Pasivní aglutinační reakce. Nepřímé aglutinační reakce. Nepřímá nebo pasivní hemaglutinační reakce (IRHA, RPHA). Reverzní RNGA. Reakce pasivní inhibice hemaglutinace (PHA).
Tyto reakce jsou nazývány nepřímý (pasivní), protože používají Ag (nebo AT) uměle sorbovaný na povrchu různých korpuskulárních částic.
Nepřímá nebo pasivní hemaglutinační reakce (RNGA, RPGA) je jednou z nejcitlivějších sérologických reakcí. Je založena na schopnosti AT interagovat s Ag fixovaným na různých červených krvinkách, které pak aglutinují. Pro větší stabilitu diagnostických přípravků jsou červené krvinky formalinizovány.
Reverzní RNGA používá se k detekci Ag v krevním séru; Za tímto účelem se na erytrocyty nefixují Ag, ale AT. Reakce tohoto typu jsou široce používány pro diagnostiku infekčních onemocnění, stanovení těhotenství, detekci přecitlivělost na léky atd.
Odezva na brzdění pasivní hemaglutinace (RTPGA) - další vývoj RNGA; v jistém smyslu řídí jeho specifičnost. Na rozdíl od RNGA obsahuje tři složky; Ag, AT a Ag (AT) adsorbované na erytrocytech. Nejprve Ag reaguje s AT (standardní antisérum), poté se do směsi přidají erytrocyty senzibilizované stejným Ag (nebo AT). Pokud během interakce Ag s AT nezůstane v systému žádný volný AT (nebo Ag), pak není pozorována aglutinace erytrocytárního diagnostica.
Používá červené krvinky nebo neutrální syntetické materiály(například latexové částice), na jejichž povrchu se sorbují antigeny (bakteriální, virové, tkáňové) nebo protilátky. K jejich aglutinaci dochází po přidání vhodných sér nebo antigenů. Červené krvinky senzibilizované antigeny se nazývají antigenní erytrocytární diagnosticum a používají se k detekci a titraci protilátek. Erytrocyty senzibilizované protilátkami. se nazývají imunoglobulinová erytrocytární diagnostika a používají se k detekci antigenů.
Pasivní hemaglutinační reakce se používá k diagnostice onemocnění způsobených bakteriemi ( břišní tyfus a paratyfus, úplavice, brucelóza, mor, cholera atd.), prvoci (malárie) a viry (chřipka, adenovirové infekce, virová hepatitida B, spalničky, klíšťová encefalitida, krymská hemoragická horečka atd.), stejně jako určit určité hormony, identifikovat zvýšenou citlivost pacienta na léky a hormony, jako je penicilin a inzulín.
Pasivní hemaglutinační reakce (RPHA). Pasivní hemaglutinační test je citlivá metoda sérologické diagnostiky a používá se jak pro časnou a retrospektivní diagnostiku, tak i pro stanovení imunopogického stavu očkovaných osob. U pacientů s tularémií jsou protilátky detekovány obvykle na konci 1. nebo 2. týdne onemocnění, po 1-1,5 měsíci dosahují titry RPHA maximální výkon(1:100000-1:20000, výjimečně vyšší), načež klesají a zůstávají dlouho na úrovni 1:100-1:200.
U očkovaných osob jsou protilátky také trvale detekovány, avšak v nižších titrech, nepřesahujících 1:2000-1:5000 1-1,5 měsíce po očkování, a zůstávají několik let na nízké úrovni 1:20-1:80.
Antigen pro staging RPHA je tularemia erythrocyte diagnosticum (antigenní). Lékem jsou formalinizované ovčí červené krvinky, senzibilizované antigenem tularemie, dostupné v tekuté a suché formě. Tekutý přípravek - 10% suspenze červených krvinek v roztoku formaldehydu o 10% koncentraci. Suchý lyofilizovaný přípravek je vakuově sušená 10% suspenze červených krvinek bez konzervantů. Před použitím se ředí podle pokynů na etiketě. Pro nastavení reakce v polystyrenových deskách se obě léčiva používají v koncentraci 2,5% a při nastavení reakce v mikroobjemech - v koncentraci 0,5%.
