Kompleman fiksasyon reaksiyonu (CFR), spesifik bir antijen-antikor kompleksinin her zaman komplemanı kendisine adsorbe ettiği (bağladığı) gerçeğine dayanmaktadır.
Bu reaksiyon, antijenlerin tanımlanmasında ve enfeksiyonların, özellikle de spiroketlerin (Wassermann reaksiyonu), riketsiya ve virüslerin neden olduğu hastalıkların* serodiyagnozunda yaygın olarak kullanılmaktadır.
RSC karmaşık bir serolojik reaksiyondur. Kompleman ve iki antijen-antikor sistemini içerir. Esasen bunlar iki serolojik reaksiyondur.
İlk sistem - ana sistem bir antijen ve bir antikordan oluşur (biri biliniyor, diğeri bilinmiyor). Üzerine belli miktarda tamamlayıcı eklenir. Bu sistemin antijeni ve antikoru eşleşirse komplemana bağlanacak ve bağlanacaktır. Ortaya çıkan kompleks ince bir şekilde dağılmıştır ve görünmez.
Bu kompleksin oluşumu ikinci bir hemolitik veya gösterge sistemi kullanılarak tespit edilir. Koyun kırmızı kan hücrelerini (antijen) ve karşılık gelen hemolitik serumu (antikor), yani hazır bir bağışıklık kompleksini içerir. Bu sistemde kırmızı kan hücrelerinin parçalanması ancak kompleman varlığında gerçekleşebilir. Kompleman birinci sisteme bağlıysa (eğer antijen ve antikor buna karşılık geliyorsa), o zaman ikinci sistemde hemoliz olmayacaktır - çünkü serbest tamamlayıcı yoktur. Hemolizin olmaması (tüp içeriğinin bulanık olması veya altta eritrosit çökeltisinin bulunması) pozitif RSC sonucu olarak kaydedilir.
İlk sistemde antijen antikorla eşleşmezse bağışıklık kompleksi oluşmayacak ve tamamlayıcı serbest kalacaktır! Serbest kalan tamamlayıcı ikinci sisteme katılarak hemolize neden olur; RSC sonucu negatiftir (tüplerin içeriği şeffaftır - "lake kan").
Kompleman fiksasyon reaksiyonunun bileşenleri:
Antijen - genellikle lizat, ekstrakt, hapten; daha az sıklıkla bir süspansiyon.
1.Hasta sisteminin antikor serumu
2. Tamamlayıcı - serum kobaylar
3. Antijen – koyun kırmızı kan hücreleri
4.Antikor - koyun kırmızı kan hücrelerine hemolizin
5.İzotonik çözüm
RSC'de çok sayıda karmaşık bileşen yer aldığından, bunların öncelikle titre edilmesi ve tam miktarlarda ve uygun şekilde reaksiyona alınması gerekir. eşit hacimler: 0,5 veya 0,25, daha az sıklıkla 0,2 ml. Buna göre deneyin tamamı 2,5, 1,25 veya 1,0 ml'lik hacimlerde gerçekleştirilir (daha büyük hacimler daha doğru sonuç verir). Reaksiyon bileşenlerinin titrasyonu deneyle aynı hacimde gerçekleştirilir ve eksik bileşenler izotonik bir çözeltiyle değiştirilir.
Malzemelerin Hazırlanması
Hemolitik serum (hemolizin). Serum titresinden 3 kat daha az seyreltilir (bkz. s. 211). Tüm deney için serumun genel bir seyreltisini hazırlayın; hacmi, bir test tüpündeki serum hacminin (örneğin, 0,5 ml) deneydeki sayıyı biraz aşacak şekilde test tüplerinin sayısıyla çarpılmasıyla belirlenir.
2. Koyun kırmızı kan hücreleri. Deneydeki tüm test tüpleri için %3'lük yıkanmış koyun eritrositleri süspansiyonu hazırlayın (bkz. s. 211). Hemolitik sistemi hazırlamak için, deneye eklemeden 30 dakika önce, eşit hacimlerde seyreltilmiş hemolizin ve kırmızı kan hücreleri süspansiyonunu karıştırın, serumu kırmızı kan hücrelerine ekleyin, iyice karıştırın ve 30 dakika boyunca 37˚C'de inkübe edin.
3. Tamamlayıcı genellikle 1:10 oranında seyreltilir. Her deneyden önce titre edilmelidir. Kompleman titresi en küçük miktarıdır, hemolitik sisteme eklendiğinde 37˚C'de 1 saat içinde hemoliz tamamlanır. Tamamlayıcı titrasyon şeması Tablo 21'de sunulmaktadır.
Dikkat! Eksik bileşenleri izotonik bir çözelti ile değiştirerek, iltifatı ana deneyle aynı hacimde titre edin.
Sonuçların muhasebeleştirilmesi. Kontrollerde biri kompleman, diğeri hemolizin içermediğinden hemoliz izi bile olmamalıdır. Kontroller, reaksiyon bileşenlerinin hemotoksisiteye (kırmızı kan hücrelerini kendiliğinden parçalama yeteneği) sahip olmadığını göstermektedir.
