Metoda wzorców (rozwiązania standardowe)
Stosując metodę pojedynczego wzorca, wielkość sygnału analitycznego (w ST) mierzy się najpierw dla roztworu o znanym stężeniu substancji (Cst). Następnie mierzy się wielkość sygnału analitycznego (y x) dla roztworu o nieznanym stężeniu substancji (C x). Obliczenia przeprowadza się według wzoru
C x = C st ×y x / y ST (2.6)
Tę metodę obliczeń można zastosować, jeśli zależność sygnału analitycznego od stężenia opisuje się równaniem niezawierającym wyrazu wolnego, tj. równanie (2.2). Ponadto stężenie substancji w roztworze wzorcowym musi być takie, aby wartości sygnałów analitycznych otrzymanych przy użyciu roztworu wzorcowego i roztworu o nieznanym stężeniu substancji były jak najbardziej zbliżone do siebie.
Niech gęstość optyczna i stężenie pewnej substancji zostaną powiązane równaniem A = 0,200C + 0,100. W wybranym roztworze wzorcowym stężenie substancji wynosi 5,00 µg/ml, a gęstość optyczna tego roztworu wynosi 1,100. Roztwór o nieznanym stężeniu ma gęstość optyczną 0,300. W przypadku obliczenia metodą krzywej kalibracyjnej nieznane stężenie substancji będzie wynosić 1,00 μg/ml, a w przypadku obliczenia przy użyciu jednego roztworu wzorcowego będzie to 1,36 μg/ml. Oznacza to, że stężenie substancji w roztworze wzorcowym zostało wybrane nieprawidłowo. Do określenia stężenia należy przyjąć roztwór wzorcowy, którego gęstość optyczna jest bliska 0,3.
Jeżeli zależność sygnału analitycznego od stężenia substancji opisuje równanie (2.1), wówczas preferuje się stosowanie metody nie jednego wzorca, lecz dwóch wzorców (metody ograniczania roztworów). Metodą tą mierzy się wartości sygnałów analitycznych dla roztworów wzorcowych o dwóch różnych stężeniach substancji, z których jedno (C 1) jest mniejsze od oczekiwanego nieznanego stężenia (C x), a drugie (C 2) jest wspanialszy. Nieznane stężenie oblicza się za pomocą wzorów
Cx = C 2 (y x - y 1) + C 1 (y 2 – y x) / y 2 - y 1
Metodę addytywną stosuje się zwykle w analizie złożonych matryc, gdy składniki matrycy wpływają na wielkość sygnału analitycznego i nie ma możliwości dokładnego odtworzenia składu matrycy próbki.
Istnieje kilka odmian tej metody. Stosując metodę obliczania dodatków, w pierwszej kolejności mierzy się wartość sygnału analitycznego dla próbki o nieznanym stężeniu substancji (y x). Następnie do tej próbki dodaje się określoną ilość analitu (wzorzec) i ponownie mierzy się wartość sygnału analitycznego (ext). Stężenie oznaczanego składnika w analizowanej próbce oblicza się ze wzoru
C x = C to6 y x / y ext – y x (2,8)
Stosując graficzną metodę dodatków, pobiera się kilka identycznych porcji (podwielokrotności) analizowanej próbki i do jednej z nich nie dodaje się żadnego dodatku, a do reszty dodaje się różne dokładne ilości oznaczanego składnika. Dla każdej porcji mierzy się wielkość sygnału analitycznego. Następnie konstruuje się wykres charakteryzujący liniową zależność wielkości odbieranego sygnału od stężenia dodatku i ekstrapoluje go do przecięcia z osią odciętych. Odcinek odcięty tą prostą na osi odciętych jest równy nieznanemu stężeniu oznaczanej substancji.
Należy zaznaczyć, że wzór (2.8) zastosowany w metodzie addytywnej, jak i rozważana wersja metody graficznej, nie uwzględniają sygnału tła, tj. uważa się, że zależność opisuje równanie (2.2). Metodę roztworu standardowego i metodę addytywną można stosować tylko wtedy, gdy funkcja kalibracji jest liniowa.
W jedna standardowa metoda rozwiązania zmierzyć wartość sygnału analitycznego (y st) dla roztworu o znanym stężeniu substancji (C st). Następnie mierzy się wielkość sygnału analitycznego (y x) dla roztworu o nieznanym stężeniu substancji (C x).
