyje 3 - 4 ml izotonického roztoku, přenese se do sterilní zkumavky a stanoví se hustota. Suspenze musí být homogenní a obsahovat až 3 miliardy mikrobiálních buněk na 1 ml. Práci usnadňuje použití suspenze usmrcených mikrobů - diagnosticums (připravené ve výrobě).
2. Protilátky (aglutininy) se nacházejí v séru pacienta (během sérodiagnostiky) nebo v aglutinačním séru (při sérotypizaci). Aglutinační séra se získávají imunizací králíků usmrcenými bakteriemi.
Aglutinační titr sérum se nazývá jeho nejvyšší ředění, ve kterém za určitých experimentálních podmínek reaguje s odpovídajícím antigenem.
Aglutinační séra mohou být nativní (neadsorbovaná) a adsorbovaná. Nativní séra v malých ředěních interagují nejen s typem mikroorganismů, kterými bylo zvíře imunizováno za účelem získání séra, ale také s příbuznými typy mikroorganismů, protože obsahují skupinové protilátky (protilátky proti mikroorganismům, které mají společné antigeny). Nativní séra se používají k podrobné aglutinační reakci (k sérodiagnostike), která zohledňuje nejen přítomnost reakce, ale i dynamiku nárůstu titru protilátek.
Pokud jsou skupinové protilátky extrahovány (adsorbovány) z nativního séra interakcí s příbuznými bakteriemi, které mají skupinové antigeny, získají se adsorbovaná séra. Adsorbovaná séra mohou být monoreceptorová (nebo typově specifická), obsahující protilátky pouze proti jednomu antigennímu receptoru Polyvalentní séra se skládají ze směsi několika adsorbovaných nebo neadsorbovaných sér. Adsorbovaná séra se používají ke skleněné aglutinační reakci.
Když jsou zvířata imunizována pohyblivými bakteriemi s H-antigenem, získají se H-aglutinační séra obsahující H-protilátky (např. Salmonella monoreceptor H-aglutinační sérum). Imunizací O-antigenem se získají O-aglutinační séra obsahující O-protilátky (například O-aglutinační sérum adsorbované na skupinu Salmonella, O-aglutinační sérum proti cholere). Imunizací H- a O-antigeny se získají séra s H- a O-protilátkami.
Navíc O-aglutininy produkují jemnozrnný aglutinát a H-aglutininy produkují hrubozrnný sediment.
3. Elektrolyt – izotonický roztok NaCl (0,9% roztok chloridu sodného připravený v destilované vodě).
Existují dvě hlavní metody provádění aglutinační reakce: reakce na skle (někdy nazývaná indikativní nebo destičková reakce) a podrobná reakce (ve zkumavkách)
Nastavení aglutinační reakce na skle. Na podložní sklíčko bez tuku se aplikují dvě kapky séra a kapka izotonického roztoku chloridu sodného. Diagnostické aglutinační sérum se odebírá v jednom ředění, které je v závislosti na jeho titru 1:10, 1:25, 1:50 nebo 1:100. Kultura zkoumaného mikroorganismu se pomocí kličky přidá do jedné kapky séra a kapky izotonického roztoku a důkladně se promíchá. Kapka chloridu sodného s mikroorganismy je kontrola antigenu, kapka séra bez mikroorganismů je kontrola séra. Kulturu nelze přenést z kapky se sérem do kapky s NaCl. Reakce probíhá při teplotě místnosti po dobu 1-3 minut. Pokud kontrolní sérum zůstane čiré, u antigenové kontroly je pozorován stejnoměrný zákal a v kapce, kde je kultura smíchána se sérem, se objeví vločky aglutinátu, pak je výsledek považován za pozitivní. Pokud je v kapce rovnoměrný zákal se sérem a antigenem, pak je to negativní výsledek. Reakce je zřetelněji viditelná na tmavém pozadí.
Sérum
1. kontrola antigenu
2. kontrola séra
13.1. Reakce antigen-protilátka a jejich aplikace
Při zavedení antigenu se v těle tvoří protilátky. Protilátky jsou komplementární k antigenu, který způsobil jejich syntézu a jsou schopny se na něj vázat. Vazba antigenů na protilátky se skládá ze dvou fází. První fáze je specifická, ve které dochází k rychlé vazbě antigenní determinanty na aktivní centrum Fab fragmentu protilátek. Je třeba poznamenat, že vazba je způsobena van der Waalsovými silami, vodíkem a hydrofobními interakcemi. Síla vazby je určena stupněm prostorové korespondence mezi aktivním místem protilátky a epitopem antigenu. Po specifické fázi nastupuje fáze pomalejší - nespecifická, která se projevuje viditelným fyzikálním jevem (např. tvorba vloček při aglutinaci apod.).
Imunitní reakce jsou interakce mezi protilátkami a antigeny a tyto reakce jsou specifické a mají vysoká citlivost. Jsou široce používány v lékařská praxe. Pomocí imunitních reakcí lze vyřešit následující problémy:
Stanovení neznámých protilátek známými antigeny (antigenic diagnosticum). Tento úkol nastává, když je nutné stanovit protilátky proti patogenu v krevním séru pacienta (serodiagnostika). Nalezení protilátek umožňuje potvrdit diagnózu;
Stanovení neznámých antigenů pomocí známých protilátek (diagnostické sérum). Tato studie se provádí při identifikaci kultury patogenu izolovaného z materiálu pacienta (sérotypizace) a také při detekci
antigeny mikrobů a jejich toxiny v krvi a další biologické tekutiny. Existuje mnoho typů imunitních reakcí, které se liší technikou stagingu a zaznamenaným efektem. Jedná se o aglutinační reakce (RA), precipitační reakce (RP), reakce zahrnující komplement (RSC), reakce využívající značené složky (RIF, ELISA, RIA).