Verilen tabloda 21. örnekte, 1:10 seyreltmedeki tamamlayıcı titresi 0,15 ml'dir. Bir deneyde komplemanın aktivitesi, reaksiyonun diğer bileşenleri tarafından spesifik olmayan adsorpsiyonu nedeniyle azalabilir, bu nedenle deney için kompleman miktarı arttırılır: titreyi takip eden doz alınır. Bu çalışma dozudur. Verilen örnekte 1:10 seyreltide 0,2 komplemana eşittir. RSC'ye dahil olan tüm bileşenlerin eşit hacimlerde alınması gerektiğinden (örneğimizde 0:5 ml'dir), kompleman çalışma dozuna (0,2 ml1:10) 0,3 ml izotonik çözelti eklemek gerekir. Deneyin tamamı için her birinin hacmi (tamamlayıcı ve izotonik çözelti.
Deneyin tamamı için, her birinin hacmi (tamamlayıcı ve izotonik çözelti), RSC'ye katılan test tüplerinin sayısıyla çarpılır. Örneğin 50 test tüpünde bir deney yapmak için 10 ml kompleman 1:10 (0,2 mlx50) ve 15 ml izotonik çözelti (0,3 mlx50) almanız gerekir.
4. Antijen genellikle titresi belirtilen şekilde hazır olarak elde edilir; antijenin seyreltilmesinden sonra 1 ml'de bulunması gereken miktar. örneğin 0,4 titre ile 0,96 ml izotonik çözelti içerisinde seyreltilir. Deney için titrenin yarısına (0,5 ml) eşit miktarda antijen alıyorum. Bu onun çalışma dozu. 0,5 ml'yi deneydeki test tüplerinin sayısıyla çarparak tüm deney için toplam antijen seyreltmesini hesaplayın.
5. Antikor – hastanın serumu. Taze serum, içinde bulunan komplemanı yok etmek için deneyden önce etkisiz hale getirilir. Bunu yapmak için su banyosunda veya termostatlı inaktivatörde 56˚C'de 30 dakika ısıtılır. İkinci yöntem tercih edilir: Peynir altı suyunun aşırı ısınması, yani denatürasyonu olasılığını ortadan kaldırır. Denatüre serumlar test için uygun değildir. Hasta serumu genellikle 1:10 ila 1:160 oranında seyreltilerek kullanılır.
Tablo No.14
| Malzemeler, ml | test tüpleri | |||||||||||
| deneyim | kontrol | |||||||||||
| Hemolitik sistem | Kırmızı kan hücreleri | |||||||||||
| İzotonik solüsyon | 1,45 | 1,4 | 1,35 | 1,3 | 1,25 | 1,2 | 1,15 | 1,1 | 1,05 | 1,0 | 1,5 | 1,5 |
| Tamamlayıcı 1:10 | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,35 | 0,4 | 0,45 | 0,5 | ― | 0,5 |
| Hemolitik sistem | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | ― |
| Koyun kırmızı kan hücrelerinin %3 süspansiyonu | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | 0,5 |
| Tüpler iyice çalkalanıp 37˚C’de 1 saat inkübe edilir. | ||||||||||||
| sonuç | Hemoliz yok | Hemoliz | Hemoliz yok |
Bağışıklık serumları çoğunlukla üretim koşullarında hazırlanır ve inaktif halde salınır. 1:50 ve daha yüksek oranda seyreltilirler.
Tüm bileşenler biraz fazla hazırlanır.
| Malzemeler, ml | Test tüpleri | |||||||
| Deneyim kontrolü | ||||||||
| serum | antijen | Hemolitik sistem | Çalışma dozunda tamamlayıcı | |||||
| ½ | ||||||||
| Aşama 1 İzotonik çözüm | ― | 0,5 | 0,5 | 1,5 | 1,25 | 1,0 | 0,5 | |
| 1:10 oranında seyreltilmiş test serumu | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ― | |
| Çalışma dozunda antijen | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ||
| Çalışma dozunda tamamlayıcı 1:10 | 0,5 | 0,5 | 0,5 | ― | 0,25 | 0,5 | 1,0 | |
| Tüpler iyice çalkalanır ve 37°C'de 45 dakika 1 saat veya 4°C'de 18 saat inkübe edilir. | ||||||||
| Faz 2 hemolitik sistem | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | |
| Tüpler iyice çalkalanır ve 2, 3, 6 ve 7 numaralı tüplerde hemoliz tamamlanana kadar 37˚C'de inkübe edilir. | ||||||||
| Sonuç | Pozitif veya negatif | ― | ― | ++++ | (+) | ― | ― | |
Tablo No.15
Ana deneyin yürütülmesi
Deneyi kurarken son derece; Bileşenlerin eklenme sırası önemlidir. Deney iki aşamada gerçekleştirilir.
