Coombsova reakce je přímá a nepřímá. Coombsův test pro diagnostiku hemolytického onemocnění novorozence

Coombsův test je metoda laboratorní výzkum, vyrobený ovlivněním hemaglutinace. Je založena na citlivosti protilátek k imunoglobulinům a enzymovým prvkům a také na jejich schopnosti aglutinovat erytrocyty potažené C3 nebo Lg.

Přímá Coombsova diagnostika

Používá se k detekci protilátek nebo komponent komplementu instalovaných na vnější straně buněk. Přímý Coombsův test se provádí následovně.

Použití takového vzorku

Přímá Coombsova diagnostika se používá v určitých případech, jako jsou:

• transfuzní účinky;
• autoimunitní hemolýza;
• léčivý hemolytická anémie.

Nepřímý Coombsův test

Tato diagnóza umožňuje detekovat protilátky proti buňkám v séru, které je inkubováno zpravidla s dárcovskými červenými krvinkami typu 0, a poté je proveden přímý test. Aplikovat nepřímá diagnóza Coombs v následujících případech:

Jak se připravit na analýzu

Pro přípravu na zkoušku platí určitá pravidla.

1. Pokud je pacient novorozenec, rodiče si musí být vědomi toho, že test pomůže diagnostikovat hemolytické onemocnění novorozence.
2. Pokud má pacient podezření na hemolytickou anémii, je třeba mu vysvětlit, že analýza mu umožní zjistit, zda je způsobena ochrannými poruchami, léky nebo jinými faktory.
3. Coombsův test, přímý ani nepřímý, nečiní žádná omezení ve výživě nebo dietě.
4. Je nutné pacienta upozornit, že vyšetření bude vyžadovat odběr krve ze žíly, a také mu přesně sdělit, kdy bude venepunkce provedena.
5. Také byste měli být na tuto možnost upozorněni nepohodlí po dobu přikládání obvazu na paži a samotného zákroku.
6. Léky, které mohou ovlivnit výsledek vzorku, by měly být vysazeny.

Mezi tyto léky patří:

• "Streptomycin";
• "Methyldopa";
• "Prokainamid";
• sulfonamidy;
• "Melfalan";
• "chinidin";
• "Rifampin";
• "Isoniazid";
• cefalosporiny;
• "Hydralazin";
• "chlorpromazin";
• "Levodopa";
• "tetracyklin";
• "difenylhydantoin";
• "Ethosuximid";
• "Penicilin";
• kyselina mefenamová.

Odběr krve se provádí ráno nalačno.

Jak se akce koná

Coombsův test se provádí v následujícím pořadí:

1. Při provádění diagnostiky u dospělého pacienta se po venepunkci odebírá krev do zkumavek s EDTA (ethylendiamintetraacetát).
2. Krev novorozence se odebírá z pupeční šňůry do kádinky obsahující EDTA.
3. Oblast vpichu se přitlačí vatovým tamponem, dokud se krvácení nezastaví.
4. Pokud se v místě venepunkce objeví modřina, předepisují se teplé obklady.
5. Po odběru krve je pacientovi umožněn návrat k užívání léků.
6. Je nutné informovat rodiče novorozence, že může být zapotřebí sekundární analýza pro sledování dynamiky anémie.

Výhody Coombsova testu

Takový výzkum má některé výhody, jmenovitě:

Nevýhody analýzy

Pozitivní Coombsův test je poměrně pracná vyšetřovací metoda, která vyžaduje charakteristickou přesnost provedení. Při jeho užívání se můžete setkat s určitými obtížemi, souvisejícími zejména s interpretací slabě pozitivních účinků.

Bylo zjištěno, že chybné negativní nebo slabě pozitivní reakce při výrobě Coombsových testů mohou být důsledky neuspokojivě aktivního mytí buněk, oslabení antiglobulinového činidla zbytky séra a také spojení s nemastnými povrchy, na kterých může antiglobulin opravit, čímž ztratí svou účinnost.

Coombsův test má ještě jednu nevýhodu – nízkou stabilitu antiglobulinového činidla, jehož získávání a skladování individuální vlastnosti, což obdobně znesnadňuje numerické posouzení vlivu antiglobulinového séra na hemaglutinaci.

