Ixtiroga tegishli genetik muhandislik, biotexnologiya, tibbiyot, farmakologiya. Yangi rekombinant ko'p nusxali plazmid DNK pSX50, inson leykotsitlari alfa-2b interferonining sintezini kodlovchi, uning ifodasi laktoza va triptofan promotorlari va transkripsiya terminatori nazorati ostida. Qabul qiluvchi E. coli BL21 shtammi hujayralarining pSX50 rekombinant plazmid DNKsi bilan transformatsiyasi natijasida E. coli SX50 shtammi - mahsuldorligi 0,9-1,0 g gacha bo'lgan rekombinant leykotsit inson alfa-2b interferon ishlab chiqaruvchisi olindi. 1 litr madaniy muhitdan alfa-2b interferon. Rekombinant alfa-2b interferonini ishlab chiqarish usuli E. coli SX50 ning yaratilgan rekombinant shtammidan foydalanishga asoslangan va uni ozuqaviy muhitda chuqur o'stirishni o'z ichiga oladi. kamaytirilgan tarkib biosintez jarayonida ozuqaviy substratlarning uzluksiz qo'shilishi bilan triptofan, mikroorganizm hujayralarini mexanik ravishda yo'q qilish. yuqori qon bosimi, agregatlangan oqsilni guanidin gidroxloridning konsentrlangan eritmasida eritib yuborish, so‘ngra xaotrop moddalar ishtirokida fiziologik bufer eritmalarda interferonni renaturatsiya qilish va uni Chelating Sepharose Fast Flow tipidagi Cuimmobilizatsiyalangan qatronlar bilan interferonni uch bosqichli xromatografik tozalash yordamida tozalash. +2 ionlari, SM tipidagi ion almashinadigan qatronlarda ion almashinish xromatografiyasi va Superdex 75 tipidagi smolalarda gel filtrlash xromatografiyasi bu usul elektroforez bo'yicha qaytaruvchi va bo'lmagan holda 99% dan ortiq tozalikdagi interferon moddasini olish imkonini beradi. RF HPLC bo'yicha jellarni kumush va 98% dan ortiq bo'yashda va 1 litr madaniy muhit uchun kamida 400-800 mg miqdorida pirogenlarni (LAL testi) o'z ichiga olmaydi. 3 n. va 3 ish haqi lavozimi, 6 kasal.
RF patenti uchun chizmalar 2242516
Ixtiro biotexnologik yo'l bilan olingan genetik muhandislik preparatlariga, ya'ni usullarga tegishli. sanoat ishlab chiqarish rekombinant inson leykotsitlari interferon alfa-2b tibbiy maqsadlarda(keyingi o'rinlarda interferon deb yuritiladi), shuningdek, Escherichia coli (E.coli) va interferon sintezini kodlovchi plazmid DNKning rekombinant ishlab chiqaruvchi shtammlariga.
Interferonlar - molekulyar og'irligi 15 000 dan 21 000 daltongacha bo'lgan oqsil molekulalari virusli infektsiya yoki boshqa patogenlarga javoban hujayralar tomonidan ishlab chiqariladi va chiqariladi. Interferonlarning uchta asosiy guruhi mavjud: alfa, beta va gamma. Bu guruhlarning o'zlari bir hil emas va interferonning bir nechta turli molekulyar turlarini o'z ichiga olishi mumkin. Shunday qilib, interferon alfa ning 14 dan ortiq genetik navlari aniqlangan, ular qiziqish uyg'otadi va topadi. keng qo'llanilishi tibbiyotda antiviral, antiproliferativ va immunomodulyatsion vositalar sifatida.
Viruslar va boshqa induktorlar (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873) tomonidan qo'zg'atilgan inson donor qoni leykotsitlaridan inson leykotsitlari interferonini olishning ma'lum usullari mavjud.
Interferonlarni ishlab chiqarishning ushbu usullarining asosiy kamchiliklari - bu oxirgi mahsulotning inson viruslari, masalan, gepatit B va C virusi, immunitet tanqisligi virusi va boshqalar bilan ifloslanish ehtimoli.
Hozirgi vaqtda mikrobiologik sintez orqali interferon ishlab chiqarish usuli yanada istiqbolli deb tan olingan, bu esa nisbatan arzon boshlang'ich materiallardan sezilarli darajada yuqori rentabellik bilan maqsadli mahsulotni olish imkonini beradi. Bu erda qo'llaniladigan yondashuvlar bakterial ekspressiya uchun optimal bo'lgan strukturaviy gen variantlarini, shuningdek, uning ifodasini boshqaradigan tartibga soluvchi elementlarni yaratishga imkon beradi.
Ishlatilgan boshlang'ich mikroorganizmlar turli dizaynlar Pichia pastoris, Pseudomonas putida va Escherichia coli shtammlari.
P. pastorisdan interferon ishlab chiqaruvchisi sifatida foydalanishning kamchiliklari (J.N. Garsiya, J.A. Aguiar va boshqalar. // Pichia pastorisda inson IFN-2b ning yuqori darajadagi ifodasi.//Biotecnologia Aplicada, 12 (3), 152-155, 1995 yil. ), Ushbu turdagi xamirturushning fermentatsiya sharoitlari juda qiyin, biosintez jarayonida induktorning, xususan, metanolning konsentratsiyasini qat'iy saqlash zarurati. Ps dan foydalanishning kamchiliklari. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) past ifoda darajasida fermentatsiya jarayonining murakkabligi (1 litr madaniyat muhitiga 10 mg interferon). Escherichia coli shtammlarini qo'llash yanada samaralidir (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3 Suppl. 9): S9-41-S9-51).
Ko'p miqdordagi plazmidlar va ular asosida interferonni ifodalovchi E. coli shtammlari ma'lum: E. coli shtammlari ATCC 31633 va 31644 Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 yoki Z-pBR 322(Pstl)/ plazmidlari bilan. HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli shtammi pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli shtammi pINF-F-Pa (AU 1312962), E. Coli shtammi SG 20050 plazmidli VNF (p280/ravchenko). va boshqalar Bioorganic chemistry, 1987, v. 13, no 9, s. 1186-1193), shtammi E. Coli SG 20050 pINF14 (SU 1703691), shtammi E. coli SG 20050 bilan plas140) va hokazo. Ushbu shtammlardan foydalanishga asoslangan texnologiyalarning kamchiliklari ularning beqarorligi, shuningdek, interferon ifodalash darajasining etarli emasligi.
Amaldagi shtammlarning xususiyatlari bilan bir qatorda, jarayonning samaradorligi ko'p jihatdan interferonni izolyatsiya qilish va tozalash uchun ishlatiladigan texnologiyaga bog'liq.
Interferon ishlab chiqarishning ma'lum usuli mavjud bo'lib, u Ps hujayralarini etishtirishni o'z ichiga oladi. putida, biomassani yo'q qilish, polietilenimin bilan ishlov berish, ammoniy sulfat bilan fraksiyalash, fenilsiloxrom C-80 da hidrofobik xromatografiya, lizatning pH fraksiyasi, uning konsentratsiyasi va diafiltratsiyasi, tsellyuloza DE-52 ning ion almashinuvi xromatografiyasi, pH gradientida elyusiya, tsellyuloza SM -52 da hosil bo'lgan elyuentning almashinuv kromatografiyasi, filtr kassetasidan o'tish orqali konsentratsiya va Sephadex G-100 (SU 1640996) da gel filtrlash. Ushbu usulning nochorligi, murakkab ko'p bosqichli fermentatsiyaga qo'shimcha ravishda, yakuniy mahsulotni olishda ko'p bosqichli jarayondir.
Interferon ishlab chiqarishning ma'lum usuli ham mavjud bo'lib, u E. coli SG 20050/pIF16 shtammini LB bulonida termostatli shakerda kolbalarda etishtirish, biomassani santrifüj qilish, bufer eritmasi bilan yuvish va hujayralarni yo'q qilish uchun ultratovush bilan ishlov berishni o'z ichiga oladi. Olingan lizat santrifüjlanadi, buferdagi 3M karbamid eritmasi bilan yuviladi, buferdagi guanidin xlorid eritmasida eritiladi, ultratovush bilan ishlov beriladi, sentrifugalanadi, oksidlovchi sulfitoliz, 8 M karbamidga qarshi dializ, renaturatsiya va yakuniy ikki bosqichli xromatografiya. 52 tsellyuloza va Sephadex G-50 (RU 2054041). Ushbu usulning kamchiliklari izolyatsiya va tozalash jarayonining asosiy bosqichlarining nisbatan past mahsuldorligidir. Bu, ayniqsa, mahsulotni ultratovush bilan davolash, dializ va oksidlovchi sulfitolizga taalluqlidir, bu interferonning chiqarilishida beqarorlikka olib keladi, shuningdek, ushbu usuldan foydalanishning mumkin emasligi. sanoat ishlab chiqarish interferon.