Tę metodę obliczeń można zastosować, jeśli zależność sygnału analitycznego od stężenia opisuje się równaniem liniowym bez składnika wolnego. Stężenie substancji w roztworze wzorcowym musi być takie, aby wartości sygnałów analitycznych otrzymanych przy stosowaniu roztworu wzorcowego i roztworu o nieznanym stężeniu substancji były jak najbardziej zbliżone do siebie.
W metoda dwóch rozwiązań standardowych mierzyć wartości sygnałów analitycznych dla roztworów wzorcowych o dwóch różnych stężeniach substancji, z których jedno (C 1) jest mniejsze niż oczekiwane nieznane stężenie (C x), a drugie (C 2) jest większe.
Lub 
Metodę dwóch roztworów wzorcowych stosuje się, jeśli zależność sygnału analitycznego od stężenia opisuje się równaniem liniowym, które nie przechodzi przez początek układu współrzędnych.
Przykład 10.2.Do oznaczenia nieznanego stężenia substancji zastosowano dwa roztwory wzorcowe: stężenie substancji w pierwszym z nich wynosiło 0,50 mg/l, a w drugim 1,50 mg/l. Gęstości optyczne tych roztworów wynosiły odpowiednio 0,200 i 0,400. Jakie jest stężenie substancji w roztworze, którego gęstość optyczna wynosi 0,280?
Metoda addytywna
Metodę addytywną stosuje się zwykle w analizie złożonych matryc, gdy składniki matrycy wpływają na wielkość sygnału analitycznego i nie ma możliwości dokładnego odtworzenia składu matrycy próbki. Ta metoda można zastosować tylko wtedy, gdy wykres kalibracji jest liniowy i przechodzi przez początek układu współrzędnych.
Za pomocą metoda obliczania dodatków Najpierw mierzy się wielkość sygnału analitycznego dla próbki o nieznanym stężeniu substancji (y x). Następnie do tej próbki dodaje się określoną ilość analitu i ponownie mierzy się wartość sygnału analitycznego (y ext).
Jeśli to konieczne, należy wziąć pod uwagę rozcieńczenie roztworu
Przykład 10.3. Roztwór początkowy o nieznanym stężeniu substancji miał gęstość optyczną 0,200. Po dodaniu 5,0 ml roztworu o stężeniu tej samej substancji 2,0 mg/l do 10,0 ml tego roztworu gęstość optyczna roztworu osiągnęła wartość 0,400. Określ stężenie substancji w roztworze pierwotnym.
= 0,50 mg/l
Ryż. 10.2. Graficzna metoda dodatków
W graficzna metoda dodatków pobrać kilka porcji (podwielokrotności) analizowanej próbki, do jednej z nich nie dodawać żadnych dodatków, a do reszty dodawać różne dokładne ilości oznaczanego składnika. Dla każdej porcji mierzy się wielkość sygnału analitycznego. Następnie uzyskuje się liniową zależność wielkości odbieranego sygnału od stężenia dodatku i ekstrapoluje ją aż do przecięcia się z osią x (rys. 10.2). Odcinek odcięty tą prostą na osi odciętych będzie równy nieznanemu stężeniu oznaczanej substancji.Metodę można zastosować w liniowych obszarach krzywej kalibracyjnej.
2.1. Metoda wielokrotnego dodawania
Do roztworu badawczego, przygotowanego zgodnie z monografią farmakopei prywatnej, wprowadza się kilka (co najmniej trzy) porcji objętości Vst. roztworze o znanym stężeniu oznaczanego jonu, przestrzegając warunku stałej siły jonowej w roztworze. Zmierz potencjał przed i po każdym dodaniu i oblicz różnicę ∆E pomiędzy zmierzonymi wartościami
potencjał i potencjał rozwiązania testowego. Otrzymana wartość jest związana ze stężeniem jonu określonym równaniem:
gdzie: V – objętość badanego roztworu;
C oznacza stężenie molowe jonu oznaczanego w roztworze testowym;
Zbuduj wykres w zależności od objętości dodatku Vst. i ekstrapolować otrzymaną linię prostą aż do przecięcia się z osią X. W punkcie przecięcia stężenie oznaczanego jonu w roztworze testowym wyraża się równaniem:
2.2. Metoda pojedynczego dodawania
Do objętości V badanego roztworu, przygotowanego zgodnie z opisem w prywatnej monografii farmakopealnej, dodać objętość Vst. roztwór wzorcowy o znanym stężeniu Cst. Przygotuj roztwór ślepy w tych samych warunkach. Zmierz potencjały roztworu testowego i roztworu ślepego przed i po dodaniu roztworu wzorcowego. Obliczyć stężenie C analitu, korzystając z poniższego równania i dokonując niezbędnych poprawek dla roztworu ślepego:
gdzie: V to objętość roztworu testowego lub ślepego;
C oznacza stężenie jonu oznaczane w roztworze testowym;
Vst. – dodana objętość roztworu wzorcowego;
Cst. – oznaczane stężenie jonu w roztworze wzorcowym;
∆E – różnica potencjałów mierzona przed i po dodaniu;
S – nachylenie funkcji elektrody, wyznaczone doświadczalnie przy stała temperatura poprzez pomiar różnicy potencjałów pomiędzy dwoma roztworami wzorcowymi, których stężenia różnią się 10-krotnie i odpowiadają liniowemu obszarowi krzywej kalibracyjnej.