Technika pro nastavení RPGA. Testovaná séra se zředí fyziologickým roztokem 1:5 (1:10) a zahřejí se na 56 °C po dobu 30 minut. Poté, aby se odstranily heterogenní protilátky proti ovčím erytrocytům, jsou séra ošetřena 50% suspenzí formalinizovaných ovčích erytrocytů. K tomu přidejte červené krvinky rychlostí 2 kapky (0,05 ml) na 1 ml séra a důkladně promíchejte protřepáním. Sérum se ponechá, dokud se erytrocyty úplně neusadí, nebo se po jedné hodině při pokojové teplotě odstředí, poté je připraveno k vyšetření.
Ředicí kapalina se nalije v objemu 0,5 ml do řady jamek na polystyrenové destičce. Během předběžné studie sér je vhodné je otestovat nastavením reakce v krátké řadě destičky (6 jamek). Pokud jsou protilátky detekovány v krátké sérii, séra se znovu testují v dlouhé sérii ředění (12 jamek). Po rozlití ředicí kapaliny přidejte 0,5 ml testovacího séra v ředění 1:5 do první jamky každé řady (krátké nebo dlouhé). Poté se stejné objemy séra titrují dvojnásobným ředěním. Tak se získají ředění séra v krátkých sériích od 1:10 do 1:320 a v dlouhých sériích od 1:10 do 1:20480. Po titraci séra se do každé jamky přidá jedna kapka (0,05 ml) pracovní 2,5% suspenze senzibilizovaných erytrocytů. Obsah destiček se důkladně protřepe, dokud se nezíská homogenní suspenze. Destičky se nechají při pokojové teplotě na stacionárním povrchu stolu. Předběžný záznam reakce se provádí po 2-3 hodinách, konečné stanovení titru se provádí po úplné sedimentaci červených krvinek v jamkách. Pro reakci jsou poskytnuty následující kontroly: 1) testovací sérum zředěné 1:10 v objemu 0,5 ml + 1 kapka 2,5% suspenze nesenzibilizovaných erytrocytů; 2) ředicí kapalina v objemu 0,5 ml + 1 kapka 2,5% suspenze nesenzibilizovaných erytrocytů; 3) ředicí kapalina v objemu 0,5 ml + 1 kapka 2,5% suspenze senzibilizovaných erytrocytů. Všechny kontroly by měly vykazovat jasně negativní reakci.
Účetnictví a hodnocení RPGA. Reakce se hodnotí pomocí následující schéma:
1) ostře pozitivní reakce(++++) - červené krvinky padají na dno otvoru v rovnoměrné vrstvě ve formě „deštníku“, který má často vroubkované roztavení okrajů;
2) pozitivní reakce (+++) - červené krvinky pokrývají alespoň 2/3 dna jamky;
3) slabě pozitivní reakce (++) - aglutinát je malý a nachází se v samém středu jamky;
4) diskutabilní reakce (+) - kolem sedimentu erytrocytů v samém středu jamky jsou jednotlivá zrnka aglutinátu;
5) negativní (-) - na dně otvoru se červené krvinky usazují ve formě „knoflíku“ nebo malého kroužku s hladkými, ostře ohraničenými okraji.
Sérový titr se bere v úvahu na základě posledního ředění séra, které poskytlo velmi jasnou reakci (alespoň tři plusy). Za diagnostický titr se považuje ředění 1:100 nebo vyšší, ale stejně jako u RA je nutné sledovat jeho nárůst.
RPGA pro tularemii je poměrně specifické a některé detekuje křížové reakce pouze se séry na brucelózu. Diferenciální diagnostika možnou výškou titrů v RPGA, které jsou významně vyšší u homologního antigenu.
Technika pro nastavení RPHA v mikroobjemech. RPGA lze provádět v mikroobjemech pomocí mikrotitrátoru typu Takachi (nebo mikrodestičky s kulatým dnem s mikropipetami), který umožňuje titraci materiálu v objemech 25 μl a 50 μl. Reakční technika a sled všech operací je stejný jako při studiu v polystyrenových deskách. Je však třeba mít na paměti, že citlivost mikrometody je obvykle o jedno ředění (tj. 2krát) nižší než citlivost makrometody.
