Ang agglutination reaction (RA) ay ang pagdirikit at pag-ulan ng mga mikrobyo o iba pang mga selula sa ilalim ng impluwensya ng mga antibodies sa pagkakaroon ng isang electrolyte. Ang nagresultang precipitate ay tinatawag na agglutinate.
Ginagamit ang RA:
1. Upang makita ang mga antibodies sa serum ng dugo ng pasyente (serodiagnosis).
2. Upang matukoy ang uri at serovar ng isang purong kultura ng mga pathogenic microorganism na nakahiwalay sa isang pasyente (serotyping).
Ang agglutination reaction ay ginagamit upang matukoy ang mga antibodies sa blood serum ng mga pasyente, halimbawa, na may typhoid fever at paratyphoid fever (Vidal reaction), brucellosis (Wright reaction, Heddleson reaction), tularemia, leptospirosis at iba pa Nakakahawang sakit, pati na rin upang matukoy ang pathogen na nakahiwalay sa isang pasyente (mga impeksyon sa bituka, whooping cough, atbp.). Ginagamit ang RA upang matukoy ang mga pangkat ng dugo, Rh factor, atbp.
Ang reaksyon ay nangangailangan ng mga sumusunod na sangkap:
1. Ang antigen (agglutinogen) ay dapat na corpuscular, iyon ay, ito ay isang suspensyon ng mga nabubuhay o napatay na microorganism (diagnostics m), erythrocytes o iba pang mga cell. Karaniwan, ginagamit ang pang-araw-araw na kultura ng mga mikroorganismo na lumaki sa agar slants. Ang kultura ay hugasan ng 3 - 4 ML ng isotonic solution, inilipat sa isang sterile tube, at tinutukoy ang density. Ang suspensyon ay dapat na homogenous at naglalaman ng hanggang 3 bilyong microbial cell bawat 1 ml. Ang paggamit ng isang suspensyon ng mga pinatay na microbes - diagnosticums - pinapadali ang trabaho (inihanda sa produksyon).
2. Ang mga antibodies (agglutinin) ay matatagpuan sa serum ng pasyente (sa panahon ng serodiagnosis) o sa agglutinating serum (sa panahon ng serotyping). Ang agglutinating sera ay nakukuha sa pamamagitan ng pagbabakuna sa mga kuneho na may napatay na bakterya.
Agglutinating titer Ang serum ay tinatawag na pinakamataas na pagbabanto nito, kung saan ito ay tumutugon sa kaukulang antigen sa ilalim ng ilang mga eksperimentong kondisyon.
Ang agglutinating sera ay maaaring native (non-adsorbed) at adsorbed. Ang katutubong sera sa maliliit na dilution ay nakikipag-ugnayan hindi lamang sa uri ng mga mikroorganismo kung saan ang hayop ay nabakunahan upang makuha ang serum, kundi pati na rin sa mga kaugnay na uri ng mga mikroorganismo, dahil naglalaman ang mga ito ng mga antibodies ng grupo (antibodies sa mga mikroorganismo na may mga karaniwang antigen). Ang katutubong sera ay ginagamit para sa isang detalyadong reaksyon ng agglutination (para sa serodiagnosis), na isinasaalang-alang hindi lamang ang pagkakaroon ng reaksyon, kundi pati na rin ang dinamika ng pagtaas ng titer ng antibody.
Kung ang mga antibodies ng grupo ay nakuha (na-adsorbed) mula sa katutubong serum sa pamamagitan ng pakikipag-ugnayan sa mga kaugnay na bakterya na mayroong mga antigen ng grupo, ang adsorbed na sera ay nakuha. Ang adsorbed sera ay maaaring monoreceptor (o type-specific), na naglalaman ng mga antibodies sa isang antigen receptor lamang na binubuo ng pinaghalong ilang adsorbed o non-adsorbed na sera. Ang adsorbed sera ay ginagamit para sa reaksyon ng pagsasama-sama ng salamin.
Kapag ang mga hayop ay nabakunahan ng motile bacteria na may H-antigen, ang H-agglutinating sera na naglalaman ng H-antibodies ay nakukuha (halimbawa, Salmonella monoreceptor H-agglutinating serum). Sa pamamagitan ng pagbabakuna ng O-antigen, nakukuha ang O-agglutinating sera na naglalaman ng O-antibodies (halimbawa, ang grupo ng Salmonella na adsorbed O-agglutinating serum, anticholera O-agglutinating serum). Sa pamamagitan ng pagbabakuna na may H- at O-antigens, nakukuha ang sera na may H- at O-antibodies.
Bukod dito, ang O-agglutinin ay gumagawa ng isang pinong butil na agglutinate, at ang H-agglutinin ay gumagawa ng isang magaspang na sediment.
3. Electrolyte - isotonic NaCl solution (0.9% sodium chloride solution na inihanda sa distilled water).
Mayroong dalawang pangunahing pamamaraan para sa pagsasagawa ng isang agglutination reaction: isang reaksyon sa salamin (minsan ay tinatawag na indicative o plate reaction) at isang detalyadong reaksyon (sa mga test tubes)
Pagse-set up ng agglutination reaction sa salamin. Dalawang patak ng serum at isang patak ng isotonic sodium chloride solution ay inilapat sa isang walang taba na glass slide. Ang diagnostic agglutinating serum ay kinuha sa isang dilution, na, depende sa titer nito, ay 1:10, 1:25, 1:50 o 1:100. Ang kultura ng mikroorganismo sa ilalim ng pag-aaral ay idinagdag sa isang patak ng serum at isang patak ng isotonic solution gamit ang isang loop at halo-halong lubusan. Ang isang patak ng sodium chloride na may mga microorganism ay antigen control, ang isang drop ng serum na walang microorganism ay serum control. Hindi mo maaaring ilipat ang kultura mula sa isang patak na may serum sa isang patak na may NaCl. Ang reaksyon ay nagaganap sa temperatura ng silid sa loob ng 1-3 minuto. Kung ang kontrol ng serum ay nananatiling malinaw, ang pare-parehong labo ay sinusunod sa kontrol ng antigen, at ang mga agglutinate na natuklap ay lilitaw sa patak kung saan ang kultura ay nahahalo sa serum, kung gayon ang resulta ay itinuturing na positibo. Kung mayroong pare-parehong labo sa drop na may serum at antigen, kung gayon ito ay isang negatibong resulta. Ang reaksyon ay mas malinaw na nakikita laban sa isang madilim na background.
Serum
1. kontrol ng antigen
2. kontrol ng suwero
13.1. Mga reaksyon ng antigen-antibody at ang kanilang mga aplikasyon
Kapag ang isang antigen ay ipinakilala, ang mga antibodies ay nabuo sa katawan. Ang mga antibodies ay pantulong sa antigen na naging sanhi ng kanilang synthesis at may kakayahang magbigkis dito. Ang pagbubuklod ng mga antigen sa mga antibodies ay binubuo ng dalawang yugto. Ang unang yugto ay tiyak, kung saan ang mabilis na pagbubuklod ng antigenic determinant sa aktibong sentro ng Fab fragment ng mga antibodies ay nangyayari. Dapat pansinin na ang pagbubuklod ay dahil sa mga puwersa ng van der Waals, hydrogen at hydrophobic na pakikipag-ugnayan. Ang lakas ng bono ay tinutukoy ng antas ng spatial na pagsusulatan sa pagitan ng aktibong site ng antibody at ng epitope ng antigen. Matapos ang tiyak na yugto, nagsisimula ang isang mas mabagal na yugto - hindi tiyak, na ipinakita ng isang nakikitang pisikal na kababalaghan (halimbawa, ang pagbuo ng mga natuklap sa panahon ng aglutinasyon, atbp.).
