Buluş aşağıdakilerle ilgilidir: genetik mühendisliği, biyoteknoloji, tıp, farmakoloji. Ekspresyonu laktoz ve triptofan promotörlerinin ve bir transkripsiyon sonlandırıcının kontrolü altında olan insan lökosit alfa-2b interferonunun sentezini kodlayan yeni bir rekombinant çok kopyalı plazmit DNA pSX50. Alıcı suş E. coli BL21'in rekombinant plazmid DNA pSX50 ile dönüştürülmesinin bir sonucu olarak, 0.9-1.0 g'a kadar üretkenliğe sahip bir rekombinant lökosit insan alfa-2b interferon üreticisi olan E. coli SX50 suşu elde edildi. 1 litre kültür ortamından alfa-2b interferon. Rekombinant alfa-2b interferon üretme yöntemi, E. coli SX50'nin oluşturulmuş bir rekombinant suşunun kullanımına dayanmaktadır ve bunun, bir besin ortamı üzerinde derin ekimini içerir. azaltılmış içerik biyosentez sürecinde besin substratlarının sürekli eklenmesiyle triptofan, mikroorganizma hücrelerinin mekanik olarak yok edilmesi yüksek tansiyon, toplanmış proteinin konsantre bir guanidin hidroklorür çözeltisi içinde çözülmesi, ardından interferonun kaotropik ajanların varlığında fizyolojik tampon çözeltileri içinde yeniden doğallaştırılması ve Cu + ile hareketsizleştirilmiş Şelatlayıcı Sefaroz Hızlı Akış reçineleri üzerinde interferonun üç aşamalı kromatografik saflaştırması kullanılarak saflaştırılması. 2 iyon, SM tipi iyon değişim reçineleri üzerinde iyon değişim kromatografisi Sephsrose Fast Flow ve Superdex 75 tipi reçineler üzerinde jel filtrasyon kromatografisi. Yöntem, indirgeyici ve indirgeyici olmayan elektroforeze göre %99'un üzerinde saflığa sahip bir interferon maddesinin elde edilmesini mümkün kılar. Jellerin RF HPLC'ye göre %98'den fazla gümüşle boyandığı ve 1 litre kültür ortamı başına en az 400-800 mg miktarlarda pirojen (LAL testi) içermediği durumlar. 3 N. ve 3 maaş pozisyonu, 6 hasta.
RF patenti 2242516 için çizimler
Buluş, biyoteknolojik olarak elde edilen genetiği değiştirilmiş ilaçlarla, yani yöntemlerle ilgilidir. endüstriyel üretim rekombinant insan lökosit interferon alfa-2b tıbbi amaçlar(bundan sonra interferon olarak anılacaktır) ve aynı zamanda rekombinant üreten Escherichia coli (E.coli) suşları ve interferon sentezini kodlayan plazmid DNA ile ilgilidir.
İnterferonlar, viral enfeksiyona veya diğer patojenlere yanıt olarak hücreler tarafından üretilen ve salgılanan, moleküler ağırlığı 15.000 ila 21.000 dalton olan protein molekülleridir. Üç ana interferon grubu vardır: alfa, beta ve gama. Bu grupların kendisi homojen değildir ve interferonun birkaç farklı moleküler türünü içerebilir. Böylece interferon alfanın 14'ten fazla genetik çeşidi tanımlanmış olup bunlar ilgi çekicidir ve bulunur. geniş uygulama Tıpta antiviral, antiproliferatif ve immünomodülatör ajanlar olarak kullanılır.
Virüsler ve diğer indükleyiciler tarafından indüklenen insan donör kanındaki lökositlerden insan lökosit interferonunun elde edilmesine yönelik bilinen yöntemler vardır (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873).
İnterferon üretimine yönelik bu yöntemlerin ana dezavantajı, nihai ürünün hepatit B ve C virüsü, immün yetmezlik virüsü vb. gibi insan virüsleriyle kontaminasyon olasılığıdır.
Şu anda, mikrobiyolojik sentez yoluyla interferon üretme yöntemi daha umut verici olarak kabul edilmektedir; bu, hedef ürünün nispeten ucuz başlangıç malzemelerinden önemli ölçüde daha yüksek bir verimle elde edilmesini mümkün kılmaktadır. Burada kullanılan yaklaşımlar, bakteriyel ekspresyon için optimal olan yapısal bir genin varyantlarının yanı sıra ekspresyonunu kontrol eden düzenleyici unsurların oluşturulmasını mümkün kılar.
Kullanılan başlangıç mikroorganizmaları: çeşitli tasarımlar Pichia pastoris, Pseudomonas putida ve Escherichia coli suşları.
P. pastoris'i bir interferon üreticisi olarak kullanmanın dezavantajı (J.N. Garcia, J.A. Aguiar ve diğerleri //Pichia pastoris'te insan IFN-2b'nin yüksek düzeyde ifadesi.//Biotecnologia Aplicada, 12(3),152-155, 1995) ), Bu tür mayanın fermantasyon koşulları son derece zordur, biyosentez işlemi sırasında indükleyicinin, özellikle de metanolün konsantrasyonunun sıkı bir şekilde muhafaza edilmesi gerekir. Ps kullanmanın dezavantajı. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508), düşük ekspresyon seviyesinde (1 litre kültür ortamı başına 10 mg interferon) fermantasyon işleminin karmaşıklığıdır. Escherichia coli suşlarının kullanılması daha verimlidir (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3 Ek 9): S9-41-S9-51).
İnterferonu eksprese eden çok sayıda plazmit ve bunlara dayalı olarak oluşturulan E. coli suşu bilinmektedir: Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 veya Z-pBR 322(Pstl)/ plazmitlerine sahip E. coli suşları ATCC 31633 ve 31644 HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli suşu pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli suşu pINF-F-Pa (AU 1312962), plazmid p280/21FN ile E. Coli suşu SG 20050 (Kravchenko V.V. ve diğerleri, Bioorganik kimya, 1987, v. 13, no. 9, s. 1186-1193), pINF14 plazmitli E. Coli SG 20050 suşu (SU 1703691), pINF16 plazmitli E. coli SG 20050 suşu (RU 2054041) vb. Bu suşların kullanımına dayalı teknolojilerin dezavantajı, bunların istikrarsızlığının yanı sıra yetersiz düzeyde interferon ekspresyonudur.
Kullanılan suşların özelliklerinin yanı sıra, prosesin verimliliği büyük ölçüde interferonun izolasyonu ve saflaştırılması için kullanılan teknolojiye bağlıdır.
Ps hücrelerinin kültürlenmesini içeren, interferon üretimine yönelik bilinen bir yöntem vardır. putida, biyokütlenin yok edilmesi, polietilenimin ile muamele, amonyum sülfat ile fraksiyonlama, fenilsilokrom C-80 üzerinde hidrofobik kromatografi, lizatın pH fraksiyonlaması, konsantrasyonu ve diafiltrasyon, selüloz DE-52 üzerinde iyon değiştirme kromatografisi, pH gradyanında elüsyon, iyon elde edilen eluent'in selüloz SM-52 üzerinde değişim kromatografisi, bir filtre kasetinden geçirilerek konsantrasyon ve Sephadex G-100 (SU 1640996) üzerinde jel filtrasyonu. Bu yöntemin dezavantajı, karmaşık çok aşamalı fermantasyonun yanı sıra, nihai ürünün elde edilmesindeki çok aşamalı süreçtir.
Ayrıca interferon üretimine yönelik bilinen bir yöntem de vardır; bu yöntem, E. coli SG 20050/pIF16 türünün termostatlı bir çalkalayıcıdaki şişelerde LB besiyerinde yetiştirilmesini, biyokütlenin santrifüjlenmesini, bir tampon çözeltisiyle yıkanmasını ve hücreleri yok etmek için ultrasonik tedaviyi içerir. Elde edilen lizat santrifüjlenir, tampon içindeki 3M üre çözeltisi ile yıkanır, tampon içindeki guanidin klorür çözeltisi içinde eritilir, ultrasonla işlenir, santrifüjlenir, oksidatif sülfitoliz, 8 M üreye karşı diyaliz, renatürasyon ve CM- üzerinde son iki aşamalı kromatografi yapılır. 52 selüloz ve Sephadex G-50 (RU 2054041). Bu yöntemin dezavantajları, izolasyon ve saflaştırma işleminin ana aşamalarının nispeten düşük verimliliğidir. Bu özellikle ürünün ultrasonik tedavisi, diyaliz ve oksidatif sülfitoliz için geçerlidir; bu, interferon salınımında dengesizliğe yol açar ve bu yöntemin aşağıdaki amaçlar için kullanılmasının imkansızlığına yol açar: endüstriyel üretim interferon.