Aşama I. Gerekli miktarda izotonik sodyum klorür çözeltisi test tüplerine dökülür, ardından gerekli hacimde seyreltilmiş serum ve aynı hacimde çalışma dozlarında antijen ve kompleman dökülür. Deneye, içerdiği tüm bileşenlerin kontrolü eşlik etmelidir: serum, antijen, hemolitik sistem ve tamamlayıcı.
Tüpler iyice çalkalanır ve 37°C'de 45 dakika-1 saat veya 4°C'de (“soğukta RSC”) 18 saat inkübe edilir. Bu süre zarfında spesifik bir kompleksin varlığında kompleman bağlanması gerçekleşir. Reaksiyonun "soğukta" gerçekleştirilmesi duyarlılığını ve özgüllüğünü önemli ölçüde artırır.
Aşama II. İnkübasyon sonunda tüm test tüplerine 1 ml hemolitik sistem eklenir ve bu sistem önceden termostatta 30 dakika bekletilir (duyarlı hale getirilir). Test tüpleri çalkalanır ve tekrar termostata yerleştirilir.
Muhasebe sonucu o. Tüpler 2, 3, 6 ve 7 numaralı tüplerde hemoliz tamamlanıncaya kadar termostatta bırakılır (bir ve iki doz için serum, antijen ve kompleman kontrolü). Hemoliz ilk olarak iki katı kompleman içeren 7. test tüpünde meydana gelecektir. Bu tüpte hemoliz meydana geldikten ve içeriği tamamen şeffaf hale geldikten sonra, kalan kontrolleri özellikle dikkatle izlemeniz gerekir. 2., 3. ve 6. test tüplerindeki sıvı şeffaf hale gelir gelmez, test tüplerinin bulunduğu rafı derhal termostattan çıkarmalısınız. Deneyin termostatta gerekenden daha uzun süre tutulmaması, 5. test tüpünde hafif bir bulanıklığın (eksik hemoliz) varlığıyla gösterilir - çalışma kompleman dozunun yalnızca yarısını içerir ve eğer deney yapılırsa tam hemoliz meydana gelemez. doğru şekilde ayarlayın.
Serumdaki hemoliz ve antijen kontrolü (tüp 2 ve 3), dozlarının doğru seçildiğini ve ne serumun ne de antijenin kendilerinin komplemana bağlanmadığını gösterir.
Hemolitik sistemin kontrolünde (test tüpü 4), eğer düzgün çalışıyorsa, hemoliz izleri bile olmamalıdır - içinde tamamlayıcı yoktur.
Kontrollerin doğru bir şekilde tamamlandığından emin olduktan sonra deneyimi dikkate alabilirsiniz. Test tüplerinde hemolizin olmaması reaksiyonun olumlu sonucu olarak kabul edilir. Serumun alınan antijene özgü antikorlar içerdiğini gösterir. Oluşturdukları kompleks tamamlayıcıyı bağladı ve hemoliz reaksiyonuna katılımını engelledi. Test tüplerinde hemoliz meydana gelirse reaksiyon sonucu negatif olarak değerlendirilir. İÇİNDE bu durumda antijen ile antikor arasında bir yazışma yoktur, kompleman bağlanmaz ve hemoliz reaksiyonunda yer alır.
Hasta serumuna paralel olarak aynı deney, açıkça pozitif olan serumla (yani belirli bir antijene karşı antikorlar içeren serumla) ve açıkça negatif olan ve spesifik antikorlar içermeyen serumla gerçekleştirilir. Deney doğru şekilde kurulursa, ilk durumda hemolizde bir gecikme olması gerekir, ikinci durumda ise hemoliz olacaktır.
Reaksiyonun yoğunluğu şu şekilde ifade edilir:
Hemolizin tamamen gecikmesi. Kırmızı kan hücreleri tekdüze bir bulanıklık oluşturur veya dibe çöker. Bu durumda test tüpündeki sıvı renksiz hale gelir;
Kırmızı kan hücrelerinin yaklaşık %25'i parçalanır. Daha az tortu var, üstündeki sıvı hafif pembe. RSC'nin sonucu da oldukça olumlu olarak değerlendiriliyor;
Kırmızı kan hücrelerinin yaklaşık %50'si parçalanır. Tortu küçük, sıvı pembe. Pozitif RSC sonucu;
Kırmızı kan hücrelerinin yaklaşık %75'i parçalanır. Üzerinde yoğun renkli bir sıvının bulunduğu hafif bir tortu. Şüpheli RSC sonucu;
Tüm kırmızı kan hücreleri parçalandı. Sıvı yoğun renkli ve tamamen şeffaftır. Negatif RSK sonucu.
Bu reaksiyon, bakteriyel, viral, protozoal enfeksiyonları olan hastaların kan serumundaki antikorları tespit etmek ve ayrıca hastalardan izole edilen virüsleri tanımlamak ve tiplendirmek için kullanılır.