Eng yaqin analog (prototip) sifatida inson leykotsitlari interferonini olish usuli ko'rsatilishi mumkin, bu E. coli rekombinant shtammini etishtirish, hosil bo'lgan biomassani -70 ° C dan yuqori bo'lmagan haroratda muzlatish, eritish, mikroorganizm hujayralarini yo'q qilishdan iborat. lizozim bilan, DNK va RNKni DNK lizatini kiritish orqali olib tashlash va interferonning ajratilgan erimaydigan shaklini yuvish vositalari bilan bufer eritmasi bilan yuvish, interferon cho'kmasini guanidin gidroxlorid eritmasida eritish, renaturatsiya va bir bosqichda tozalash. almashinish xromatografiyasi. Produser sifatida uchta promotorni o'z ichiga olgan pSS5 rekombinant plazmididan olingan E. coli SS5 shtammi ishlatiladi: P lac, P t7 va P trp va kiritilgan nukleotid o'rnini bosuvchi alfa-interferon geni.
Ushbu plazmidni o'z ichiga olgan E. coli SS5 shtammi tomonidan interferonning ekspressiyasi uchta promotor tomonidan boshqariladi: P lac, P t7 va P trp. Interferonni ifodalash darajasi 1 litr hujayra suspenziyasi uchun taxminan 800 mg (RU 2165455).
Ushbu usulning kamchiliklari mikroorganizmning hujayralarni, DNK va RNKlarini fermentativ yo'q qilish va interferonni bir bosqichli xromatografik tozalashdan foydalanishning past texnologik samaradorligidir. Bu interferonni chiqarish jarayonida beqarorlikni keltirib chiqaradi, uning sifatini pasayishiga olib keladi va interferonni sanoat ishlab chiqarish uchun yuqoridagi sxemadan foydalanish imkoniyatini cheklaydi. Ushbu plazmid va unga asoslangan shtammning kamchiliklari plazmidda E. coli shtammi BL21 (DE3)dagi T7 fagining kuchli tartibga solinmagan promouteridan foydalanish bo'lib, unda T7 RNK polimeraza geni promotor ostida joylashgan. lak operon va har doim "oqadigan". Binobarin, hujayrada interferon sintezi uzluksiz sodir bo'ladi, bu plazmidning dissotsiatsiyasiga va shtamm hujayralarining hayotiyligining pasayishiga olib keladi va natijada interferon unumining pasayishiga olib keladi.
Ushbu ixtironing maqsadi interferon biosintezining yuqori darajasiga ega yangi rekombinant plazmid DNK yordamida E. coli ning rekombinant sanoat ishlab chiqaruvchi shtammini yaratish va tibbiy maqsadlarda foydalanish uchun sifatli interferon moddasini ishlab chiqarishning samarali sanoat texnologiyasini ishlab chiqishdan iborat. interferon alfa-2b moddasi uchun "Yevropa farmakopeyasiga".
Bu muammo VKPM B-8550 raqamli Davlat genetika instituti Federal davlat unitar korxonasining Butunrossiya sanoat shtammlari kollektsiyasida saqlanadigan rekombinant plazmid DNK pSX50 va Escherichia coli SX50 shtammini yaratish orqali hal qilindi.
shuningdek, E. coli SX50 ning rekombinant shtammidan foydalanishga asoslangan va uni triptofan miqdori kamaygan ozuqa muhitida chuqur o'stirishni o'z ichiga olgan rekombinant alfa-2b interferonini ishlab chiqarish usuli. biosintez, mikroorganizm hujayralarini yuqori bosimda mexanik ravishda yo'q qilish, agregatlangan oqsilni guanidin gidroxloridning konsentrlangan eritmasida eritish, so'ngra xaotrop moddalar ishtirokida fiziologik bufer eritmalarida interferonni renaturatsiya qilish va bunday qatronlarda interferonni uch bosqichli xromatografik tozalash. Cu +2 ionlari bilan immobilizatsiya qilingan chelating Sepharose Fast Flow, CM Sepharose Fast Flow kabi ion almashinadigan qatronlarda ion almashinadigan xromatografiya va Superdex 75 kabi qatronlarda gel filtrlash xromatografiyasi.
Ixtiroga ko'ra, laktoza va triptofan promotorlari va transkripsiya terminatori nazorati ostida bo'lgan inson leykotsitlari alfa-2b interferonining sintezini kodlaydigan yangi rekombinant multikopiya plazmid DNKsi pSX50 taklif etiladi. Plazmid pSX50 3218 ta asosiy juftlik (bp) ga ega va quyidagi fragmentlarning mavjudligi bilan tavsiflanadi:
Nukleotid 1 dan nukleotid (nt) 176 gacha bo'lgan ketma-ketlik triptofan promouterini (P trp) o'z ichiga olgan 176 bp DNK fragmentini o'z ichiga oladi;
177 nt dan ketma-ketlik. 194 n gacha. tarjimaning boshlanishi uchun mas'ul Shine Delgarno ketma-ketligini o'z ichiga olgan 18 bp sintetik DNK fragmentini o'z ichiga oladi;
195 nt dan ketma-ketlik. 695 n gacha. 501 bp o'lchamdagi DNK fragmentini o'z ichiga oladi, interferon genining quyidagi nukleotidlar o'rnini bosuvchi ketma-ketligini o'z ichiga oladi: 37-pozitsiyada A ni C ga almashtirish, 39-pozitsiyada G ni T ga, 40-pozitsiyada A ni almashtirish C, 42-pozitsiyada, G ni T ga almashtirish, 67-pozitsiyada, A ni C bilan almashtirish, 69-pozitsiyada, G ni T bilan almashtirish, 70-pozitsiyada, A ni C bilan almashtirish, 72-pozitsiyada, A ni C bilan almashtirish. T, 96-pozitsiyada, G ni A bilan almashtirish, 100-pozitsiyada, A ni C bilan almashtirish, 102-da, A ni T bilan almashtirish, 114-pozitsiyada, A ni C bilan almashtirish, 120-pozitsiyada, C ni almashtirish G bilan, 126-pozitsiyada, G-ni A bilan almashtirish, 129-pozitsiyada, G-ni A bilan almashtirish, 330-da, C ni G bilan, 339-da, G o‘rnini A bilan, 342-da, Gni A bilan almashtirishda, 487-pozitsiyada A o‘rniga C, 489-pozitsiyada A o‘rniga T, 495-pozitsiyada G o‘rniga A;
696 nt dan ketma-ketlik. 713 n bo'yicha. sintetik polilinkerni o'z ichiga olgan 18 bp sintetik DNK fragmentini o'z ichiga oladi;
714 nt dan ketma-ketlik. 1138 n gacha. 4129 nt bo'lgan pKK223-3 plazmidining DNK fragmentini o'z ichiga oladi. 4553 n gacha. rrnBT 1 T 2 qat'iy transkripsiya terminatorining ketma-ketligini o'z ichiga olgan o'lchami 425 bp;
1139-yildan boshlab ketma-ketlik b. 1229 n gacha. 2487 nt bo'lgan pUC19 plazmidining DNK fragmentini o'z ichiga oladi. 2577 n gacha. 91 bp o'lchamda, b-laktomaza genining promouterini o'z ichiga oladi (ampitsillinga qarshilik geni - Amp R);
1230 n dan boshlab ketma-ketlik. 2045 n gacha. 720 nt bilan pUC4K plazmidining DNK fragmentini o'z ichiga oladi. 1535 yilgacha 816 bp hajmda, kan genining strukturaviy hududini o'z ichiga oladi;
2046 yildan boshlab ketma-ketlik b. 3218 n gacha. 1625 dan 453 nt gacha bo'lgan pUC19 plazmidining DNK fragmentini o'z ichiga oladi. 1173 bp o'lchamda, plazmid replikatsiyasi (ori) va lak promotori (P lak) uchun mas'ul bo'lgan ketma-ketlikni o'z ichiga oladi.
Shakllar 1-5 dizayn sxemalarini ko'rsatadi va jismoniy xarita pSH50 plazmidlari.
6-rasmda pSX50 plazmidi uchun aniqlangan to'liq nukleotidlar ketma-ketligi ko'rsatilgan.
SX50 shtammi Escherichia coli BL21 hujayralarini pSX50 plazmidi bilan an'anaviy tarzda o'zgartirish orqali olingan. genetik muhandislik texnologiyasi. E.Coli SX50 shtammi quyidagi xususiyatlar bilan tavsiflanadi.
Madaniy va morfologik xususiyatlar
Hujayralar mayda, toʻgʻri, qalinlashgan tayoqchali, gramm manfiy, sporasiz. Hujayralar oddiy oziq muhitida yaxshi rivojlanadi. Difko agarda o'sganda yumaloq, silliq, qavariq, loyqa, yaltiroq, qirrasi silliq bo'lgan kulrang koloniyalar hosil bo'ladi. Suyuq muhitda (glyukoza bilan minimal muhitda yoki LB bulonda) o'stirilganda, zich, bir xil loyqalik hosil bo'ladi.