Nemoci, které lze zjistit při vyšetření

Coombsova diagnostika umožňuje odhalit určité typy onemocnění, jako jsou:

• hemolytická malátnost novorozence;
• různé transfuzní reakce;
• autoimunitní hemolýza;
• hemolytická anémie způsobená léky.

Dnes je Coombsův test považován za poměrně populární systém krevních testů pro dospělé i novorozence. Umožňuje identifikovat mnoho různých onemocnění.

Protilátky, umístěné na povrchu erytrocytů, mohou být buď ve statickém, nebo volném stavu v krevní plazma. V závislosti na stavu protilátek se provádí přímá nebo nepřímá Coombsova reakce. Pokud existuje důvod se domnívat, že protilátky jsou fixovány na povrchu červených krvinek, provede se přímý Coombsův test. Test v tomto případě probíhá v jedné fázi – sčítání antiglobulinové sérum. Pokud jsou na povrchu červených krvinek přítomny neúplné protilátky, aglutinacečervené krvinky

Nepřímá reakce

Nepřímá Coombsova reakce probíhá ve 2 fázích. Nejprve je třeba uměle implementovat senzibilizacečervené krvinky K tomu se inkubují červené krvinky a testované krevní sérum, což způsobí fixaci protilátek na povrchu červených krvinek. Poté se provede druhá fáze Coombsova testu - přidání antiglobulinového séra.

Srážková reakce - RP (z lat. praecipilo sraženina) je tvorba a precipitace komplexu rozpustného molekulárního antigenu s protilátkami ve formě zákalu tzv. sraženina. Vzniká smícháním antigenů a protilátek v ekvivalentních množstvích, nadbytek jednoho z nich snižuje úroveň tvorby imunitního komplexu. Precipitační reakce se provádí ve zkumavkách (kroužková precipitační reakce), v gelech, živných médiích atd. Odrůdy srážecí reakce v polotekutém agaru nebo agarózovém gelu, dvojitá imunodifúze tzv. Ouchterlony, radiap imunodifuze, imunoepektroforéza atd.

Reakce srážení kruhu. Reakce se provádí v úzkých precipitačních zkumavkách: na imunitní sérum se navrství rozpustný antigen. Při optimálním poměru antigenu a protilátek se na hranici těchto dvou roztoků vytvoří neprůhledná vrstva. prstenec sraženiny. Pokud se jako antigeny v reakci použijí vařené a filtrované tkáňové extrakty, pak se tato reakce nazývá první termoprecipitační reakce (reakce, při které je detekován hapten antraxu).
Ouchterlonyho dvojitá imunodifúzní reakce. Pro nastavení reakce se na skleněnou desku nalije tenká vrstva roztaveného agarového gelu a po vytvrzení se v ní vyříznou jamky. Antigeny a imunitní séra jsou umístěny odděleně do jamek gelu, které difundují směrem k sobě. V místě setkání v ekvivalentních poměrech tvoří sraženinu ve formě bílého pruhu. Ve vícesložkových systémech se mezi jamkami s antigeny a protilátkami objeví několik linií sraženiny; v identických AG se sraženiny spojují; v neidentických AG se protínají.
Radiální imunodifúzní reakce. Imunitní sérum s roztaveným agarovým gelem se rovnoměrně nalije na sklenici. Po ztuhnutí v gelu se udělají jamky, do kterých se umístí antigen v různých ředěních. Antigen difundující do gelu vytváří kruhové precipitační zóny kolem jamek s protilátkami. Průměr precipitačního prstence je úměrný koncentraci antigenu. Reakce se používá ke stanovení imunoglobulinů v krevním séru různé třídy, komponenty komplementového systému atd.
Imunoelektroforéza- kombinace metody elektroforézy a imunoprecipitace: do jamek gelu se zavede směs antigenů a elektroforézou se v gelu separuje, do žlábku paralelně se zónami elektroforézy se přidá imunosérum, jehož protilátky difundují do gel a tvoří precipitační linie v místě „setkání“ s antigenem.
Flokulační reakce(podle Ramona) (z lat. f1oecus - vločky vlny) - výskyt opalescence nebo flokulentní hmoty (imunoprecipitace) ve zkumavce během reakce toxin - antitoxin nebo toxoid - antitoxin. Používá se ke stanovení aktivity antitoxického séra nebo toxoidu.