Pro nastavení reakce v mikrotitrátoru se do každé jamky přidá ředicí kapalina o objemu 50 μl pomocí pipety s kapátkem. Poté se pomocí titrátorů s 50 μl hlavicí odebere testovací sérum ponořením hlavice do něj. Ujistěte se, že kapalina naplnila hlavu titrátoru. Titrátor se sérem se přenese do první jamky a drží se v ní vertikální poloze, udělat několik rotační pohyby okružní výlet. Poté se titrátor přenese do další jamky a manipulace se opakuje. Titraci lze provádět současně v několika řadách. Po titraci celé série se titrátor rotačními pohyby promyje destilovanou vodou (výměna 2 porcí), voda se z hlavice odstraní tampónem a spálí se na plameni hořáku.
Po titraci přidejte do jamek 25 μl diagnostické tekutiny pro erytrocyty. Koncentrace diagnostica pro RPHA v mikroobjemech by měla být 0,5 % (tj. 2,5% suspenze červených krvinek se navíc 5krát zředí). Po přidání červených krvinek je třeba destičky mírně protřepat, dokud se nezíská homogenní suspenze. Výsledky lze zaznamenat během 1-1,5 hodiny, což je významnou výhodou RPGA v mikrotitru. Navíc tato technika vyžaduje malá množství všech reakčních složek a testovacích sér.
Reakce se bere v úvahu podle následujícího schématu:
1) „+“ – úplná hemaglutinace, při které červené krvinky dopadají na dno jamky v rovnoměrné vrstvě ve formě „deštníku“, zabírajícího alespoň 2/3 dna;
2) „+-“ - částečná hemaglutinace, při které červené krvinky klesají na dno ve formě volného prstence malé velikosti;
3) „-“ – nepřítomnost hemaglutinace, kdy červené krvinky padají na dno ve formě malého knoflíku nebo kroužku s hladkým okrajem.
Specifičnost pozitivního výsledku získaného u RPHA může být testována pomocí třísložkové reakce – pasivní hemaglutinační inhibiční reakce (PHA).
Technika pro nastavení RTPGA. Tato reakce se používá k potvrzení specifičnosti pozitivního výsledku RPGA v případě pochybností nebo zvláštního epidemiologického zájmu. Mechanismem reakce je specifická inhibice hemaglutinace, když se do testovaného séra přidá suspenze usmrcených bakterií tularemie. V reakci interagují tři složky: testované sérum, specifický antigen tularemie a antigenní erytrocytární diagnosticum RTPHA se obvykle umístí do řady po 7-8 jamkách. Je vhodné instalovat opakované RPGA paralelně s RTPGA. Do dvou řad jamek se nalije 0,25 ml ředící kapaliny, do prvních jamek obou řad se přidá testované sérum v objemu 0,25 ml a provede se titrace, čímž se získají dvě stejné řady ředění séra. Do všech jamek druhé řady přidejte 0,25 ml ředící kapaliny a do jamek první řady 0,25 ml suspenze bakterií tularemie. Používá se Tularemia diagnosticum (obsahující 25 miliard bakterií tularemia v 1 ml), předem naředěný 50x. Tato suspenze obsahuje 500 milionů bakterií v 1 ml nebo 125 milionů v objemu 0,25 ml. Po přidání antigenu se destička ponechá 1 hodinu při teplotě místnosti, poté se do všech jamek obou řad přidá jedna kapka (0,05 ml) erytrocytárního diagnosticum, destička se protřepe a nechá na rovném povrchu stolu. Účetnictví se provádí po 2-3 hodinách.