Jismoniy va biologik xususiyatlar
Aerob. O'sish uchun harorat oralig'i 4-42 ° C, optimal pH 6,5-7,5.
Azot manbai sifatida ammiakli va nitrat shaklidagi mineral tuzlar, shuningdek, organik birikmalar aminokislotalar, pepton, tripton, xamirturush ekstrakti va boshqalar shaklida.
Uglerod manbai sifatida aminokislotalar, glitserin va uglevodlar ishlatiladi. Antibiotiklarga qarshilik. Hujayralar kanamitsinga qarshilik ko'rsatadi (100 mkg / ml gacha).
Escherichia coli shtammi 8X50 interferon ishlab chiqaruvchisi hisoblanadi.
Shtammni saqlash muhitining usuli, shartlari va tarkibi
L-arapeda kanamitsin qo'shilgan holda 20 mkg/ml konsentratsiyali moy ostida, L-bulonda 15% glitserin va tegishli antibiotiklar ampulalarda minus 70 ° C haroratda, liyofillangan holatda ampulalarda +4 ° C harorat.
Escherichia coli SX50 shtammi Bergey qo'llanmasiga (1974) ko'ra ichak tayoqchasi turlarining shtammi sifatida aniqlangan.
Alfa-2b interferonni sanoat ishlab chiqarish usuli
Taklif etilayotgan usulning o'ziga xos xususiyati interferonni fermentatsiya paytida to'plangan erimaydigan shakldan ajratib olishga imkon beradigan texnologiyani ishlab chiqishdir, bu esa sezilarli darajada soddalashtirishga imkon beradi. texnologik sxema izolyatsiyalash jarayoni va maqsadli mahsulotning hosildorligini oshirish.
Usul Escherichia coli SH50 shtammini ozuqaviy muhitda o'stirishdan iborat bo'lib, doimiy ravishda ozuqa substratlari, yaxshisi glyukoza va xamirturush ekstrakti, biosintez jarayonida, yaxshisi kamaytirilgan triptofan bilan, yuqori bosimda mikroorganizm hujayralarini mexanik ravishda yo'q qilish. 700-900 bar, interferonni guanidin gidroxloridning bufer eritmasida eritishi, xaotrop moddalar ishtirokida interferonning fiziologik bufer eritmalarida renaturatsiyasi, so'ngra Xelating Sepharose Fast Flow tipidagi Cuimmobilizatsiyalangan qatronlar bilan interferonni uch bosqichli xromatografik tozalash + 2 ion, CM Sepharose Fast Flow tipidagi ion almashinadigan qatronlarda ion almashinish xromatografiyasi va Superdex 75 kabi qatronlarda jel filtrlash xromatografiyasi.
Interferon ishlab chiqarishning alohida bosqichlarini o'tkazish uchun maqbul shartlar quyidagilardir:
Fermentatsiya butun jarayon davomida substratlarning uzluksiz qo'shilishi bilan amalga oshiriladi, bu aniqlaydi yuqori daraja interferon ifodasi;
Hujayralarni yo'q qilish Gaulin tipidagi parchalanuvchida 900 bar bosim ostida amalga oshiriladi;
Eriydigan hujayra komponentlarini (DNK, RNK, oqsillar, lipopolisakkaridlar va boshqalar) olib tashlash interferonning erimaydigan shaklini yuvish vositalarini (Triton XI00, karbamid va boshqalar) o'z ichiga olgan bufer eritmalar bilan yuvish orqali amalga oshiriladi;
Hosil bo'lgan interferonli cho'kma 6 M guanidin gidroxloridning bufer eritmasida eritiladi;
Interferonning renaturatsiyasi xaotropik moddalarni o'z ichiga olgan fiziologik tampon eritmasida amalga oshiriladi;
Interferonni uch bosqichli xromatografik tozalash Cu+2 ionlari bilan immobilizatsiya qilingan Chelating Sepharose Fast Flow da, kation almashinadigan SM Sepharose Fast Flow qatronida va Superdex 75 tipidagi smolada gel filtrlash xromatografiyasida amalga oshiriladi;
Har bir xromatografik tozalashdan so'ng, 0,22 mikron gözenek o'lchamlari bo'lgan pirogensiz filtrlar orqali sterilizatsiya filtrlash amalga oshiriladi.
Ta'riflangan usulni qo'llash natijasida interferonning unumi 1 litr madaniy muhit uchun taxminan 400-800 mg interferonni tashkil qiladi. Olingan mahsulot sifati alfa-2b interferon moddasi bo'yicha "Yevropa farmakopeyasi" standartlari va talablariga javob beradi.
Taklif etilgan usul va prototip o'rtasidagi sezilarli farqlar:
Biosintez jarayonida 1 litr madaniy muhitdan ko'proq miqdorda interferon olish imkonini beradigan yuqori mahsuldorlikka ega shtamm dizaynidan foydalanish;
Uyali biomassani samarali mexanik yo'q qilishdan foydalanish, bu esa ko'proq vaqt davomida interferonning erimaydigan shaklining toza ekstraktini olish imkonini beradi. qisqa vaqt, kamroq yo'qotishlar bilan;
Fiziologik bufer eritmalarini renaturatsiya jarayonida xaotrop moddalar ishtirokida qo'llash interferonning to'g'ri renaturatsiya qilingan shaklining hosildorligini oshirishga imkon beradi;
Interferonni uch bosqichli xromatografik tozalash jellarni kumush bilan bo'yashda va RF HPLC bo'yicha 98% dan ortiq va deyarli pirogenlardan xoli bo'lganida qaytaruvchi va qaytarmaydigan sharoitlarda elektroforez bo'yicha 99% dan ortiq tozalikdagi interferon moddasini olish imkonini beradi. (LAL testi).
Talab qilingan ixtirolar guruhining mohiyati va afzalliklari quyidagi misollar orqali ko'rsatilgan.
Misol 1. Rekombinant plazmid pSH50 ning qurilishi
pSX50 plazmidini yaratish usuli quyidagi bosqichlarni o'z ichiga oladi:
pSX10 vektor plazmidini qurish;
1. pSX3 plazmidining tuzilishi (2641 bp)
2. pSX10 vektor plazmidini qurish (2553 bp)
pSX41 rekombinant plazmidini qurish (3218 bp);
pSX43 rekombinant plazmidini qurish (3218 bp);
pSX45 rekombinant plazmidini qurish (3218 bp);
pSX50 rekombinant plazmidini qurish (3218 bp).
pSX10 vektor plazmidini qurish
pSX10 vektor plazmidi pUC19 vektor bo'lib, unda ampitsillinga qarshilik ko'rsatadigan beta-laktomaza genining kodlash ketma-ketligi kan genining kodlash ketma-ketligi bilan almashtiriladi va pKK223-3 plazmididan transkripsiya terminatorini o'z ichiga oladi.
pSS10 vektor plazmidini qurish ikki bosqichda amalga oshiriladi:
Plazmid pSX3 (2641 bp) ni tayyorlash, bu pUC19 plazmididir, bunda amp genining kodlash hududi kan genining kodlash hududi bilan almashtiriladi;
pSX10 vektor plazmidini (2553 bp) tayyorlash, bu pSX3 plazmidi bo'lib, unda rBT 1 T 2 transkripsiya terminatorini kodlovchi DNK fragmenti BamHI saytining orqasiga kiritilgan.
Plazmid pSX3 ni olish uchun DNKni kuchaytirishning besh bosqichi amalga oshiriladi. PCR usuli bilan(polimeraza zanjiri reaktsiyasi). Birinchi turda pUC19 plazmid DNK dan shablon sifatida foydalanilganda, hajmi 1828 bp bo'lgan DNK fragmenti kuchaytiriladi. (PU1-PU2 fragmenti) primerlar yordamida:
Bu va undan keyingi PCR reaksiyalari quyidagi sharoitlarda amalga oshiriladi: 20 mM Tis-HCl, pH 8,8, 10 mM (NH 4) 2 SO 4, 10 mM KCl, 2 tM MgCl 2, 0,1% Triton X100, 0,1 mg/ml BSA, har bir dNTP dan 0,2 mM, 1,25 birlik. Pfu DNK polimeraza, 100 ng DNK. Kuchaytirish jarayoni quyidagi bosqichlardan iborat: 95°C da 5 minut qizdirish, 35 PCR tsikli (30 sek 95°C, 30 sek 56°C, 2 min 72°C) va 72°C da 10 minut inkubatsiya. Amplifikatsiyadan so'ng (va keyingi kuchaytirilgandan keyin) DNK fragmenti 1% agaroz jelida elektroforez bilan tozalanadi. Ikkinchi va uchinchi turlarda pUC4K plazmid DNK dan shablon sifatida foydalanib, 555 bp DNK fragmenti kuchaytiriladi. (Fragment KM1-KM2) primerlar yordamida:
va 258 bp DNK fragmentini kuchaytirish. (KMZ-KM4) astarlardan
PCRning beshinchi bosqichida fragmentlar (PU1-PU2) va (KM1-KM4) quyidagi sharoitlarda birlashtiriladi: 95 ° C da 5 daqiqa davomida isitish, 5 PCR tsikli (30 sek 95 ° C, 30 sek 56 ° C) , 10 min 72°C) va 72°C da 10 minut inkubatsiya. Oxirgi PCRdan so'ng olingan DNK to'g'ridan-to'g'ri E. coli DH5 shtammi hujayralariga aylanadi va 20 mkg/ml kanamitsinni o'z ichiga olgan LA muhitiga qo'yiladi. 37°C da 12 soat davomida inkubatsiyadan so‘ng klonlar yo‘q qilinadi, plazmid DNK ajratiladi va cheklov tahlili o‘tkaziladi. Natijada, o'lchami 2641 bp bo'lgan pSX3 plazmidi olinadi.
