Tindak balas penetapan pelengkap (CFR) adalah berdasarkan fakta bahawa kompleks antigen-antibodi tertentu sentiasa menjerap (mengikat) pelengkap kepada dirinya sendiri.
Tindak balas ini digunakan secara meluas dalam pengenalpastian antigen dan dalam serodiagnosis jangkitan, terutamanya penyakit* yang disebabkan oleh spirochetes (tindak balas Wassermann), rickettsia dan virus.
RSC adalah tindak balas serologi yang kompleks. Ia melibatkan pelengkap dan dua sistem antigen-antibodi. Pada asasnya, ini adalah dua tindak balas serologi.
Sistem pertama - yang utama terdiri daripada antigen dan antibodi (satu diketahui, yang lain tidak). Sejumlah pelengkap tertentu ditambahkan kepadanya. Jika antigen dan antibodi sistem ini sepadan, mereka akan menyambung dan mengikat pelengkap. Kompleks yang terhasil tersebar dengan halus dan tidak kelihatan.
Pembentukan kompleks ini dikesan menggunakan sistem hemolitik atau penunjuk kedua. Ia termasuk sel darah merah biri-biri (antigen) dan serum hemolitik (antibodi) yang sepadan, iaitu, kompleks imun siap sedia. Dalam sistem ini, lisis sel darah merah hanya boleh berlaku dengan kehadiran pelengkap. Jika pelengkap terikat oleh sistem pertama (jika antigen dan antibodi sesuai di dalamnya), maka dalam sistem kedua tidak akan ada hemolisis - kerana tidak ada pelengkap bebas. Ketiadaan hemolisis (kandungan tiub keruh atau terdapat sedimen eritrosit di bahagian bawah) direkodkan sebagai keputusan RSC positif.
Jika dalam sistem pertama antigen tidak sepadan dengan antibodi, maka kompleks imun tidak akan terbentuk dan pelengkap akan kekal bebas! Kekal bebas, pelengkap mengambil bahagian dalam sistem kedua, menyebabkan hemolisis; keputusan RSC adalah negatif (kandungan tiub adalah telus - "darah lakuer").
Komponen tindak balas penetapan pelengkap:
Antigen - biasanya lysate, ekstrak, hapten; kurang kerap penggantungan.
1.Antibody-serum sistem pesakit
2. Pelengkap - serum babi guinea
3. Antigen - sel darah merah biri-biri
4.Antibodi - hemolysin kepada sel darah merah biri-biri
5. Larutan isotonik
Disebabkan fakta bahawa sebilangan besar komponen kompleks terlibat dalam RSC, mereka mesti terlebih dahulu dititrasi dan diambil ke dalam tindak balas dalam kuantiti yang tepat dan dalam isipadu yang sama: 0.5 atau 0.25, kurang kerap 0.2 ml. Sehubungan itu, keseluruhan eksperimen dijalankan dalam jumlah 2.5, 1.25 atau 1.0 ml (isipadu yang lebih besar memberikan hasil yang lebih tepat). Pentitratan komponen tindak balas dijalankan dalam jumlah yang sama seperti eksperimen, menggantikan bahan yang hilang dengan larutan isotonik.
Menyediakan Bahan
Serum hemolitik (hemolysin). Serum dicairkan 3 kali kurang daripada titernya (lihat ms 211). Sediakan pencairan umum serum untuk keseluruhan eksperimen, isipadunya ditentukan dengan mendarabkan isipadu serum dalam satu tabung uji (contohnya, 0.5 ml) dengan bilangan tabung uji, melebihi bilangan dalam eksperimen.
2. Sel darah merah biri-biri. Sediakan 3% penggantungan eritrosit biri-biri yang telah dibasuh (lihat ms 211) untuk keseluruhan bilangan tabung uji dalam eksperimen. Untuk menyediakan sistem hemolitik, 30 minit sebelum menambahkannya ke dalam eksperimen, campurkan jumlah yang sama hemolysin yang dicairkan dan penggantungan sel darah merah, menambah serum ke sel darah merah, campurkan dengan teliti dan eramkan selama 30 minit pada suhu 37˚C.