Ang mga reaksyon ng immune ay ang pakikipag-ugnayan sa pagitan ng mga antibodies at antigens, at ang mga reaksyong ito ay tiyak at mayroon mataas na sensitivity. Malawakang ginagamit ang mga ito sa medikal na kasanayan. Sa tulong ng mga reaksyon ng immune, malulutas ang mga sumusunod na problema:
Pagpapasiya ng hindi kilalang antibodies sa pamamagitan ng mga kilalang antigens (antigenic diagnosticum). Ang gawaing ito ay nangyayari kapag kinakailangan upang matukoy ang mga antibodies sa isang pathogen sa serum ng dugo ng pasyente (serodiagnosis). Ang paghahanap ng mga antibodies ay nagpapahintulot sa iyo na kumpirmahin ang diagnosis;
Pagpapasiya ng hindi kilalang antigen gamit ang mga kilalang antibodies (diagnostic serum). Isinasagawa ang pag-aaral na ito kapag tinutukoy ang kultura ng pathogen na nakahiwalay sa materyal ng isang pasyente (serotyping), gayundin kapag natukoy
antigens ng microbes at ang kanilang mga lason sa dugo at iba pa mga biyolohikal na likido. Mayroong maraming mga uri ng mga reaksyon ng immune, naiiba sa pamamaraan ng pagtatanghal at ang naitala na epekto. Ang mga ito ay agglutination reactions (RA), precipitation reactions (RP), reactions involving complement (RSC), reactions using labeled components (RIF, ELISA, RIA).
13.2. Reaksyon ng aglutinasyon
Agglutination reaction (RA) ay immune reaksyon pakikipag-ugnayan ng antigen sa mga antibodies sa pagkakaroon ng mga electrolytes, at ang antigen ay nasa isang corpuscular state (erythrocytes, bacteria, latex particle na may adsorbed antigens). Sa panahon ng agglutination, ang mga corpuscular antigens ay pinagsama ng mga antibodies, na ipinakita sa pamamagitan ng pagbuo ng isang flocculent precipitate. Ang pagbuo ng mga natuklap ay nangyayari dahil sa ang katunayan na ang mga antibodies ay may dalawang aktibong sentro, at ang mga antigen ay polyvalent, i.e. may ilang mga antigenic determinants. Ginagamit ang RA upang tukuyin ang pathogen na nakahiwalay sa materyal ng pasyente, gayundin upang makita ang mga antibodies sa pathogen sa serum ng dugo ng pasyente (halimbawa, ang mga reaksyon ng Wright at Heddleson para sa brucellosis, ang reaksyon ng Widal para sa typhoid fever at paratyphoid fever).
Ang pinakasimpleng paraan upang masuri ang RA ay ang reaksyon sa salamin; ito ay isang tinatayang RA, na ginagamit upang matukoy ang pathogen na nakahiwalay sa pasyente. Kapag naitatag ang isang reaksyon, ang diagnostic agglutinating serum ay inilapat sa isang glass slide (sa isang pagbabanto ng 1:10 o 1:20), pagkatapos ay isang kultura mula sa pasyente ay idinagdag. Positibo ang reaksyon kung may lalabas na flocculent sediment sa drop. Ang isang kontrol ay inilalagay sa malapit: sa halip na serum, isang patak ng sodium chloride solution ang inilapat. Kung ang diagnostic agglutinating serum ay hindi adsorbed 1, pagkatapos ito ay diluted (sa titer - ang pagbabanto kung saan dapat mangyari ang agglutination), i.e. ilagay ang pinalawak na RA sa mga test tube na may pagtaas
1 Ang hindi na-adsorbed na agglutinating serum ay maaaring pagsama-samahin ang mga nauugnay na bakterya na may mga karaniwang (cross-reacting) na antigens. Samakatuwid ginagamit nilaadsorbed agglutinating sera, kung saan ang mga cross-reacting antibodies ay tinanggal sa pamamagitan ng adsorption sa mga kaugnay na bakterya. Ang nasabing sera ay nagpapanatili ng mga antibodies na partikular lamang sa isang partikular na bacterium.
dilutions ng agglutinating serum, kung saan idinagdag ang 2-3 patak ng isang suspensyon ng pathogen na nakahiwalay sa pasyente. Ang aglutinasyon ay isinasaalang-alang ng dami ng sediment at ang antas ng pag-clear ng likido sa mga test tube. Ang reaksyon ay itinuturing na positibo kung ang agglutination ay sinusunod sa isang pagbabanto na malapit sa titer ng diagnostic serum. Ang reaksyon ay sinamahan ng mga kontrol: ang serum na diluted na may isotonic sodium chloride solution ay dapat na transparent, ang suspensyon ng microbes sa parehong solusyon ay dapat na pantay na maulap, walang sediment.
Upang matukoy ang mga antibodies sa pathogen sa serum ng dugo ng pasyente, ginagamit ang full-scale RA. Kapag itinatakda ito, ang serum ng dugo ng pasyente ay diluted sa mga test tube at isang pantay na halaga ng diagnosticum suspension (suspensyon ng mga napatay na mikrobyo) ay idinagdag sa mga test tube. Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog, ang pinakamataas na pagbabanto ng serum kung saan naganap ang agglutination ay tinutukoy, i.e. isang precipitate (serum titer) ay nabuo. Sa kasong ito, ang reaksyon ng agglutination na may O-diagnosticum (bacteria na pinatay sa pamamagitan ng pag-init, pinapanatili ang thermostable O-antigen) ay nangyayari sa anyo ng fine-grained agglutination. Ang agglutination reaction na may H-diagnosticum (bacteria na pinatay ng formaldehyde, na pinapanatili ang thermolabile flagellar H-antigen) ay magaspang at mas mabilis na nagpapatuloy.
Hindi direktang (passive) hemagglutination reaksyon(RNGA o RPGA) ay isang uri ng RA. Ang pamamaraang ito ay lubos na sensitibo. Sa tulong ng RNGA, dalawang problema ang maaaring malutas: upang matukoy ang mga antibodies sa serum ng dugo ng pasyente, kung saan idinagdag ang isang antigenic erythrocyte diagnosticum, na kung saan ay mga erythrocytes kung saan ang mga kilalang antigen ay adsorbed; matukoy ang pagkakaroon ng mga antigen sa materyal ng pagsubok. Sa kasong ito, kung minsan ang reaksyon ay tinatawag na reverse indirect hemagglutination reaction (RONHA). Sa panahon ng pamamaraan, ang isang antibody erythrocyte diagnosticum (erythrocytes na may mga antibodies na adsorbed sa kanilang ibabaw) ay idinagdag sa materyal ng pagsubok. Sa reaksyong ito, ang mga pulang selula ng dugo ay kumikilos bilang mga carrier at pasibo na kasangkot sa pagbuo ng mga immune aggregate. Sa isang positibong reaksyon, ang pasibo na nakadikit na mga pulang selula ng dugo ay sumasakop sa ilalim ng butas sa isang pantay na layer na may mga scalloped na gilid ("payong"); sa kawalan ng agglutination, ang mga pulang selula ng dugo ay naipon sa gitnang recess ng butas, na bumubuo ng isang compact na "button" na may malinaw na tinukoy na mga gilid.