pSX10 vektor plazmidini olish uchun PCR yordamida DNKni kuchaytirishning uch bosqichi amalga oshiriladi. Birinchi turda pSX3 plazmid DNK dan shablon sifatida foydalanib, 2025 bp DNK fragmenti kuchaytiriladi. (10.1-10.2 fragmentlari) primerlar yordamida:
Ikkinchi turda pKK223-3 plazmidining DNKsidan shablon sifatida foydalanib, 528 bp o'lchamdagi DNK fragmenti kuchaytiriladi. (KK1-KK2 fragmenti) astarlardan foydalangan holda:
PCRning uchinchi bosqichida fragmentlar (10.1-10.2) va (KK1-KK2) quyidagi sharoitlarda birlashtiriladi: 5 daqiqa davomida 95 ° C da isitish, 5 PCR tsikli (30 sek 95 ° C, 30 sek 56 ° C) , 10 min 72°C) va 72°C da 10 minut inkubatsiya. Oxirgi PCRdan so'ng olingan DNK to'g'ridan-to'g'ri E. coli shtammi DH5 hujayralariga aylanadi va 20 mkg / ml kanamitsinni o'z ichiga olgan LA muhitida qoplanadi. 37°C da 12 soat davomida inkubatsiyadan so‘ng klonlar yo‘q qilinadi, plazmid DNK ajratiladi va cheklov tahlili o‘tkaziladi. Natijada, o'lchami 2553 bp bo'lgan pSX10 plazmidi olinadi.
pSX41 rekombinant plazmidini qurish
pSX41 rekombinant plazmidi Hind III - BamHI DNK fragmenti pSX3 vektor plazmidi (2529 bp), Hind III - EcoRI DNK fragmenti 168 bp, E. coli triptofan operon (P trp) promotorini kodlovchi, EcoRI-XbaI a sintetik. SD ketma-ketligini (Shine-Delgarno) kodlovchi 20 bp DNK fragmenti va inson interferon alfa 2b genini kodlovchi 501 bp bo'lgan XbaI-BamHI DNK fragmenti.
pSX3 vektor plazmidining Hind III - BamHI DNK fragmentini (2529 bp) olish uchun pSX3 plazmidining DNKsi HindIII va BamHI cheklash fermentlari bilan ishlanadi, so'ngra 1% agaroz jelida elektroforetik tozalash amalga oshiriladi. Triptofan operon (P trp) promotorini kodlovchi 168 bp boʻlgan Hind III EcoRI DNK fragmenti shablon sifatida jami E. coli DNKsi va TRP1 va PRP2 primerlaridan foydalangan holda PCR orqali olinadi, soʻngra kuchaytirilgan fragment Hindll va EcoRI cheklovi bilan ishlov beriladi. fermentlar:
EcoRI-Xbal ni SD ketma-ketligini (Shine-Delgarno) kodlovchi 20 bp sintetik DNK fragmentini olish uchun quyidagi komplementar oligonukleotidlar sintezlanadi:
Odam alfa 2b interferon genini kodlovchi 501 bp hajmdagi XbaI-BamIII DNK fragmenti shablon sifatida jami inson DNKsi va IFN1 va IFN2 primerlaridan foydalangan holda PCR yo'li bilan olinadi, so'ngra kuchaytirilgan fragmentni Xbal va BamIII cheklash fermentlari bilan qayta ishlanadi:
Keyinchalik, elektroforetik tozalangan bo'laklar birlashtiriladi, T4 faj ligaza fermenti bilan bog'lanadi, DNK E. coli DH5 shtammi hujayralariga aylanadi va 20 mkg / ml kanamitsinni o'z ichiga olgan LA muhitiga qoplanadi. 37°C da 12 soat davomida inkubatsiyadan so‘ng klonlar yo‘q qilinadi, plazmid DNK ajratiladi, cheklanish tahlili o‘tkaziladi va birlamchi DNK tuzilishi aniqlanadi. Natijada 3218 bp kattalikdagi pSX41 plazmidi olinadi. Keyinchalik, maqsadli mahsulotning ifoda darajasini oshirish uchun interferon genining bosqichma-bosqich mutagenezi amalga oshiriladi. Interferon genining mutagenezi E. coli da kam uchraydigan, mos keladigan aminokislotalarni kodlovchi uchliklarni, koʻpincha E. coli da uchraydigan, bir xil aminokislotalarni kodlovchi tripletlarni almashtirishdan iborat. Interferon genining DNK mutagenezi PCR usuli yordamida amalga oshiriladi.
pSX43 rekombinant plazmidini qurish
pSX43 rekombinant plazmidini olish uchun DNKni kuchaytirishning bir bosqichi PCR yordamida pSX41 plazmidining DNKsidan shablon sifatida va IFN3 va IFN4 primerlari yordamida amalga oshiriladi:
PCR quyidagi sharoitlarda amalga oshiriladi: 95 ° C da 5 daqiqa davomida isitish, 20 PCR tsikli (30 sek 95 ° C, 30 sek 56 ° C, 10 min 72 ° C) va 72 ° C da 20 minut inkubatsiya. PCRdan so'ng olingan DNK to'g'ridan-to'g'ri E. coli DH5 shtammi hujayralariga aylanadi va 20 mkg / ml kanamitsinni o'z ichiga olgan LA muhitida qoplanadi. 37°C da 12 soat davomida inkubatsiyadan so‘ng klonlar yo‘q qilinadi, plazmid DNK ajratiladi, cheklanish tahlili o‘tkaziladi va birlamchi DNK tuzilishi aniqlanadi. Natijada, o'lchami 3218 bp bo'lgan pSX43 plazmidi olinadi.
pSX45 rekombinant plazmidini qurish
pSX45 rekombinant plazmidini olish uchun DNKni kuchaytirishning bir bosqichi PCR orqali pSX43 plazmidining DNKsidan shablon sifatida va IFN5 va IFN6 primerlaridan foydalangan holda amalga oshiriladi:
PCR quyidagi sharoitlarda amalga oshiriladi: 95 ° C da 5 daqiqa davomida isitish, 20 PCR tsikli (30 sek 95 ° C, 30 sek 56 ° C, 10 min 72 ° C) va 72 ° C da 20 minut inkubatsiya. PCRdan so'ng olingan DNK to'g'ridan-to'g'ri E. coli DH5 shtammi hujayralariga aylanadi va 20 mkg / ml kanamitsinni o'z ichiga olgan LA muhitida qoplanadi. 37°C da 12 soat davomida inkubatsiyadan so‘ng klonlar yo‘q qilinadi, plazmid DNK ajratiladi, cheklanish tahlili o‘tkaziladi va birlamchi DNK tuzilishi aniqlanadi. Natijada 3218 bp kattalikdagi pSX45 plazmidi olinadi.
pSX50 rekombinant plazmidini qurish.
pSX50 rekombinant plazmidini olish uchun DNKni kuchaytirishning bir bosqichi PCR orqali pSX45 plazmidining DNKsidan shablon sifatida va IFN7 va IFN8 primerlaridan foydalangan holda amalga oshiriladi:
PCR quyidagi sharoitlarda amalga oshiriladi: 95 ° C da 5 daqiqa davomida isitish, 20 PCR tsikli (30 sek 95 ° C, 30 sek 56 ° C, 10 min 72 ° C) va 72 ° C da 20 minut inkubatsiya. PCRdan so'ng olingan DNK to'g'ridan-to'g'ri E. coli DH5 shtammi hujayralariga aylanadi va 20 mkg / ml kanamitsinni o'z ichiga olgan LA muhitida qoplanadi. 37°C da 12 soat davomida inkubatsiyadan so‘ng klonlar yo‘q qilinadi, plazmid DNK ajratiladi, cheklanish tahlili o‘tkaziladi va birlamchi DNK tuzilishi aniqlanadi. Natijada 3218 bp kattalikdagi pSX50 plazmidi olinadi.