En yakın analog (prototip) olarak, insan lökosit interferonunu üretmeye yönelik bir yöntem gösterilebilir; bu yöntem, rekombinant bir E. coli suşunun yetiştirilmesini, elde edilen biyokütlenin -70°C'yi aşmayan bir sıcaklıkta dondurulmasını, çözülmesini ve mikroorganizma hücrelerinin yok edilmesini içerir. Lizozim ile DNA ve RNA'nın DNAz lisatına dahil edilmesi ve izole edilmiş çözünmeyen interferon formunun deterjanlı bir tampon çözelti ile yıkanarak saflaştırılması, interferon çökeltisinin bir guanidin hidroklorür çözeltisi içinde çözülmesi, renatürasyon ve iyonla tek aşamalı saflaştırma değişim kromatografisi. Üretici olarak kullanılan tür, üç promoter içeren pSS5 rekombinant plazmidi kullanılarak elde edilen E. coli SS5'tir: P lac, P t7 ve P trp ve eklenen nükleotid ikameleri ile alfa-interferon geni.
Bu plazmidi içeren E. coli SS5 suşu tarafından interferonun ekspresyonu üç promoter tarafından kontrol edilir: P lac, P t7 ve P trp. İnterferon ekspresyonunun seviyesi, 1 litre hücre süspansiyonu başına yaklaşık 800 mg'dır (RU 2165455).
Bu yöntemin dezavantajı, mikroorganizmanın hücrelerinin, DNA'sının ve RNA'sının enzimatik imhası ve interferonun tek aşamalı kromatografik saflaştırılmasının kullanılmasının düşük teknolojik verimliliğidir. Bu, interferon salınımı sürecinde dengesizliğe neden olur, kalitesinin düşmesine yol açar ve yukarıdaki şemanın endüstriyel interferon üretimi için kullanılma olasılığını sınırlar. Bu plazmidin ve buna dayalı suşun dezavantajları, T7 RNA polimeraz geninin promotörünün altına yerleştirildiği E. coli BL21 (DE3) suşundaki T7 fajının güçlü, düzenlenmemiş bir promotörünün plazmidinde kullanılmasıdır. lac operonu ve her zaman “akan”. Sonuç olarak, hücrede sürekli olarak interferon sentezi meydana gelir, bu da plazmidin ayrışmasına ve suş hücrelerinin canlılığının azalmasına ve bunun sonucunda interferon veriminde bir azalmaya yol açar.
Bu buluşun amacı, yüksek düzeyde interferon biyosentezine sahip yeni bir rekombinant plazmid DNA kullanarak, E. coli'nin rekombinant endüstriyel üretici suşunu oluşturmak ve tıbbi kullanım için bir interferon maddesinin üretilmesine yönelik etkili bir endüstriyel teknoloji geliştirmektir. interferon alfa-2b maddesi için "Avrupa Farmakopesi" kalitesine uygundur.
Bu sorun, Federal Devlet Üniter İşletmesi Devlet Genetik Araştırma Enstitüsü'nün Tüm Rusya Endüstriyel Suşları Koleksiyonunda, VKPM B-8550 numarasıyla saklanan rekombinant plazmid DNA pSX50 ve Escherichia coli suşu SX50'nin oluşturulmasıyla çözüldü.
rekombinant alfa-2b interferon üretmeye yönelik bir yöntemin yanı sıra, rekombinant bir E. coli SX50 suşunun kullanımına dayanan ve bunun, besin substratlarının sürekli eklenmesiyle azaltılmış triptofan içeriğine sahip bir besin ortamında derin ekimini içeren bir yöntem. Biyosentez, mikroorganizma hücrelerinin yüksek basınçta mekanik olarak yok edilmesi, toplanmış proteinin konsantre bir guanidin hidroklorür çözeltisi içinde çözülmesi, ardından interferonun kaotropik ajanların varlığında fizyolojik tampon çözeltileri içinde yeniden doğallaştırılması ve interferonun reçineler üzerinde üç aşamalı kromatografik saflaştırılması. Cu +2 iyonları ile immobilize edilmiş Şelatlayıcı Sefaroz Hızlı Akış olarak, CM Sefaroz Hızlı Akış gibi iyon değiştirme reçineleri üzerinde iyon değiştirme kromatografisi ve Superdex 75 gibi reçineler üzerinde jel filtrasyon kromatografisi.
Buluşa göre, ekspresyonu laktoz ve triptofan promotörlerinin ve bir transkripsiyon sonlandırıcının kontrolü altında olan insan lökosit alfa-2b interferonunun sentezini kodlayan yeni bir rekombinant çok kopyalı plazmid DNA pSX50 önerilmektedir. Plazmid pSX50, 3218 baz çiftine (bp) sahiptir ve aşağıdaki parçaların varlığıyla karakterize edilir:
Nükleotid 1'den nükleotid (nt) 176'ya kadar olan dizi, triptofan promoterini (P trp) içeren 176 bp'lik bir DNA fragmanı içerir;
177 nt'den dizi. 194'e kadar çevirinin başlatılmasından sorumlu olan Shine Delgarno dizisini içeren 18 bp boyutunda sentetik bir DNA fragmanı içerir;
195 nt'den itibaren sekans. 695 n'ye kadar. aşağıdaki nükleotid ikamelerine sahip interferon geninin dizisini içeren 501 bp boyutunda bir DNA fragmanını içerir: 37. pozisyonda, A'dan C'ye ikame, 39. pozisyonda, G'den T'ye ikame, 40. pozisyonda, A'dan C'ye ikame C, 42. pozisyonda, G'nin T ile değiştirilmesi, 67. pozisyonda, A'nın C ile değiştirilmesi, 69. pozisyonda, G'nin T ile değiştirilmesi, 70. pozisyonda, A'nın C ile değiştirilmesi, 72. pozisyonda, A'nın yerine C konulması T, 96. pozisyonda, G'nin A ile değiştirilmesi, 100. pozisyonda, A'nın C ile değiştirilmesi, 102. pozisyonda, A'nın T ile değiştirilmesi, 114. pozisyonda, A'nın C ile değiştirilmesi, 120. pozisyonda, C'nin değiştirilmesi 126. pozisyonda G ile, 129. pozisyonda G'nin A ile değiştirilmesi, 330. pozisyonda G'nin A ile değiştirilmesi, 339. pozisyonda C'nin G ile değiştirilmesi, 339. pozisyonda G'nin A ile değiştirilmesi, 342. pozisyonda G'nin A ile değiştirilmesi, içinde konum 487, A'nın C ile değiştirilmesi, konum 489'da A'nın T ile değiştirilmesi, konum 495'te G'nin A ile değiştirilmesi;
696 nt'den dizi. 713 no.'ya göre. sentetik bir polilinker içeren 18 bp'lik sentetik bir DNA fragmanı içerir;
714 nt'den dizi. 1138'e kadar 4129 nt'li pKK223-3 plazmitinin bir DNA fragmanını içerir. 4553'e kadar 425 bp boyutunda, katı transkripsiyon sonlandırıcı rrnBT 1 T 2'nin dizisini içerir;
1139'dan itibaren sekans b. 1229'a kadar 2487 nt'li pUC19 plazmitinin bir DNA fragmanını içerir. 2577'ye kadar 91 bp boyutunda, β-laktomaz geninin promoterini (ampisilin direnç geni - Amp R) içerir;
1230 b'den itibaren sekans. 2045'e kadar. 720 nt'lik pUC4K plazmidinin bir DNA fragmanını içerir. MS 1535'e kadar kan geninin yapısal bölgesini içeren 816 bp boyutunda;
2046'dan itibaren sekans b. 3218'e kadar 1625'ten 453 nt'ye kadar pUC19 plazmidinin bir DNA fragmanını içerir. Boyutu 1173 bp olup, plazmid replikasyonundan (ori) ve lac promoterinden (P lac) sorumlu diziyi içerir.
Şekil 1-5'te tasarım şemaları ve fiziki harita pSH50 plazmitleri.
Şekil 6, pSX50 plazmidi için belirlenen tam nükleotid dizisini gösterir.
Escherichia coli suşu SX50, Escherichia coli BL21 hücrelerinin geleneksel yöntemler kullanılarak pSX50 plazmidi ile dönüştürülmesiyle elde edildi. genetik mühendisliği teknolojisi. E.Coli SX50 suşu aşağıdaki özelliklerle karakterize edilir.