13.2. Aglutinační reakce
Aglutinační reakce (RA) je imunitní reakce interakce antigenu s protilátkami za přítomnosti elektrolytů a antigen je v korpuskulárním stavu (erytrocyty, bakterie, latexové částice s adsorbovanými antigeny). Při aglutinaci dochází ke slepování korpuskulárních antigenů protilátkami, což se projevuje tvorbou vločkovité sraženiny. K tvorbě vloček dochází díky tomu, že protilátky mají dvě aktivní centra a antigeny jsou polyvalentní, tzn. mají několik antigenních determinant. RA se používá k identifikaci patogenu izolovaného z materiálu pacienta a také k detekci protilátek proti patogenu v krevním séru pacienta (například Wrightova a Heddlesonova reakce na brucelózu, Widalova reakce na tyfus a paratyfus).
Nejjednodušším způsobem diagnostiky RA je reakce na skle, jedná se o přibližnou RA, která se používá k určení patogenu izolovaného od pacienta. Po zjištění reakce se na podložní sklíčko nanese diagnostické aglutinační sérum (v ředění 1:10 nebo 1:20), poté se přidá kultura od pacienta. Reakce je pozitivní, pokud se v kapce objeví vločkovitý sediment. Poblíž je umístěna kontrola: místo séra se aplikuje kapka roztoku chloridu sodného. Pokud se diagnostické aglutinační sérum neadsorbuje 1, pak se ředí (na titr - ředění, na které má dojít k aglutinaci), tzn. dejte expandovanou RA do zkumavek se zvyšujícím se počtem
1 Neadsorbované aglutinační sérum může aglutinovat příbuzné bakterie, které mají běžné (zkříženě reagující) antigeny. Proto používajíadsorbovaná aglutinační séra, ze kterých byly zkříženě reagující protilátky odstraněny adsorpcí na příbuzné bakterie. Taková séra si uchovávají protilátky, které jsou specifické pouze pro danou bakterii.
ředění aglutinačního séra, do kterého se přidají 2-3 kapky suspenze patogenu izolovaného od pacienta. Aglutinace je zohledněna množstvím sedimentu a stupněm vyčeření kapaliny ve zkumavkách. Reakce je považována za pozitivní, pokud je pozorována aglutinace v ředění blízkém titru diagnostického séra. Reakce je doprovázena kontrolami: sérum zředěné izotonickým roztokem chloridu sodného by mělo být průhledné, suspenze mikrobů ve stejném roztoku by měla být rovnoměrně zakalená, bez sedimentu.
Pro stanovení protilátek proti patogenu v krevním séru pacienta se používá RA v plném rozsahu. Při nastavení se pacientovo krevní sérum naředí ve zkumavkách a do zkumavek se přidá stejné množství suspenze diagnosticum (suspenze usmrcených mikrobů). Po inkubaci se stanoví nejvyšší ředění séra, při kterém došlo k aglutinaci, tzn. vytvořila se sraženina (sérový titr). V tomto případě dochází k aglutinační reakci s O-diagnosticum (bakterie usmrcené zahříváním, zadržující termostabilní O-antigen) ve formě jemnozrnné aglutinace. Aglutinační reakce s H-diagnosticum (bakterie usmrcená formaldehydem, zadržující termolabilní bičíkový H-antigen) je hrubá a probíhá rychleji.
Nepřímá (pasivní) hemaglutinační reakce(RNGA nebo RPGA) je typ RA. Tato metoda je vysoce citlivá. Pomocí RNGA lze vyřešit dva problémy: stanovit protilátky v krevním séru pacienta, ke kterému je přidáno antigenní erytrocytární diagnosticum, což jsou erytrocyty, na kterých jsou adsorbovány známé antigeny; stanovit přítomnost antigenů v testovaném materiálu. V tomto případě se reakce někdy nazývá reverzní nepřímá hemaglutinační reakce (RONHA). Během výkonu se k testovanému materiálu přidává protilátkové erytrocytární diagnosticum (erytrocyty s protilátkami adsorbovanými na jejich povrchu). Při této reakci působí červené krvinky jako přenašeče a pasivně se podílejí na tvorbě imunitních agregátů. Při pozitivní reakci pasivně slepené červené krvinky pokrývají dno otvoru v rovnoměrné vrstvě s vroubkovanými okraji („deštník“); v nepřítomnosti aglutinace se červené krvinky hromadí v centrálním vybrání otvoru a tvoří kompaktní „knoflík“ s ostře ohraničenými okraji.
Koaglutinační reakce používá se k určení buněk patogenů (antigenů) pomocí protilátek adsorbovaných na Staphylococcus aureus, obsahující protein A. Protein A má afinitu k Fc fragmentu imunoglobulinů. Díky tomu se protilátky vážou na stafylokoka nepřímo přes Fc fragment a Fab fragmenty jsou orientovány směrem ven a jsou schopny interagovat s odpovídajícími mikroby izolovanými od pacientů. V tomto případě se tvoří vločky.
Hemaglutinační inhibiční reakce (HAI) používané v diagnostice virové infekce a pouze infekce způsobené hemaglutinačními viry. Tyto viry obsahují na svém povrchu protein – hemaglutinin, který je zodpovědný za hemaglutinační reakci (HRA), kdy se k virům přidávají červené krvinky. RTGA zahrnuje blokování virových antigenů protilátkami, v důsledku čehož viry ztrácejí schopnost aglutinovat červené krvinky.