HLA typizace- studium lidského hlavního histokompatibilního komplexu - HLA komplexu. Tato formace zahrnuje oblast genů na chromozomu 6, které kódují HLA antigeny zapojené do různých imunitních reakcí.

Úkoly pro HLA typizace mohou být velmi odlišné - biologická identifikace (typ HLA se dědí spolu s rodičovskými geny), určení predispozice k různé nemoci, výběr dárců pro transplantaci orgánů – jedná se o porovnání výsledků HLA typizace tkání dárce a příjemce. Pomocí HLA typizace se zjišťuje, jak podobní nebo odlišní jsou manželé z hlediska histokompatibilních antigenů, aby bylo možné diagnostikovat případy neplodnosti.

HLA typizace naznačuje Analýza polymorfismu HLA a provádí se dvěma metodami – sérologickou a molekulárně genetickou. Klasická sérologická metoda typizace HLA je založena na mikrolymfocytotoxickém testu a molekulární metoda využívá PCR (polymerázová řetězová reakce).

sérologické HLA typizace prováděné na izolovaných buněčných populacích. Antigeny hlavního histokompatibilního komplexu jsou neseny hlavně lymfocyty. Proto se jako hlavní nosiče antigenů třídy I používá suspenze T lymfocytů a pro stanovení antigenů HLA třídy II suspenze B lymfocytů. K izolaci požadovaných buněčných populací z plné krve se používá buď centrifugace, nebo imunomagnetická separace. Předpokládá se, že první metoda může vést k falešně pozitivním údajům, protože to vede ke smrti některých buněk. Druhá metoda je uznávána jako specifičtější – více než 95 % buněk zůstává životaschopných.

Ale základ pro provedení lymfocytotoxického testu HLA typizace je specifické sérum obsahující protilátky proti různým alelickým variantám antigenů HLA třídy I a II. Sérologický test může určit typ HLA tím, že zkoumá, která séra reagují s lymfocyty a která ne.

Pokud dojde k reakci mezi buňkami a sérem, výsledkem je vytvoření komplexu antigen-protilátka na povrchu buňky. Po přidání roztoku obsahujícího komplement dochází k buněčné lýze a smrti. Sérologický test typizace HLA se hodnotí pomocí fluorescenční mikroskopie k vyhodnocení pozitivních (červená fluorescence) a negativních (zelená fluorescence) reakcí nebo mikroskopie s fázovým kontrastem k obarvení jader mrtvých buněk. Výsledek typizace HLA je odvozen s přihlédnutím ke specifitě zreagovaného séra a zkříženě reagujících skupin antigenů a intenzitě cytotoxické reakce.

Nevýhody sérologického HLA typizace jsou přítomnost zkřížených reakcí, slabá afinita protilátek nebo nízká exprese HLA antigenů, nepřítomnost proteinových produktů v řadě HLA genů.

Modernější, molekulární metody HLA typizace používají již standardizované syntetické vzorky, které nereagují s antigeny na povrchu leukocytů, ale s DNA a přímo indikují, které antigeny jsou ve vzorku přítomny. Molekulární metody nevyžadují živé leukocyty, žádné lidská buňka lze studovat a k práci stačí pár mikrolitrů krve, nebo se můžete omezit na seškrabování z ústní sliznice.

Molekulární genetika HLA typizace využívá metodu PCR, jejímž prvním krokem je získání čisté genomové DNA (z plné krve, suspenze leukocytů, tkání).

Vzorek DNA je poté zkopírován – amplifikován in vitro pomocí primerů (krátká jednovláknová DNA) specifických pro konkrétní HLA lokus. Konce každého páru primerů musí být přísně komplementární k jedinečné sekvenci odpovídající specifické alele, jinak nedojde k amplifikaci.