Reaksyon ng coagglutination ginagamit upang matukoy ang mga pathogen cell (antigens) gamit ang mga antibodies na naka-adsorb sa Staphylococcus aureus, naglalaman ng protina A. Ang protina A ay may kaugnayan sa Fc fragment ng mga immunoglobulin. Salamat dito, ang mga antibodies ay nagbubuklod sa staphylococcus nang hindi direkta sa pamamagitan ng Fc fragment, at ang mga fragment ng Fab ay nakatuon sa labas at nagagawang makipag-ugnayan sa mga kaukulang microbes na nakahiwalay sa mga pasyente. Sa kasong ito, ang mga natuklap ay nabuo.
Hemagglutination inhibition reaction (HAI) ginagamit sa diagnostics mga impeksyon sa viral, at mga impeksyon lamang na dulot ng mga virus na nagha-hemaglutinate. Ang mga virus na ito ay naglalaman ng isang protina sa kanilang ibabaw - hemagglutinin, na responsable para sa reaksyon ng hemagglutination (HRA) kapag ang mga pulang selula ng dugo ay idinagdag sa mga virus. Ang RTGA ay nagsasangkot ng pagharang sa mga viral antigen na may mga antibodies, bilang isang resulta kung saan ang mga virus ay nawawalan ng kakayahang pagsama-samahin ang mga pulang selula ng dugo.
Reaksyon ng Coombs - RA para sa pagtukoy ng hindi kumpletong antibodies. Sa ilang mga nakakahawang sakit, tulad ng brucellosis, ang mga hindi kumpletong antibodies sa pathogen ay kumakalat sa serum ng dugo ng pasyente. Hindi kumpletong antibodies ay tinatawag na blocking antibodies dahil mayroon silang isang antigen-binding site, at hindi dalawa, tulad ng ganap na antibodies. Samakatuwid, kapag ang isang antigenic diagnosticum ay idinagdag, ang mga hindi kumpletong antibodies ay nagbubuklod sa mga antigen, ngunit huwag idikit ang mga ito. Upang maipakita ang reaksyon, ang antiglobulin serum (antibodies sa mga immunoglobulin ng tao) ay idinagdag, na hahantong sa agglutination ng mga immune complex (antigenic diagnosticum + hindi kumpletong antibodies) na nabuo sa unang yugto ng reaksyon.
Ang hindi direktang reaksyon ng Coombs ay ginagamit sa mga pasyente na may intravascular hemolysis. Sa ilan sa mga pasyenteng ito, natukoy ang hindi kumpletong monovalent na anti-Rhesus antibodies. Partikular na nakikipag-ugnayan ang mga ito sa Rh-positive erythrocytes, ngunit hindi nagiging sanhi ng kanilang aglutinasyon. Samakatuwid, ang antiglobulin serum ay idinagdag sa anti-Rh antibodies + Rh-positive erythrocytes system, na nagiging sanhi ng agglutination ng mga erythrocytes. Ang Coombs test ay ginagamit para mag-diagnose mga kondisyon ng pathological, na nauugnay sa intravascular lysis ng mga erythrocytes ng immune na pinagmulan, halimbawa, hemolytic disease ng mga bagong silang na sanhi ng Rh conflict.
RA para sa pagtukoy ng mga pangkat ng dugo ay batay sa agglutination ng mga erythrocytes ng immune serum antibodies sa mga antigen ng pangkat ng dugo A(II), B(III). Ang kontrol ay serum na hindi naglalaman ng mga antibodies, i.e. serum AB(IV) blood group, at erythrocyte antigens ng mga grupong A(P) at B(III). Ang pangkat 0(I) na mga pulang selula ng dugo ay ginagamit bilang isang negatibong kontrol dahil wala silang mga antigen.
Upang matukoy ang Rh factor, ginagamit ang anti-Rh sera (hindi bababa sa dalawang magkaibang serye). Kung mayroong isang Rh antigen sa lamad ng mga erythrocytes sa ilalim ng pag-aaral, ang agglutination ng mga cell na ito ay nangyayari.
13.3. Reaksyon ng ulan
Ang RP ay isang immune reaksyon ng pakikipag-ugnayan ng mga antibodies sa mga antigen sa pagkakaroon ng mga electrolytes, at ang antigen ay nasa isang natutunaw na estado. Sa panahon ng pag-ulan, ang mga natutunaw na antigens ay pina-precipitate ng mga antibodies, na ipinakikita ng cloudiness sa anyo ng mga precipitation band. Ang pagbuo ng isang nakikitang precipitate ay sinusunod kapag ang parehong mga reagents ay pinaghalo sa katumbas na mga ratio. Ang labis sa isa sa mga ito ay binabawasan ang bilang ng mga precipitated immune complex. Mayroong iba't ibang mga paraan upang maisagawa ang reaksyon ng pag-ulan.
Reaksyon ng pag-ulan ng singsing inilagay sa mga tubo ng ulan na may maliit na diameter. Ang immune serum ay idinagdag sa test tube at ang natutunaw na antigen ay maingat na pinahiran. Kung positibo ang resulta, mabubuo ang isang milky ring sa interface ng dalawang solusyon. Ang reaksyon ng pag-ulan ng singsing, na ginagamit upang matukoy ang pagkakaroon ng mga antigen sa mga organo at tisyu, ang mga extract na kung saan ay pinakuluan at sinala, ay tinatawag na reaksyon ng thermoprecipitation (reaksyon ng Ascoli para sa pagtukoy ng thermostable anthrax antigen).
Ouchterlony double immunodiffusion reaksyon. Ang reaksyon na ito ay isinasagawa sa isang agar gel. Sa isang layer ng gel ng pare-parehong kapal, ang mga balon ay pinutol sa isang tiyak na distansya mula sa bawat isa at puno ng antigen at immune serum, ayon sa pagkakabanggit. Pagkatapos nito, ang mga antigen at antibodies ay nagkakalat sa gel, nakakatugon sa isa't isa at bumubuo ng mga immune complex, na namuo sa gel at nagiging nakikita bilang mga linya ng katumpakan.
nutrisyon. Ang reaksyong ito ay maaaring gamitin upang matukoy ang hindi kilalang mga antigen o antibodies, at upang subukan din ang pagkakatulad sa pagitan ng iba't ibang antigens: kung ang mga antigen ay magkapareho, ang mga linya ng pag-ulan ay nagsasama, kung ang mga antigen ay hindi magkapareho, ang mga linya ng pag-ulan ay nagsalubong, kung ang mga antigen ay bahagyang magkapareho, isang udyok ay nabuo.
Radial immunodiffusion reaksyon. Ang mga antibodies ay idinagdag sa tinunaw na agar gel at ang gel ay inilapat sa isang pantay na layer sa salamin. Ang mga balon ay pinutol sa gel at isang karaniwang dami ng mga solusyon sa antigen ng iba't ibang mga konsentrasyon ay idinagdag sa kanila. Sa panahon ng pagpapapisa ng itlog, ang mga antigen ay kumakalat nang radially mula sa balon at, nakakatugon sa mga antibodies, ay bumubuo ng isang singsing ng pag-ulan. Hangga't nananatili ang labis na antigen sa balon, nangyayari ang unti-unting pagtaas sa diameter ng precipitation ring. Ang pamamaraang ito ay ginagamit upang matukoy ang mga antigen o antibodies sa solusyon sa pagsubok (halimbawa, upang matukoy ang konsentrasyon ng mga immunoglobulin ng iba't ibang klase sa serum ng dugo).