Coombsova reakce - RA pro stanovení nekompletních protilátek. U některých infekčních onemocnění, jako je brucelóza, cirkulují v krevním séru pacienta neúplné protilátky proti patogenu. Nekompletní protilátky se nazývají blokující protilátky, protože mají jedno vazebné místo pro antigen a ne dvě, jako plnohodnotné protilátky. Proto, když se přidá antigenní diagnosticum, neúplné protilátky se navážou na antigeny, ale neslepí je dohromady. K manifestaci reakce je přidáno antiglobulinové sérum (protilátky proti lidským imunoglobulinům), což povede k aglutinaci imunitních komplexů (antigenní diagnosticum + neúplné protilátky) vzniklých v první fázi reakce.
Nepřímá Coombsova reakce se používá u pacientů s intravaskulární hemolýzou. U některých z těchto pacientů jsou detekovány neúplné monovalentní protilátky proti Rhesus. Specificky interagují s Rh-pozitivními erytrocyty, ale nezpůsobují jejich aglutinaci. Proto se do systému anti-Rh protilátek + Rh-pozitivních erytrocytů přidává antiglobulinové sérum, které způsobuje aglutinaci erytrocytů. K diagnostice se používá Coombsův test patologické stavy, spojené s intravaskulární lýzou erytrocytů imunitního původu, například hemolytické onemocnění novorozenců způsobené Rh konfliktem.
RA pro stanovení krevních skupin je založena na aglutinaci erytrocytů imunitními sérovými protilátkami na antigeny krevní skupiny A(II), B(III). Kontrolou je sérum, které neobsahuje protilátky, tzn. krevní skupina AB(IV) v séru a erytrocytární antigeny skupin A(P) a B(III). Červené krvinky skupiny 0(I) se používají jako negativní kontrola, protože nemají antigeny.
Pro stanovení Rh faktoru se používají anti-Rh séra (alespoň dvě různé série). Pokud je na membráně zkoumaných erytrocytů Rh antigen, dochází k aglutinaci těchto buněk.
13.3. Srážková reakce
RP je imunitní reakce interakce protilátek s antigeny v přítomnosti elektrolytů a antigen je v rozpustném stavu. Při precipitaci dochází k vysrážení rozpustných antigenů protilátkami, což se projevuje zákalem ve formě precipitačních pásů. Tvorba viditelné sraženiny je pozorována, když se obě činidla smíchají v ekvivalentních poměrech. Nadbytek jednoho z nich snižuje počet vysrážených imunitních komplexů. Existují různé způsoby, jak provést srážecí reakci.
Reakce srážení kruhu umístěna v precipitačních zkumavkách o malém průměru. Imunitní sérum se přidá do zkumavky a opatrně se navrství rozpustný antigen. Pokud je výsledek pozitivní, vytvoří se na rozhraní obou roztoků mléčný prstenec. Kruhová precipitační reakce, která se používá ke stanovení přítomnosti antigenů v orgánech a tkáních, jejichž extrakty se vaří a filtrují, se nazývá termoprecipitační reakce (Ascoliho reakce pro stanovení termostabilního antraxového antigenu).
Ouchterlonyho dvojitá imunodifúzní reakce. Tato reakce se provádí v agarovém gelu. Ve vrstvě gelu o jednotné tloušťce se vyříznou jamky v určité vzdálenosti od sebe a naplní se antigenem a imunitním sérem. Poté antigeny a protilátky difundují do gelu, setkávají se a vytvářejí imunitní komplexy, které se v gelu vysrážejí a stávají se viditelnými jako přesné linie.
výživa. Tato reakce může být použita k identifikaci neznámých antigenů nebo protilátek a také k testování podobnosti mezi různými antigeny: pokud jsou antigeny identické, precipitační linie se spojí, pokud antigeny nejsou identické, precipitační linie se protnou, pokud jsou antigeny částečně identické, vznikne ostruha.
Radiální imunodifúzní reakce. Do rozpuštěného agarového gelu se přidají protilátky a gel se nanese v rovnoměrné vrstvě na sklenici. V gelu se vyříznou jamky a přidá se do nich standardní objem roztoků antigenu různých koncentrací. Během inkubace antigeny radiálně difundují z jamky a po setkání s protilátkami vytvoří precipitační prstenec. Dokud přebytek antigenu zůstává v jamce, dochází k postupnému zvětšování průměru precipitačního prstence. Tato metoda se používá ke stanovení antigenů nebo protilátek v testovacím roztoku (například ke stanovení koncentrace imunoglobulinů různých tříd v krevním séru).
Imunoelektroforéza. Směs antigenů se nejprve elektroforeticky oddělí, poté se do žlábku probíhajícího ve směru pohybu proteinu přidá precipitující antisérum. Antigeny a protilátky difundují do gelu směrem k sobě; spolupůsobí, tvoří obloukovité srážkové linie.
Flokulační reakce(podle Ramona) - typ srážecí reakce, která se používá ke stanovení aktivity antitoxického séra nebo toxoidu. Reakce se provádí ve zkumavkách. Ve zkumavce, kde jsou toxoid a antitoxin v ekvivalentním poměru, je pozorován zákal.