Kültürel ve morfolojik özellikler
Hücreler küçük, düz, kalınlaşmış çubuk şeklinde, gram negatif, spor taşımayan hücrelerdir. Hücreler basit besin ortamlarında iyi büyür. Difco agarda yetiştirildiğinde yuvarlak, pürüzsüz, dışbükey, bulutlu, parlak, gri, düzgün kenarlı koloniler oluşur. Sıvı ortamda büyütüldüğünde (glikozlu minimal ortamda veya LB sıvı besiyerinde) yoğun, eşit bir bulanıklık oluşur.
Fiziksel ve biyolojik özellikler
Aerobe. Büyüme için sıcaklık aralığı 4-42°C olup optimum pH 6,5-7,5'tir.
Azot kaynağı olarak hem amonyum hem de nitrat formundaki mineral tuzları kullanılır. organik bileşikler amino asitler, pepton, tripton, maya ekstraktı vb. şeklinde.
Amino asitler, gliserol ve karbonhidratlar karbon kaynağı olarak kullanılır. Antibiyotik direnci. Hücreler kanamisine (100 μg/ml'ye kadar) direnç gösterir.
Escherichia coli suşu 8X50 bir interferon üreticisidir.
Gerinim depolama ortamının yöntemi, koşulları ve bileşimi
Yağ altında 20 mcg/ml konsantrasyonda kanamisin ilaveli L-arape'de, eksi 70°C sıcaklıkta ampullerde %15 gliserol ve uygun antibiyotik içeren L-et suyu içinde, ampullerde liyofilize halde sıcaklık artı 4°C.
Escherichia coli suşu SX50, Bergey Kılavuzuna (1974) göre Escherichia coli türünün bir suşu olarak tanımlandı.
Alfa-2b interferonun endüstriyel üretimi için yöntem
Önerilen yöntemin bir özelliği, interferonun fermantasyon sırasında biriken çözünmeyen bir formdan izole edilmesini mümkün kılan ve önemli ölçüde basitleştirmeyi mümkün kılan teknolojinin geliştirilmesidir. teknolojik şemaİzolasyon işlemini gerçekleştirin ve hedef ürünün verimini artırın.
Yöntem, Escherichia coli SH50 soyunun bir besin ortamında yetiştirilmesini, besin substratlarının, tercihen glikoz ve maya ekstraktının sürekli eklenmesiyle, biyosentez sürecinde, tercihen azaltılmış bir triptofan içeriğiyle, mikroorganizma hücrelerinin yüksek basınçta mekanik olarak yok edilmesini içerir. 700-900 bar, interferonun bir guanidin hidroklorür tampon çözeltisi içinde çözülmesi, interferonun kaotropik ajanların varlığında fizyolojik tampon çözeltileri içinde yeniden doğallaştırılması, ardından Cu + ile hareketsizleştirilmiş Şelatlayıcı Sefaroz Hızlı Akış tipi reçineler üzerinde interferonun üç aşamalı kromatografik saflaştırılması 2 iyon, CM Sepharose Fast Flow tipi iyon değişim reçineleri üzerinde iyon değişim kromatografisi ve Superdex 75 gibi reçineler üzerinde jel filtrasyon kromatografisi.
İnterferon üretiminin bireysel aşamalarını gerçekleştirmek için en uygun koşullar şunlardır:
Fermantasyon, tüm süreç boyunca substratların sürekli eklenmesiyle gerçekleştirilir; bu, yüksek seviye interferon ifadesi;
Hücre imhası, Gaulin tipi bir parçalayıcıda 900 bar basınçta gerçekleştirilir;
Çözünür hücresel bileşenlerin (DNA, RNA, proteinler, lipopolisakkaritler, vb.) çıkarılması, interferonun çözünmeyen formunun deterjanlar (Triton XI00, üre vb.) içeren tampon çözeltilerle yıkanmasıyla gerçekleştirilir;
Ortaya çıkan interferon içeren çökelti, 6 M guanidin hidroklorürün tampon çözeltisi içinde eritilir;
İnterferonun renatürasyonu, kaotropik maddeler içeren fizyolojik bir tampon çözeltisi içerisinde gerçekleştirilir;
İnterferonun üç aşamalı kromatografik saflaştırması, Cu+2 iyonları ile immobilize edilmiş Şelatlayıcı Sefaroz Hızlı Akış üzerinde, katyon değiştirme reçinesi SM Sefaroz Hızlı Akış üzerinde ve bir Superdex 75 tipi reçine üzerinde jel filtrasyon kromatografisi üzerinde gerçekleştirilir;
Her kromatografik saflaştırmadan sonra gözenek büyüklüğü 0,22 mikron olan pirojen içermeyen filtrelerden sterilizasyon filtrasyonu gerçekleştirilir.
Tarif edilen yöntemin kullanılması sonucunda interferon verimi, 1 litre kültür ortamı başına yaklaşık 400-800 mg interferondur. Ortaya çıkan ürünün kalitesi, alfa-2b interferon maddesine ilişkin "Avrupa Farmakopesi" standartlarına ve gerekliliklerine uygundur.
Önerilen yöntem ile prototip arasındaki önemli farklar şunlardır:
Biyosentez sırasında 1 litre kültür ortamından daha fazla miktarda interferon elde edilmesini mümkün kılan daha yüksek verimliliğe sahip bir suş tasarımının kullanılması;
Hücresel biyokütlenin etkili mekanik imhasının kullanılması, bu da daha fazla çözünmeyen interferon formunun daha saf bir ekstraktının elde edilmesini mümkün kılar. Kısa bir zaman daha az kayıpla;
Kaotropik ajanların varlığında renatürasyon sırasında fizyolojik tampon çözeltilerinin kullanılması, interferonun doğru şekilde renatüre edilmiş formunun veriminin arttırılmasını mümkün kılar;
İnterferonun üç aşamalı kromatografik saflaştırılması, jelleri gümüşle boyarken indirgeyici ve indirgeyici olmayan koşullarda elektroforeze göre% 99'dan fazla saflığa sahip ve RF HPLC'ye göre% 98'den fazla ve pratik olarak pirojen içermeyen bir interferon maddesi elde etmeyi mümkün kılar. (LAL testi).
Talep edilen buluş grubunun özü ve avantajları aşağıdaki örneklerle açıklanmaktadır.
Örnek 1. Rekombinant plazmit pSH50'nin yapımı
PSX50 plazmidini oluşturma yöntemi aşağıdaki adımları içerir:
Vektör plazmid pSX10'un yapımı;
1. pSX3 plazmidinin yapımı (2641 bp)
2. pSX10 vektör plazmidinin yapımı (2553 bp)
Rekombinant plazmit pSX41'in (3218 bp) yapımı;
Rekombinant plazmit pSX43'ün (3218 bp) yapımı;
Rekombinant plazmit pSX45'in (3218 bp) yapımı;
Rekombinant plazmit pSX50'nin (3218 bp) yapımı.
Vektör plazmid pSX10'un yapımı
Vektör plazmidi pSX10, ampisiline direnç sağlayan beta laktomaz geninin kodlama dizisinin, kan geninin kodlama dizisi ile değiştirildiği ve pKK223-3 plazmitinden transkripsiyon sonlandırıcıyı içeren bir pUC19 vektörüdür.
Vektör plazmid pSS10'un yapımı iki aşamada gerçekleştirilir:
Amp geninin kodlama bölgesinin kan geninin kodlama bölgesi ile değiştirildiği pUC19 plazmidi olan pSX3 plazmidinin (2641 bp) hazırlanması;
Transkripsiyon sonlandırıcı rBT1 T2'yi kodlayan bir DNA fragmanının BamHI bölgesinin arkasına yerleştirildiği bir pSX3 plazmidi olan pSX10 vektör plazmidinin (2553 bp) hazırlanması.