Účetnictví a hodnocení RTPGA. Pokud testované sérum obsahuje specifické protilátky proti tularemii, jsou neutralizovány přidaným antigenem a nedojde k hemaglutinaci v první řadě jamek, nebo při vysokém titru séra bude hemaglutinace pozorována v menším (2-4) počtu jamek. jamek než v řadě s RPHA. V tomto případě byla potvrzena specifičnost výsledků. Pokud je hemaglutinace zaznamenána v obou řadách, tzn. Pokud se výsledky RTPGA a RPGA shodují, znamená to nepřítomnost protilátek proti tularémii v testovaném séru. V tomto případě je primární výsledek RPGA považován za nespecifický.
Technika inscenování RTHG v mikroobjemech. RTPGA, stejně jako RPGA, lze provádět v mikroobjemech pomocí mikrotitru typu Takachi. K tomu přidejte 0,25 μl ředící kapaliny do jamek mikrodestičky ve dvou řadách po 7-8 jamkách. Poté se pomocí titrátoru přidá 0,25 μl testovaného séra a titruje se v obou řadách. Poté se do každé jamky v první řadě přidá 25 μl antigenu tularemie (jehož koncentrace je 500 milionů bakterií tularemie v 1 ml) a do druhé řady se přidá 25 μl ředící kapaliny. Destičky se nechají 1 hodinu při pokojové teplotě, poté se do všech jamek obou řad přidá 25 μl antigenního zritrocytárního diagnostica (0,5% koncentrace). Účtování a vyhodnocování výsledků se provádí obdobně jako reakce v makroobjemech.
pasivní hemaglutinační reakce) způsob detekce a identifikace antigenů nebo protilátek, založený na jevu aglutinace červených krvinek, ke kterému dochází v jejich přítomnosti, na jejichž povrchu byly předem adsorbovány odpovídající specifické nebo antigeny.
1. Malá lékařská encyklopedie. - M.: Lékařská encyklopedie. 1991-96 2. První zdravotní péče. - M.: Velká ruská encyklopedie. 1994 3. Encyklopedický slovník lékařské termíny. - M.: Sovětská encyklopedie. - 1982-1984.
Podívejte se, co je „Nepřímá hemaglutinační reakce“ v jiných slovnících:
nepřímá hemaglutinační reakce- RNGA Laboratorní test pomocí diagnostiky erytrocytů. [Anglicko-ruský slovníček základních pojmů ve vakcinologii a imunizaci. Světová zdravotnická organizace, 2009] Témata vakcinologie, imunizace Synonyma RNGA EN... ... Technická příručka překladatele
- (RNHA; synonymum pro pasivní hemaglutinační reakci) metoda detekce a identifikace antigenů nebo protilátek, založená na fenoménu aglutinace erytrocytů, ke kterému dochází v jejich přítomnosti, na jehož povrchu byly předtím adsorbovány... .. . Velký lékařský slovník
- (RPHA) viz Nepřímá hemaglutinační reakce... Velký lékařský slovník
Tato stránka je glosář. # A... Wikipedie
Základní zkratky převzaté ve Veterinárním encyklopedickém slovníku- a., aa, artena, arteriae aa ana (stejně) Akademie lékařských věd SSSR Akademie lékařských věd SSSR Akademie lékařských věd SSSR Akademie věd SSSR Bac. Bacillus Bact. Bakterie BSSR Běloruská SSR c., století. století, století v., vv. vena, venae VASKHNIL Všesvazový řád Lenina a... ...