Misol 2. E. coli SX50 shtammini tayyorlash - interferon ishlab chiqaruvchisi
Interferon ishlab chiqaruvchi E. coli SX50 shtammi E. coli shtammi BL21 hujayralarini pSX50 rekombinant plazmidi bilan o'zgartirish orqali olinadi. Interferon ishlab chiqaruvchi shtamm 30 litrli fermentatorda optik zichligi 25,0-30,0 p.u.gacha yetishtiriladi. 1% kazein kislota gidrolizat (Difco), 1% glyukoza, 40 mkg/ml kanamitsinni o'z ichiga olgan M9 muhitida 38-39°C haroratda. Fermentatsiya jarayonida gravimetrik kontroller yordamida ozuqa substratining uzluksiz qo'shilishi amalga oshiriladi.
Misol 3. SX50 E. coli shtammidan interferonni ajratib olish usuli
Interferon 4 bosqichda olinadi:
1-bosqich. E. coli SX50 shtammini yetishtirish.
2-bosqich. Interferonning erimaydigan shaklini ajratish va tozalash.
3-bosqich. Interferonning erishi va renaturatsiyasi.
4-bosqich. Interferonni xromatografik tozalash.
1-bosqich. E. coli SX50 shtammini yetishtirish
E. coli SX50 shtammining 3 litr boy LB muhitida 12 soat davomida 26 ° C da o'stirilgan emlash aseptik tarzda M9, 1% kazein kislota gidrolizati, 1% glyukoza, 27 litr steril muhitni o'z ichiga olgan fermentatorga kiritiladi. 1 mM MgCl 2, 0,1 mM CaCl 2, 40 mg / ml kanamitsin. Fermentatorda kultivatsiya 40% natriy gidroksid eritmasi bilan avtomatik titrlash orqali pH 7±0,15 ni saqlab, 38-39°S haroratda amalga oshiriladi. To'yinganlikning (50±10)% oralig'ida erigan kislorod konsentratsiyasi aralashtirgichning tezligini 100 dan 800 rpm gacha va havo berishni 1 dan 15 l / min gacha o'zgartirish orqali saqlanadi. Substratlarning kontsentratsiyasi, xususan, glyukoza va xamirturush ekstrakti fermentatsiya paytida o'lchanadi va ularning konsentratsiyasi gravimetrik regulyator yordamida peristaltik nasoslar orqali konsentrlangan eritmalarni etkazib berish tezligini o'zgartirish orqali saqlanadi.
Interferonning erimaydigan shaklda to'planishi fazali kontrastli mikroskop, 15% poliakrilamid gel elektroforezi (SDS-PAAG) va teskari fazali yuqori samarali xromatografiya (RF HPLC) yordamida nazorat qilinadi. Maksimal optik zichlikka (~ 25-30 p.u.) erishilganda fermentatsiya to'xtatiladi va interferon sintezi to'xtaydi. Fermentatsiya oxirida madaniy suyuqlik oqim rotorida 5000-10000 rpm aylanish tezligida santrifüjlash orqali ajratiladi. Biomassa qadoqlangan plastik qoplar va minus 70 ° C da muzlatilgan.
2-bosqich. Interferonning erimaydigan shaklini ajratish va tozalash
E. coli SX50 shtammining 300-400 g muzlatilgan biomassasi 3000 ml 1-buferda (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 0,1% Triton X100) to'xtatiladi. Suspenziya Gaulin tipidagi oqim gomogenizatoridan o'tkaziladi, 900 bar bosimda saqlanadi va oqim rotorida 15000 aylanish tezligida santrifüj qilinadi. Olingan cho'kma shunga o'xshash sharoitda ketma-ket yuviladi buferlar 2 (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 3 M karbamid) va bufer 3 (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA) va nihoyat interferon. cho'kma 200 ml buferda to'xtatiladi 3. Bu holda, interferonning erimaydigan shaklini izolyatsiya qilish va tozalash vaqti 5 soatdan oshmaydi.
3-bosqich. Interferonning erishi va renaturatsiyasi
Oldingi bosqichda olingan interferonning erimaydigan shakli suspenziyasiga 6 M konsentratsiyaga quruq guanidin gidroxlorid qo'shing, 50 mM konsentratsiyaga ditiotreitol, 50 mM konsentratsiyaga Tris-HCl pH 8,0, NaCl - a. konsentratsiyasi 150 mM va Triton X100 konsentratsiyasi 0,1% gacha, 2 soat davomida xona haroratida inkubatsiya qilinadi erimagan material 0,22 mikron gözenek diametrli membranalar orqali filtrlash orqali ajratiladi.
Interferonning renaturatsiyasi hosil bo'lgan eritmani 100-200 marta bufer 4 (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA) bilan sekin suyultirish orqali amalga oshiriladi. Shundan so'ng, renaturatsiya aralashmasi 4-8 ° S haroratda 12-15 soat davomida doimiy aralashtirish bilan inkubatsiya qilinadi. Keyin magniy sulfat 1 mM konsentratsiyaga qo'shiladi va yig'ilgan material 0,22 mikron teshik diametri bo'lgan membranali filtr orqali filtrlash orqali sterilizatsiya qilinadi.
4-bosqich. Interferonni xromatografik tozalash
Interferonni xromatografik tozalash uch bosqichda amalga oshiriladi.
1. Olingan renaturatsiyalangan interferon avval Cu+2 ionlari bilan immobilizatsiyalangan Chelating Sepharose Fast Flow qatronida (Amersham Biosciences) yaqinlik xromatografiyasi yordamida tozalanadi. Buning uchun interferon eritmasi Cu +2 Chelating Sepharose Fast Flow bilan kolonkaga surtiladi va interferon 0,1 M bufer bilan elutsiya qilinadi. limon kislotasi pH 2,2.
2. Xromatografik tozalashning ikkinchi bosqichida interferon eritmasi CM Sepharose Fast Flow tipidagi kation almashinadigan qatronga (Amersham Biosciences) surtiladi va interferon eritmalar gradienti (0,0-0,5 M NaCl) bilan 50 mM lik eritmada elutiladi. Na (CH 3 COO) bufer, pH 5,5.
3. Interferonning monomerik shaklini interferonning polimer shakllari qoldiqlaridan tozalash interferonni tozalashning uchinchi bosqichida Superdex 75 qatronida (Amersham Biosciences) gel filtrlash orqali amalga oshiriladi. Xromatografiya 50 mM Na(CH 3 COO), pH 5,0, tarkibida 0,15 M NaCl bo'lgan buferda amalga oshiriladi.
Interferonni ajratib olish va tozalashning tavsiflangan usuli 10 litr madaniy muhitdan olingan biomassadan 7-10 kun davomida bir izolyatsiya siklida 4-8 g yuqori darajada tozalangan interferonni olish imkonini beradi. Olingan interferonning sifati "Yevropa farmakopeyasi" ning interferon alfa-2b moddasiga bo'lgan talablariga to'liq javob beradi, xususan:
Interferon konsentratsiyasi 2 × 10 8 IU / ml dan kam emas;
Interferonning o'ziga xos faolligi 2,0 × 10 8 IU / mg dan kam emas;
Jellarni kumush bilan bo'yashda kamaytiruvchi va qaytarilmaydigan sharoitlarda preparatning elektroforetik tozaligi kamida 99% ni tashkil qiladi;
Izolyatsiya qilingan interferonning izoelektrik nuqtasi pH 5,8-6,3 mintaqasida;
Izolyatsiya qilingan interferonning peptid xaritasi Evropa standartidagi interferon alfa 2b CRS uchun peptid xaritasidan tubdan farq qilmaydi;
Keltirilgan misollardan ko'rinib turibdiki, da'vo qilingan ixtirolar guruhi nisbatan sodda va ishonchli texnologiya yordamida yuqori mahsuldorlikka ega interferon alfa-2b olish imkonini beradi.