Po PCR se při opakovaném kopírování získá velké množství fragmentů DNA, které lze posoudit vizuálně. K tomu se reakční směsi podrobí elektrolýze nebo hybridizaci a pomocí programu nebo tabulky se určí, zda došlo ke specifické amplifikaci. Výsledek typizace HLA je prezentován ve formě komplexní zprávy na genové a alelické úrovni. Vzhledem ke standardizaci použitých vzorků molekulární HLA typizace přesněji sérologické. Kromě toho poskytuje více informací (více nových alel DNA) a další vysoká úroveň jeho upřesnění, protože umožňuje identifikovat nejen antigeny, ale i samotné alely, které určují, který antigen je na buňce přítomen.

Reakce imunitní lýzy. Reakce je založena na schopnosti specifických protilátek tvořit imunitní komplexy s buňkami včetně erytrocytů a bakterií, což vede k aktivaci komplementového systému po klasické dráze a buněčné lýze. Z imunitních lýzových reakcí se nejčastěji využívá reakce hemolytická a zřídka bakteriolýzní (hlavně při odlišení cholery a choleře podobných vibrií).

Reakce hemolýzy. Pod vlivem reakce s protilátkami v přítomnosti komplementu se zakalená suspenze červených krvinek změní na jasně červenou průhlednou kapalinu - „lakovou krev“ v důsledku uvolňování hemoglobinu. Při nastavování diagnostické reakce fixace komplementu (FFR) se hemolytická reakce používá jako indikátor: k testování přítomnosti nebo nepřítomnosti (fixace) volného komplementu.

Lokální hemolytická reakce v gelu(Erneova reakce) je jednou z variant hemolytické reakce. Umožňuje určit počet buněk tvořících protilátky. Počet buněk vylučujících protilátky - hemolyziny - je určen počtem hemolytických plaků, které se objevují v agarovém gelu obsahujícím erytrocyty, suspenzi buněk studované lymfoidní tkáně a komplementu.

Imunofluorescenční metoda

(RIF, imunofluorescenční reakce) je metoda pro detekci specifických Ag (Abs) pomocí Abs (Ags) konjugovaných s fluorochromem. Má vysokou citlivost a specificitu. Používá se pro expresní diagnostiku infekcí. onemocnění (identifikace patogenu ve výzkumném materiálu), dále pro stanovení Ab a povrchových receptorů a markerů leukocytů (imunofenotypizace) a dalších buněk. Přímý I. m. spočívá ve zpracování části tkáně nebo nátěru z patologického materiálu nebo mikrobiální kůry obsahující specifické Ab konjugované s fluorochromem; přípravek se promyje, aby se zbavil nenavázaných Abs a zkoumá se pod fluorescenčním mikroskopem. V pozitivních případech se kolem periferie objektu objeví zářící imunitní komplex. Kontrola je nezbytná k vyloučení nespecifické luminiscence. Na nepřímý. Jim. v první fázi se tkáňový řez nebo nátěr ošetří nefluorescenčním specifickým činidlem, ve druhé - luminiscenčním činidlem proti -globulinům zvířete, které bylo použito v první fázi. V kladném případě vzniká svítící komplex skládající se z Ar, At k němu a At proti At (sendvičová metoda). Kromě fluorescenčního mikroskopu se při fenotypizaci buněk bere v úvahu RIF. laserový třídič buněk .

Průtoková cytometrie- metoda optického měření parametrů buňky, jejích organel a procesů v ní probíhajících.

Tato technika zahrnuje detekci rozptylu světla z laserového paprsku, když jím buňka prochází v proudu kapaliny, a stupeň rozptylu světla umožňuje získat představu o velikosti a struktuře buňky. Kromě toho analýza bere v úvahu úroveň fluorescence chemických sloučenin, které jsou součástí buňky (autofluorescence) nebo přidané do vzorku před průtokovou cytometrií.