Immunoelectrophoresis. Ang pinaghalong antigen ay unang pinaghihiwalay ng electrophoretically, pagkatapos ay idinagdag ang precipitating antiserum sa uka na tumatakbo sa direksyon ng paggalaw ng protina. Ang mga antigen at antibodies ay nagkakalat sa gel patungo sa isa't isa; nakikipag-ugnayan, bumubuo sila ng mga arcuate precipitation lines.
Reaksyon ng flocculation(ayon kay Ramon) - isang uri ng precipitation reaction na ginagamit upang matukoy ang aktibidad ng antitoxic serum o toxoid. Ang reaksyon ay isinasagawa sa mga test tube. Sa isang test tube kung saan ang toxoid at antitoxin ay nasa isang katumbas na ratio, ang labo ay sinusunod.
13.4. Makadagdag sa reaksyon ng pag-aayos
Ang mga antibodies, na nakikipag-ugnayan sa kaukulang antigen, ay nagbubuklod ng karagdagang pandagdag (1st system). Ang isang tagapagpahiwatig ng pag-aayos ng pandagdag ay ang mga erythrocytes na sensitized na may hemolytic serum, i.e. antibodies sa mga pulang selula ng dugo (ika-2 sistema). Kung hindi naayos ang complement sa 1st system, i.e. Kung ang reaksyon ng antigen-antibody ay hindi nangyari, ang mga sensitized na pulang selula ng dugo ay ganap na lysed (negatibong reaksyon). Kapag ang pandagdag ay naayos ng mga immune complex ng 1st system pagkatapos magdagdag ng sensitized erythrocytes, hemolysis mula sa
wala (positibong reaksyon). Ang complement fixation reaction ay ginagamit upang masuri ang mga nakakahawang sakit (gonorrhea, syphilis, influenza, atbp.).
13.5. Reaksyon ng neutralisasyon
Ang mga mikrobyo at ang kanilang mga lason ay may nakakapinsalang epekto sa mga organo at tisyu ng katawan ng tao. Ang mga antibodies ay maaaring magbigkis sa mga nakakapinsalang ahente na ito at harangan ang mga ito, i.e. neutralisahin. Ang reaksyon ng diagnostic na neutralisasyon ay batay sa tampok na ito ng mga antibodies. Isinasagawa ito sa pamamagitan ng paglalagay ng isang antigen-antibody mixture sa mga hayop o sa mga sensitibong bagay sa pagsubok (cell culture, embryo). Halimbawa, upang makita ang mga lason sa materyal ng isang pasyente, ang mga hayop ng 1st group ay tinuturok ng materyal mula sa pasyente. Ang mga hayop ng ika-2 pangkat ay tinuturok ng katulad na materyal, na paunang ginagamot ng naaangkop na antiserum. Ang mga hayop ng 1st group ay namamatay kung mayroong lason sa materyal. Ang pangalawang pangkat ng mga hayop ay nakaligtas; ang nakakapinsalang epekto ng lason ay hindi nagpapakita ng sarili, dahil ito ay neutralisado.
13.6. Mga reaksyon gamit ang mga may label na antibodies o antigens
13.6.1. Immunofluorescence reaction (RIF, paraan ng Koons)
Ang pamamaraang ito ay ginagamit para sa express diagnostics. Maaari itong magamit upang makita ang parehong microbial antigens at antibodies.
Direktang paraan ng RIF- isang immune reaction ng interaksyon ng mga antibodies sa antigens, at ang mga antibodies ay may label na fluorochrome - isang substance na may kakayahang maglabas ng light quanta ng isang tiyak na wavelength kapag nalantad sa liwanag ng isang tiyak na wavelength. Ang kakaiba ng pamamaraang ito ay ang pangangailangan na tanggalin ang mga hindi na-react na bahagi upang hindi isama ang pagtuklas ng hindi tiyak na luminescence. Upang gawin ito, hugasan ang mga hindi gumagalaw na antibodies. Ang mga resulta ay tinasa gamit ang isang fluorescent microscope. Bakterya sa isang smear ginagamot sa tulad ng isang luminescent serum glow laban sa isang madilim na background sa kahabaan ng paligid ng cell.
Hindi direktang paraan ng RIF ay ginagamit nang mas madalas kaysa sa nauna. Ang reaksyong ito ay isinasagawa sa dalawang yugto. Sa unang yugto, ang mga antigen ay magkapareho
nakikipag-ugnayan sa kaukulang antibodies, na bumubuo ng mga immune complex. Ang lahat ng mga sangkap na hindi gumanti (ibig sabihin, ay hindi bahagi ng mga immune complex) ay dapat alisin sa pamamagitan ng paghuhugas. Sa ikalawang yugto, ang nagreresultang antigen-antibody complex ay nakita gamit ang fluorochromized antiglobulin serum. Bilang resulta, nabuo ang isang complex ng microbe + antimicrobial rabbit antibodies + antibodies sa rabbit immunoglobulins, na may label na fluorochrome. Ang mga resulta ay tinasa gamit ang isang fluorescent microscope.
13.6.2. Enzyme immunosorbent na paraan o assay
ELISA - ang pinakakaraniwan makabagong pamamaraan, ginagamit para sa pagsusuri ng mga impeksyon sa viral, bacterial, protozoal, lalo na para sa diagnosis ng impeksyon sa HIV, viral hepatitis at iba pa.
Mayroong maraming mga pagbabago sa ELISA. Ang solid-phase non-competitive na ELISA ay malawakang ginagamit. Isinasagawa ito sa 96-well polystyrene plates (solid phase). Kapag nagsasagawa ng isang reaksyon, kinakailangang hugasan ang mga hindi gumagalaw na sangkap sa bawat yugto. Kapag tinutukoy ang mga antibodies, ang test serum ng dugo ay idinagdag sa mga balon kung saan ang mga antigens ay nasorbed, pagkatapos ay antiglobulin serum na may label na isang enzyme. Ang reaksyon ay isinasagawa sa pamamagitan ng pagdaragdag ng isang substrate para sa enzyme. Sa pagkakaroon ng isang enzyme, nagbabago ang substrate, at ang enzyme-substrate complex ay pinili upang ang produkto na nabuo sa reaksyon ay may kulay. Kaya, sa isang positibong reaksyon, ang isang pagbabago sa kulay ng solusyon ay sinusunod. Upang matukoy ang mga antigen, ang isang solid-phase carrier ay na-sensitize sa mga antibodies, pagkatapos ay ang materyal na pansubok (antigens) at serum na may label na enzyme sa mga antigen ay sunud-sunod na idinaragdag. Para mangyari ang reaksyon, idinagdag ang isang substrate para sa enzyme. Ang pagbabago sa kulay ng solusyon ay nangyayari sa isang positibong reaksyon.
13.6.3. Immunoblotting
Ang pamamaraang ito ay batay sa isang kumbinasyon ng electrophoresis at ELISA. Kapag nagsasagawa ng immunoblotting (blotting mula sa English. blot- spot) ang isang kumplikadong halo ng mga antigen ay unang sumailalim sa electrophoresis sa isang polyacrylamide gel. Ang nagresultang fractionated anti-
Ang mga peptide ng gene ay inililipat sa isang lamad ng nitrocellulose. Ang mga blots ay ginagamot sa pamamagitan ng enzyme-labeled antibodies sa isang partikular na antigen, i.e. isagawa ang ELISA blot. Ginagamit ang immunoblotting sa pagsusuri ng mga impeksyon tulad ng HIV.