RSC, antijen, antikor ve komplemana ek olarak hemolitik sistemin de katıldığı ve reaksiyonun sonuçlarını ortaya çıkaran karmaşık serolojik reaksiyonları ifade eder. RSC iki aşamada ilerler: birincisi, kompleman katılımıyla antijenin antikorla etkileşimi, ikincisi ise hemolitik sistem kullanılarak kompleman bağlanma derecesinin belirlenmesidir. Bu sistem, koyun kırmızı kan hücreleri ve laboratuvar hayvanlarının kırmızı kan hücreleriyle immünize edilmesiyle elde edilen hemolitik serumdan oluşur. Eritrositler işlenir - 30 dakika boyunca 37°C sıcaklıkta bunlara serum eklenerek hassaslaştırılır. Duyarlılaştırılmış koyun eritrositlerinin parçalanması yalnızca hemolitik kompleman sistemine katılmaları durumunda gerçekleşir. Yokluğunda kırmızı kan hücreleri değişmez. RSC'nin sonuçları test serumundaki antikorların varlığına bağlıdır. Serum, reaksiyonda kullanılan antijene homolog antikorlar içeriyorsa, ortaya çıkan antijen-antikor kompleksi komplemana bağlanır ve bağlanır. Hemolitik bir sistem eklerken, bu durumda hemoliz meydana gelmeyecektir, çünkü tamamlayıcının tamamı antijen-antikor kompleksinin spesifik bağına harcanmaktadır.
Kırmızı kan hücreleri değişmeden kalır, dolayısıyla test tüpünde hemoliz olmaması pozitif RBC olarak kaydedilir. Serumda antijene karşılık gelen antikorların yokluğunda spesifik bir antijen-antikor kompleksi oluşmaz ve kompleman serbest kalır. Hemolitik bir sistem eklendiğinde kompleman ona bağlanır ve kırmızı kan hücrelerinin hemolizine neden olur. Kırmızı kan hücrelerinin yok edilmesi ve hemolizleri negatif reaksiyonu karakterize eder.
RSC'yi evrelemek için aşağıdakiler gereklidir: hastanın serumu, kompleman, koyun eritrositleri ve hemolitik serumdan oluşan bir hemolitik sistemin yanı sıra izotonik bir sodyum klorür çözeltisi.
Reaksiyon serolojik tüplerde gerçekleştirilir. Koyun kırmızı kan hücreleri, defibrine edilmiş koyun kanının izotonik sodyum klorür çözeltisi ile üç kez yıkanmasıyla elde edilir. Hemolitik serum, etiketi titresini, yani serumun maksimum seyreltilmesini gösteren, tamamlayıcı varlığında kırmızı kan hücrelerine eklendiğinde hala hemolize neden olan ampullerde hazır olarak üretilir. Hemolitik serum, tavşan gibi hayvanların koyun kırmızı kan hücreleriyle aşılanmasıyla elde edilir. Reaksiyonu ayarlarken serum üçlü titrede kullanılır. Örneğin, hemolitik serumun titresi 1: 1200 ve çalışma seyreltisi 1: 400'dür. Kompleman olarak taze kobay kanı serumu (24-48 saat içinde) veya ampullerdeki kuru kompleman kullanılır.
RSC gerçekleştirilmeden önce kompleman 1:10 oranında seyreltilir ve titre edilerek titre edilir - bu reaksiyonda kullanılan hemolitik sistemle birleştirildiğinde kırmızı kan hücrelerinin hemoliziyle üretilen en küçük kompleman miktarı. Antijenin olası anti-tamamlayıcı özellikleri dikkate alınarak, bir reaksiyonun aşamalandırılması sırasında, tamamlayıcının belirlenmiş çalışma titresinde %20-30'luk bir artış yapılır.
RSC antijeni, öldürülmüş bakterilerin süspansiyonları, bu süspansiyonlardan hazırlanan ekstraktlar ve mikropların ayrı ayrı kimyasal fraksiyonlarından oluşur. Bir antijen için temel gereksinim, kompleman aktivitesinin inhibisyonunun olmamasıdır. Anti-tamamlayıcı özelliklere sahip olmamalıdır. Antijenin bu özelliklerini tanımlamak için kompleman, reaksiyonda kullanılan antijenin varlığında ilave olarak titre edilir. RSC'yi evrelemek için belirli şemalar vardır. Reaksiyonun sonuçları, hemolitik sistemdeki kırmızı kan hücrelerinin hemolizinin varlığı veya yokluğu ile dikkate alınır. RSC, sifiliz (Wassermann reaksiyonu), gonore (Bordet-Gengou reaksiyonu), toksoplazmoz, riketsiyal ve viral hastalıklar.
Kompleman fiksasyon reaksiyonu (CFR), antijenler ve antikorlar birbirine karşılık geldiğinde, bunların, antikorların Fc fragmanı yoluyla kompleman (C)'nin bağlandığı bir immün kompleksi oluşturmasıdır; yani kompleman, antijen-antikor kompleksi tarafından bağlanır. Antijen-antikor kompleksi oluşmazsa kompleman serbest kalır.