Buněčná suspenze, předem značená fluorescenčními monoklonálními protilátkami nebo fluorescenčními barvivy, vstupuje do proudu tekutiny procházející průtokovou kyvetou. Podmínky jsou voleny tak, aby se buňky seřadily jedna za druhou kvůli tzv. hydrodynamické zaměření paprsku v paprsku. V okamžiku, kdy buňka překročí laserový paprsek, detektory zaznamenají:

rozptyl světla v malých úhlech (od 1° do 10°) ( tuto vlastnost slouží k určení velikosti buňky).

rozptyl světla pod úhlem 90° (umožňuje nám posoudit poměr jádro/cytoplazma, stejně jako heterogenitu a zrnitost buněk).

intenzita fluorescence prostřednictvím několika fluorescenčních kanálů (od 2 do 18-20) - umožňuje určit složení subpopulace buněčné suspenze atd.

Coombsův test

Přímý Coombsův test je antiglobulinový test (aglutinace v gelu umožňující detekci kompletních divalentních protilátek), který detekuje protilátky třídy IgG a C3 složku komplementu na povrchu červených krvinek. Typicky mají protilátky detekované přímým Coombsovým testem širokou specifitu, která není spojena s dobře zavedeným antigenem. Pozitivní přímý Coombsův test jasně ukazuje, že pacient má hemolytickou anémii, i když ne všichni pacienti s pozitivním přímým antiglobulinovým testem trpí tímto onemocněním. Přibližně u 10 % pacientů nelze protilátky nebo složky komplementu na membráně červených krvinek stanovit přímým Coombsovým testem (test je negativní), přesto však trpí autoimunitní hemolytickou anémií. K objasnění specifity protilátek se v takových případech používají testy s jejich elucí. Přímý Coombsův test, pozitivní pouze na komplement, obvykle odkazuje na studené protilátky typu IgM. V tomto případě IgM protilátky není přítomen na červených krvinkách, když bazální teplota těla. Vzhledem k tomu, že protilátky IgM aktivně fixují komplement a komplement zůstává na červených krvinkách, u této formy autoimunitní hemolytické anémie (nemoc studených aggutininů) bude Coombsův test pozitivní pouze na komplement.

Přímý Coombsův test je pozitivní u autoimunitní hemolytické anémie způsobené teplými protilátkami, autoimunitní anémii vyvolanou léky (při užívání methyldopy má až 20 % pacientů pozitivní reakce), lékově adsorpční typ hemolytické anémie, imunokomplexní typ hemolytické anémie (test je pozitivní pouze na C3), s autoimunitní hemolytickou anémií způsobenou chladovými protilátkami - nemoc chladových aglutininů (test je pozitivní pouze na C3). U paroxysmální studené hemoglobinurie je přímý Coombsův test negativní.
V akutní období onemocnění v důsledku destrukce červených krvinek, na kterých bylo zaznamenáno velké množství protilátek, během hemolytické krize a také s nedostatečným počtem protilátek během chronický průběh onemocnění, může být pozorován negativní přímý Coombsův test.

:

• Důležitou podmínkou pro zajištění kvality laboratorních krevních testů je odběr materiálu nalačno, ráno (do 12:00).
• 12 hodin před testem byste se měli vyvarovat pití alkoholu, kouření, jídla a omezení fyzické aktivity.
• Ráno v den krevního testu můžete pít vodu.
• Vyhněte se užívání léků; Pokud není možné přestat užívat léky, musíte informovat laboratoř.
• Je vhodné vzít materiál před provedením jakýchkoli lékařských diagnostických postupů.
• Při hodnocení hladiny hormonů u žen je důležité vzít v úvahu den menstruační cyklus Kdy je nejlepší čas na stanovení určitých hormonů? Tyto informace můžete získat od svého lékaře.

Index	Charakteristický
Analyzátor a testovací systém	Gelové karty; DiaMed AG (Švýcarsko)
Referenční hodnoty	Negativní výsledek / Pozitivní výsledek
Rušivé faktory. Léky
Pozitivní test je možný při užívání následujících léků: acetaminofen, kyselina salicylová, aminopyrin, antihistaminika, karbromal, cefalosporiny, chlorpromazin, chlorpropamid, cisplatina, klonidin, dipyron, ethosuximid, fenfluramin, fuadin, hydralazin, hydrochlorothiazid, ibuprofen, inzulín, isoniazid, levodopa, mefenlanamová kyselina, kyselina methadonol, nomifenlanamová, methadid, nomifeninicill, methyldopamel amin, peniciliny, fenacetin, fenylbutazon, probenecid, prokainamid, chinidin, chinin, rifampin, streptomycin, sulfonamidy, deriváty sulfonylmočoviny, tetracyklin, triamteren, anhydrid kyseliny trimellitové
Indikace pro použití
Diagnóza imunitní hemolytické anémie, hemolytické onemocnění novorozenci, lékem indukovaná imunitní hemolytická anémie, hemolytické transfuzní reakce
Interpretace výsledků
Normálně je přímý Coombsův test negativní. Pozitivní test Coombs v: autoimunitní hemolytická anémie; hemolytické onemocnění novorozenců; léky indukovaná imunitní hemolytická anémie; hemolytické transfuzní reakce