Plazmid pSX3'ü elde etmek için beş tur DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir. PCR yöntemi(polimeraz zincirleme reaksiyonu). İlk turda, pUC19 plazmid DNA'yı şablon olarak kullanarak, 1828 bp boyutunda bir DNA fragmanı amplifiye edilir. (PU1-PU2 parçası) primerleri kullanarak:
Bu ve sonraki PCR reaksiyonları aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirilir: 20 mM Tis-HCl, pH 8,8, 10 mM (NH4)2S04, 10 mM KCl, 2 tM MgCl2, %0,1 Triton X100, 0,1 mg/ml BSA, her dNTP'den 0,2 mM, 1,25 birim. Pfu DNA polimeraz, 100 ng DNA. Amplifikasyon prosesi aşağıdaki aşamalardan oluşur: 95°C'de 5 dakika süreyle ısıtma, 35 PCR döngüsü (30 saniye 95°C, 30 saniye 56°C, 2 dakika 72°C) ve 10 dakika süreyle 72°C'de inkübasyon. Amplifikasyondan sonra (ve sonraki amplifikasyonlardan sonra), DNA fragmanı %1 agaroz jelinde elektroforez yoluyla saflaştırılır. İkinci ve üçüncü turlar sırasında, pUC4K plazmid DNA'yı şablon olarak kullanarak 555 bp'lik bir DNA fragmanı amplifiye edilir. (KM1-KM2 parçası) primerleri kullanarak:
ve 258 bp'lik bir DNA fragmanının amplifikasyonu. (KMZ-KM4) primerlerden
PCR'nin beşinci turunda, (PU1-PU2) ve (KM1-KM4) fragmanları aşağıdaki koşullar altında birleştirilir: 95°C'de 5 dakika süreyle ısıtma, 5 PCR döngüsü (30 saniye 95°C, 30 saniye 56°C) , 10 dakika 72°C) ve 10 dakika boyunca 72°C'de inkübasyon. Son PCR'den sonra elde edilen DNA, doğrudan E. coli DH5 suşu hücrelerine dönüştürülür ve 20 μg/ml kanamisin içeren LA ortamına kaplanır. 37°C'de 12 saat inkübasyonun ardından klonlar elimine edilir, plazmid DNA izole edilir ve restriksiyon analizi yapılır. Sonuç olarak 2641 bp boyutunda pSX3 plazmidi elde edilir.
PSX10 vektör plazmidini elde etmek için PCR kullanılarak üç tur DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir. İlk turda, şablon olarak pSX3 plazmid DNA'sı kullanılarak 2025 bp'lik bir DNA fragmanı amplifiye edilir. (parça 10.1-10.2) primerleri kullanarak:
İkinci tur sırasında, pKK223-3 plazmitinin DNA'sı şablon olarak kullanılarak, 528 bp boyutunda bir DNA fragmanı amplifiye edilir. (KK1-KK2 parçası) primerleri kullanarak:
PCR'nin üçüncü turunda, fragmanlar (10.1-10.2) ve (KK1-KK2) aşağıdaki koşullar altında birleştirilir: 95°C'de 5 dakika ısıtma, 5 PCR döngüsü (30 saniye 95°C, 30 saniye 56°C) , 10 dakika 72°C) ve 10 dakika boyunca 72°C'de inkübasyon. Son PCR'den sonra elde edilen DNA, doğrudan E. coli DH5 suşu hücrelerine dönüştürülür ve 20 μg/ml kanamisin içeren LA ortamına kaplanır. 37°C'de 12 saat inkübasyonun ardından klonlar elimine edilir, plazmid DNA izole edilir ve restriksiyon analizi yapılır. Sonuç olarak 2553 bp boyutunda pSX10 plazmidi elde edilir.
Rekombinant plazmit pSX41'in yapımı
Rekombinant plazmid pSX41, pSX3 vektör plazmidinin (2529 bp) bir Hind III - BamHI DNA fragmanıdır, 168 bp'lik Hind III - EcoRI DNA fragmanıdır, E. coli triptofan operonunun (P trp) promotörünü kodlar, EcoRI-XbaI sentetik bir SD dizisini (Shine-Delgarno) kodlayan 20 bp boyutunda DNA fragmanı ve insan interferon alfa 2b genini kodlayan 501 bp boyutunda bir XbaI-BamHI DNA fragmanı.
Vektör plazmit pSX3'ün (2529 bp) Hind III - BamHI DNA fragmanını elde etmek için, pSX3 plazmitinin DNA'sı, HindIII ve BamHI kısıtlama enzimleri ile işleme tabi tutulur, ardından %1 agaroz jel içinde elektroforetik saflaştırma yapılır. Triptofan operonunun promotörünü (P trp) kodlayan 168 bp'lik Hind III EcoRI DNA fragmanı, şablon olarak toplam E. coli DNA'sı ve TRP1 ve PRP2 primerleri kullanılarak PCR ile elde edilir, ardından amplifiye fragmanın Hindll ve EcoRI kısıtlaması ile işlenmesi takip edilir enzimler:
EcoRI-Xbal'in SD dizisini (Shine-Delgarno) kodlayan 20 bp'lik sentetik bir DNA fragmanı elde etmek için aşağıdaki tamamlayıcı oligonükleotidler sentezlenir:
İnsan alfa 2b interferon genini kodlayan, boyutu 501 bp olan XbaI-BamIII DNA fragmanı, şablon olarak toplam insan DNA'sı ve IFN1 ve IFN2 primerleri kullanılarak PCR ile elde edilir, ardından amplifiye fragmanın Xbal ve BamIII kısıtlama enzimleri ile işlenmesi takip eder:
Daha sonra, elektroforetik olarak saflaştırılmış parçalar birleştirilir, T4 faj ligaz enzimi ile bağlanır, DNA, E. coli DH5 soyunun hücrelerine dönüştürülür ve 20 ug/ml kanamisin içeren LA ortamına kaplanır. 37°C'de 12 saat inkübasyonun ardından klonlar elimine edilir, plazmid DNA izole edilir, restriksiyon analizi yapılır ve primer DNA yapısı belirlenir. Sonuç olarak 3218 bp boyutunda pSX41 plazmidi elde edilir. Daha sonra, hedef ürünün ekspresyon seviyesini arttırmak için interferon geninin adım adım mutajenezi gerçekleştirilir. İnterferon geninin mutajenezi, karşılık gelen amino asitleri kodlayan E. coli'de nadiren bulunan üçlülerin, aynı amino asitleri kodlayan E. coli'de sıklıkla bulunan üçlülerle değiştirilmesinden oluşur. İnterferon geninin DNA mutajenezi PCR yöntemi kullanılarak gerçekleştirilir.
Rekombinant plazmid pSX43'ün yapımı
Rekombinant pSX43 plazmidini elde etmek için, pSX41 plazmitinin DNA'sını şablon olarak ve IFN3 ve IFN4 primerlerini kullanarak PCR ile bir tur DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir:
PCR aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirilir: 95°C'de 5 dakika süreyle ısıtma, 20 PCR döngüsü (30 saniye 95°C, 30 saniye 56°C, 10 dakika 72°C) ve 20 dakika süreyle 72°C'de inkübasyon. PCR sonrasında elde edilen DNA, doğrudan E. coli DH5 suşu hücrelerine dönüştürülür ve 20 µg/ml kanamisin içeren LA ortamına kaplanır. 37°C'de 12 saat inkübasyonun ardından klonlar elimine edilir, plazmid DNA izole edilir, restriksiyon analizi yapılır ve primer DNA yapısı belirlenir. Sonuç olarak 3218 bp boyutunda pSX43 plazmidi elde edilir.
Rekombinant plazmit pSX45'in yapımı
Rekombinant pSX45 plazmidini elde etmek için, pSX43 plazmitinin DNA'sını şablon olarak ve IFN5 ve IFN6 primerlerini kullanarak PCR ile bir tur DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir:
PCR aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirilir: 95°C'de 5 dakika süreyle ısıtma, 20 PCR döngüsü (30 saniye 95°C, 30 saniye 56°C, 10 dakika 72°C) ve 20 dakika süreyle 72°C'de inkübasyon. PCR sonrasında elde edilen DNA, doğrudan E. coli DH5 suşu hücrelerine dönüştürülür ve 20 µg/ml kanamisin içeren LA ortamına kaplanır. 37°C'de 12 saat inkübasyonun ardından klonlar elimine edilir, plazmid DNA izole edilir, restriksiyon analizi yapılır ve primer DNA yapısı belirlenir. Sonuç olarak 3218 bp boyutunda pSX45 plazmidi elde edilir.
Rekombinant plazmit pSX50'nin yapımı.