AG ve AT'nin spesifik etkileşimine komplemanın adsorpsiyonu (bağlanması) eşlik eder. Kompleman fiksasyonu süreci görsel olarak belirgin olmadığından, J. Bordet ve O. Zhangu, komplemanın AG-AT kompleksi tarafından sabitlenip sabitlenmediğini gösteren bir gösterge olarak hemolitik sistemin (koyun kırmızı kan hücreleri + hemolitik serum) kullanılmasını önerdiler. AG ve AT birbirine karşılık gelirse, yani bir bağışıklık kompleksi oluşmuşsa, o zaman kompleman bu komplekse bağlanır ve hemoliz meydana gelmez. AT, AG'ye karşılık gelmiyorsa, kompleks oluşmaz ve serbest kalan tamamlayıcı, ikinci sistemle birleşerek hemolize neden olur.
Reaksiyon ilerlemesi
Reaksiyon iki sistemi içeren iki aşamada gerçekleşir; Bakteriyel ve hemolitik. İlk reaksiyon (spesifik) antijen 4-+ antikor + komplemanı içerir. Antikorlar bir antijenle eşleştiğinde ortaya çıkan pozitif reaksiyon sonucu, adsorbe edilmiş veya dedikleri gibi "bağlı" tamamlayıcı ile spesifik bir bakteriyel antijen-antikor kompleksinin oluşumu ile karakterize edilir. Görünmez kalan kompleks, oluştuğu ortamda herhangi bir dış değişikliğe neden olmaz. Antijen ile serum antikoru arasında spesifik afinitenin yokluğunda negatif bir RSC sonucu ortaya çıkar ve serbest aktif komplemanın korunmasıyla karakterize edilir. RSC'nin ilk aşaması, bir termostatta 37°C'de (1-2 saat) veya buzdolabında 3-4°C'de (18-20 saat) gerçekleştirilebilir. Soğukta antijen-antikor immün kompleksinin uzun süre oluşmasıyla birlikte, komplemanın daha tam bağlanması meydana gelir ve sonuç olarak reaksiyonun duyarlılığı artar. Karşılaştırmalı deneyler yaparken Sovyet immünolog Akademisyen. V.I. Ioffe ve öğrencileri, soğukta uzun süreli kompleman fiksasyonu koşulları altında, 100-500 kat daha küçük miktarlarda antijen yakalamanın ve elde etmenin mümkün olduğunu gösterdi. pozitif sonuçlar 1-2 saat boyunca 37 ° C sıcaklıkta tamamlayıcı fiksasyon deneyine göre daha yüksek bağışıklık serumu seyreltmelerinde Reaksiyonun ikinci aşaması (gösterge), hemolitik sistemin reaktifleri arasında meydana gelir (% 3'lük bir süspansiyon karışımı). eritrositler ve hemolitik serum eşit hacimlerde) 37 °C sıcaklıkta yalnızca reaksiyonun ilk aşamasından serbest kalan kompleman varlığında (negatif reaksiyon). Serbest aktif tamamlayıcının yokluğunda, spesifik hemolizinlerin etkisi altında kırmızı kan hücrelerinin hemolizi meydana gelmez (reaksiyon pozitiftir).
Bileşenler
Kompleman fiksasyon reaksiyonu (CFR) karmaşık bir serolojik reaksiyondur. Bunu gerçekleştirmek için 5 bileşene ihtiyaç vardır: AG, AT ve kompleman (birinci sistem), koyun eritrositleri ve hemolitik serum (ikinci sistem).
RSC antijeni, çeşitli öldürülmüş mikroorganizmaların kültürleri, bunların lizatları, bakteri bileşenleri, patolojik olarak değiştirilmiş ve normal organlar, doku lipitleri, virüsler ve virüs içeren materyaller.
Tamamlayıcı olarak taze veya kurutulmuş kobay serumu kullanılır.
Reaksiyon mekanizması
RSK iki aşamada gerçekleştirilir: 1. aşama - üç bileşenli antijen + antikor + kompleman içeren bir karışımın inkübasyonu; 2. aşama (gösterge) - koyun eritrositlerinden ve bunlara karşı antikor içeren hemolitik serumdan oluşan bir hemolitik sistemin eklenmesiyle karışımdaki serbest komplemanın tespiti. Reaksiyonun 1. aşamasında antijen-antikor kompleksi oluştuğunda kompleman bağlanır ve ardından 2. aşamada antikorlar tarafından duyarlılaştırılan eritrositlerin hemolizi meydana gelmez; tepki olumlu. Antijen ve antikor birbiriyle eşleşmezse (test örneğinde antijen veya antikor yoksa), kompleman serbest kalır ve 2. aşamada eritrosit - anti-eritrosit antikor kompleksine katılarak hemolize neden olur; tepki olumsuzdur.