Tento termín má jiné významy, viz Mor. Choroba masožravců (Kareova choroba) akutní nebo subakutní nakažlivá virové onemocnění, projevující se horečkou, katarálními záněty sliznic, kožními lézemi, centrální ... ... Wikipedia
- (renes) párový vylučovací a endokrinní orgán, který reguluje chemickou homeostázu těla prostřednictvím funkce tvorby moči. ANATOMICKO FYZIOLOGICKÝ NÁČČ Ledviny jsou umístěny v retroperitoneálním prostoru (Retroperitoneální prostor) na... ... Lékařská encyklopedie
I (trichinelóza; synonymum: trichinelóza, „nafouklý“) helmintiáza ze skupiny hlístic, charakterizovaná horečkou, myalgií, otokem obličeje, kožní vyrážky krevní eozinofilie a ve vážných případech léze vnitřní orgány a centrální...... Lékařská encyklopedie
- (nematodózy) helminthiázy způsobené hlístovými škrkavkami třídy Nematoda. Z dalších helmintiáz mají N. nejvyšší hodnotu v lidské patologii je většina z nich geohelminthiasis (viz Helminthiasis); vývoj jejich vajíček nebo larev...... Lékařská encyklopedie
infekční epididymitida- Rýže. 1. Zvětšení levého varlete u ovce s infekční epididymitidou. Rýže. 1. Zvětšení levého varlete u ovce s infekční epididymitidou. infekční epididymitida ovcí (Epididymitis infectiosa arietum), chronická infekční... ... Veterinární encyklopedický slovník
Viz Nepřímá hemaglutinační reakce... Velký lékařský slovník
Reakce je dána:
1) pro detekci polysacharidů, proteinů, bakteriálních extraktů a dalších vysoce disperzních látek, rickettsie a virů, jejichž komplexy s aglutininy nelze u konvenčních RA pozorovat,
2) k detekci protilátek v séru pacientů proti těmto vysoce rozptýleným látkám a malým mikroorganismům.
Nepřímá neboli pasivní aglutinace je chápána jako reakce, při které protilátky interagují s antigeny předem adsorbovanými na inertních částicích (latex, celulóza, polystyren, oxid barnatý aj. nebo ovčí červené krvinky, I(0)-lidská krevní skupina)
Při pasivní hemaglutinační reakci (RPHA) červené krvinky. Antigenem nabité červené krvinky se slepí pohromadě v přítomnosti specifických protilátek proti tomuto antigenu a vysrážejí se. Antigenem senzibilizované erytrocyty se v RPGA používají jako erytrocytární diagnosticum pro průkaz protilátek (serodiagnostika). Pokud jsou červené krvinky nabity protilátkami (erytrocytární protilátka diagnosticum), lze jej použít k detekci antigenů.
Rýže. 3. Schéma RPGA: červené krvinky (1), naložené antigenem (3), jsou vázány specifickými protilátkami (4).
Inscenace. V jamkách polystyrénových destiček se připraví série sériových ředění séra. Do předposlední jamky přidejte 0,5 ml zjevně pozitivního séra a do poslední jamky 0,5 ml fyziologického roztoku (kontroly). Poté se do všech jamek přidá 0,1 ml zředěného erytrocytárního diagnosticum, protřepe se a umístí na 2 hodiny do termostatu.
Účetnictví. V pozitivní případ erytrocyty se usazují na dně otvoru ve formě rovnoměrné vrstvy buněk se složeným nebo zubatým okrajem (obrácený deštník), v negativním případě - usazují se ve formě knoflíku nebo kroužku.
Obr.4. Účtování pro RNGA (RPGA).
Účtování výsledků rentgenového testu provedeného k detekci botulotoxinu.
Původce botulismu, Clostridium botulinum, produkuje toxiny sedmi sérovarů (A, B, C, D, E, F, G), ale běžnější jsou sérovary A, B a E. Všechny toxiny se liší antigenními vlastnostmi a mohou být odlišeny v reakcích s použitím typově specifických sér. Za tímto účelem lze provést pasivní (nepřímou) hemaglutinační reakci se sérem pacienta, u kterého se předpokládá přítomnost toxinu, a červených krvinek naložených protilátkami antitoxických antibotulinových sér typu A, B, E. Normální sérum slouží jako kontrola.
Rýže. 3. Vyjádření a výsledek RNGA.
Účetnictví. V pozitivním případě se červené krvinky usazují na dně jamky ve formě rovnoměrné vrstvy buněk se složeným nebo zubatým okrajem (obrácený deštník), v negativním případě se usazují ve formě knoflíku nebo kroužku. .
Závěr: V séru pacientky byl detekován botulotoxin typu E.
Hemaglutinační inhibiční reakce (HRT).
Rýže. 8. Hemaglutinační inhibiční reakce (HAI) (schéma).