TALAB
1. Rekombinant inson alfa-2b interferonining sintezini kodlovchi pSX50 rekombinant plazmid DNKsi, uning o'lchami 3218 ta asosiy juftlik (bp) bo'lishi va quyidagi fragmentlardan iboratligi bilan tavsiflanadi: 1 dan 176 gacha nukleotidlar (bp) ketma-ketligi o'z ichiga oladi. triptofan promotorini (P trp) o'z ichiga olgan 176 bp bo'lgan DNK parchasi, 177 dan 194 nt gacha bo'lgan ketma-ketlik. tarjimaning boshlanishi uchun mas'ul bo'lgan Shine Delgarno ketma-ketligini o'z ichiga olgan 18 bp kattalikdagi sintetik DNK fragmentini o'z ichiga oladi, 195 dan 695 nt gacha. nukleotidlar almashinuvi bilan interferon alfa-2b genini o'z ichiga olgan 501 bp DNK fragmentini o'z ichiga oladi: 37 (A>C), 39 (G>T), 40 (A>C), 42 (G>T), 67 ( A> C), 69 (G>T), 70 (A>C), 72 (A>T), 96 (G>A), 100 (A>C), 102 (A>T), 114 (A >S) ), 120 (C>G), 126 (G>A), 129 (G>A), 330 (C>G), 339 (G>A), 342 (G>A), 487 (A> C) , 489 (A>T), 495 (G>A), 696 dan 713 nt gacha ketma-ketlik. 714 dan 1138 nt gacha bo'lgan ketma-ketlikda sintetik polilinkerni o'z ichiga olgan 18 bp sintetik DNK fragmentini o'z ichiga oladi. 4129 dan 4553 nt gacha bo'lgan pKK223-3 plazmidining DNK fragmentini o'z ichiga oladi. 425 bp o'lchamli, qat'iy transkripsiya terminatori rrnBT 1 T 2 ketma-ketligini, 1139 dan 1229 nt gacha bo'lgan ketma-ketlikni o'z ichiga oladi. 2487 dan 2577 nt gacha bo'lgan pUC19 plazmidining DNK fragmentini o'z ichiga oladi. 91 bp o'lchamda, -laktomaza genining promotorini o'z ichiga oladi (ampitsillin qarshilik geni -Amp R), 1230 dan 2045 nt gacha bo'lgan ketma-ketlik. 720 nt bilan pUC4K plazmidining DNK fragmentini o'z ichiga oladi. 1535 yilgacha 816 bp o'lchamda, kan genining strukturaviy hududini o'z ichiga oladi, ketma-ketlik 2046 bp. 3218 n gacha. 1625 dan 453 nt gacha bo'lgan pUC19 plazmidining DNK fragmentini o'z ichiga oladi. 1173 bp o'lchamda, plazmid replikatsiyasi (ori) va lak promotori (P lak) uchun mas'ul bo'lgan ketma-ketlikni o'z ichiga oladi.
2. 1-bandga muvofiq rekombinant plazmid bilan o'zgartirilgan Eschcerichia coli SX50 bakterial shtammi rekombinant inson leykotsitlari interferon alfa-2b ishlab chiqaruvchisi hisoblanadi.
3. Inson interferon alfa-2b ishlab chiqarish usuli, shu jumladan, 2-bandga muvofiq Escherichia coli SX5 shtammini biosintez jarayonida doimiy ravishda ozuqaviy substratlar qo'shilishi bilan oziq muhitida etishtirish, 700- bosim ostida mikroorganizm hujayralarini mexanik ravishda yo'q qilish. 900 bar, interferonni guanidin gidroxloridning bufer eritmasida eritish, xaotrop moddalar ishtirokida interferonni fiziologik bufer eritmalarida renaturatsiya qilish, Chelating Sepharose Fast Flow tipidagi qatronlarda interferonni uch bosqichli xromatografik tozalash, Cuion bilan almashinish +2 CM Sepharose Fast Flow tipidagi ion almashinadigan qatronlarda xromatografiya va Superdex 75 tipidagi qatronlarda jel filtrlash kromatografiyasi.
4. 3-bandga muvofiq usul bo'lib, unda etishtirish ozuqaviy substratlar, afzalroq glyukoza va xamirturush ekstrakti doimiy qo'shilishi bilan kamaytirilgan triptofanli ozuqa muhitida amalga oshiriladi.
5. Interferonni eritishdan oldin DNK, RNK, oqsillar, lipopolisaxaridlar, Triton XI 00, karbamid kabi yuvish vositalarini o'z ichiga olgan bufer eritmalar bilan yuvish, eruvchan hujayra komponentlarini olib tashlash yo'li bilan tozalanadi.
6. 3-bandga muvofiq usul bo'lib, unda har bir xromatografik tozalashdan so'ng, 0,22 mikron teshik o'lchamli filtrlar orqali sterilizatsiya filtrlash amalga oshiriladi.
Bilan olib borilgan klinik tadqiqotlarda keng ko'rsatmalar va dozalarning keng diapazoni bilan (haftasiga 6 million IU / m2 dan - tukli hujayrali leykemiya uchun; haftasiga 100 million IU / m2 gacha - melanoma uchun), eng ko'p uchraydigan nojo'ya hodisalar isitma, charchoq, Bosh og'rig'i, miyalji. Isitma va charchoq preparatni qo'llash to'xtatilgandan keyin 72 soat o'tgach yo'qoladi. Garchi isitma grippga o'xshash sindromning tez-tez interferon bilan davolashda uchraydigan alomati bo'lishi mumkin bo'lsa-da, boshqalarni istisno qilish uchun baholashni o'tkazish kerak. mumkin bo'lgan sabablar doimiy isitma.
Quyidagi xavfsizlik profili 4 dan keyin olingan klinik sinovlar Intron A monoterapiya sifatida yoki ribavirin bilan birgalikda 1 yil davomida qabul qilingan surunkali gepatit C bilan og'rigan bemorlarda. Barcha bemorlar haftasiga 3 marta 3 million IU Intron A olganlar.
2-jadvalda 1 yil davomida Intron A (yoki Intron A ni ribavirin bilan birgalikda) olgan, ilgari davolanmagan bemorlarda 10% dan ortiq yoki unga teng chastotada yuzaga keladigan noxush hodisalar ko'rsatilgan. Umuman olganda, kuzatilgan noxush hodisalar engil yoki o'rtacha darajada edi.
2-jadval.
| Salbiy hodisalar | Intron A (n=806) | Intron A + ribavirin (n=1010) |
| Mahalliy reaktsiyalar | ||
| Yallig'lanish reaktsiyalari in'ektsiya joyida | 9–16% | 6–17% |
| Inyeksiya joyidagi boshqa reaktsiyalar | 5–8% | 3–36% |
| Umumiy reaktsiyalar | ||
| Bosh og'rig'i | 51–64% | 48–64% |
| Charchoq | 42–79% | 43–68% |
| Sovuq | 15–39% | 19–41% |
| Isitma | 29–39% | 29–41% |
| Grippga o'xshash sindrom | 19–37% | 18–29% |
| Asteniya | 9–30% | 9–30% |
| Ozish | 6–11% | 9–19% |
| Oshqozon-ichak traktidan reaktsiyalar | ||
| Ko'ngil aynishi | 18–31% | 25–44% |
| Anoreksiya | 14–19% | 19–26% |
| Diareya | 12–22% | 13–18% |
| Qorin og'rig'i | 9–17% | 9–14% |
| Kusish | 3–10% | 6–10% |
| Mushak-skelet tizimidan reaktsiyalar | ||
| Mialgiya | 41–61% | 30–62% |
| Artralgiya | 25–31% | 21–29% |
| Suyaklar va mushaklardagi og'riq | 15–20% | 11–20% |
| Markaziy asab tizimidan reaktsiyalar | ||
| Depressiya | 16–36% | 25–34% |
| Achchiqlanish | 13–27% | 18–34% |
| Uyqusizlik | 21–28% | 33–41% |
| Anksiyete | 8–12% | 8–16% |
| Diqqatni jamlash qobiliyatining buzilishi | 8–14% | 9–21% |
| Hissiy labillik | 8–14% | 5–11% |
| Teri reaktsiyalari | ||
| Alopesiya | 22–31% | 26–32% |
| Qichishish | 6–9% | 18–37% |
| Quruq teri | 5–8% | 5–7% |
| Toshma | 10–21% | 15–24% |
| Tashqi tomondan reaktsiyalar nafas olish tizimi | ||
| Faringit | 3–7% | 7–13% |
| Yo'tal | 3–7% | 8–11% |
| Nafas qisilishi | 2–9% | 10–22% |
| Boshqalar | ||
| Bosh aylanishi | 8–18% | 10–22% |
| Virusli infektsiya | 0–7% | 3–10% |
bo'lgan bemorlarda kuzatilgan noxush hodisalar virusli gepatit C, rivojlanish chastotasining dozaga bog'liq bo'lgan boshqa ko'rsatkichlar uchun Intron A dan foydalanishda qayd etilganlarga mos keladi.
Intron A dan boshqa ko'rsatmalar uchun foydalanilganda (klinik va klinik bo'lmagan tadqiqotlarda) kamdan-kam hollarda (|1/10000,< 1/1000) или очень редко (.
Umuman tanadan. Juda kamdan-kam hollarda - yuzning shishishi.
Astenik sharoitlar (asteniya, bezovtalik va charchoq), suvsizlanish, yurak urishi, toshbaqa kasalligi, qo'ziqorin infektsiyasi va bakterial infektsiya(shu jumladan sepsis).
Immunitet tizimidan. Juda kamdan-kam hollarda - sarkoidoz yoki uning kuchayishi.
Alfa-interferonlarni qo'llashda turli xil otoimmün va immun tizimi vositachiligidagi buzilishlar, jumladan idiopatik yoki trombotik trombotsitopenik purpura, revmatoid artrit, tizimli qizil yuguruk, vaskulit va Vogt-Koyanagi-Harada sindromi haqida xabar berilgan.