Rekombinant pSX50 plazmidini elde etmek için, pSX45 plazmitinin DNA'sını şablon olarak ve IFN7 ve IFN8 primerlerini kullanarak PCR ile bir tur DNA amplifikasyonu gerçekleştirilir:
PCR aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirilir: 95°C'de 5 dakika süreyle ısıtma, 20 PCR döngüsü (30 saniye 95°C, 30 saniye 56°C, 10 dakika 72°C) ve 20 dakika süreyle 72°C'de inkübasyon. PCR sonrasında elde edilen DNA, doğrudan E. coli DH5 suşu hücrelerine dönüştürülür ve 20 µg/ml kanamisin içeren LA ortamına ekilir. 37°C'de 12 saat inkübasyonun ardından klonlar elimine edilir, plazmid DNA izole edilir, restriksiyon analizi yapılır ve primer DNA yapısı belirlenir. Sonuç olarak 3218 bp boyutunda pSX50 plazmidi elde edilir.
Örnek 2. E. coli SX50 suşunun hazırlanması - interferon üreticisi
İnterferon üreten E. coli SX50 suşu, E. coli BL21 suşu hücrelerinin rekombinant plazmid pSX50 ile dönüştürülmesiyle elde edilir. İnterferon üreten suş, 30 litrelik bir fermentörde 25.0-30.0 p.u. optik yoğunluğa kadar büyütülür. %1 kazein asit hidrolizatı (Difco), %1 glikoz, 40 ug/ml kanamisin içeren M9 ortamında, 38-39°C sıcaklıkta. Fermantasyon işlemi sırasında, bir gravimetrik kontrol cihazı kullanılarak sürekli bir besin maddesi substratı ilavesi gerçekleştirilir.
Örnek 3. İnterferonun E. coli SX50 türünden izole edilmesine yönelik yöntem
İnterferon 4 aşamada elde edildi:
1. Aşama. E. coli suşu SX50'nin yetiştirilmesi.
2. aşama. İnterferonun çözünmeyen formunun izolasyonu ve saflaştırılması.
Sahne 3. İnterferonun çözünmesi ve renatürasyonu.
Aşama 4. İnterferonun kromatografik saflaştırılması.
1. Aşama. E. coli suşu SX50'nin yetiştirilmesi
26°C'de 12 saat boyunca 3 litre zengin LB ortamı hacminde yetiştirilen E. coli SX50 aşısı, M9, %1 kazein asit hidrolizatı, %1 glikoz içeren 27 litre steril ortam içeren bir fermentöre aseptik olarak eklenir. 1 mM MgCl2, 0,1 mM CaCl2, 40 mg/ml kanamisin. Bir fermentörde yetiştirme, 38-39°C'lik bir sıcaklıkta, %40'lık bir sodyum hidroksit çözeltisi ile otomatik titrasyon yoluyla 7±0.15'lik bir pH muhafaza edilerek gerçekleştirilir. Doygunluğun %(50±10) aralığındaki çözünmüş oksijen konsantrasyonu, karıştırıcı hızının 100'den 800 rpm'ye ve hava beslemesinin 1'den 15 l/dak'ya değiştirilmesiyle korunur. Substratların konsantrasyonu, özellikle glikoz ve maya ekstraktı, fermantasyon sırasında ölçülür ve konsantrasyonları, bir gravimetrik kontrol cihazı kullanılarak peristaltik pompalar aracılığıyla konsantre çözeltilerin besleme hızı değiştirilerek korunur.
İnterferonun çözünmeyen formda birikmesi, faz kontrast mikroskobu, %15 poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAAG) ve ters fazlı yüksek performanslı kromatografi (RF HPLC) kullanılarak izlenir. Maksimum optik yoğunluğa (~ 25-30 p.u.) ulaşıldığında fermantasyon durdurulur ve interferon sentezi durur. Fermantasyonun sonunda kültürel sıvı, 5000-10000 rpm dönüş hızında bir akış rotorunda santrifüj edilerek ayrılır. Biyokütle paketlenmiştir plastik poşetler ve eksi 70°C'de donduruldu.
2. aşama. İnterferonun çözünmeyen formunun izolasyonu ve saflaştırılması
300-400 g dondurulmuş E. coli suşu SX50 biyokütlesi, 3000 ml tampon 1 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, %0.1 Triton X100) içerisinde süspanse edilir. Süspansiyon, Gaulin tipi bir akış homojenizatöründen geçirilir, 900 bar basınçta tutulur ve 15.000 rpm'de bir akış rotorunda santrifüjlenir. Elde edilen çökelti benzer koşullar altında sırasıyla tamponlar 2 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 3 M üre) ve tampon 3 (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) ve son olarak interferon ile yıkanır. çökelti, 200 ml tampon 3 içinde süspanse edilir. Bu durumda, çözünmeyen interferon formunun izolasyonu ve saflaştırılması için süre 5 saatten fazla değildir.
Sahne 3. İnterferonun çözünmesi ve renatürasyonu
Önceki aşamada elde edilen çözünmeyen interferon formunun süspansiyonuna, 6 M'lik bir konsantrasyona kadar kuru guanidin hidroklorür ekleyin, 50 mM'lik bir konsantrasyona kadar ditiyotreitol, 50 mM'lik bir konsantrasyona kadar Tris-HCl pH 8,0, NaCl'yi 50 mM'lik bir konsantrasyona kadar ekleyin. 150 mM konsantrasyonu ve Triton X100'ü %0,1 konsantrasyonuna getirin, oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin, çözünmemiş malzeme, 0,22 mikron gözenek çapına sahip membranlardan sterilize edilerek filtrasyon yoluyla ayrılır.
İnterferonun renatürasyonu, elde edilen çözeltinin tampon 4 (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA) ile 100-200 kez yavaşça seyreltilmesiyle gerçekleştirilir. Bundan sonra renatürasyon karışımı, 4-8°C'lik bir sıcaklıkta 12-15 saat boyunca sürekli karıştırılarak inkübe edilir. Daha sonra 1 mM'lik bir konsantrasyona kadar magnezyum sülfat eklenir ve toplanan malzeme, gözenek çapı 0,22 mikron olan bir membran filtreden sterilize edilerek filtrasyon yoluyla çıkarılır.
Aşama 4. İnterferonun kromatografik saflaştırılması
İnterferonun kromatografik saflaştırılması üç aşamada gerçekleştirilir.
1. Sonuçta elde edilen renatüre interferon ilk olarak Cu+2 iyonları ile hareketsizleştirilmiş bir Şelatlayıcı Sefaroz Hızlı Akış reçinesi (Amersham Biosciences) üzerinde afinite kromatografisi kullanılarak saflaştırılır. Bunu yapmak için interferon çözeltisi Cu +2 Şelatlayıcı Sefaroz Hızlı Akışlı bir kolona uygulanır ve interferon 0,1 M tamponla elüt edilir. sitrik asit PH'ı 2.2.
2. Kromatografik saflaştırmanın ikinci aşamasında, interferon çözeltisi CM Sepharose Hızlı Akış tipi katyon değiştirme reçinesine (Amersham Biosciences) uygulanır ve interferon, 50 mM'lik bir çözelti gradyanı (0,0-0,5 M NaCl) ile elüt edilir. Na(CH3COO) tamponu, pH 5,5.
3. İnterferonun monomerik formunun, interferonun polimerik formlarının kalıntılarından saflaştırılması, interferon saflaştırmasının üçüncü aşamasında Superdex 75 reçinesi (Amersham Biosciences) üzerinde jel filtrasyonu yoluyla gerçekleştirilir. Kromatografi, 0,15 M NaCl içeren, pH 5,0 olan 50 mM Na(CH3COO) tamponunda gerçekleştirilir.
İnterferonun izole edilmesi ve saflaştırılması için açıklanan yöntem, 10 litre kültür ortamından elde edilen biyokütleden 7-10 gün boyunca bir izolasyon döngüsünde 4-8 g yüksek derecede saflaştırılmış interferon elde edilmesini mümkün kılar. Ortaya çıkan interferonun kalitesi, interferon alfa-2b maddesine ilişkin "Avrupa Farmakopesi" gerekliliklerine tamamen uygundur:
İnterferon konsantrasyonu 2x10 8 IU/ml'den az değildir;
İnterferonun spesifik aktivitesi 2,0x108 IU/mg'den az değildir;
İlacın elektroforetik saflığı, jelleri gümüşle boyarken indirgeyici ve indirgeyici olmayan koşullar altında en az %99'dur;
İzole edilmiş interferonun izoelektrik noktası pH 5,8-6,3 civarındadır;
İzole edilmiş interferonun peptit haritası, Avrupa standardı interferon alfa 2b CRS'ye yönelik peptit haritasından temel olarak farklı değildir;
Verilen örneklerden de anlaşılacağı gibi, talep edilen buluş grubu, nispeten basit ve güvenilir bir teknoloji kullanılarak yüksek verimle interferon alfa-2b'nin elde edilmesini mümkün kılar.