Başvuru
Kompleman fiksasyon reaksiyonu şu amaçlarla kullanılabilir:
1) bilinmeyen serumdaki spesifik antikorların, bilinen nitelikteki bir antijenle etkileşimlerine dayanarak tanımlanması;
2) bilinen spesifik bir serumla reaksiyona giren antijenin özelliklerinin incelenmesi. RSC'nin evrelemesi için bileşenlerin hazırlanması.
1. Reaksiyonun arifesinde araştırma için elde edilen kan serumu, kendi tamamlayıcısını etkisiz hale getirmek için 56°C'deki bir su banyosunda 30 dakika ısıtılır. İnaktif serum 3-4°C'de 5-6 gün saklanabilir. Deney gününde serum, 1:5 oranında izotonik sodyum klorür çözeltisi (0,1 ml test serumu + 0,4 ml izotonik sodyum klorür çözeltisi) ile seyreltilir.
2. CSC'nin üretimi için antijen, çeşitli mikropların kültürleri, bakteriyel proteinler ve mikrobiyal kültürlerden, patolojik olarak değiştirilmiş ve normal organ ve dokulardan elde edilen ekstraktlar olabilir. Antijen hazırlamanın özellikleri, bulaşıcı sürecin doğası ve patojenin özelliklerine göre belirlenir.
3. Kompleman, 3-5 sağlıklı kobaydan elde edilen serumların veya ampullerdeki kuru komplemanın bir karışımıdır.
Kullanımdan hemen önce, kobay serumu, bir stok çözelti elde etmek için 1:10 oranında izotonik bir sodyum klorür çözeltisi ile seyreltilir.
4. Deneyi gerçekleştirmeden önce hemolitik serum, 56°C sıcaklıkta 30 dakika ısıtılarak etkisiz hale getirilir. Ana RSC deneyini gerçekleştirmek ve kompleman ve antijeni titre etmek için üçlü titrede hemolitik serum kullanılır. Örneğin hemolitik serumun titresi 1:1800 ise reaksiyonda 1:600 serum seyreltmesi kullanılır.
5. Eritrositler defibrine koyun kanından elde edilir. Fibrin filmlerini çıkarmak için kan, üç katmanlı bir gazlı bez filtreden süzülür. Ortaya çıkan süzüntü santrifüje tabi tutulur, serum emilir ve boşaltılır ve eritrositler, izotonik bir sodyum klorür çözeltisi ile 3-4 kez santrifüjleme yoluyla yıkanır. Kırmızı kan hücreleri son kez yıkandığında süpernatan sıvı tabakası tamamen şeffaf olmalıdır. İzotonik bir sodyum klorür çözeltisi içinde yıkanmış kırmızı kan hücrelerinden %3'lük bir süspansiyon hazırlanır. RSC'ye dahil olan bileşenleri yukarıdaki şekilde hazırladıktan sonra hemolitik serum, kompleman ve antijenin titrasyonuna geçin.
Ders kitabı yedi bölümden oluşmaktadır. Birinci bölüm – “Genel Mikrobiyoloji” – bakterilerin morfolojisi ve fizyolojisi hakkında bilgiler içerir. İkinci bölüm bakterilerin genetiğine ayrılmıştır. Üçüncü bölüm – “Biyosferin Mikroflorası” – mikroflorayı inceliyor çevre doğadaki madde döngüsündeki rolü, insan mikroflorası ve önemi. Dördüncü bölüm – “Enfeksiyon doktrini” – mikroorganizmaların patojenik özelliklerine, bunların hastalıktaki rollerine ayrılmıştır. bulaşıcı süreç Ayrıca antibiyotikler ve etki mekanizmaları hakkında da bilgi içerir. Beşinci bölüm – “Dokunulmazlık Doktrini” – bağışıklıkla ilgili modern fikirleri içeriyor. Altıncı bölüm olan “Virüsler ve sebep oldukları hastalıklar”, virüslerin temel biyolojik özellikleri ve sebep oldukları hastalıklar hakkında bilgi vermektedir. Yedinci bölüm - “Özel tıbbi mikrobiyoloji” - birçok patojenin morfolojisi, fizyolojisi ve patojenik özellikleri hakkında bilgi içerir bulaşıcı hastalıklar ve ayrıca hakkında modern yöntemler onların teşhisleri, spesifik önleme ve terapi.
Ders kitabı öğrenciler, lisansüstü öğrenciler ve yüksek tıp fakültesi öğretmenlerine yöneliktir. Eğitim Kurumları, üniversiteler, her uzmanlıktan mikrobiyologlar ve pratisyen doktorlar.
5. baskı, gözden geçirilmiş ve genişletilmiş
Kitap:
| <<< Назад
|
İleri >>> |
Kompleman sabitleme reaksiyonu
Komplemanın farklı doğadaki antijen + antikor komplekslerine spesifik olarak bağlanma konusundaki eşsiz yeteneği bulunmuştur. geniş uygulama tamamlayıcı fiksasyon reaksiyonunda (CFR). RSC'nin özel bir avantajı, içinde yer alan antijenin doğasının (korpüsküler veya çözünür) önemli olmamasıdır çünkü kompleman, antikor spesifikliğine bakılmaksızın IgG ve IgM ile ilgili herhangi bir antikorun Fc fragmanına bağlanır. Ek olarak, RSA çok hassastır: örneğin çökelme reaksiyonundan 10 kat daha az antikor miktarını tespit etmenize olanak tanır. RSC, 1901 yılında J. Bordet ve O. Zhang tarafından önerildi. Tamamlayıcının iki özelliğine dayanır:
1) antijen + antikor kompleksine bağlanma yeteneği;
2) hemolitik serum elde etmek için kullanılan kırmızı kan hücrelerinin parçalanması.