Holatlar haqida xabar berilgan o'tkir reaktsiyalar yuqori sezuvchanlik, shu jumladan ürtiker, anjiyoödem va anafilaksi.
Tomonidan yurak-qon tomir tizimi: kamdan-kam hollarda - aritmiya (odatda yurak-qon tomir tizimining oldingi kasalliklari bo'lgan yoki oldingi kardiotoksik terapiya bilan og'rigan bemorlarda paydo bo'lgan), vaqtinchalik qaytariladigan kardiyomiyopatiya (yurak-qon tomir tizimining og'ir tarixi bo'lmagan bemorlarda qayd etilgan); juda kam - arterial gipotenziya, miyokard ishemiyasi va miyokard infarkti.
Markaziy asab tizimidan va periferik asab tizimi. Kamdan-kam hollarda - o'z joniga qasd qilish tendentsiyalari; kamdan kam - tajovuzkor xatti-harakatlar, shu jumladan, boshqa odamlarga qaratilgan, o'z joniga qasd qilishga urinishlar, o'z joniga qasd qilish, psixoz (shu jumladan gallyutsinatsiyalar), ongning buzilishi, neyropatiya, polineyropatiya, ensefalopatiya, serebrovaskulyar ishemiya, miya qon tomirlarining qon ketishi, periferik neyropatiya, konvulsiyalar.
Eshitish organi tomonidan. Juda kamdan-kam hollarda - eshitish halokati.
Endokrin tizimdan. Juda kamdan-kam hollarda - diabetes mellitus, mavjud bo'lganlarning yomonlashishi qandli diabet.
Oshqozon-ichak traktidan. Juda kamdan-kam hollarda - pankreatit, ishtahani kuchayishi, milklarning qon ketishi, kolit.
Jigar va o't yo'llaridan. Juda kamdan-kam hollarda - gepatotoksisite (shu jumladan halokatli).
Tishlar va periodontitdagi o'zgarishlar. Nitron A va ribavirin bilan kombinatsiyalangan terapiyani olgan bemorlarda mavjud patologik o'zgarishlar tish va periodontitdan. Uzoq vaqt davomida quruq og'iz kombinatsiyalangan terapiya Ribavirin va Intron A tish va og'iz shilliq qavatining shikastlanishiga hissa qo'shishi mumkin. Bemorlar kuniga ikki marta tishlarini yuvishlari va muntazam ravishda stomatologik tekshiruvdan o'tishlari kerak. Bundan tashqari, ba'zi bemorlarda qusish kuzatilishi mumkin.
Metabolizm tomondan. Kamdan kam hollarda - giperglikemiya, gipertrigliseridemiya.
Tayanch-harakat tizimidan. Kamdan kam - rabdomiyoliz (ba'zan og'ir), oyoq kramplari, bel og'rig'i, miyozit.
Teri tomondan. Juda kamdan-kam hollarda - eritema multiforme, Stivens-Jonson sindromi, toksik epidermal nekroliz, in'ektsiya joyida nekroz.
Nafas olish tizimidan. kamdan-kam hollarda - pnevmoniya; juda kamdan-kam hollarda - o'pka infiltrati, pnevmonit.
Siydik chiqarish tizimidan. Kamdan kam - nefrotik sindrom, buyrak funktsiyasining buzilishi, buyrak etishmovchiligi.
Gematopoetik tizimdan. Juda kamdan-kam hollarda, Intron A ni monoterapiya sifatida yoki ribavirin bilan birgalikda qo'llashda aplastik anemiya va to'liq qizil aplaziya kuzatildi. ilik.
Ko'rish organi tomonidan. Kamdan-kam hollarda - retinal qon ketish, fundusdagi fokal o'zgarishlar, retinal arteriyalar va tomirlarning trombozi, ko'rish keskinligining pasayishi, ko'rish maydonining pasayishi, nevrit optik asab, papilla shishi.
Klinik jihatdan sezilarli o'zgarishlar laboratoriya ko'rsatkichlari.(ko'pincha preparat kuniga 10 million IU dan ortiq dozalarda buyurilganda kuzatiladi) - granulotsitlar va leykotsitlar sonining kamayishi, gemoglobin darajasi va trombotsitlar sonining pasayishi, ishqoriy fosfataza, LDH faolligining oshishi. , kreatinin va sarum karbamid azot darajasi. Qon plazmasida ALT va AST faolligining oshishi gepatitdan tashqari barcha ko'rsatkichlar uchun qo'llanilganda, shuningdek, HBV DNKsi yo'qligida surunkali gepatit B bo'lgan ba'zi bemorlarda patologik sifatida qayd etiladi.
Agar biron bir ko'rsatma bo'yicha Intron A dan foydalanish paytida noxush hodisalar yuzaga kelsa, nojo'ya hodisalar bartaraf etilmaguncha dozani kamaytirish yoki davolanishni vaqtincha to'xtatish kerak. Agar etarli dozalash rejimiga doimiy yoki takroriy intolerans rivojlansa yoki kasallik rivojlansa, Intron A terapiyasini to'xtatish kerak. Preparatni parenteral yuborish bilan titroq, isitma, charchoq, bosh og'rig'i, bezovtalik va grippga o'xshash sindrom mumkin. Ushbu nojo'ya ta'sirlar qisman paratsetamol yoki indometazin bilan bartaraf etiladi.
Da mahalliy dastur preparatning ko'zning shilliq qavatiga tushishi, kon'yunktiva infektsiyasi, ko'zning shilliq qavatining giperemiyasi, bitta follikullar, pastki forniks kon'yunktivasining shishishi mumkin.
Preparatni qo'llashda leykopeniya, limfopeniya, trombotsitopeniya, alanin aminotransferaza, gidroksidi fosfataza darajasining oshishi bilan namoyon bo'ladigan normal laboratoriya ko'rsatkichlaridan chetga chiqish mumkin. Terapiya davomida bu og'ishlarni o'z vaqtida aniqlash uchun, umumiy klinik testlar qon testlari har 2 haftada va biokimyoviy testlar har 4 haftada takrorlanishi kerak. Umuman olganda, bu o'zgarishlar odatda kichik, asemptomatik va qaytarilmasdir.
Interferon beta ning yon ta'siri.
Leykopeniya. Trombotsitopeniya. Anemiya. Otoimmün gemoliz. Anoreksiya. Diareya. Transaminaza darajasining oshishi. Gipotenziya. Taxikardiya. Nafas qisilishi. Bosh aylanishi. Uyqu buzilishi. Suyak va bo'g'imlarda og'riq. Isitma. Zaiflik. Mialgiya. Bosh og'rig'i. Ko'ngil aynishi. qusish; uzoq muddatli foydalanish bilan - soch to'kilishi.Ushbu bo'lim taqdim etadi alfa 2b va alfa 2a interferonlarini qo'llash bo'yicha ko'rsatmalar birinchi avlod, ular chiziqli, oddiy yoki qisqa muddatli deb ham ataladi. Ushbu preparatlarning yagona afzalligi ularning nisbatan past narxidir.
1943 yilda V. va J. Xeyle interferensiya deb ataladigan hodisani kashf etdilar. Interferonning dastlabki g'oyasi bu edi: viruslarning ko'payishiga to'sqinlik qiluvchi omil. 1957 yilda ingliz olimi Alik Isaacs va shveytsariyalik tadqiqotchi Jan Lindenman bu omilni ajratib, aniq tasvirlab berdilar va uni interferon deb atadilar.
Interferon (IFN) inson tanasida ishlab chiqariladigan oqsil molekulasidir. Inson genetik apparati uning sintezi (interferon geni) uchun "retsept" ni kodlaydi. Interferon sitokinlardan biri bo'lib, o'ynaydigan signal molekulalaridan biridir muhim rol immun tizimining faoliyatida.
IFN kashf etilganidan beri yarim asr davomida ushbu oqsilning o'nlab xususiyatlari o'rganildi. Tibbiyot nuqtai nazaridan, asosiylari antiviral va antitumor funktsiyalari.
Inson tanasi 20 ga yaqin turdagi interferonlarni ishlab chiqaradi - butun oila. IFN ikki turga bo'linadi: I va II.
I turdagi IFNlar - alfa, beta, omega, teta - viruslar va boshqa ba'zi agentlarning ta'siriga javoban tananing aksariyat hujayralari tomonidan ishlab chiqariladi va chiqariladi. II toifa IFNga chet el agentlarining ta'siriga javoban immun tizimining hujayralari tomonidan ishlab chiqariladigan interferon gamma kiradi.
Dastlab, interferon preparatlari faqat donor qon hujayralaridan olingan; Ular shunday deb nomlangan: leykotsitlar interferonlari. 1980 yilda rekombinant yoki genetik jihatdan yaratilgan interferonlar davri boshlandi. Rekombinant dori vositalarini ishlab chiqarish inson donor qoni yoki boshqa biologik xom ashyolardan shu kabi dori vositalarini ishlab chiqarishga qaraganda ancha arzonlashdi; ishlab chiqarishda foydalanilmaydi donor qoni infektsiya manbai bo'lib xizmat qilishi mumkin. Rekombinant dorilar begona aralashmalarni o'z ichiga olmaydi va shuning uchun kamroq bo'ladi yon effektlar. Ularning shifobaxsh potentsiali shunga o'xshash tabiiy dorilarga qaraganda yuqori.