Zainteresowanie metodą addytywną w jonometrii wynika z faktu, że odgrywa ona większą rolę niż metoda addytywna w innych metodach analitycznych. Metoda dodawania jonometrycznego ma dwie ogromne zalety. Po pierwsze, jeśli zmienność siły jonowej w analizowanych próbkach jest nieprzewidywalna, wówczas zastosowanie wspólnej metody krzywej kalibracyjnej daje duże błędy definicje. Zastosowanie metody addytywnej radykalnie zmienia sytuację i pozwala zminimalizować błąd oznaczenia. Po drugie, istnieje kategoria elektrod, których stosowanie jest problematyczne ze względu na potencjalny dryft. Przy umiarkowanym dryfie potencjału metoda addycyjna znacznie zmniejsza błąd wyznaczania.
Powszechnie znane są następujące modyfikacje metody addytywnej: metoda dodatku standardowego, metoda dodatku podwójnego standardu, metoda Gran. Wszystkie te metody można podzielić na dwie kategorie według wyraźnego kryterium matematycznego, które określa dokładność uzyskanych wyników. Polega to na tym, że niektóre metody addytywne w obliczeniach koniecznie wykorzystują zmierzoną wcześniej wartość nachylenia funkcji elektrody, a inne nie. Według tego podziału metoda dodawania wzorca i metoda Gran należą do jednej kategorii, a metoda dodawania podwójnego wzorca do drugiej.
1. Metoda dodawania wzorca i metoda Gran.
Zanim przedstawię Cechy indywidulane tego czy innego rodzaju metody addytywnej, w kilku słowach opiszemy procedurę analizy. Procedura polega na dodaniu do analizowanej próbki roztworu zawierającego ten sam analizowany jon. Na przykład, aby określić zawartość jonów sodu, dodaje się mianowany roztwór sodu. Po każdym dodaniu rejestruje się odczyty elektrod. W zależności od sposobu dalszej obróbki wyników pomiarów metoda ta będzie nazywana metodą dodawania wzorca lub metodą Gran.
Obliczenia dla metody dodawania wzorca są następujące:
Cx = DC (10DE/S - 1)-1,
gdzie Cx jest pożądanym stężeniem;
DC to ilość dodatku;
DE jest potencjalną reakcją na wprowadzenie dodatku DC;
S jest nachyleniem funkcji elektrody.
Obliczenia metodą Grana wyglądają na nieco bardziej skomplikowane. Polega na wykreśleniu wykresu we współrzędnych (W+V) 10 E/S od V,
gdzie V jest objętością dodanych dodatków;
E - potencjalne wartości odpowiadające wprowadzonym dodatkom V;
W jest początkową objętością próbki.
Wykres jest linią prostą przecinającą oś x. Punkt przecięcia odpowiada objętości dodanego dodatku (DV), która jest równa pożądanemu stężeniu jonów (patrz rys. 1). Z prawa równoważników wynika, że Cx = Cst DV/W, gdzie Cst jest stężeniem jonów w roztworze, w którym wprowadzane są dodatki. Dodatków może być kilka, co w naturalny sposób poprawia dokładność oznaczania w porównaniu ze standardową metodą addytywną.
Łatwo zauważyć, że w obu przypadkach pojawia się nachylenie funkcji elektrody S. Z tego wynika, że pierwszym etapem metody addytywnej jest kalibracja elektrod w celu późniejszego określenia wartości nachylenia. Wartość bezwzględna potencjału nie jest brana pod uwagę w obliczeniach, ponieważ dla uzyskania wiarygodnych wyników ważna jest jedynie stałość nachylenia funkcji kalibracyjnej od próbki do próbki.