Coombsova reakce - účinná metoda detekce erytrocytárních antigenů a antierytrocytárních protilátek v lidské krvi nepřímá reakce aglutinace. Základem testu je použití specifických monoklonálních reagencií na bázi imunoglobulinů třídy G (IgG) pro typizaci erytrocytárních antigenů a následně použití Coombsova antiglobulinového séra (AGS) ve druhé fázi.

AGS se vyrábí smícháním séra z krve laboratorních zvířat imunizovaných lidskými imunoglobuliny G a monoklonálními protilátkami k jedné ze složek - C3D komplementu lidského séra. AGS způsobuje aglutinaci červených krvinek senzibilizovaných specifickými protilátkami. Při absenci protilátek na červených krvinkách pod vlivem AGS nedochází k pozitivní reakci.

Nepřímá Coombsova reakce umožňuje určit přítomnost:

• erytrocytární antigeny detekované IgG reagenciemi („nekompletní“ protilátky, např. monoklonální reagencie anti-D, anti-F Y a, anti-F Y b);
• antierytrocytární protilátky třídy IgG.

Nepřímý antiglobulinový test: průkaz antigenů červených krvinek

Uvádíme metodu nepřímé Coombsovy reakce na příkladu anti-D IgG koliklonu.

1. Označte čistou zkumavku: uveďte jméno testované osoby.
2. Do zkumavky přidejte 2 kapky (přibližně 0,1 ml) anti-D IgG zoliclonu.
3. Přidejte 2 kapky 5% suspenze analyzovaných erytrocytů, předem promytých fyziologickým roztokem. Smíchejte zkušební vzorky se zoliclonem.
4. Směs inkubujte ve vodní lázni nebo v termostatu při 37 °C po dobu 30 minut.
5. Přidejte 5 - 10 ml fyziologického roztoku do zkumavky pomocí Pasteurovy pipety.
6. Centrifugujte zkumavku s odstředivým zrychlením 1200 g při 18 - 25 °C po dobu jedné minuty.
7. Odstraňte fyziologický roztok.
8. Opakujte postup promývání červených krvinek pomocí centrifugace ještě 2-3krát.
9. Přidejte 2 kapky antiglobulinového séra do sedimentu krvinek a promíchejte.
10. Zkumavku centrifugujte s odstředivým zrychlením 1200 g po dobu jedné minuty při teplotě 18 - 25 °C.
11. Pomocí dávkovače nebo Pasteurovy pipety přidejte 3 až 5 kapek fyziologického roztoku.
12. Resuspendujte sediment a vizuálně zkontrolujte, zda nedošlo k aglutinaci. Výrazné aglutinace na dně zkumavky proti pozadí čirý roztok indikují průkaz erytrocytárního antigenu. Neprůhledná suspenze krvinek indikuje nepřítomnost antigenu.

Coombsův test: screening na izoimunní antierytrocytární protilátky

Studie se provádí jako součást individuálního testu kompatibility pro všechny antigeny červených krvinek dárce a příjemce. Závěr o plná kompatibilita recipientní séra s dárcovskými erytrocyty jsou produkována na základě absence hemolýzy a/nebo aglutinace ve všech fázích analýzy. Známky hemolýzy a/nebo aglutinace v kterékoli fázi testování ukazují na nekompatibilitu krevních vzorků.