3.Pelengkap biasanya dicairkan 1:10. Ia mesti dititrasi sebelum setiap eksperimen. Titer komplemen ialah jumlah terkecilnya, apabila ditambah kepada sistem hemolitik, hemolisis lengkap berlaku dalam masa 1 jam pada 37˚C. Skim pentitratan pelengkap dibentangkan dalam Jadual 21.
Perhatian! Titrasi pujian dalam jumlah yang sama seperti eksperimen utama, menggantikan bahan yang hilang dengan larutan isotonik.
Perakaunan untuk keputusan. Seharusnya tidak ada kesan hemolisis dalam kawalan, kerana salah satu daripadanya tidak mengandungi pelengkap, dan satu lagi tidak mengandungi hemolysin. Kawalan menunjukkan bahawa komponen tindak balas tidak mempunyai hemotoksik (keupayaan untuk melisiskan sel darah merah secara spontan).
Dalam jadual yang diberi Dalam contoh 21, titer pelengkap pada pencairan 1:10 ialah 0.15 ml. Dalam eksperimen, aktiviti pelengkap boleh berkurangan disebabkan oleh penjerapan tidak spesifiknya oleh komponen tindak balas lain, oleh itu, untuk eksperimen, jumlah pelengkap ditingkatkan: dos selepas titer diambil. Ini adalah dos kerja. Dalam contoh yang diberikan, ia bersamaan dengan 0.2 pelengkap dalam pencairan 1:10. Oleh kerana semua komponen yang terlibat dalam RSC mesti diambil dalam jumlah yang sama (dalam contoh kita ialah 0:5 ml), adalah perlu untuk menambah 0.3 ml larutan isotonik kepada dos kerja pelengkap (0.2 ml1:10). Untuk keseluruhan eksperimen, isipadu setiap satu daripadanya (pelengkap dan larutan isotonik.
Untuk keseluruhan eksperimen, isipadu setiap satu daripadanya (pelengkap dan larutan isotonik) didarab dengan bilangan tabung uji yang mengambil bahagian dalam RSC. Sebagai contoh, untuk menjalankan eksperimen dalam 50 tabung uji, anda perlu mengambil 10 ml pelengkap 1:10 (0.2 mlx50) dan 15 ml larutan isotonik (0.3 mlx50).
4. Antigen biasanya diperolehi siap dengan titernya ditunjukkan, i.e. jumlah yang, selepas mencairkan antigen, harus terkandung dalam 1 ml. contohnya, dengan titer 0.4, ia dicairkan dalam 0.96 ml larutan isotonik. Untuk eksperimen, saya mengambil sejumlah antigen yang sama dengan separuh titer (0.5 ml). Ini adalah dos kerjanya. Kira jumlah pencairan antigen bagi keseluruhan eksperimen dengan mendarab 0.5 ml dengan bilangan tabung uji dalam eksperimen itu.
5. Antibodi – serum pesakit. Serum segar dinyahaktifkan sebelum eksperimen untuk memusnahkan pelengkap yang ada di dalamnya. Untuk melakukan ini, ia dipanaskan selama 30 minit pada 56˚C dalam tab mandi air atau dalam penyahaktif dengan termostat. Kaedah terakhir adalah lebih baik: ia menghapuskan kemungkinan terlalu panas whey, iaitu, denaturasinya. Sera yang didenatur tidak sesuai untuk ujian. Serum pesakit biasanya digunakan dalam pencairan 1:10 hingga 1:160.
Jadual No. 14
| Bahan-bahan, ml | Tabung uji | |||||||||||
| pengalaman | kawalan | |||||||||||
| Sistem hemolitik | sel darah merah | |||||||||||
| Larutan isotonik | 1,45 | 1,4 | 1,35 | 1,3 | 1,25 | 1,2 | 1,15 | 1,1 | 1,05 | 1,0 | 1,5 | 1,5 |
| Pelengkap 1:10 | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,35 | 0,4 | 0,45 | 0,5 | ― | 0,5 |
| Sistem hemolitik | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | ― |
| 3% penggantungan sel darah merah biri-biri | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | 0,5 |
| Tiub digoncang dengan teliti dan diinkubasi pada suhu 37˚C selama 1 jam. | ||||||||||||
| hasil | Tiada hemolisis | Hemolisis | Tiada hemolisis |
Sera imun paling kerap disediakan dalam keadaan pengeluaran dan dikeluarkan dalam keadaan tidak aktif. Mereka dicairkan 1:50 dan lebih tinggi.