Princip reakce je založen na schopnosti AT vázat různé viry a neutralizovat je, čímž znemožňuje aglutinaci červených krvinek. Vizuálně se tento efekt projevuje „inhibicí“ hemaglutinace. RTGA se používá v diagnostice virových infekcí k identifikaci specifických antihemaglutininů a identifikaci různých virů podle jejich hemaglutininů, které vykazují vlastnosti Ag.
Typizace viru se provádí v reakci RTGA se sadou typově specifických sér. Výsledky reakce jsou zohledněny nepřítomností hemaglutinace. Podtypy viru typu A s antigeny H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 a dalšími lze v RTGA diferencovat pomocí sady homologních typově specifických sér
Rýže. 9. Výsledky RTGA pro typizaci viru chřipky
Legenda: - inhibice hemaglutinace (tlačítko); - hemaglutinace (deštník).
Závěry: Studovaný materiál obsahuje virus chřipky typu A s antigenem H3N2
Nepřímá (pasivní) hemaglutinační reakce (IRHA) je založena na tom, že červené krvinky, pokud je na jejich povrchu adsorbován rozpustný antigen, získávají schopnost aglutinace při interakci s protilátkami proti adsorbovanému antigenu. Schéma RNGA je na Obr. 34. RNGA se široce používá při diagnostice řady infekcí.
Rýže. 34. Schéma pasivní hemaglutinační reakce (RPHA). A - získání diagnostického erytrocytu: B - RPGA: 1 - erytrocyt: 2 - zkoumaný antigen; 3 - diagnostika erytrocytů; 4 - protilátka ke studovanému antigenu: 5 - aglutinovat
Nastavení reakce. Testované sérum se zahřeje po dobu 30 minut na 56 °C, zředí se postupně v poměru 1:10 - 1:1280 a nalije se do 0,25 ml do zkumavek nebo jamek, kde se nakapají 2 kapky erytrocytárního diagnosticum (erytrocyty s adsorbovaným antigenem ) jsou poté přidány.
Kontroly: suspenze erytrocytárního diagnostica se známým imunitním sérem; suspenze diagnostika normálním sérem; suspenze normálních červených krvinek s testovacím sérem. V první kontrole by mělo dojít k aglutinaci, ve druhé a třetí by k ní nemělo dojít.
Pomocí RIGA můžete detekovat neznámý antigen, pokud jsou známé protilátky adsorbovány na červené krvinky.
Hemaglutinační reakci lze provést v objemu 0,025 ml (mikrometoda) za použití mikrotitrátoru Takachi.
1. Co to znamená? pozitivní výsledek RHA mezi červenými krvinkami a testovaným materiálem na přítomnost viru?
2. Dojde k aglutinaci červených krvinek, pokud se k nim přidá virus a jemu odpovídající sérum? Jak se nazývá reakce, která tento jev odhaluje?
Cvičení
Vezměte v úvahu a zaregistrujte výsledek RIGA.
Srážková reakce
Při precipitační reakci dochází k vysrážení specifického imunitního komplexu skládajícího se z rozpustného antigenu (lyzátu, extraktu, haptenu) a specifické protilátky za přítomnosti elektrolytů.
Zakalený prstenec nebo sraženina vzniklá v důsledku této reakce se nazývá sraženina. Tato reakce se od aglutinační reakce liší především velikostí částic antigenu.
Precipitační reakce se obvykle používá ke stanovení antigenu při diagnostice řady infekcí ( antrax meningitida atd.); v soudním lékařství - určit druh krve, spermatu atd.; v sanitárních a hygienických studiích - při zjišťování padělání výrobků; s jeho pomocí se zjišťuje fylogenetický vztah živočichů a rostlin. Pro reakci potřebujete:
1. Protilátky (precipitiny) - imunitní sérum s vysoký titr protilátky (ne nižší než 1:100 000). Titr precipitujícího séra je určen nejvyšším ředěním antigenu, se kterým reaguje. Sérum se obvykle používá neředěné nebo v ředění 1:5 - 1:10.
2. Antigen - rozpuštěné látky proteinové nebo lipoidní polysacharidové povahy (plné antigeny a hapteny).
3. Izotonický roztok.
Hlavní metody pro provedení srážecí reakce jsou: kruhová srážecí reakce a srážecí reakce na agaru (gelu).