13.4. Reakce fixace komplementu
Protilátky v interakci s odpovídajícím antigenem vážou přidaný komplement (1. systém). Indikátorem fixace komplementu jsou erytrocyty senzibilizované hemolytickým sérem, tzn. protilátky proti červeným krvinkám (2. systém). Není-li komplement v 1. systému fixní, tzn. Pokud nedojde k reakci antigen-protilátka, senzibilizované červené krvinky jsou zcela lyžovány (negativní reakce). Při fixaci komplementu imunitními komplexy 1. systému po přidání senzibilizovaných erytrocytů hemolýza z
chybí (pozitivní reakce). Reakce fixace komplementu se využívá k diagnostice infekčních onemocnění (kapavka, syfilis, chřipka atd.).
13.5. Neutralizační reakce
Mikroby a jejich toxiny mají škodlivý účinek na orgány a tkáně lidského těla. Protilátky jsou schopny se na tato poškozující činidla vázat a blokovat je, tzn. neutralizovat. Na této vlastnosti protilátek je založena diagnostická neutralizační reakce. Provádí se zavedením směsi antigen-protilátka do zvířat nebo do citlivých testovacích objektů (buněčná kultura, embrya). Například pro detekci toxinů v materiálu pacienta se zvířatům 1. skupiny injikuje materiál od pacienta. Zvířatům z 2. skupiny se injikuje podobný materiál, předem ošetřený vhodným antisérem. Zvířata skupiny 1 umírají, pokud je v materiálu toxin. Druhá skupina živočichů přežívá, škodlivý účinek toxinu se neprojeví, protože je neutralizován.
13.6. Reakce využívající značené protilátky nebo antigeny
13.6.1. Imunofluorescenční reakce (RIF, Koonsova metoda)
Tato metoda se používá pro expresní diagnostiku. Lze jej použít k detekci jak mikrobiálních antigenů, tak protilátek.
Přímá metoda RIF- imunitní reakce interakce protilátek s antigeny a protilátky jsou značeny fluorochromem - látkou schopnou vyzařovat světelná kvanta o určité vlnové délce při vystavení světlu o určité vlnové délce. Zvláštností této metody je nutnost odstranit nezreagované složky, aby se vyloučila detekce nespecifické luminiscence. K tomu smyjte nezreagované protilátky. Výsledky jsou hodnoceny pomocí fluorescenčního mikroskopu. Bakterie v nátěru ošetřeném takovým luminiscenčním sérem září na tmavém pozadí podél obvodu buňky.
Nepřímá metoda RIF se používá častěji než předchozí. Tato reakce se provádí ve dvou stupních. V první fázi se antigeny vzájemně
interagují s odpovídajícími protilátkami a tvoří imunitní komplexy. Všechny složky, které nezreagovaly (tj. nejsou součástí imunitních komplexů), musí být odstraněny promytím. Ve druhé fázi je výsledný komplex antigen-protilátka detekován pomocí fluorochromovaného antiglobulinového séra. V důsledku toho vzniká komplex mikrob + antimikrobiální králičí protilátky + protilátky proti králičím imunoglobulinům, značený fluorochromem. Výsledky jsou hodnoceny pomocí fluorescenčního mikroskopu.
13.6.2. Enzymová imunosorbentní metoda nebo test
ELISA - nejběžnější moderní metoda, používané k diagnostice virových, bakteriálních, protozoálních infekcí, zejména k diagnostice infekce HIV, virová hepatitida atd.
Existuje mnoho modifikací ELISA. Široce se používá nekompetitivní ELISA na pevné fázi. Provádí se v 96-jamkových polystyrénových destičkách (pevná fáze). Při provádění reakce je nutné v každém stupni smýt nezreagované složky. Při stanovení protilátek se do jamek, na kterých se sorbují antigeny, přidá testované krevní sérum a poté antiglobulinové sérum značené enzymem. Reakce se provádí přidáním substrátu pro enzym. V přítomnosti enzymu se substrát mění a komplex enzym-substrát se volí tak, aby se produkt vzniklý při reakci zbarvil. Při pozitivní reakci je tedy pozorována změna barvy roztoku. Pro stanovení antigenů se nosič na pevné fázi senzibilizuje protilátkami, poté se k antigenům postupně přidá testovaný materiál (antigeny) a enzymaticky značené sérum. Aby reakce proběhla, přidá se substrát pro enzym. Při pozitivní reakci dochází ke změně barvy roztoku.
13.6.3. Imunoblotting
Tato metoda je založena na kombinaci elektroforézy a ELISA. Při provádění imunoblottingu (blotting z angl. skvrna- spot) komplexní směs antigenů se nejprve podrobí elektroforéze v polyakrylamidovém gelu. Výsledná frakcionovaná anti-
genové peptidy jsou přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Na bloty se pak působí enzymem značenými protilátkami proti specifickému antigenu, tzn. proveďte ELISA blot. Imunoblotting se používá při diagnostice infekcí, jako je HIV.
13.6.4. Imunitní elektronová mikroskopie
Metoda spočívá v mikroskopii v elektronový mikroskop viry (méně často jiné mikroby), předem ošetřené vhodným imunitním sérem značeným elektronově opticky hustými přípravky, například feritinem, proteinem obsahujícím železo.
13.7. Průtoková cytometrie
Krvinky se diferencují na základě laserové cytofluorometrie. K tomu se požadované buňky obarví fluorescenčními monoklonálními protilátkami proti CD antigenům. Vzorek krve po ošetření značenými protilátkami prochází tenkou zkumavkou a prochází jí laserový paprsek, který vybudí fluorochrom ke záři. Intenzita fluorescence koreluje s hustotou antigenů na buněčném povrchu a lze ji kvantitativně měřit pomocí fotonásobiče. Získané výsledky se převedou do histogramu.