13.6.4. Immune electron microscopy
Ang pamamaraan ay binubuo ng mikroskopya sa electron microscope mga virus (hindi gaanong karaniwang iba pang mga mikrobyo), paunang ginagamot gamit ang naaangkop na immune serum na may label na electron-optically siksik na paghahanda, halimbawa ferritin, isang protina na naglalaman ng bakal.
13.7. Daloy ng cytometry
Naiiba ang mga selula ng dugo batay sa laser cytofluorometry. Upang gawin ito, ang ninanais na mga cell ay nabahiran ng fluorescent monoclonal antibodies sa CD antigens. Ang sample ng dugo, pagkatapos na tratuhin ng may label na antibodies, ay dumaan sa isang manipis na tubo at isang laser beam ay dumaan dito, na nagpapasigla sa fluorochrome na lumiwanag. Ang intensity ng fluorescence ay nauugnay sa density ng mga antigen sa ibabaw ng cell at maaaring masukat sa dami gamit ang isang photomultiplier tube. Ang mga resulta na nakuha ay na-convert sa isang histogram.
Ang flow cytometry ay ginagamit upang matukoy katayuan ng immune(nilalaman ng pangunahing populasyon ng mga lymphocytes, nilalaman ng intracellular at extracellular cytokines, functional na aktibidad ng NK cells, aktibidad ng phagocytosis, atbp.).
IMMUNOMICROBIOLOGICAL STUDIES
Ang mga immunological na pamamaraan ay ginagamit upang malutas ang maraming mga problema:
1. Pagtatasa ng kondisyon immune system tao (immune status) sa pamamagitan ng pagtukoy ng quantitative at functional na mga katangian mga selula ng immune system at ang kanilang mga produkto.
2. Pagpapasiya ng komposisyon at mga katangian ng mga tisyu ng tao: mga pangkat ng dugo, Rh factor, transplant antigens.
3. Diagnosis ng mga nakakahawang sakit at paglaban sa mga ito sa pamamagitan ng pagtukoy at pagtatatag ng mga titer ng antibody (serodiagnosis), pagtukoy ng mga pathogen antigen sa katawan, at pagtukoy ng mga cellular reaction sa mga antigen na ito.
4. Pagkilala sa seroid ng mga kultura ng bakterya at mga virus na nakahiwalay sa katawan ng mga tao at hayop.
5. Detection sa katawan ng tao at sa loob panlabas na kapaligiran anumang mga sangkap na may mga katangian ng antigenic o hapten (mga hormone, enzyme, lason, gamot, gamot, atbp.).
6. Pagkilala sa mga kondisyon ng immunopathological, allergy, paglipat at mga reaksyon ng antitumor.
Ang proseso ng pakikipag-ugnayan sa pagitan ng antigen at antibody serological reaksyon nangyayari sa dalawang yugto:
1) tiyak- ang yugto ng pakikipag-ugnayan kung saan nangyayari ang isang komplementaryong kumbinasyon ng mga aktibong sentro ng antibodies (paratopes) at antigen epitopes. Karaniwan ang bahaging ito ay tumatagal ng ilang segundo o minuto;
2) hindi tiyak- yugto ng paghahayag, nailalarawan panlabas na mga palatandaan pagbuo ng mga immune complex. Ang yugtong ito ay maaaring umunlad mula sa ilang minuto hanggang ilang oras.
Ang pinakamainam na partikular na pakikipag-ugnayan ng mga antibodies sa antigen ay nangyayari sa isang isotonic solution na may pH na malapit sa neutral. Ang reaksyon ng antigen-antibody sa isang in vitro system ay maaaring sinamahan ng paglitaw ng ilang mga phenomena
· aglutinasyon,
· ulan,
· lysis.
Panlabas na pagpapakita ang mga reaksyon ay nakasalalay sa mga katangian ng physicochemical ng antigen (laki ng butil, pisikal na estado), klase at uri ng antibodies (kumpleto at hindi kumpleto), pati na rin ang mga pang-eksperimentong kondisyon (katamtamang pagkakapare-pareho, konsentrasyon ng asin, pH, temperatura).
Tinitiyak ng polyvalency ng antigens at antibodies ang pagbuo ng mga pinagsama-samang nakikita ng mata. Nangyayari ito alinsunod sa teorya ng pagbuo ng network, ayon sa kung saan ang iba pang mga molekula ng antibody at antigen ay sunud-sunod na nakakabit sa nagreresultang antigen-antibody complex. Bilang resulta, nabuo ang mga istruktura ng network, na nagiging mga pinagsama-samang namuo. Ang kalikasan at kalubhaan ng reaksyon ay nakasalalay sa dami ng ratio ng mga antigen at antibodies. Ang mga reaksyon ay pinakamatindi kapag ang mga reaksyon ay nasa katumbas na sukat.
Prerequisite pagbuo ng sala-sala (network) - ang pagkakaroon ng higit sa tatlong antigenic determinants para sa bawat molekula ng antigen at dalawang aktibong sentro para sa bawat molekula ng antibody. Ang mga molekula ng antigen ay mga lattice node, at ang mga molekula ng antibody ay mga link na nagkokonekta. Ang rehiyon ng pinakamainam na ratios (equivalence zone) ng mga konsentrasyon ng antigen at antibodies, kapag ang mga libreng antigen o libreng antibodies ay hindi nakita sa supernatant pagkatapos ng pagbuo ng isang namuo.
Nabubuo ang mga aggregate na maaaring mag-precipitate kapag ang mga antigen ay pinagsama sa buong antibodies. Ang mga hindi kumpletong antibodies (monovalent) ay hindi nagiging sanhi ng pagbuo ng mga istruktura ng network at malalaking pinagsama-sama. Upang makita ang gayong mga antibodies, gamitin mga espesyal na pamamaraan batay sa paggamit ng mga antiglobulin (reaksyon ng Coombs).
Ang mga pagsusuri sa serological, dahil sa kanilang mataas na pagtitiyak at pagiging sensitibo, ay ginagamit upang makita at quantification antigens at antibodies. Ang dami ng immunoreagents sa mga reaksyon ay ipinahayag ng titer - ang pinakamataas na pagbabanto ng serum o antigen kung saan ang isang reaksyon ay sinusunod pa rin.
Ang mga serological na reaksyon sa microbiological at immunological laboratories ay ginagamit para sa dalawang layunin:
1) para sa seroidentification ng mga microorganism, toxins, antigens sa pangkalahatan gamit ang isang kilalang antibody (immune diagnostic serum),
2) para sa serodiagnosis - pagtukoy sa likas na katangian ng antibody sa serum ng dugo ng pasyente para sa bacterial, viral, at mas madalas na iba pang mga nakakahawang sakit gamit ang isang kilalang antigen (diagnosticum).