İDDİA
1. Rekombinant insan alfa-2b interferonunun sentezini kodlayan rekombinant plazmit DNA pSX50, özelliği, 3218 baz çifti (bp) boyutuna sahip olması ve aşağıdaki fragmanlardan oluşmasıdır: 1 ila 176 nükleotid (bp) dizisi içerir triptofan promotörünü (P trp) içeren 176 bp boyutunda bir DNA fragmanı, 177 ila 194 nt sekans. translasyonun başlatılmasından sorumlu olan Shine Delgarno sekansını içeren, 195 ila 695 nt arası sekansı içeren 18 bp boyutunda sentetik bir DNA fragmanını içerir. 37 (A>C), 39 (G>T), 40 (A>C), 42 (G>T), 67 ( A>) nükleotid ikamelerine sahip interferon alfa-2b genini içeren 501 bp'lik bir DNA fragmanı içerir C), 69 (G>T), 70 (A>C), 72 (A>T), 96 (G>A), 100 (A>C), 102 (A>T), 114 (A >С) ), 120 (C>G), 126 (G>A), 129 (G>A), 330 (C>G), 339 (G>A), 342 (G>A), 487 (A> C) , 489 (A>T), 495 (G>A), 696'dan 713 nt'ye kadar dizi. sentetik bir polilinker içeren 18 bp'lik sentetik bir DNA fragmanı, 714'ten 1138 nt'ye kadar dizi içerir. 4129'dan 4553 nt'ye kadar pKK223-3 plazmitinin bir DNA fragmanını içerir. 425 bp boyutunda, katı transkripsiyon sonlandırıcı rrnBT 1 T 2'nin dizisini içerir, dizi 1139'dan 1229 nt'ye kadardır. 2487'den 2577 nt'ye kadar pUC19 plazmidinin bir DNA fragmanını içerir. Boyutu 91 bp, -laktomaz geninin promotörünü (ampisilin direnç geni -Amp R), 1230'dan 2045 nt'ye kadar diziyi içerir. 720 nt'lik pUC4K plazmidinin bir DNA fragmanını içerir. MS 1535'e kadar 816 bp boyutunda, kan geninin yapısal bölgesini içeren, 2046 bp'lik dizi. 3218'e kadar 1625'ten 453 nt'ye kadar pUC19 plazmidinin bir DNA fragmanını içerir. Boyutu 1173 bp olup, plazmid replikasyonundan (ori) ve lac promoterinden (P lac) sorumlu diziyi içerir.
2. İstem 1'e göre rekombinant plazmid ile dönüştürülmüş Eschcerichia coli SX50 bakteri suşu, rekombinant insan lökosit interferon alfa-2b'nin bir üreticisidir.
3. İnsan interferon alfa-2b'yi elde etmek için, istem 2'ye göre Escherichia coli SX5 suşunun, biyosentez işlemi sırasında besin substratlarının sürekli eklenmesiyle bir besin ortamında yetiştirilmesini, mikroorganizma hücrelerinin 700-100°C'lik bir basınçta mekanik olarak yok edilmesini içeren bir yöntem. 900 bar, interferonun bir guanidin hidroklorür tampon çözeltisi içinde çözülmesi, interferonun kaotropik ajanların varlığında fizyolojik tampon çözeltileri içinde renatürasyonu, Cu +2 iyonları ile immobilize edilmiş Şelatlayıcı Sefaroz Hızlı Akış tipi reçineler üzerinde interferonun üç aşamalı kromatografik saflaştırılması, iyon değişimi CM Sepharose Fast Flow tipi iyon değiştirme reçineleri üzerinde kromatografi ve Superdex 75 tipi reçineler üzerinde jel filtrasyon kromatografisi.
4. İstem 3'e göre yöntem olup, bu yöntemde, yetiştirme, besin substratlarının, tercihen glikoz ve maya ekstraktının sürekli eklenmesiyle, azaltılmış triptofan içeriğine sahip bir besin ortamı üzerinde gerçekleştirilmektedir.
5. İstem 3'e göre yöntem olup, bu yöntemde, interferon çözünmeden önce, DNA, RNA, proteinler, lipopolisakkaritler dahil olmak üzere çözünür hücresel bileşenlerin çıkarılması, Triton XI 00, üre gibi deterjanlar içeren tampon çözeltileri ile yıkanması yoluyla saflaştırılmaktadır.
6. İstem 3'e uygun yöntem olup özelliği, her kromatografik saflaştırmadan sonra, gözenek boyutları 0,22 mikron olan filtreler aracılığıyla sterilizasyon filtrelemesinin gerçekleştirilmesidir.
İle yapılan klinik çalışmalarda geniş aralık endikasyonlara göre ve geniş bir doz aralığıyla (tüylü hücreli lösemi için haftada 6 milyon IU/m2'den; melanom için haftada 100 milyon IU/m2'ye kadar) en sık görülen yan etkiler ateş, yorgunluk, baş ağrısı, miyalji. İlacın kesilmesinden sonra ateş ve yorgunluk 72 saat içinde düzeldi. Ateş, interferon tedavisiyle sıklıkla karşılaşılan grip benzeri sendromun bir semptomu olsa da, diğerlerini dışlamak için değerlendirme yapılmalıdır. Olası nedenler kalıcı ateş.
Aşağıdaki güvenlik profili 4'ten elde edildi: klinik denemeler 1 yıl boyunca monoterapi olarak veya ribavirin ile kombinasyon halinde Intron A alan kronik hepatit C hastalarında. Tüm hastalara haftada 3 kez 3 milyon IU Intron A verildi.
Tablo 2, 1 yıl boyunca Intron A (veya ribavirin ile kombinasyon halinde Intron A) alan daha önce tedavi görmemiş hastalarda %10'a eşit veya daha yüksek bir sıklıkta meydana gelen advers olayları göstermektedir. Genel olarak gözlemlenen olumsuz olaylar hafif veya orta şiddetteydi.
Tablo 2.
| Olumsuz olaylar | İntron A (n=806) | İntron A + ribavirin (n=1010) |
| Yerel reaksiyonlar | ||
| Enflamatuar reaksiyonlar enjeksiyon yerinde | 9–16% | 6–17% |
| Diğer enjeksiyon bölgesi reaksiyonları | 5–8% | 3–36% |
| Genel reaksiyonlar | ||
| Baş ağrısı | 51–64% | 48–64% |
| Tükenmişlik | 42–79% | 43–68% |
| Titreme | 15–39% | 19–41% |
| Ateş | 29–39% | 29–41% |
| Grip benzeri sendrom | 19–37% | 18–29% |
| Asteni | 9–30% | 9–30% |
| Kilo kaybı | 6–11% | 9–19% |
| Gastrointestinal sistemden kaynaklanan reaksiyonlar | ||
| Mide bulantısı | 18–31% | 25–44% |
| Anoreksiya | 14–19% | 19–26% |
| İshal | 12–22% | 13–18% |
| Karın ağrısı | 9–17% | 9–14% |
| Kusmak | 3–10% | 6–10% |
| Kas-iskelet sisteminden gelen reaksiyonlar | ||
| Miyalji | 41–61% | 30–62% |
| Artralji | 25–31% | 21–29% |
| Kemiklerde ve kaslarda ağrı | 15–20% | 11–20% |
| Merkezi sinir sisteminden gelen reaksiyonlar | ||
| Depresyon | 16–36% | 25–34% |
| sinirlilik | 13–27% | 18–34% |
| Uykusuzluk hastalığı | 21–28% | 33–41% |
| Endişe | 8–12% | 8–16% |
| Konsantrasyon yeteneğinde bozulma | 8–14% | 9–21% |
| Duygusal değişkenlik | 8–14% | 5–11% |
| Cilt reaksiyonları | ||
| Alopesi | 22–31% | 26–32% |
| Kaşıntı | 6–9% | 18–37% |
| Kuru cilt | 5–8% | 5–7% |
| Döküntü | 10–21% | 15–24% |
| Dışarıdan gelen tepkiler solunum sistemi | ||
| Farenjit | 3–7% | 7–13% |
| Öksürük | 3–7% | 8–11% |
| Nefes darlığı | 2–9% | 10–22% |
| Diğerleri | ||
| Baş dönmesi | 8–18% | 10–22% |
| Viral enfeksiyon | 0–7% | 3–10% |
olan hastalarda gözlenen advers olaylar viral hepatit C, Intron A'yı diğer endikasyonlar için kullanırken, gelişme sıklığında doza bağlı bir miktar artışla birlikte not edilenlere karşılık gelir.