Ke stanovení se používá průtoková cytometrie imunitní stav(obsah hlavních populací lymfocytů, obsah intracelulárních a extracelulárních cytokinů, funkční aktivita NK buněk, aktivita fagocytózy atd.).
IMUNOMIKROBIOLOGICKÉ STUDIE
Imunologické metody se používají k řešení mnoha problémů:
1. Posouzení stavu imunitní systém osoba (imunitní stav) stanovením kvantitativní a funkční charakteristiky buňky imunitního systému a jejich produkty.
2. Stanovení složení a vlastností lidských tkání: krevní skupiny, Rh faktor, transplantační antigeny.
3. Diagnostika infekčních onemocnění a rezistence vůči nim detekcí a stanovením titrů protilátek (sérodiagnostika), identifikací antigenů patogenů v těle a stanovením buněčných reakcí na tyto antigeny.
4. Seroidní identifikace kultur bakterií a virů izolovaných z těla lidí a zvířat.
5. Detekce v lidském těle a v vnější prostředí jakékoli látky s antigenními nebo haptenovými vlastnostmi (hormony, enzymy, jedy, léky, léky atd.).
6. Identifikace imunopatologických stavů, alergií, transplantačních a protinádorových reakcí.
Proces interakce mezi antigenem a protilátkou sérologické reakce probíhá ve dvou fázích:
1) charakteristický- fáze interakce, ve které dochází ke komplementární kombinaci aktivních center protilátek (paratopů) a epitopů antigenu. Tato fáze obvykle trvá několik sekund nebo minut;
2) nespecifické- fáze projevu, charakter vnější znaky tvorba imunitních komplexů. Tato fáze může trvat několik minut až několik hodin.
K optimální specifické interakci protilátek s antigenem dochází v izotonickém roztoku s pH blízkým neutrálnímu. Reakce antigen-protilátka v systému in vitro může být doprovázena výskytem několika jevů
· aglutinace,
· srážky,
· lýza.
Vnější projevy reakce závisí na fyzikálně-chemických vlastnostech antigenu (velikost částic, fyzický stav), třída a typ protilátek (kompletní a neúplné), stejně jako experimentální podmínky (konzistence média, koncentrace soli, pH, teplota).
Polyvalence antigenů a protilátek zajišťuje tvorbu agregátů viditelných pouhým okem. K tomu dochází v souladu s teorií tvorby sítě, podle níž jsou na výsledný komplex antigen-protilátka postupně připojeny další molekuly protilátky a antigenu. V důsledku toho se tvoří síťové struktury, které se mění v agregáty, které se vysrážejí. Povaha a závažnost reakce závisí na kvantitativním poměru antigenů a protilátek. Nejintenzivnější reakce nastanou, když jsou reagencie v ekvivalentních poměrech.
Předpoklad tvorba mřížky (sítě) - přítomnost více než tří antigenních determinant pro každou molekulu antigenu a dvou aktivních center pro každou molekulu protilátky. Molekuly antigenu jsou uzly mřížky a molekuly protilátek jsou spojovací články. Oblast optimálních poměrů (zóna ekvivalence) koncentrací antigenu a protilátek, kdy po vytvoření sedimentu nejsou v supernatantu detekovány volné antigeny ani volné protilátky.
Agregáty, které se mohou vysrážet, se tvoří, když se antigeny spojí s plnými protilátkami. Nekompletní protilátky (monovalentní) nezpůsobují tvorbu síťových struktur a velkých agregátů. K detekci takových protilátek použijte speciální metody založené na použití antiglobulinů (Coombsova reakce).
Sérologické testy se pro svou vysokou specificitu a senzitivitu používají k detekci a kvantifikace antigeny a protilátky. Množství imunoreagentů v reakcích je vyjádřeno titrem - maximálním ředěním séra nebo antigenu, při kterém je ještě pozorována reakce.
Sérologické reakce v mikrobiologických a imunologických laboratořích se používají ke dvěma účelům:
1) pro séroidentifikaci mikroorganismů, toxinů, antigenů obecně pomocí známé protilátky (imunitní diagnostické sérum),
2) pro sérodiagnostiku - stanovení povahy protilátky v krevním séru pacienta na bakteriální, virová a méně často jiná infekční onemocnění pomocí známého antigenu (diagnosticum).
K určení generika, druhu a typu antigenu jsou zapotřebí známá imunodiagnostická séra. Získávají se opakovaným podáváním zvířatům (nejčastěji králíkům) ve zvyšujících se dávkách usmrcených nebo živých mikroorganismů, produktů jejich rozkladu, neutralizovaných nebo nativních toxinů. Po určitém cyklu imunizace zvířat se provádí masivní prokrvení nebo celkové vykrvení zvířete. Krev odebraná do sterilní nádoby se nejprve umístí do termostatu při teplotě 37°C na 4 - 6 hodin pro urychlení srážení, poté na jeden den do lednice. Vzniklé průhledné sérum se odsaje do sterilní nádobky, přidají se konzervační látky, stanoví se titr protilátek, zkontroluje se sterilita a nalije se do ampulí.
Jsou používány neadsorbovaný A adsorbované diagnostická séra. Neadsorbovaná séra mají vysoké titry protilátky, ale jsou schopny poskytnout skupinové (křížové) reakce.
Adsorbovaná séra se vyznačují přísnou specificitou účinku (reagují pouze s homologním antigenem). Nazývají se séra obsahující protilátky pouze proti jednomu specifickému antigenu monoreceptor.