Upang matukoy ang generic, species at uri ng antigen, kinakailangan ang kilalang immune diagnostic sera. Nakukuha ang mga ito sa pamamagitan ng paulit-ulit na pangangasiwa sa mga hayop (karaniwan ay mga kuneho) sa pagtaas ng dosis ng mga napatay o nabubuhay na mikroorganismo, ang kanilang mga produkto ng pagkabulok, neutralisado o katutubong mga lason. Pagkatapos ng isang tiyak na siklo ng pagbabakuna ng mga hayop, isinasagawa ang malawakang pagdurugo o kabuuang pagdurugo ng hayop. Ang dugo na nakolekta sa isang sterile na lalagyan ay unang inilagay sa isang thermostat sa temperatura na 37°C sa loob ng 4 - 6 na oras upang mapabilis ang pamumuo, pagkatapos ay sa isang icebox sa loob ng isang araw. Ang nagresultang transparent na serum ay sinipsip sa isang sterile na lalagyan, idinagdag ang mga preservative, tinutukoy ang titer ng antibody, sinuri para sa sterility at ibinuhos sa mga ampoules.
Ay ginamit hindi na-adsorbed At na-adsorbed diagnostic sera. Ang mga hindi sinadyang serum ay mayroon mataas na titers antibodies, ngunit may kakayahang magbigay ng mga reaksyon ng grupo (cross).
Ang adsorbed sera ay nailalarawan sa pamamagitan ng mahigpit na pagtitiyak ng pagkilos (sila ay tumutugon lamang sa isang homologous antigen). Sera na naglalaman ng mga antibodies sa isang partikular na antigen lamang ang tinatawag monoreceptor.
Gumagawa din sila ng mga serum na may label na fluorochromes, enzymes, at radioisotopes, na nagpapahintulot sa kahit na mga bakas ng antigen na matukoy nang may mataas na antas ng katumpakan.
Ang mga pagsususpinde ng mga nabubuhay o napatay na bakterya, ang kanilang mga produkto ng pagkasira, lason, at mga virus ay ginagamit bilang mga antigen (diagnosticum) sa mga serological na reaksyon. Sa ilang mga kaso, ginagamit ang mga extract o mga antigen na nakahiwalay sa kemikal mula sa mga microorganism at tissue ng hayop.
Ang lahat ng immunomicrobiological na pamamaraan ay maaaring nahahati sa 3 grupo:
1) batay sa direktang pakikipag-ugnayan ng antigen sa antibody(phenomena ng agglutination, precipitation, hemagglutination, immobilization, atbp.);
2) batay sa mediated interaction ng antigen sa antibody(mga reaksyon hindi direktang hemagglutination, coagglutination, latex agglutination, carbon agglomeration, bentonite agglutination, complement fixation, atbp.);
3) gamit may label na antibodies o antigens(fluorescent antibody method, enzyme-linked immunosorbent at radioimmunoassays at iba pang pamamaraan).
MGA REAKSIYON NG AGLUTINASYON
Ang mga reaksyong ito ay nagsasangkot ng mga antigen sa anyo ng mga particle (microbial cells, red blood cell at iba pang corpuscular antigens), na pinagdikit ng mga antibodies at namuo.
Upang magsagawa ng agglutination reaction(RA) tatlong sangkap ang kailangan: 1) antigen (agglutinogen);
2) antibody (aglutinin)
3) electrolyte (isotonic sodium chloride solution).
Tinatayang agglutination reaction (RA)
Ang isang indicative, o plato, RA ay inilalagay sa isang glass slide sa temperatura ng silid. Upang gawin ito, gumamit ng Pasteur pipette para maglagay ng isang patak ng serum sa isang dilution na 1:10 hanggang 1:20 at isang control drop ng isotonic sodium chloride solution nang hiwalay sa baso. Ang mga kolonya o isang pang-araw-araw na kultura ng bakterya (isang patak ng diagnosticum) ay ipinakilala sa parehong mga bacteriological loop at pinaghalo nang lubusan. Isinasaalang-alang ang mga reaksyon pagkatapos ng ilang minuto, minsan ay gumagamit ng magnifying glass (x5). Sa positibong RA, ang hitsura ng malaki at maliit na mga natuklap sa isang patak ng serum ay nabanggit na may negatibong RA, ang serum ay nananatiling pantay na maulap.
Detalyadong reaksyon ng agglutination upang matukoy ang titer ng mga tiyak na antibodies sa isang pasyente.
Ang full-blown RA para sa serodiagnosis ay ginawa sa serum ng mga pasyente. Diluted din ito sa isotonic sodium chloride solution mula 1:50 - 1:100 hanggang 1:800 o 1: 1600. Dahil ang mas mababang serum titers ay maaaring maglaman ng mga normal na agglutinin na matatagpuan sa malusog na tao o mga pasyente na may ibang diagnosis (diagnostic titer). Bilang isang antigen sa reaksyong ito, ginagamit ang mga diagnosticum - mga kilalang suspensyon, kadalasan ng mga napatay na bakterya.
Ang 1 ml ng isotonic sodium chloride solution ay unang ibinuhos sa mga agglutination tubes. Ang 1 ml ng serum na diluted 1:100 ay idinagdag sa una sa kanila, at pagkatapos ng paghahalo nito, 1 ml ay inilipat sa pangalawa, mula sa pangalawa hanggang sa pangatlo, atbp. 1-2 patak ng bacterial suspension na naglalaman ng 3 bilyong microbial body sa 1 ml ay idinagdag sa nagreresultang dalawang beses na dilution ng sera (mula 1:100 hanggang 1:1600 o higit pa). Ang mga tubo ay inalog at inilagay sa isang thermostat sa 37°C sa loob ng 2 oras, pagkatapos ay pinananatili sa temperatura ng silid sa loob ng 24 na oras.
Ang detalyadong reaksyon ng agglutination ay isinasaalang-alang sa pamamagitan ng pagsusuri sa bawat test tube nang sunud-sunod, simula sa mga control, na may banayad na pag-alog. Dapat ay walang agglutination sa control tubes. Ang intensity ng reaksyon ng agglutination ay minarkahan ng mga sumusunod na palatandaan: ++++ - kumpletong agglutination (agglutinate flakes sa isang ganap na transparent na likido); +++ - hindi kumpletong agglutination (mga natuklap sa isang bahagyang opalescent na likido); ++ - bahagyang agglutination (ang mga natuklap ay malinaw na nakikita, ang likido ay bahagyang maulap); + - mahina, kaduda-dudang agglutination - ang likido ay masyadong maulap, ang mga natuklap sa loob nito ay hindi gaanong nakikilala; - - kawalan ng agglutination (ang likido ay pantay na maulap).