Pozornost! Všechny složky podílející se na srážecí reakci musí být zcela průhledné.
Reakce srážení kruhu. Pomocí Pasteurovy pipety přidejte 0,2-0,3 ml (5-6 kapek) séra do precipitační zkumavky (sérum by se nemělo dostat na stěny zkumavky). Antigen ve stejném objemu se opatrně navrství na sérum a nalije ho tenkou Pasteurovou pipetou podél stěny zkumavky. Zkumavka se udržuje v nakloněné poloze. Při správném vrstvení by měla být jasná hranice mezi sérem a antigenem. Opatrně, aby nedošlo k promísení kapaliny, umístěte zkumavku do stojanu. Pokud je reakce pozitivní, na rozhraní antigenu a protilátky se vytvoří zakalený „prstenec“ - sraženina (viz obr. 48).
Reakce je doprovázena řadou kontrol (tabulka 18). Pořadí přidávání reakčních složek do zkumavky je velmi důležité. Na antigen nelze navrstvit sérum (v kontrole - na izotonický roztok), protože relativní hustota séra je větší, klesne na dno zkumavky a hranice mezi kapalinami nebude odhalena.
Tabulka 18. Schéma pro nastavení reakce srážení kruhu
Poznámka. + přítomnost „kroužku“; - nepřítomnost „kroužku“.
Výsledky se zaznamenávají po 5-30 minutách, v některých případech po hodině, jako vždy počínaje kontrolami. „Kruh“ ve 2. zkumavce označuje schopnost imunitního séra vstoupit dovnitř specifická reakce s odpovídajícím antigenem. Ve 3-5 zkumavkách by neměly být žádné „kroužky“ - neexistují žádné navzájem odpovídající protilátky a antigeny. „Kružek“ v 1. zkumavce – výsledek pozitivní reakce – znamená, že testovací antigen odpovídá odebranému imunitnímu séru, nepřítomnost „kroužku“ („kroužek“ pouze ve 2. zkumavce) ukazuje na jejich nekonzistenci – negativní výsledek reakce.
Srážecí reakce v agaru (gelu). Zvláštností reakce je, že k interakci antigenu a protilátky dochází v hustém médiu, tj. v gelu. Výsledná sraženina vytváří zakalený pruh v tloušťce média. Absence proužku ukazuje na nesrovnalost mezi reakčními složkami. Tato reakce je široce používána v biomedicínském výzkumu, zejména při studiu tvorby toxinu u původce záškrtu.
Kontrolní otázky
1. Jaký je hlavní rozdíl mezi aglutinační a precipitační reakcí?
2. Proč nelze při srážecí reakci použít zakalené přísady?
Cvičení
1. Nastavte reakci srážení prstence a načrtněte výsledek.
2. Prostudujte si povahu interakce antigenu s protilátkou při precipitační reakci v agaru, načrtněte výsledek (pořiďte si kelímek od učitele).
Lytická reakce (imunitní cytolýza)
Imunitní lýza je rozpouštění buněk pod vlivem protilátek při povinná účast doplněk. Pro reakci potřebujete:
1. Antigen - mikroby, červené krvinky nebo jiné buňky.
2. Protilátka (lysin) - imunitní sérum, méně často pacientské sérum. Bakteriolytické sérum obsahuje protilátky podílející se na lýze bakterií; hemolytické - hemolyziny, které podporují lýzu červených krvinek; pro lýzu spirochet jsou potřeba spirochetolysiny, buňky - itolysiny atp.
3. Doplňovat. Nejvíce se doplňuje v séru morčata. Toto sérum (směs z několika zvířat) se obvykle používá jako doplněk. Čerstvý (nativní) doplněk je nestabilní a snadno se zničí zahříváním, protřepáváním nebo skladováním, takže jej nelze použít déle než dva dny po obdržení. Pro zachování komplementu se k němu přidávají 2 %. kyselina boritá a 3% síran sodný. Tento doplněk lze skladovat při teplotě 4 °C po dobu až dvou týdnů. Nejčastěji se používá suchý komplement. Před použitím se rozpustí v izotonickém roztoku na původní objem (uvedený na etiketě).