Produkují také séra značená fluorochromy, enzymy a radioizotopy, které umožňují s vysokou přesností detekovat i stopy antigenu.
Suspenze živých nebo usmrcených bakterií, produktů jejich rozpadu, toxinů a virů se používají jako antigeny (diagnostika) v sérologických reakcích. V některých případech se používají extrakty nebo chemicky izolované antigeny z mikroorganismů a živočišných tkání.
Všechny imunomikrobiologické metody lze rozdělit do 3 skupin:
1) na základě přímá interakce antigenu s protilátkou(jevy aglutinace, precipitace, hemaglutinace, imobilizace atd.);
2) na základě zprostředkovaná interakce antigenu s protilátkou(reakce nepřímá hemaglutinace koagulace, latexová aglutinace, uhlíková aglomerace, bentonitová aglutinace, fixace komplementu atd.);
3) pomocí značené protilátky nebo antigeny(metoda fluorescenčních protilátek, enzymatické imunoanalýzy a radioimunoanalýzy a další metody).
AGLUTINAČNÍ REAKCE
Tyto reakce zahrnují antigeny ve formě částic (mikrobiálních buněk, červených krvinek a dalších korpuskulárních antigenů), které jsou slepeny dohromady protilátkami a vysrážejí se.
K provedení aglutinační reakce(RA) jsou zapotřebí tři složky: 1) antigen (aglutinogen);
2) protilátka (aglutinin)
3) elektrolyt (izotonický roztok chloridu sodného).
Přibližná aglutinační reakce (RA)
Indikativní nebo destička RA se umístí na podložní sklíčko při pokojové teplotě. K tomu použijte Pasteurovu pipetu a naneste odděleně na sklenici kapku séra v ředění 1:10 až 1:20 a kontrolní kapku izotonického roztoku chloridu sodného. Do obou bakteriologických smyček se zavedou kolonie nebo denní kultura bakterií (kapka diagnostica) a důkladně se promísí. Reakce jsou zohledněny vizuálně po několika minutách, někdy pomocí lupy (x5). Při pozitivní RA je v kapce séra zaznamenán výskyt velkých a malých vloček, při negativní RA zůstává sérum rovnoměrně zakalené.
Detailní aglutinační reakce za účelem identifikace titru specifických protilátek u pacienta.
Plně rozvinutá RA pro sérodiagnostiku se provádí v séru pacientů. Také se ředí v izotonickém roztoku chloridu sodného od 1:50 - 1:100 do 1:800 nebo 1:1600. Protože nižší sérové titry mohou obsahovat normální aglutininy nalezené v zdravých lidí nebo pacientů s jinou diagnózou (diagnostický titr). Jako antigen v této reakci se používají diagnostická - známé suspenze, obvykle usmrcených bakterií.
Do aglutinačních zkumavek se nejprve nalije 1 ml izotonického roztoku chloridu sodného. Do prvního z nich se přidá 1 ml séra zředěného 1:100 a po jeho promíchání se 1 ml přenese do druhého, z druhého na třetí atd. K výsledným dvojnásobným ředěním sér (od 1:100 do 1:1600 nebo více) se přidají 1-2 kapky bakteriální suspenze obsahující 3 miliardy mikrobiálních tělísek v 1 ml. Zkumavky se protřepou a umístí na 2 hodiny do termostatu při 37 °C, poté se udržují při teplotě místnosti po dobu 24 hodin.
Podrobná aglutinační reakce se zohledňuje postupným vyhodnocením každé zkumavky, počínaje kontrolními, za mírného protřepání. V kontrolních zkumavkách by neměla být žádná aglutinace. Intenzita aglutinační reakce je označena následujícími znaky: ++++ - úplná aglutinace (aglutinace vloček v absolutně průhledné kapalině); +++ - neúplná aglutinace (vločky v mírně opalescentní kapalině); ++ - částečná aglutinace (vločky jsou jasně viditelné, kapalina je mírně zakalená); + - slabá, pochybná aglutinace - kapalina je velmi zakalená, vločky v ní jsou těžko rozlišitelné; - - absence aglutinace (kapalina je rovnoměrně zakalená).