RSK iki aşamada gerçekleştirilir ve buna sırasıyla iki sistem dahil edilir - deneysel veya teşhis ve gösterge. Teşhis sistemi, içinde bulunan komplemanı ve antijeni etkisiz hale getirmek için reaksiyonu gerçekleştirmeden önce 56 °C'de 30 dakika ısıtılan test (veya teşhis) serumundan oluşur. Bu sisteme standart tamamlayıcı eklenir. Kaynağı taze veya kurutulmuş kobay peynir altı suyudur. Karışım 37°C'de bir saat süreyle inkübe edilir. Test serumu antikorlar içeriyorsa, bunlar eklenen antijenle etkileşime girecek ve ortaya çıkan antijen + antikor kompleksleri eklenen komplemana bağlanacaktır. Serumda antikor yoksa antijen + antikor kompleksi oluşumu gerçekleşmeyecek ve kompleman serbest kalacaktır. Reaksiyonun bu aşamasında genellikle kompleman fiksasyonunun görünür bir belirtisi yoktur. Bu nedenle kompleman fiksasyonunun oluşup oluşmadığı sorusunu açıklığa kavuşturmak için ikinci bir gösterge sistemi (inaktive edilmiş hemolitik serum + koyun kırmızı kan hücreleri) eklenir ve tüm RSC bileşenlerinin karışımı tekrar 37 °C'de 30 - 60 dakika süreyle inkübe edilir. Daha sonra reaksiyonun sonuçları değerlendirilir. Tanı sisteminde kompleman ilk aşamada bağlanırsa, yani hastanın serumunda antikorlar varsa ve kompleman antikor + + antijen kompleksi ile bağlıysa, eritrositlerin parçalanması gerçekleşmez - RBC pozitiftir: sıvı Tüpün dibinde renksiz, eritrosit çökeltisi vardır. Serumda spesifik antikorlar yoksa ve teşhis sisteminde kompleman bağlanması oluşmuyorsa, yani RSC negatifse, teşhis sisteminde harcanmayan kompleman, kırmızı kan hücreleri + gösterge sisteminin antikorları ve hemoliz kompleksine bağlanır. oluşur: test tüpünde "laklanmış kan", kırmızı kan hücresi çökeltisi No. RSC'nin yoğunluğu, hemoliz gecikmesinin derecesine ve eritrosit sedimentinin varlığına bağlı olarak dört çapraz sistem kullanılarak değerlendirilir. Reaksiyona uygun kontroller eşlik eder: bazı serumlar ve bazı antijenler anti-tamamlayıcı etkiye sahip olduğundan serum kontrolü (antijensiz) ve antijen kontrolü (serumsuz). RSC'yi gerçekleştirmeden önce, test serumu veya antijen dışında, içerdiği tüm bileşenler dikkatli bir titrasyona tabi tutulur. Komplemanın tam dozunun reaksiyona dahil edilmesi özellikle önemlidir, çünkü eksikliği veya fazlalığı aşağıdaki sorunlara yol açabilir: yanlış sonuçlar. Kompleman titresi, çalışma dozunda hemolitik serum varlığında kırmızı kan hücrelerinin tamamen çözünmesini sağlayan minimum miktardır. Ana deneyi oluşturmak için, belirlenen titreye kıyasla %20-25 oranında artırılmış bir tamamlayıcı dozu alın. Hemolitik serumun titresi, eşit hacimde %10'luk kompleman çözeltisi ile karıştırıldığında, 37 °C sıcaklıkta 1 saat içinde karşılık gelen kırmızı kan hücrelerini tamamen hemolize eden maksimum seyreltmedir. Ana deney, titresinin 1/3'üne kadar seyreltilmiş serumun alınmasını içerir.
Kompleman fiksasyonu reaksiyonu geleneksel reaksiyonlardan biridir. serolojik reaksiyonlar Birçok viral hastalığın teşhisinde kullanılan ve diğer bazı tespit yöntemlerinin de temelini oluşturan antiviral antikorlar. Nötralizasyon reaksiyonu olmasına rağmen hemaglutinasyonun inhibisyonu, dolaylı hemaglutinasyon, bağlantılı immünosorbent tahlili Duyarlılık açısından kompleman fiksasyon reaksiyonundan üstün olmasına rağmen tekniğin basitliği, antikorların erken saptanması ve hemaglutinasyon özelliği olmayan viral antijenlerin saptanması virolojik çalışmalarda yaygın kullanımını açıklamaktadır.