Ang titer ng serum ay itinuturing na huling pagbabanto nito, kung saan ang intensity ng agglutination ay tinasa bilang hindi bababa sa dalawang plus (++)
Reaksyon ng aglutinasyon Reaksyon ng aglutinasyon
(RA) ay isang paraan para sa pagtukoy at pagbibilang ng Ag at Ab, batay sa kanilang kakayahang bumuo ng mga agglomerates na nakikita ng mata. Sa departamento ng mga nakakahawang sakit. Ang mga sakit o para sa iba pang layunin ay ginagamit upang makilala ang mga hindi kilalang mikrobyo at mga selula, upang matukoy ang presensya at dami ng Ab sa dugo at iba pang mga likido. Ang prinsipyo ng pagpapasiya ay batay sa pagtitiyak ng pakikipag-ugnayan sa pagitan ng Ag at Ab at binubuo sa paghahanap ng kilala mula sa hindi alam. Mayroong maraming mga opsyon para sa RA: quantitative at qualitative, test tube at glass, volumetric at droplet, conventional, accelerated at express na mga pamamaraan. Upang i-stage RA kailangan mo: 1) s-ka dugo. Sa variant sa pagtukoy ng uri (var) ng bakterya, ginagamit ang mga pang-industriyang agglutinating na pagsubok, na ginawa ng mga kuneho na nagpapabakuna. Sa variant na may pagpapasiya ng uri ng Ab, isang sample ng dugo ang kinuha mula sa pagsubok. tao o hayop. Ang solusyon ay dapat na sterile at walang nasuspinde na mga particle. Ihanda ang pangunahing pagbabanto sa solusyon ng asin. Dapat itong 2-4 beses na mas mababa kaysa sa diagnostic titer para sa sakit na ito; 2) Ag. Sa bersyon ng reaksyon na may pagpapasiya ng uri ng Ab, ginagamit ang mga pang-industriyang diagnostic kit; sa variant na may pagpapasiya ng Ag, ang mga diagnosticum ay inihanda sa kanilang sarili sa anyo ng isang 1-3 bilyong suspensyon sa isang solusyon sa asin ng 18-20-oras na agar (mas madalas na sabaw) na pagsubok. microbe inactivated sa pamamagitan ng pag-init sa isang paliguan ng tubig sa 70°C para sa 1 oras o sa pamamagitan ng 24-oras na incubation sa 37°C na may formaldehyde (panghuling konsentrasyon 0.2%); 3) electrolyte sa anyo ng saline solution. Teknik ng pagtatanghal volumetric serial tube RA upang matukoy ang Ab titer sa s-ki: ilang hanay ng mga gumaganang dilution ang inihanda mula sa pangunahing pagbabanto ng s-ki. Ang bilang ng mga hilera ay nakasalalay sa bilang ng mga diagnosticum na kinuha sa eksperimento; ang bilang at mga kadahilanan ng pagbabanto ay tinutukoy ng diagnostic titer ng pinaghihinalaang sakit. Ang serye ay dapat man lang maglaman ng dilution na tumutugma sa diagnostic Ab titer, dalawang dilution sa ibaba at dalawang dilution sa itaas nito. halimbawa, kung ang diagnostic titer ay 1:100, pagkatapos ay sa volumetric na paraan ng pagtatanghal ng RA ang mga sumusunod na dilution ay dapat ihanda: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; kasama ang drip pamamaraan, ang unang pagbabanto (1:25) ay hindi kinakailangan, ngunit ang isa pang mas mataas na pagbabanto ay kinakailangan - 1:800 B. siyentipikong pananaliksik s-ku ay titrated sa negatibong reaksyon. Ito ay diluted tulad ng sumusunod: 0.25 ml ng saline solution ay ibinuhos sa lahat ng test tubes, maliban sa una, kapag ang reaksyon ay isinasagawa sa dami ng 0.5 ml, at 0.5 ml kapag ang reaksyon ay isinasagawa sa dami ng 1. ml. Ibuhos ang 0.25 (0.5) ml ng pangunahing dilution sa 1st at 2nd test tubes, mula sa 2nd test tube, papunta sa cut volume at pag-aanak s-k at tumaas ng 2 beses, 0.25 (0.5) ml ay inilipat sa ika-3, mula sa ika-3 hanggang ika-4, atbp. hanggang sa huli, mula sa hiwa 0.25 (0.5) ml ay ibinubuhos sa lahat upang balansehin ang mga volume. Ang bawat pagbabanto ay isinasagawa gamit ang isang hiwalay na pipette. Kung ang ilang mga diagnosticum ay kinuha sa eksperimento, kung gayon para sa bawat isa sa kanila ang sarili nitong serye ng pagbabanto ay inihanda sa parehong paraan. Ang Diagnosticum ay idinagdag sa bawat pagbabanto ng test tube sa isang volume na katumbas ng volume ng test tube, bilang isang resulta kung saan ang dilution sa bawat test tube ay nadoble. Ang eksperimento ay tumutugma sa s-ki control (0.25 - 0.5 ml ng pangunahing dilution ng s-ki at ang parehong halaga ng saline solution) at ang Ag control (0.25 - 0.5 ml ng diagnosticum at ang parehong halaga ng saline solution). Kung maraming diagnosticum ang ginagamit sa eksperimento, ang bawat isa ay may sariling antigen control. Ang rack na may mga test tube ay inalog ng mabuti at inilagay sa isang thermostat sa 37°C sa loob ng 4 na oras, at pagkatapos ay iniiwan sa temperatura ng silid hanggang sa susunod na araw, pagkatapos nito ay naitala ang PA batay sa dami ng sediment at antas ng pag-alis ng ang likido. Ang pagpapasiya ng mga tagapagpahiwatig na ito, depende sa likas na katangian ng mga agglutinates, ay isinasagawa gamit ang hubad na mata laban sa isang madilim na background, sa isang agglutinoscope o sa ibabaw ng malukong ibabaw ng salamin ng mikroskopyo. Ang accounting ay nagsisimula sa mga kontrol: ang control C ay dapat na transparent, Ag ay dapat na pantay na maulap (pagkatapos ng pag-alog ng tubo). Kung ang mga kontrol ay mabuti, itatag ang presensya at antas ng agglutination sa lahat ng mga test tube, na itinalaga ng mga plus: malaking sediment at kumpletong pag-clear ng likido - 4 na plus; malaking sediment at hindi kumpletong paglilinis ng likido - 3 plus; kapansin-pansing sediment at kapansin-pansing pag-clear ng likido ay 2 plus. Pagkatapos nito, tinutukoy ang titer: ang pinakamataas na pagbabanto na may intensity ng agglutination ng hindi bababa sa 2 plus. Pananaliksik sa pamagat Ang s-ki ay inihambing sa diagnostic titer para sa sakit na ito. Kung susuriin ang titer. Ang s-ki ay 2 beses na mas mababa kaysa sa diagnostic na halaga, ang reaksyon ay tinasa bilang nagdududa; kung pantay ang titer diagnostic - paano mahinang positibo; kung ito ay 2-4 beses na mas mataas, ito ay itinuturing na positibo kung ito ay 8 o higit pang mga beses na mas mataas, ito ay itinuturing na positibo. Kapag ang Ab ay laganap sa malulusog na tao, ang pagtaas ng Ab titer ay ginagamit upang masuri ang RA. Upang matukoy ang uri ng Ar sa serial RA, ang bilang ng mga hilera ay dapat tumugma sa bilang na kinuha para sa pagkakakilanlan mga pagsusuri sa diagnostic. Mula sa pangunahing dilution ng diagnostic test, isang serye ng sunud-sunod na dalawang-tiklop na dilution ay inihanda sa parehong paraan tulad ng sa RA upang matukoy ang Ab titer. Ang mga kadahilanan ng pagbabanto ay nakasalalay sa titer ng agglutinating test Sa eksperimento, kinakailangan na magkaroon ng dilution na katumbas ng titer ng pagsubok, pati na rin ang 2, 4, 6, 8 beses na mas mababa kaysa dito titer ng diagnostic test ay 1 3200, pagkatapos ay dapat mong gamitin ang mga dilution 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 Ang parehong dami ng nasubok na Ag ay idinagdag sa mga dilution ng pagsubok, bilang isang resulta, ang pagbabanto ng ang pagsubok ay tumaas ng 2 beses na kontrol at Ag ay idinagdag sa eksperimento Kung sa eksperimento ay ilang s-k ang kasangkot, kung gayon ang bawat isa sa kanila ay nangangailangan ng sarili nitong kontrol Sa pagtatapos ng reaksyon, ang stand ay inalog nang malakas at inilagay sa isang termostat sa 37 ° C. Ang mga resulta ay isinasaalang-alang tulad ng inilarawan sa itaas Ang pagsusuri ng reaksyon ay may mga tampok. Ag kinuha sa eksperimento, ang titer ng reaksyon ay dapat na tumutugma sa hindi bababa sa kalahati ng titer ng karaniwang diagnostic na pagsusulit ay itinuturing na isang reaksyon ng grupo Tumulo ang md Ang staging ng RA ay naiiba sa volumetric dahil ang s-ku ay natunaw sa dami ng 1 ml, ang Ag ay ginagamit sa mas mataas na konsentrasyon (10 bilyon/ml) at ito ay idinagdag ng 1 - 2 bumaba sa isang test tube Ang pagbabanto ng gamot pagkatapos ng pagdaragdag ng Ag ay itinuturing na hindi nagbabago Kung hindi man, ang paraan ng pagbabalangkas, pagtatala at pagsusuri ay katulad ng volumetric na paraan
(Pinagmulan: Dictionary of Microbiology Terms)
Reaksyon ng aglutinasyon.