Intron A'yı diğer endikasyonlar için kullanırken (klinik ve klinik olmayan çalışmalarda) nadiren (|1/10000,< 1/1000) или очень редко (.
Bir bütün olarak vücuttan.Çok nadiren - yüzün şişmesi.
Astenik durumlar (asteni, halsizlik ve yorgunluk), dehidrasyon, çarpıntı, sedef hastalığı, mantar enfeksiyonu ve bakteriyel enfeksiyon(sepsis dahil).
Bağışıklık sisteminden.Çok nadiren - sarkoidoz veya alevlenmesi.
Alfa interferonların kullanımıyla, idiyopatik veya trombotik trombositopenik purpura, romatoid artrit, sistemik lupus eritematozus, vaskülit ve Vogt-Koyanagi-Harada sendromu dahil olmak üzere çeşitli otoimmün ve immün sistem aracılı bozukluklar rapor edilmiştir.
Vakalar bildirildi akut reaksiyonlarÜrtiker, anjiyoödem ve anafilaksi dahil aşırı duyarlılık.
Dışarıdan kardiyovasküler sistemin: nadiren - aritmi (genellikle daha önce kardiyovasküler sistem hastalıkları öyküsü olan veya daha önce kardiyotoksik tedavi görmüş hastalarda meydana geldi), geçici geri dönüşümlü kardiyomiyopati (kardiyovasküler sistemde yük öyküsü olmayan hastalarda not edildi); çok nadiren - arteriyel hipotansiyon, miyokard iskemisi ve miyokard enfarktüsü.
Merkezi sinir sisteminden ve periferik sistemden gergin sistem. Nadiren - intihar eğilimleri; çok nadiren - saldırgan davranış Başkalarına yönelik olanlar da dahil olmak üzere, intihar girişimleri, intihar, psikoz (halüsinasyonlar dahil), bilinç bozukluğu, nöropati, polinöropati, ensefalopati, serebrovasküler iskemi, serebrovasküler kanama, periferik nöropati, konvülsiyonlar.
İşitme organının yanından.Çok nadiren - işitme kaybı.
Endokrin sistemden.Çok nadiren - diyabet, mevcut durumun kötüleşmesi şeker hastalığı.
Gastrointestinal sistemden.Çok nadiren - pankreatit, iştah artışı, diş eti kanaması, kolit.
Karaciğer ve safra kanallarından.Çok nadiren - hepatotoksisite (dahil) ölümcül).
Dişlerde ve periodonsiyumda değişiklikler. Nitron A ve ribavirin ile kombinasyon tedavisi alan hastalarda, patolojik değişiklikler dişlerden ve periodonsiyumdan. Uzun süre ağız kuruluğu Birden fazla tedavinin bir arada uygulanması ribavirin ve Intron A dişlere ve ağız mukozasına zarar verebilir. Hastaların günde iki kez dişlerini fırçalamaları ve düzenli olarak diş kontrollerini yaptırmaları gerekmektedir. Ayrıca bazı hastalarda kusma da görülebilir.
Metabolizmanın yanından. Nadiren - hiperglisemi, hipertrigliseridemi.
Kas-iskelet sisteminden. Nadiren - rabdomiyoliz (bazen şiddetli), bacak krampları, sırt ağrısı, miyozit.
Cilt tarafından.Çok nadiren - eritema multiforme, Stevens-Johnson sendromu, toksik epidermal nekroliz, enjeksiyon bölgesinde nekroz.
Solunum sisteminden. Nadiren - zatürre; çok nadiren - pulmoner sızıntılar, pnömoni.
Üriner sistemden.Çok nadiren - nefrotik sendrom, Böbrek yetmezliği, böbrek yetmezliği.
Hematopoietik sistemden.Çok nadiren, Intron A'yı monoterapi olarak veya ribavirin ile kombinasyon halinde kullanırken aplastik anemi ve tam kırmızı aplazi gözlendi. kemik iliği.
Görme organının yanından. Nadiren - retina kanaması, fundusta fokal değişiklikler, retinal arter ve damarların trombozu, görme keskinliğinde azalma, görme alanlarında azalma, nevrit optik sinir, papil ödemi.
Klinik olarak önemli değişiklikler laboratuvar göstergeleri.(İlaç 10 milyon IU/gün'den fazla dozlarda reçete edildiğinde daha sık gözlenir) - granülosit ve lökosit sayısında azalma, hemoglobin seviyelerinde ve trombosit sayısında azalma, alkalin fosfataz, LDH aktivitesinde artış , kreatinin düzeyi ve serum üre nitrojeni. Kan plazmasındaki ALT ve AST aktivitesinde bir artış, hepatit dışındaki tüm endikasyonlar için ve ayrıca HBV DNA'nın yokluğunda kronik hepatit B'li bazı hastalarda kullanıldığında patolojik olarak not edilir.
Intron A'nın herhangi bir endikasyon için kullanımı sırasında advers olaylar gelişirse, doz azaltılmalı veya advers olaylar ortadan kalkana kadar tedaviye geçici olarak ara verilmelidir. Yeterli dozaj rejimine karşı kalıcı veya tekrarlayan intolerans gelişirse veya hastalık ilerlerse Intron A tedavisi kesilmelidir. İlacın parenteral uygulanmasıyla titreme, ateş, yorgunluk, baş ağrısı, halsizlik ve grip benzeri sendrom mümkündür. Bu yan etkiler parasetamol veya indometasin ile kısmen giderilir.
Şu tarihte: yerel uygulamaİlacın gözün mukoza zarına uygulanması, konjonktival enfeksiyon, gözün mukoza zarının hiperemisi, tek foliküller, alt forniksin konjonktivasının şişmesi mümkündür.
İlacı kullanırken, lökopeni, lenfopeni, trombositopeni, artan alanin aminotransferaz, alkalin fosfataz seviyeleri ile kendini gösteren normal laboratuvar parametrelerinden sapmalar mümkündür. Tedavi sırasında bu sapmaların zamanında tespiti için genel klinik testler Kan testleri 2 haftada bir, biyokimyasal testler ise 4 haftada bir tekrarlanmalıdır. Genel olarak bu değişiklikler genellikle küçük, asemptomatik ve geri dönüşümlüdür.
İnterferon betanın yan etkileri.
Lökopeni. Trombositopeni. Anemi. Otoimmün hemoliz. Anoreksiya. İshal. Artan transaminaz seviyeleri. Hipotansiyon. Taşikardi. Nefes darlığı. Baş dönmesi. Uyku bozuklukları. Kemiklerde ve eklemlerde ağrı. Ateş. Zayıflık. Miyalji. Baş ağrısı. Mide bulantısı. Kusmak; uzun süreli kullanımda - saç dökülmesi.Bu bölüm sunar interferon alfa 2b ve alfa 2a'nın kullanımına ilişkin talimatlar doğrusal, basit veya kısa ömürlü olarak da adlandırılan ilk nesil. Bu preparatların tek avantajı nispeten düşük fiyatlarıdır.
1943'te V. ve J. Heile sözde girişim olayını keşfettiler. İnterferonun ilk fikri şuydu: Virüslerin çoğalmasını engelleyen bir faktör. 1957'de İngiliz bilim adamı Alik Isaacs ve İsviçreli araştırmacı Jean Lindenman bu etkeni izole ederek açıkça tanımladı ve interferon adını verdi.
İnterferon (IFN), insan vücudunda üretilen bir protein molekülüdür. İnsan genetik aygıtı, sentezi için bir “reçeteyi” (interferon geni) kodlar. İnterferon, rol oynayan sinyal molekülleri olan sitokinlerden biridir. önemli rol bağışıklık sisteminin işleyişinde.
IFN'nin keşfinden bu yana geçen yarım yüzyıl boyunca bu proteinin düzinelerce özelliği araştırıldı. Tıbbi açıdan bakıldığında, bunların başlıcaları antiviral ve antitümör fonksiyonlarıdır.
İnsan vücudu yaklaşık 20 tür - bütün bir aile - interferon üretir. IFN iki türe ayrılır: I ve II.
Tip I IFN'ler - alfa, beta, omega, teta - virüslerin ve diğer bazı ajanların etkisine yanıt olarak vücudun çoğu hücresi tarafından üretilir ve salgılanır. Tip II IFN, yabancı ajanların etkisine yanıt olarak bağışıklık sistemi hücreleri tarafından üretilen interferon gama içerir.