Üretimi, bir dizi başka immünolojik reaksiyon için gerekli olan, antijenik ilaçların bu kadar yüksek derecede konsantrasyonunu ve saflığını gerektirmez. Ek olarak, birçok virüsün kompleman sabitleyici antijenlerinin grup özgüllüğü, toplu teşhislerde kompleman sabitleme reaksiyonunun kullanılmasını mümkün kılar: bu reaksiyon, tür farklılıklarını ortaya çıkarmaz ve virüsler arasındaki antijenik ilişkileri incelerken özellikle değerlidir.
Adın kendisi büyük ölçüde iki ayrı reaksiyondan oluşan yöntemin özünü yansıtıyor. İlk aşamada reaksiyon, antijenleri ve antikorları (bu bileşenlerden biri önceden bilinmektedir) ve ayrıca titre edilmiş miktarda tamamlayıcıyı içerir. Antijen ve antikorlar eşleşirse, kompleksleri ikinci aşamada bir gösterge sistemi (koyun kırmızı kan hücreleri ve bunlara karşı antiserum karışımı) kullanılarak tespit edilen komplemana bağlanır. Antijen ve antikorların etkileşimi sırasında kompleman bağlanırsa koyun kırmızı kan hücrelerinin lizizi meydana gelmez ( olumlu tepki tamamlayıcı fiksasyonu). Negatif bir kompleman sabitleme reaksiyonu durumunda, sabitlenmemiş kompleman, reaksiyonun sonuçlarını değerlendirmek için kullanılan hemolizi destekler.
Kompleman fiksasyon reaksiyonunun ana bileşenleri antijenler (bilinen veya tespit edilebilir), antikorlar (bilinen antiserumlar veya test serumları), kompleman, hemolitik serum ve koyun kırmızı kan hücreleridir; Seyreltici olarak izotonik sodyum klorür çözeltisi (pH 7.2-7.4) veya çeşitli tampon çözeltileri kullanılır. Antijenler ve serumlar anti-tamamlayıcı olabilir; hemolizi geciktiren ve reaksiyonun sonucunu bozan komplemanı adsorbe etme yeteneği.
CSC için antijenler, enfekte olmuş hayvanların organlarından, enfekte tavuk embriyolarının allantoik veya amniyotik sıvısından ve ayrıca doku hücre kültürlerinde virüslerin yetiştirilmesinden sonra kültür sıvısından hazırlanır. Antijenik preparatlar her zaman hayvan hücrelerinden veya doku kültürlerinden elde edilen çok sayıda balast maddesi içerir ve bu da reaksiyonun sonuçlarını bozabilir.
Ortaya çıkan viral antijenler etkisiz hale getirilir, çalışma dozunun yanı sıra anti-tamamlayıcı ve hemolitik özellikler belirlenir. Antijen daha sonra kompleman varlığında titre edilir.
Reaksiyonun aşamalandırılmasındaki ikinci ana bileşen tamamlayıcıdır. Bu terim şu anlama gelir: Kompleks sistem Hayvanların ve insanların kanında bulunan proteinler ve faktörler. Tipik olarak, kompleman fiksasyon reaksiyonunda kobay kanı serumu kullanılır. Komplemanın aktivitesi (titre), hemolisinin kullanılan hemolitik sistemin tamamen hemolizine neden olduğu en küçük miktardır.
Virüslere karşı kompleman sabitleyici antikorları tanımlamak için serumun, komplemanı ortadan kaldıracak şekilde 56°C'de 30 dakika süreyle etkisiz hale getirilmesi gerekir. Bağışıklanmış hayvanlardan elde edilen serumlar genellikle referans serumları olarak kullanılır. Ayrıca, immünizasyon için, doku safsızlıklarından iyice arındırılmış viral antijenler kullanılır, aksi takdirde spesifik olmayan belirgin bir reaksiyon meydana gelir.
Kompleman fiksasyon reaksiyonunun zorunlu bir bileşeni, koyun eritrositlerini ve tavşanların koyun eritrositleriyle hiperimmünizasyonuyla elde edilen hemolitik serumu içeren hemolitik sistemdir.
Kompleman fiksasyon reaksiyonunu gerçekleştirmek için aşağıdaki modifikasyonlar kullanılır: Takachi sistem mikrotitratöründe kompleman fiksasyon reaksiyonunun mikro yöntemi, uzun vadeli kompleman fiksasyon reaksiyonu, dolaylı kompleman fiksasyon reaksiyonu, bir jelde kompleman fiksasyon reaksiyonu, mikrodamlacık tamamlayıcı fiksasyon reaksiyonu, katı bazlı tamamlayıcı fiksasyon reaksiyonu.
Kompleman fiksasyonu reaksiyonunun duyarlılığı düşük olmasına rağmen özgüllüğü yüksektir. Bu bakımdan genç sığırlarda viral pnömoenteritlerin teşhisinde yaygın olarak kullanılmaktadır.