Jako dodatek można zastosować nie tylko roztwór zawierający jon określający potencjał, ale także roztwór substancji, która wiąże wykryty jon próbki w związek niedysocjujący. Procedura analizy nie ulega zasadniczym zmianom. Jednak w tym przypadku jest ich kilka cechy, co należy wziąć pod uwagę. Osobliwością jest to, że wykres wyników eksperymentalnych składa się z trzech części, jak pokazano na ryc. 2. Pierwszą część (A) otrzymuje się w warunkach, w których stężenie substancji wiążącej jest mniejsze niż stężenie substancji determinującej potencjał. Dalszą część wykresu (B) otrzymuje się przy w przybliżeniu równoważnych stosunkach powyższych substancji. I wreszcie trzecia część wykresu (C) odpowiada warunkom, w których ilość substancji wiążącej jest większa niż ilość determinująca potencjał. Liniowa ekstrapolacja części A wykresu na oś x daje wartość DV. Region B nie jest zwykle używany do oznaczeń analitycznych.
Jeżeli krzywa miareczkowania jest centralnie symetryczna, to do otrzymania wyników analitycznych można wykorzystać obszar C. Jednakże w tym przypadku rzędną należy obliczyć w następujący sposób: (W+V)10 -E/S.
Ponieważ metoda Gran ma większe zalety niż metoda standardowe dodatki, wówczas dalsze rozważania będą dotyczyć przede wszystkim metody Gran.
Zalety stosowania metody można wyrazić w poniższych punktach.
1. Zmniejszenie błędu oznaczenia 2-3 razy dzięki zwiększeniu liczby pomiarów w jednej próbce.
2. Metoda addytywna nie wymaga starannej stabilizacji siły jonowej w analizowanej próbce, gdyż jej wahania znajdują odzwierciedlenie w wartości całkowita wartość potencjał w większym stopniu niż nachylenie funkcji elektrody. Pod tym względem błąd wyznaczania jest zmniejszony w porównaniu z metodą krzywej kalibracyjnej.
3. Zastosowanie wielu elektrod jest problematyczne, ponieważ wymaga tego obecność niewystarczająco stabilnego potencjału częsty procedury kalibracyjne. Ponieważ w większości przypadków dryft potencjału ma niewielki wpływ na nachylenie funkcji kalibracyjnej, uzyskanie wyników metodą dodawania wzorca i metodą Gran znacznie zwiększa dokładność i upraszcza procedurę analizy.
4. Metoda dodawania wzorców pozwala na kontrolę poprawności każdego oznaczenia analitycznego. Kontrola odbywa się podczas przetwarzania danych doświadczalnych. Od w przetwarzanie matematyczne w grę wchodzi kilka punktów doświadczalnych, a następnie przeciągnięcie przez nie za każdym razem linii prostej potwierdza, że postać matematyczna i nachylenie funkcji kalibracyjnej nie uległy zmianie. W przeciwnym razie widok liniowy grafika nie jest gwarantowana. Tym samym możliwość kontroli poprawności analizy w każdym oznaczeniu zwiększa wiarygodność wyników.
Jak już wspomniano, metoda z dodatkiem wzorca pozwala na 2-3 razy dokładniejsze oznaczenia niż metoda krzywej kalibracyjnej. Aby jednak uzyskać taką dokładność definicji, należy zastosować jedną regułę. Zbyt duże lub małe dodatki zmniejszą dokładność oznaczenia. Optymalna ilość dodatku powinna być taka, aby powodowała reakcję potencjalną 10-20 mV dla pojedynczo naładowanego jonu. Zasada ta optymalizuje błąd losowy analizy, jednak w warunkach, w których często stosowana jest metoda addytywna, błąd systematyczny związany ze zmianami charakterystyki elektrod jonoselektywnych staje się znaczący. Błąd systematyczny w tym przypadku jest całkowicie zdeterminowany błędem wynikającym ze zmiany nachylenia funkcji elektrody. Jeśli nachylenie zmieni się podczas eksperymentu, wówczas w pewnych warunkach względny błąd wyznaczania będzie w przybliżeniu równy błędowi względnemu wynikającemu ze zmiany nachylenia.