Ang reaksyon ng agglutination ay ang gluing at precipitation ng microbial o iba pang mga cell (erythrocytes) sa ilalim ng impluwensya ng mga antibodies sa pagkakaroon ng isang electrolyte. Ang nakikitang epekto ng reaksyon (agglutination phenomenon) ay ang pagbuo ng isang precipitate na tinatawag na agglutinate.
Ang reaksyong ito ay ginagamit para sa serodiagnosis At seroidentification. Ginagamit ang RA para sa serodiagnosis (pagtuklas ng mga antibodies sa serum ng dugo ng mga pasyente) typhoid fever at paratyphoid(Reaksyon ni Vidal), brucellosis(Reaksyon ni Wright), tularemia at leptospirosis. Ginagamit ang RA para sa seroidentification (pagtukoy sa uri ng pathogen na nakahiwalay sa isang pasyente) kung kailan mga impeksyon sa bituka, whooping cough, kolera at iba pa.
Mga bahagimga reaksyon:
1. A ntigen (agglutinogen) – ang mga ito ay buo (hindi nawasak) microbial o iba pang mga cell ( corpuscular, hindi matutunaw na antigen). Mga aglutinogen- ito ay isang suspensyon buhay o pinatay microbial cells o anumang iba pang mga cell. Ang mga antigen ay maaaring hindi kilala o kilala. Ang hindi kilalang agglutinogen ay isang microbial culture na nakahiwalay sa katawan ng pasyente na kailangang matukoy. Kilalang antigen - diagnosticum- diagnostic na gamot - pagsususpinde sa mga patay mikrobyo kilalang species sa solusyon ng asin. Itong suspension maulap (malabo), dahil Ang mga microbial cell ay hindi natutunaw, ngunit nananatiling buo. Ang isang kilalang agglutinogen ay gagamitin upang makita ang hindi kilalang mga antibodies sa serum ng dugo ng mga pasyente.
2. Antibody (aglutinin)- matatagpuan sa serum ng dugo. Ang mga antibodies ay maaari ding hindi kilala o kilala. Ang mga hindi kilalang antibodies na matutukoy ay nasa serum ng dugo maysakit na tao. Ang mga kilalang antibodies ay matatagpuan sa immune diagnostic sera na tinatawag na agglutinating sera. Ginagamit ang mga ito para sa sero-identification, i.e. upang matukoy ang hindi kilalang antigen - isang uri ng microbial culture.
3. Electrolyte– 0.9% solusyon ng sodium chloride.
Mga pamamaraan para sa pagtatanghal ng RA.
1. Tinatayang (lamellar) RA– isinasagawa sa salamin. Maglagay ng 2 patak ng serum at 1 patak ng isotonic solution sa isang glass slide. Ang isang microbial culture ay idinagdag sa isang loop sa isa sa mga patak ng serum at sa isang patak ng isotonic solution at halo-halong. Isang patak ng isotonic solution may mikrobyo – kontrol ng antigen, isang patak mga serum na walang mikrobyo – kontrol ng antibody, isang patak mga serum na may mikrobyo – karanasan. Kung ang serum ay naglalaman ng mga antibodies na tumutugma sa microbial antigens na humahalo dito, ang mga antibodies at antigens ay partikular na magbubuklod sa isa't isa at pagkatapos ng 1-3 minuto ay lilitaw ang mga agglutinate flakes sa test drop. Ang antigen control ay dapat na maulap at ang antibody control ay dapat na malinaw. Ang mga resulta ng reaksyon ay naitala batay sa hitsura ng agglutinate flakes . Kung ang mga natuklap ay nahuhulog, ang reaksyon ay positibo, i.e. Ang isang antigen ay tumutugma sa isang antibody at ang antigen ay maaaring gamitin upang matukoy ang antibody o vice versa. Kung mananatili ang ulap, negatibo ang reaksyon.
2. Detalyadong reaksyon ng agglutination - isinasagawa sa mga test tube. Una, maghanda ng 2-tiklop na pagbabanto ng serum ng dugo ng isang taong may sakit mula 1:50 hanggang 1:1600. Ang 1 ml ng isotonic sodium chloride solution ay ibinuhos sa 6 na tubo. 1 ml ng serum ng dugo ng pasyente sa isang pagbabanto ng 1:50 ay idinagdag sa unang test tube, halo-halong at isang pagbabanto ng 1:100 ay nakuha, pagkatapos ay 1 ml ng isang pagbabanto ng 1:100 ay inilipat sa pangalawang test tube at ang pagbabanto ng 1:200 ay nakuha, atbp. Dalawang tubo ang itinatago para sa antigen at serum control. Sa serum control idagdag lamang ang serum sa isang dilution na 1:50, sa antigen control - ang antigen lamang. Magdagdag ng 0.1 ml ng antigen - diagnosticum (O- o H-) sa lahat ng iba pang test tube at ilagay ang lahat ng test tube sa thermostat sa 37°C sa loob ng 18-20 oras. Ang mga resulta ng reaksyon ay naitala batay sa likas na katangian, dami ng namuo (agglutinate) na nabuo at ang antas ng labo. Ang accounting ay isinasagawa lamang sa mga sumusunod na resulta sa mga kontrol: serum control - transparent, antigen control - maulap. Ang mga O-antibodies ay nagbibigay ng pinong butil na precipitate. H-antibodies - magaspang na butil. Batay sa huling test tube kung saan nakikita pa rin ang agglutination reaction, ito ay itinatag diagnostic titer.
Kapag serodiagnosis ng mga sakit, mahalaga hindi lamang upang makita ang mga tiyak na antibodies sa isang partikular na pathogen, kundi pati na rin upang makilala ang kanilang dami, i.e. magtatag ng naturang antibody titer kapag maaari nating pag-usapan ang pagkakaroon ng isang sakit na dulot ng pathogen na ito. Ang titer na ito ay tinatawag na diagnostic titer. Halimbawa, upang masuri ang typhoid fever, kailangan mong tukuyin ang titer ng antibody na 1:400, ngunit hindi bababa. Ang mas tumpak na mga resulta ay nakuha sa pamamagitan ng pag-detect ng pagtaas ng mga antibodies sa ipinares na sera Ang serum ng pasyente ay kinokolekta sa simula ng sakit at pagkatapos ng 3-5 o higit pang mga araw. Kung ang titer ng antibody ay tumaas ng hindi bababa sa 4 na beses, samakatuwid, maaari nating pag-usapan ang kasalukuyang sakit.