Başlangıçta interferon preparatları yalnızca donör kan hücrelerinden elde ediliyordu; Onlara şöyle deniyordu: lökosit interferonları. 1980'de rekombinant veya genetiği değiştirilmiş interferonların dönemi başladı. Rekombinant ilaçların üretimi, insan donör kanından veya diğer biyolojik hammaddelerden benzer ilaçların üretilmesinden önemli ölçüde daha ucuz hale geldi; Üretimlerinde kullanılmaz donör kanı bir enfeksiyon kaynağı olarak hizmet edebilir. Rekombinant ilaçlar yabancı yabancı maddeler içermez ve bu nedenle daha az yan etkiler. İyileşme potansiyelleri benzer doğal ilaçlara göre daha yüksektir.
Viral hastalıkların, özellikle hepatit C'nin tedavisi için esas olarak interferon alfa (IFN-a) kullanılır. "Basit" ("kısa ömürlü") interferonlar alfa 2b ve alfa 2a ve pegile edilmiş (peginterferon alfa-2a ve peginterferon alfa-2b) vardır. “Basit” interferonlar AB ve ABD'de pratikte kullanılmamaktadır, ancak ülkemizde karşılaştırmalı ucuzluğu nedeniyle oldukça sık kullanılmaktadır. Hepatit C tedavisinde "kısa" IFN-a'nın her iki formu da kullanılır: interferon alfa-2a ve interferon alfa-2b (bir amino asitte farklılık gösterir). Basit interferon enjeksiyonları genellikle günaşırı yapılır (peginterferonlarla - haftada bir). Kısa ömürlü IFN'lerle günaşırı uygulandığında tedavinin etkinliği, peginterferonlara göre daha düşüktür. Bazı uzmanlar, AVT'nin etkinliği biraz daha yüksek olduğundan günlük "basit" IFN enjeksiyonlarını önermektedir.
“Kısa” IFN'lerin aralığı oldukça geniştir. Serbest bırakıldılar farklı üreticiler tarafından altında farklı isimler: Roferon-A, Intron A, Laferon, Reaferon-EC, Realdiron, Eberon, Interal, Altevir, Alfarona ve diğerleri.
En çok çalışılan (ve dolayısıyla pahalı) Roferon-A ve Intron-A'dır. Virüsün genotipine ve diğer faktörlere bağlı olarak ribavirin ile kombinasyon halinde bu IFN'lerle tedavinin etkinliği %30 ila %60 arasında değişmektedir. Ana liste markalar Basit interferon üreticileri ve açıklamaları tabloda verilmiştir.
Tüm interferonlar buzdolabında saklanmalıdır (+2 ila +8 santigrat derece). Isıtılmamalı veya dondurulmamalıdır. İlacı sallamayın veya doğrudan ışığa maruz bırakmayın. Güneş ışınları. İlaçların özel kaplarda taşınması gerekir.
madde-çözelti: paketler Reg. No.: LSR-007009/08
Klinik ve farmakolojik grup:
Serbest bırakma formu, kompozisyon ve paketleme
madde -çözüm.
şişeler (1) - karton paketler.
İlacın aktif bileşenlerinin açıklaması " İnterferon alfa-2b»
farmakolojik etki
İnterferon. 19.300 dalton moleküler ağırlığa sahip, yüksek derecede saflaştırılmış bir rekombinant proteindir. Bir Escherichia coli klonundan, bakteriyel plazmitlerin interferon sentezini kodlayan insan lökosit geni ile melezleştirilmesiyle elde edildi. İnterferondan farklı olarak alfa-2a'nın 23. pozisyonda arginin bulunur.
Spesifik membran reseptörleri ile etkileşime ve RNA sentezinin ve sonuçta proteinlerin indüksiyonuna bağlı olarak antiviral bir etkiye sahiptir. İkincisi, virüsün normal şekilde çoğalmasını veya salınmasını engeller.
Fagositozun aktivasyonu, antikor ve lenfokin oluşumunun uyarılması ile ilişkili immünomodülatör aktiviteye sahiptir.
Tümör hücreleri üzerinde antiproliferatif etkiye sahiptir.
Belirteçler
Akut hepatit B, kronik hepatit B, kronik hepatit C.
Tüylü hücreli lösemi, kronik miyeloid lösemi, renal hücreli karsinom, AIDS'e bağlı Kaposi sarkomu, kutanöz T hücreli lenfoma (mikozis fungoides ve Sézary sendromu), malign melanom.
Dozaj rejimi
İntravenöz veya deri altı olarak uygulanır. Doz ve tedavi rejimi endikasyonlara bağlı olarak ayrı ayrı ayarlanır.
Yan etki
Grip benzeri semptomlar: sık sık - ateş, titreme, kemiklerde, eklemlerde, gözlerde ağrı, kas ağrısı, baş ağrısı, terlemede artış, baş dönmesi.
Dışarıdan sindirim sistemi: olası iştah kaybı, bulantı, kusma, ishal, kabızlık, rahatsızlık tat duyumları, ağız kuruluğu, kilo kaybı, hafif karın ağrısı, karaciğer fonksiyon testlerinde hafif değişiklikler (genellikle tedaviden sonra normale döner).
Merkezi sinir sistemi ve periferik sinir sisteminden: nadiren - baş dönmesi, zihinsel aktivitede bozulma, uyku bozukluğu, hafıza bozukluğu, anksiyete, sinirlilik, saldırganlık, öfori, depresyon (sonra uzun süreli tedavi), parestezi, nöropati, titreme; bazı durumlarda - intihar eğilimleri, uyuşukluk.
Kardiyovasküler sistemden: mümkün - taşikardi (ateşli), arteriyel hipotansiyon veya hipertansiyon, aritmi; bazı durumlarda - kardiyovasküler sistem bozuklukları, koroner arter hastalığı, miyokard enfarktüsü.
Solunum sisteminden: nadiren - göğüs ağrısı, öksürük, hafif nefes darlığı; bazı durumlarda - zatürre, akciğer ödemi.
Hematopoietik sistemden: olası hafif lökopeni, trombositopeni, granülositopeni.
Dermatolojik reaksiyonlar: olası kaşıntı, geri dönüşümlü alopesi.
Diğerleri: nadiren - kas sertliği; izole durumlarda - doğal veya rekombinant interferonlara karşı antikorlar.
Kontrendikasyonlar
Ağır kardiyovasküler hastalıklar, dekompanse karaciğer sirozu, şiddetli depresyon, psikoz, alkol veya uyuşturucu bağımlılığı, artan hassasiyet interferon alfa-2b'ye.
Gebelik ve emzirme
Hamilelik sırasında kullanım ancak anne için tedaviden beklenen faydanın fetüse yönelik potansiyel riskten daha ağır basması durumunda mümkündür.
İnterferon alfa-2b'nin salgılanıp salgılanmadığı bilinmiyor. anne sütü. Emzirme döneminde kullanılması gerekiyorsa emzirmenin durdurulması konusuna karar verilmelidir.
Çocuk doğurma çağındaki kadınlar tedavi sırasında güvenilir doğum kontrolü kullanmalıdır.
Karaciğer fonksiyon bozukluğu için kullanın
Dekompanse karaciğer sirozunda kontrendikedir. Karaciğer fonksiyon bozukluğu olan hastalarda dikkatli kullanılmalıdır.
Böbrek yetmezliği için kullanın
Böbrek fonksiyon bozukluğu olan hastalarda dikkatli kullanın.
Özel Talimatlar
Böbrek, karaciğer, kemik iliği hematopoezi bozukluğu olan veya intihar girişiminde bulunma eğilimi olan hastalarda dikkatli kullanın.
Kardiyovasküler sistem hastalıkları olan hastalarda aritmi mümkündür. Aritmi azalmıyor veya artmıyorsa doz 2 kat azaltılmalı veya tedavi durdurulmalıdır.
Tedavi süresince nörolojik ve mental durumun izlenmesi gereklidir.
Kemik iliği hematopoezinin şiddetli baskılanması durumunda periferik kanın bileşiminin düzenli olarak incelenmesi gerekir.
İnterferon alfa-2b'nin bağışıklık sistemi üzerinde uyarıcı etkisi vardır ve otoimmün reaksiyon riskinin artması nedeniyle otoimmün hastalıklara yatkın hastalarda dikkatli kullanılmalıdır.
İlaç etkileşimleri
İlaç etkileşimleri
İnterferon alfa-2b, teofilinin metabolizmasını inhibe eder ve klirensini azaltır.