Za titr séra se považuje jeho poslední ředění, ve kterém je intenzita aglutinace hodnocena jako ne méně než dva plusy (++)
Aglutinační reakce Aglutinační reakce
(RA) je metoda pro identifikaci a kvantifikaci Ag a Ab na základě jejich schopnosti tvořit aglomeráty viditelné pouhým okem. Na oddělení infekčních nemocí. onemocnění nebo pro jiné účely se používá k identifikaci neznámých mikrobů a buněk, ke stanovení přítomnosti a množství Ab v krvi a jiných tekutinách. Princip stanovení je založen na specifičnosti interakce mezi Ag a Ab a spočívá v nalezení známého od neznámého. Existuje mnoho možností pro RA: kvantitativní a kvalitativní, zkumavky a skleněné, objemové a kapkové, konvenční, zrychlené a expresní metody. Pro fázi RA potřebujete: 1) s-ka krev. Ve variantě s určením typu (var) bakterií jsou použity průmyslové aglutinační testy vyrobené imunizací králíků. Ve variantě s určením typu Ab je z testu odebrán vzorek krve. lidí nebo zvířat. Roztok musí být sterilní a bez suspendovaných částic. Připravte základní ředění ve fyziologickém roztoku. Měl by být 2-4krát nižší než diagnostický titr pro toto onemocnění; 2) Ag. Ve verzi reakce s určením typu Ab se používají průmyslové diagnostické soupravy; ve variantě se stanovením Ag se diagnostika připravují sama ve formě suspenze 1-3 miliardy ve fyziologickém roztoku 18-20hodinového agarového (méně často bujónového) testu. mikrob inaktivovaný zahříváním ve vodní lázni při 70 °C po dobu 1 hodiny nebo 24hodinovou inkubací při 37 °C s formaldehydem (konečná koncentrace 0,2 %); 3) elektrolyt ve formě solného roztoku. Inscenační technika objemová sériová trubice RA pro stanovení titru Ab v s-ki: z hlavního ředění s-ki se připraví několik řad pracovních ředění. Počet řádků závisí na počtu diagnostických vyšetření v experimentu, počet a diluční faktory jsou určeny diagnostickým titrem suspektního onemocnění. Série musí obsahovat alespoň ředění odpovídající diagnostickému titru Ab, dvě ředění pod ním a dvě ředění nad ním. je-li například diagnostický titr 1:100, pak s volumetrickou metodou stagingu RA by měly být připraveny následující ředění: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; s kapáním metoda, první ředění (1:25) není potřeba, ale je potřeba další vyšší ředění - 1:800. vědecký výzkum s-ku se titruje na negativní reakce. Ředí se následovně: 0,25 ml fyziologického roztoku se nalije do všech zkumavek kromě 1., kdy se reakce provádí v objemu 0,5 ml, a 0,5 ml, pokud se reakce provádí v objemu 1. ml. Nalijte 0,25 (0,5) ml hlavního ředění do 1. a 2. zkumavky, z 2. zkumavky, do odříznutého objemu a chovný s-k a zvýšené 2x se převede 0,25 (0,5) ml na 3., z 3. na 4. atd. do posledního se z odřezku do všeho nalije 0,25 (0,5) ml, aby se vyrovnaly objemy. Každé ředění se provádí pomocí samostatné pipety. Pokud se do experimentu vezme několik diagnostik, pak se pro každé z nich připraví jeho vlastní série ředění stejným způsobem. Diagnosticum se přidává do každého ředění zkumavky v objemu rovném objemu zkumavky, v důsledku čehož se ředění v každé zkumavce zdvojnásobí. Experiment odpovídá kontrole s-ki (0,25 - 0,5 ml hlavního ředění s-ki a stejné množství fyziologického roztoku) a kontrole Ag (0,25 - 0,5 ml diagnostika a stejné množství fyziologického roztoku). Pokud je v experimentu použito několik diagnostických prostředků, pak má každý svou vlastní antigenní kontrolu. Stojan se zkumavkami se dobře protřepe a umístí na 4 hodiny do termostatu při 37 °C a poté se nechá při pokojové teplotě do druhého dne, poté se zaznamená PA na základě množství sedimentu a stupně vyjasnění. kapalina. Stanovení těchto indikátorů v závislosti na povaze aglutinátů se provádí pouhým okem na tmavém pozadí, v aglutinoskopu nebo přes konkávní povrch zrcátka mikroskopu. Počítání začíná kontrolami: kontrola C by měla být průhledná, Ag by mělo být rovnoměrně zakalené (po protřepání zkumavky). Pokud jsou kontroly dobré, zjistěte přítomnost a stupeň aglutinace ve všech zkumavkách, které jsou označeny plusy: velký sediment a úplné vyčeření kapaliny - 4 plusy; velký sediment a neúplné čištění kapaliny - 3 plusy; znatelný sediment a znatelné čištění kapaliny jsou 2 plusy. Poté se stanoví titr: nejvyšší ředění s intenzitou aglutinace alespoň 2 plusy. Výzkum titru s-ki jsou porovnány s diagnostickým titrem pro toto onemocnění. Pokud se vyšetřuje titr. s-ki je 2x nižší než diagnostická hodnota, reakce je hodnocena jako pochybná; pokud je titr stejný diagnostika - jak slabě pozitivní; je-li 2-4krát vyšší, považuje se za kladný, je-li 8krát a vícekrát vyšší, považuje se za ostře pozitivní. Když je Ab rozšířená u zdravých lidí, používá se k hodnocení RA zvýšení titru Ab. Pro určení typu Ar v sériovém RA musí počet řádků odpovídat počtu použitému pro identifikaci diagnostické testy. Z hlavního ředění diagnostického testu se připraví série po sobě jdoucích dvojnásobných ředění stejným způsobem jako u RA pro stanovení titru Ab. Faktory ředění závisí na titru aglutinačního testu.V experimentu je nutná přítomnost ředění rovného titru testu a také 2, 4, 6, 8 krát nižšího než je. titr diagnostického testu je 1 3200, pak byste měli použít ředění 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 Stejný objem testovaného Ag se přidá do ředění testu, výsledkem je ředění test se zvýší 2krát.Do experimentu se přidají 2 kontroly testu a Ag. Pokud je v experimentu zapojeno několik s-k, pak každý z nich potřebuje svou kontrolu Po dokončení reakce se stojanem silně zatřese a umístí v termostatu při 37 ° C. Výsledky se berou v úvahu, jak je popsáno výše.. Hodnocení reakce má vlastnosti Aby bylo možné vyvodit závěr o souladu studie. Ag vzatý do experimentu musí titr reakce odpovídat alespoň polovině titru standardního diagnostického testu Titry 1 4 a nižší jsou považovány za skupinovou reakci Kapat md staging RA se od volumetrického liší tím, že s-ku se ředí v objemu 1 ml, Ag se používá ve vyšší koncentraci (10 miliard/ml) a přidává se 1 - 2 kapky do zkumavky Ředění léčiva po přidání Ag se považuje za nezměněné Jinak je způsob nastavení, zaznamenávání a vyhodnocení obdobný jako u objemové metody
(Zdroj: Slovník pojmů mikrobiologie)
Aglutinační reakce.