Posouzení kompatibility pomocí systému AB0, detekce „studených“ protilátek

1. Připravte vzorek krve dárce:
   • přidejte 0,2 ml krve do zkumavky pomocí automatického dávkovače;
   • Promyjte červené krvinky 3x v 5,0 ml fyziologického roztoku;
   • Resuspendujte peletu ve 3 až 4 ml roztoku LISS s nízkou iontovou silou.
2. Označte druhou čistou zkumavku: uveďte jméno příjemce a jméno dárce.
3. Pomocí automatického dávkovače přidejte 0,1 ml séra příjemce do označené zkumavky.
4. Přidejte 2 kapky 5% suspenze červených krvinek v roztoku LISS.
5. Směs ihned odstřeďujte s odstředivým zrychlením 1200 g při teplotě 18 - 25 °C po dobu 15 - 20 sekund.
6. Jemným protřepáním zkumavky oddělte sediment ode dna. Vyhodnoťte přítomnost aglutinátů. Přítomnost hemolýzy a/nebo aglutinátů znamená:
   • nekompatibilita podle systému AB0;
   • přítomnost „studených“ protilátek třídy IgM nebo IgA, které nejsou specifické pro antigeny AB0, v séru pacienta.

Detekce „teplých“ protilátek

1. Pokud nedochází k hemolýze a/nebo aglutinacím, inkubujte zkumavku 10 - 15 minut při 37 °C.
2. Centrifugujte zkumavku při 1200 g po dobu 15 - 20 sekund při pokojové teplotě.
3. Protřepejte zkumavku a zkontrolujte hemolýzu a/nebo aglutináty v supernatantu. Pozitivní výsledek ukazuje na detekci „teplých“ IgM protilátek proti dárcovským erytrocytárním antigenům v séru pacienta.

Detekce IgG protilátek v Coombsově testu

1. Pokud je výsledek v předchozí fázi studie negativní, přidejte do zkumavky 5 ml 0,9% roztoku NaCl pomocí Pasteurovy pipety.
2. Centrifugujte zkumavku při 1200 g po dobu 15 - 20 sekund při teplotě vzduchu 18 - 25 °C. Pomocí Pasteurovy pipety opatrně odstraňte supernatant.
3. Promytí červených krvinek opakujte ještě 2-3x.
4. Do zkumavky přidejte 1 - 2 kapky antiglobulinového séra. Proveďte důkladné promíchání.
5. Centrifugujte zkumavku při 1200 g po dobu 15 - 20 sekund.
6. Pečlivě rozbijte sediment červených krvinek a vizuálně zhodnoťte výsledek reakce. Detekce aglutinace znamená přítomnost IgG protilátek proti antigenům erytrocytů dárce v séru pacienta.

Hemolytická anémie, způsobené autoimunitními tělísky, která jsou namířena proti jejich vlastním červeným krvinkám, nejsou přesně pochopeny. Předpokládá se však, že některé faktory (například virus, abnormální protein) mění červené krvinky tak, že je tělo vnímá „jako něco cizího“ a bojuje s nimi pomocí protilátek. Podle jiné teorie protilátky namířené proti červeným krvinkám vznikají téměř náhodně při tvorbě abnormálních plazmatických proteinových tělísek u některých onemocnění. Taková proteinová tělíska, stejně jako „náhodně“, mohou vyvolat reakce, které lze použít ke stanovení diagnózy (například virová pneumonie, jak je známo, dává pozitivní Wassermanovu reakci, pozitivní Paul-Bunnelovu reakci a studenou aglutinační reakci) .

Existují dva hlavní typy autoprotilátek u hemolytické anémie, a to: teplé protilátky (reagují při 37°C) a studené protilátky (jejichž reaktivita se zvyšuje, když se teplota blíží nule). Teplé protilátky jsou častější než studené protilátky. Dacie zjistila, že teplé hemolyziny se vyskytují 2x častěji než studené. Hemolysiny a aglutininy nejsou zásadně odlišné protilátky: liší se pouze povahou svého působení. Aglutininy aglutinují červené krvinky a hemolyziny je činí náchylnějšími ke složitému procesu hemolýzy (komplement!). Autoprotilátky, fixující se na erytrocytech, tvoří komplex erytrocyt-globin. Tento komplex je detekován pomocí Coombsova antiglobinového testu.