4. Izotonický roztok.
Hemolýzní reakce(Tabulka 19). Pro reakci potřebujete:
1. Antigen - 3% suspenze promytých ovčích erytrocytů v poměru 0,3 ml sedimentu erytrocytů a 9,7 ml izotonického roztoku.
2. Protilátka - hemolytické sérum (hemolyzin) proti ovčím erytrocytům; obvykle připravené ve výrobě, lyofilizované a titr uvedený na štítku.
Titr hemolyzinu je nejvyšší ředění séra, při kterém dochází k úplné hemolýze 3% suspenze červených krvinek v přítomnosti komplementu. Pro hemolytickou reakci se hemolyzin odebírá v trojitém titru, tj. zředěný 3krát méně než před titrem. Například při sérovém titru 1:1200 se sérum ředí 1:400 (0,1 ml séra* a 39,9 ml izotonického roztoku). Nadbytek hemolyzinu je nezbytný, protože část z něj může být adsorbována jinými reakčními složkami.
* (Neměli byste brát méně než 0,1 ml séra – utrpí tím přesnost měření.)
3. Komplement se zředí 1:10 (0,2 ml komplementu a 1,8 ml izotonického roztoku).
4. Izotonický roztok.
Tabulka 19. Schéma hemolytické reakce
Účtování výsledků. Při správném provedení reakce dojde v 1. zkumavce k hemolýze – její obsah zprůhlední. V kontrolách zůstává kapalina zakalená: ve 2. zkumavce není dostatek komplementu, aby došlo k hemolýze, ve 3. zkumavce není hemolyzin, ve 4. zkumavce není hemolyzin ani komplement, v 5. zkumavce antigen ano. neodpovídají protilátkám,
V případě potřeby se hemolytické sérum titruje podle následujícího schématu (tabulka 20).
Před titrací připravte počáteční ředění séra 1:100 (0,1 ml séra a 9,9 ml izotonického roztoku), ze kterého potřebná ředění, Například:
Z těchto ředění přidejte 0,5 ml séra do titračních zkumavek, jak je uvedeno v tabulce. 20.
Tabulka 20. Titrační schéma pro hemolytické sérum (hemolyzin)
V příkladu uvedeném v tabulce. 20, titr hemolytického séra je 1:1200.
Při použití čerstvého hemolytického séra musí být inaktivováno, aby se zničil komplement v něm přítomný. K tomu se zahřívá 30 minut na 56 °C ve vodní lázni nebo v inaktivátoru s termostatem. Druhý způsob je lepší: eliminuje možnost přehřátí syrovátky, tedy její denaturaci. Denaturovaná séra jsou pro testování nevhodná.
Bakteriolýzní reakce. Při této reakci komplement lyžuje bakterie v přítomnosti vhodného (homologního) séra. Reakční schéma je v zásadě podobné schématu hemolytické reakce. Rozdíl je v tom, že po dvouhodinové inkubaci se všechny zkumavky naočkují na Petriho misky s prostředím příznivým pro mikroorganismus odebraný do experimentu, aby se zjistilo, zda je lyžován. Pokud je experiment proveden správně, měly by kultury ze 2-5 zkumavek (kontrol) vykazovat bohatý růst. Nedostatek růstu nebo slabý růst v inokulaci z 1. zkumavky (experimentu) indikuje smrt mikrobů, tj. že jsou homologní s protilátkou.
Pozornost! Bakteriolytická reakce musí být provedena za aseptických podmínek.
Kontrolní otázky
1. Co se stane s červenými krvinkami, když se místo izotonického roztoku chloridu sodného použije destilovaná voda? Co je základem tohoto jevu?
2. K jaké reakci dojde, když erytrocyty interagují s homologním imunitním sérem v nepřítomnosti komplementu?
Cvičení
Nastavte hemolytickou reakci. Výsledek zaznamenejte a načrtněte.
Související informace.