Aglutinační reakce je slepení a precipitace mikrobiálních nebo jiných buněk (erytrocytů) vlivem protilátek za přítomnosti elektrolytu. Viditelným efektem reakce (aglutinační fenomén) je tvorba sraženiny zvané aglutinát.
Tato reakce se používá pro sérodiagnostika A séroidentifikace. RA se používá pro sérodiagnostiku (detekce protilátek v krevním séru pacientů) břišní tyfus a paratyfus(Vidální reakce), brucelóza(Wrightova reakce) tularémie a leptospirózy. RA se používá k séroidentifikaci (určení typu patogenu izolovaného z pacienta), když střevní infekce, černý kašel, cholera atd.
Komponentyreakce:
1. A ntigen (aglutinogen) – jedná se o celé (ne zničené) mikrobiální nebo jiné buňky ( korpuskulární, nerozpustný antigen). Aglutinogeny- toto je pozastavení naživu nebo zabil mikrobiální buňky nebo jakékoli jiné buňky. Antigeny mohou být neznámé nebo známé. Neznámý aglutinogen je mikrobiální kultura izolovaná z těla pacienta, kterou je třeba určit. Známý antigen - diagnosticum- diagnostický lék - suspendování mrtvých mikroby známé druhy ve fyziologickém roztoku. Toto pozastavení zataženo (neprůhledné), protože mikrobiální buňky se nerozpustí, ale zůstanou neporušené. Známý aglutinogen bude použit k detekci neznámých protilátek v krevním séru pacientů.
2. Protilátka (aglutinin)- nachází se v krevním séru. Protilátky mohou být také neznámé nebo známé. Neznámé protilátky, které mají být stanoveny, jsou v krevním séru nemocný člověk. Známé protilátky se nacházejí v imunní diagnostická séra které se nazývají aglutinační séra. Používají se pro séroidentifikaci, tzn. k určení neznámého antigenu – typu mikrobiální kultury.
3. Elektrolyt– 0,9% roztok chloridu sodného.
Metody stagingu RA.
1. Přibližná (lamelární) RA– provádí se na skle. Na podložní sklíčko naneste 2 kapky séra a 1 kapku izotonického roztoku. Mikrobiální kultura se zavede do jedné z kapek séra a do kapky izotonického roztoku ve smyčce a promíchá se. Kapka izotonického roztoku s choroboplodnými zárodky – kontrola antigenu, kapka bezmikrobní séra – kontrola protilátek, kapka séra s mikroby – Zkušenosti. Pokud sérum obsahuje protilátky odpovídající mikrobiálním antigenům, které se s ním mísí, pak se protilátky a antigeny na sebe specificky navážou a po 1–3 minutách se v testovací kapce objeví aglutinační vločky. Antigenová kontrola by měla být zakalená a protilátková kontrola by měla být čirá. Výsledky reakce se zaznamenávají na základě výskytu aglutinátových vloček . Pokud vločky vypadnou, je reakce pozitivní, tzn. Antigen odpovídá protilátce a antigen lze použít ke stanovení protilátky nebo naopak. Pokud zákal zůstane, reakce je negativní.
2. Detailní aglutinační reakce - prováděné ve zkumavkách. Nejprve připravte 2-násobné ředění krevního séra nemocného člověka od 1:50 do 1:1600. 1 ml izotonického roztoku chloridu sodného se nalije do 6 zkumavek. Do první zkumavky se přidá 1 ml pacientova krevního séra v ředění 1:50, promíchá se a získá se ředění 1:100, poté se přenese 1 ml v ředění 1:100 do druhé zkumavky a získá se ředění 1:200 atd. Dvě zkumavky jsou uchovávány pro kontrolu antigenu a séra. Ke kontrole séra přidejte pouze sérum v ředění 1:50, ke kontrole antigenu - pouze antigen. Přidejte 0,1 ml antigenu - diagnosticum (O- nebo H-) do všech ostatních zkumavek a vložte všechny zkumavky do termostatu při 37°C na 18-20 hodin. Výsledky reakce se zaznamenávají podle povahy, množství vzniklé sraženiny (aglutinátu) a stupně zákalu. Zaúčtování se provádí pouze s následujícími výsledky v kontrolách: kontrola séra - průhledná, kontrola antigenu - zakalená. O-protilátky poskytují jemnozrnnou sraženinu. H-protilátky – hrubozrnné. Na základě poslední zkumavky, ve které je ještě patrná aglutinační reakce, se stanoví diagnostický titr.
Při sérodiagnostice onemocnění je důležité nejen detekovat specifické protilátky proti konkrétnímu patogenu, ale také identifikovat jejich množství, tzn. stanovit titr protilátek, abychom mohli hovořit o přítomnosti onemocnění způsobeného tímto patogenem. Tento titr se nazývá diagnostický titr. Chcete-li například diagnostikovat břišní tyfus, musíte určit titr protilátek 1:400, ale ne méně. Ještě přesnějších výsledků se dosáhne detekcí nárůstu protilátek v párových sérech. Sérum pacienta se odebírá na počátku onemocnění a po 3–5 nebo více dnech. Pokud se titr protilátek zvýší alespoň 4krát, můžeme tedy mluvit o aktuálním onemocnění.