Coombsův test prováděno Coombsovým sérem, k jehož přípravě se králík senzibilizuje lidským sérem, proti kterému se v králičím séru tvoří protilátky. Když takto senzibilizované sérum působí na lidské erytrocyty, dochází k jejich aglutinaci, pokud jsou receptory erytrocytů obsazeny blokujícími protilátkami. Protože tyto blokující protilátky pocházejí z lidského séra, aglutinují se s králičím sérem senzibilizovaným na lidskou plazmu a obsahujícím precipitiny. Tato reakce se nazývá Coombsův test; u hemolytické anémie z autoimunitních tělísek (Lo tit) je téměř specifická (podrobnosti viz Maier).

Obecně pro hemolytické anémie u primární poruchy erytrocytů je Coombsův test negativní, u získaných pozitivní. Z tohoto pravidla však existují určité výjimky: falešně pozitivní Coombsův test byl nalezen během krizí konstituční hemolytické anémie a v slabý stupeň- také někdy po splenektomii, při revmatické artritidě, sarkoidóze, po častých krevních transfuzích a při systémovém lupus erythematodes. Přirozeně u získané hemolytické anémie bez tvorby autoimunitních tělísek je negativní.

Hemolytická anémie způsobené autoimunitními tělísky lze rozdělit na:
a) akutní, subakutní a chronické formy, stejně jako na
b) idiopatické s neznámou etiologií a c) symptomatické [virová pneumonie (pouze studené aglutininy), chronická lymfatická leukémie, retikulosarkom, lymfosarkom, systémový lupus erythematodes (hlavně teplé, méně často studené aglutininy), syfilis (studené aglutininy), nádory vaječníků (Miescheromy se zaměstnanci)).
c) symptomatická [virová pneumonie (pouze studené aglutininy), chronická lymfatická leukémie, retikulosarkom, lymfosarkom, systémový lupus erythematodes (hlavně teplé, méně často studené aglutininy), syfilis (studené aglutininy), nádory vaječníků (Miescher a spolupracovníci)).

Klinika hemolytické anémie, vyvíjející se pod vlivem autoimunitních těl, je velmi rozmanitý, a proto je stěží možné nakreslit jejich obecný klinický obraz. Osoby všech věkových kategorií a obou pohlaví jsou postiženy stejně. Přesto se zdá, že idiopatické formy jsou častěji pozorovány u žen (Sacks a Workman).

Klinický obraz idiopatické formy se liší v závislosti na závažnosti onemocnění. V chronické případy Nástup je pozvolný, nemoc se vleče řadu let s častými exacerbacemi. Závažnost anémie se liší v závislosti na stupni hemolýzy. Pozorovány jsou poklesy hemoglobinu až o 10 %, v ostatních případech zůstává hemoglobin dlouhodobě na 50–60 %. Intenzita retikulocytózy a ikterického zbarvení kůže a séra odpovídá stupni hemolýzy. Bilirubin se velmi zřídka vyskytuje v moči, protože neprochází ledvinami, ale je pozorována hemoglobinurie. V chronických případech je slezina často zvětšená a může dosáhnout i velmi významné velikosti, ale v jiných případech je stále cítit. Játra nejsou zřídka zvětšena.

Ve většině případů v krvi je pozorována makrocytóza, v akutní stadia je také mnoho mikrocytů, vzácně chybí normoblastóza a polychromázie, leukocytóza může dosáhnout 30 000, krevní destičky jsou normální. V některých případech však dochází k těžké trombocytopenii. Evans tyto případy vysvětluje současnou přítomností protilátek proti krevním destičkám, takže dochází jak k hemolytické anémii, tak k trombocytopenii působením autoimunitních tělísek – Evansův syndrom. Osmotická rezistence je mírně snížena, ale ne v takové míře a ne tak trvale jako u konstituční globulární buněčné anémie. Test tepelné odolnosti (Hegglin-Maier) po 6 hodinách může také poskytnout mírnou hemolýzu (vlastní pozorování), ale v menší míře než u Marchiafavy anémie. Hemosiderin se nachází také v moči (vlastní pozorování).