Virusli kasalliklarni, xususan gepatit C ni davolash uchun asosan interferon alfa (IFN-a) qo'llaniladi. "Oddiy" ("qisqa muddatli") interferonlar alfa 2b va alfa 2a va pegilatlangan (peginterferon alfa-2a va peginterferon alfa-2b) mavjud. "Oddiy" interferonlar Evropa Ittifoqi va AQShda deyarli qo'llanilmaydi, ammo bizning mamlakatimizda nisbatan arzonligi tufayli ular juda tez-tez ishlatiladi. Gepatit C ni davolashda "qisqa" IFN-a ning ikkala shakli qo'llaniladi: interferon alfa-2a va interferon alfa-2b (bir aminokislota bilan farqlanadi). Oddiy interferonlar bilan in'ektsiya odatda har kuni amalga oshiriladi (peginterferonlar bilan - haftada bir marta). Qisqa muddatli IFN bilan davolashning samaradorligi peginterferonlarga qaraganda pastroq. Ba'zi mutaxassislar har kuni "oddiy" IFN in'ektsiyasini tavsiya qiladilar, chunki AVT samaradorligi biroz yuqoriroq.
"Qisqa" IFN diapazoni juda keng. Ular ozod qilinadi turli ishlab chiqaruvchilar tomonidan ostida turli nomlar: Roferon-A, Intron A, Laferon, Reaferon-EC, Realdiron, Eberon, Interal, Altevir, Alfarona va boshqalar.
Eng ko'p o'rganilgan (va shuning uchun qimmat) Roferon-A va Intron-A. Ushbu IFNlarni ribavirin bilan birgalikda davolash samaradorligi, virusning genotipiga va boshqa omillarga qarab, 30% dan 60% gacha. Asosiy ro'yxati brendlar Oddiy interferonlarni ishlab chiqaruvchilar va ularning tavsiflari jadvalda keltirilgan.
Barcha interferonlar muzlatgichda (+2 dan +8 darajagacha) saqlanishi kerak. Ular qizdirilmasligi yoki muzlatilmasligi kerak. Preparatni silkitmang yoki to'g'ridan-to'g'ri ta'sir qilmang quyosh nurlari. Dori vositalarini maxsus idishlarda tashish kerak.
modda-eritma: paketlar Reg. No .: LSR-007009/08
Klinik va farmakologik guruh:
Chiqarish shakli, tarkibi va qadoqlanishi
modda - yechim.
shishalar (1) - karton paketlar.
Preparatning faol komponentlarining tavsifi " Interferon alfa-2b»
farmakologik ta'sir
Interferon. Bu molekulyar og'irligi 19300 dalton bo'lgan yuqori darajada tozalangan rekombinant oqsildir. Escherichia coli klonidan bakterial plazmidlarni interferon sintezini kodlovchi inson leykotsitlari geni bilan gibridlash orqali olingan. Interferondan farqli o'laroq, alfa-2a 23-pozitsiyada argininga ega.
Antiviral ta'sirga ega, bu o'ziga xos membrana retseptorlari bilan o'zaro ta'sir qilish va RNK sintezini induktsiya qilish va oxir-oqibat, oqsillar bilan bog'liq. Ikkinchisi, o'z navbatida, virusning normal ko'payishini yoki uning tarqalishini oldini oladi.
Fagotsitozning faollashishi, antikorlar va limfokinlarning shakllanishini rag'batlantirish bilan bog'liq bo'lgan immunomodulyatsion faollikka ega.
O'simta hujayralariga antiproliferativ ta'sir ko'rsatadi.
Ko'rsatkichlar
O'tkir gepatit B, surunkali gepatit B, surunkali gepatit C.
Tukli hujayrali leykemiya, surunkali miyeloid leykemiya, buyrak hujayrali karsinoma, OITS tufayli Kaposi sarkomasi, terining T-hujayrali limfomasi (mikoz fungoides va Sezar sindromi), malign melanoma.
Dozalash tartibi
Vena ichiga yoki teri ostiga kiritiladi. Doza va davolash sxemasi ko'rsatmalarga qarab individual ravishda belgilanadi.
Yon ta'siri
Grippga o'xshash alomatlar: tez-tez - isitma, titroq, suyaklar, bo'g'imlar, ko'zlardagi og'riqlar, miyalji, bosh og'rig'i, terlashning kuchayishi, bosh aylanishi.
Tomonidan ovqat hazm qilish tizimi: mumkin bo'lgan ishtahani yo'qotish, ko'ngil aynishi, qusish, diareya, ich qotishi, bezovtalik ta'm sezgilari, quruq og'iz, vazn yo'qotish, engil qorin og'rig'i, jigar funktsiyasi testlarida engil o'zgarishlar (odatda davolanishdan keyin normallashadi).
Markaziy asab tizimi va periferik asab tizimidan: kamdan-kam hollarda - bosh aylanishi, aqliy faoliyatning yomonlashishi, uyqu buzilishi, xotira buzilishi, tashvish, asabiylashish, tajovuzkorlik, eyforiya, depressiya (keyin). uzoq muddatli davolash), paresteziya, neyropatiya, tremor; ba'zi hollarda - o'z joniga qasd qilish tendentsiyalari, uyquchanlik.
Yurak-qon tomir tizimidan: mumkin - taxikardiya (isitma bilan), arterial gipotenziya yoki gipertenziya, aritmiya; ba'zi hollarda - yurak-qon tomir tizimining buzilishi, koronar arteriya kasalligi, miyokard infarkti.
Nafas olish tizimidan: kamdan-kam hollarda - ko'krak og'rig'i, yo'tal, engil nafas qisilishi; ba'zi hollarda - pnevmoniya, o'pka shishi.
Gematopoetik tizimdan: engil leykopeniya, trombotsitopeniya, granulotsitopeniya mumkin.
Dermatologik reaktsiyalar: mumkin bo'lgan qichishish, qaytariladigan alopesiya.
Boshqa: kamdan-kam hollarda - mushaklarning qattiqligi; alohida holatlarda - tabiiy yoki rekombinant interferonlarga antikorlar.
Qo'llash mumkin bo'lmagan holatlar
Og'ir yurak-qon tomir kasalliklari, dekompensatsiyalangan jigar sirrozi, og'ir depressiya, psixoz, alkogol yoki giyohvandlik, sezuvchanlikning oshishi interferon alfa-2b uchun.
Homiladorlik va laktatsiya
Homiladorlik paytida foydalanish faqat ona uchun terapiyadan kutilayotgan foyda homila uchun potentsial xavfdan yuqori bo'lgan taqdirdagina mumkin.
Interferon alfa-2b ajralib chiqadimi yoki yo'qmi noma'lum ona suti. Agar laktatsiya davrida uni qo'llash zarur bo'lsa, emizishni to'xtatish masalasi hal qilinishi kerak.
Tug'ish yoshidagi ayollar davolanish vaqtida ishonchli kontratseptsiya vositalaridan foydalanishlari kerak.
Jigar disfunktsiyasi uchun foydalaning
Dekompensatsiyalangan jigar sirrozida kontrendikedir. Jigar funktsiyasi buzilgan bemorlarda ehtiyotkorlik bilan foydalaning.
Buyrak etishmovchiligi uchun foydalaning
Buyrak funktsiyasi buzilgan bemorlarda ehtiyotkorlik bilan foydalaning.
maxsus ko'rsatmalar
Buyrak, jigar, suyak iligi gematopoezi buzilgan yoki o'z joniga qasd qilishga urinish tendentsiyasi bo'lgan bemorlarda ehtiyotkorlik bilan foydalaning.
Yurak-qon tomir tizimi kasalliklari bo'lgan bemorlarda aritmiya bo'lishi mumkin. Agar aritmiya kamaymasa yoki ko'paysa, dozani 2 marta kamaytirish yoki davolanishni to'xtatish kerak.
Davolash davrida nevrologik va ruhiy holatni kuzatish kerak.
Suyak iligi gematopoezini jiddiy bostirish holatlarida periferik qon tarkibini muntazam tekshirish kerak.
Interferon alfa-2b immunitet tizimiga ogohlantiruvchi ta'sir ko'rsatadi va otoimmün reaktsiyalar xavfi ortishi sababli otoimmün kasalliklarga moyil bo'lgan bemorlarda ehtiyotkorlik bilan qo'llanilishi kerak.
Dori vositalarining o'zaro ta'siri
Dori vositalarining o'zaro ta'siri
Interferon alfa-2b teofillinning metabolizmini inhibe qiladi va uning klirensini kamaytiradi.