Semua bahan disediakan sedikit lebihan.
| Bahan-bahan, ml | Tabung uji | |||||||
| Kawalan pengalaman | ||||||||
| serum | antigen | Sistem hemolitik | Pelengkap dalam dos kerja | |||||
| ½ | ||||||||
| Larutan Isotonik Fasa 1 | ― | 0,5 | 0,5 | 1,5 | 1,25 | 1,0 | 0,5 | |
| Serum ujian dicairkan 1:10 | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ― | |
| Antigen pada dos kerja | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ||
| Lengkapkan 1:10 dalam dos kerja | 0,5 | 0,5 | 0,5 | ― | 0,25 | 0,5 | 1,0 | |
| Tiub digoncang dengan teliti dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 45 minit 1 jam atau 4°C selama 18 jam | ||||||||
| Sistem hemolitik fasa 2 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | |
| Tiub digoncang dengan teliti dan diinkubasi pada 37˚C sehingga hemolisis lengkap dalam tiub 2, 3, 6 dan 7 | ||||||||
| Hasilnya | Positif atau negatif | ― | ― | ++++ | (+) | ― | ― | |
Jadual No. 15
Menjalankan eksperimen utama
Apabila menyediakan percubaan, ia amat; Urutan komponen ditambah adalah penting. Eksperimen dijalankan dalam dua fasa.
Fasa I. Jumlah yang diperlukan larutan natrium klorida isotonik dituangkan ke dalam tabung uji, kemudian isipadu yang diperlukan serum cair dan dos kerja antigen dan pelengkap dalam jumlah yang sama. Eksperimen mesti disertakan dengan kawalan semua bahan yang terlibat di dalamnya: serum, antigen, sistem hemolitik dan pelengkap.
Tiub digoncang dengan teliti dan diinkubasi pada 37°C selama 45 min-1 jam atau pada 4°C (“RSC dalam keadaan sejuk”) selama 18 jam. Pada masa ini, dengan kehadiran kompleks tertentu, pengikatan pelengkap berlaku. Menjalankan tindak balas "dalam keadaan sejuk" dengan ketara meningkatkan sensitiviti dan kekhususannya.
Fasa II. Pada akhir pengeraman, 1 ml sistem hemolitik ditambah ke semua tabung uji, yang disimpan terlebih dahulu dalam termostat selama 30 minit (dipekakan). Tabung uji digoncang dan diletakkan semula di dalam termostat.
Keputusan perakaunan tentang. Tiub dibiarkan dalam termostat sehingga hemolisis lengkap dalam tiub 2, 3, 6 dan 7 (kawalan serum, antigen dan pelengkap untuk satu dan dua dos). Hemolisis akan berlaku terlebih dahulu dalam tabung uji ke-7, yang mengandungi jumlah pelengkap berganda. Selepas hemolisis berlaku dalam tiub ini dan kandungannya menjadi benar-benar telus, anda perlu berhati-hati memantau kawalan yang tinggal. Sebaik sahaja cecair dalam tabung uji ke-2, ke-3 dan ke-6 menjadi lutsinar, anda harus segera mengeluarkan rak dengan tiub uji daripada termostat. Fakta bahawa eksperimen tidak disimpan dalam termostat lebih lama daripada yang diperlukan ditunjukkan oleh kehadiran sedikit kekeruhan (hemolisis tidak lengkap) dalam tabung uji ke-5 - ia mengandungi hanya separuh dos kerja pelengkap dan hemolisis lengkap tidak boleh berlaku jika eksperimen itu sediakan dengan betul.
Hemolisis dalam kawalan serum dan antigen (tiub 2 dan 3) menunjukkan bahawa dos mereka dipilih dengan betul dan serum mahupun antigen itu sendiri tidak mengikat pelengkap.
Dalam kawalan sistem hemolitik (tiub ujian 4), jika ia berfungsi dengan baik, tidak sepatutnya ada kesan hemolisis - tidak ada pelengkap di dalamnya.
Setelah anda yakin bahawa kawalan telah dilengkapkan dengan betul, anda boleh mengambil kira pengalaman tersebut. Ketiadaan hemolisis dalam tabung uji dianggap sebagai hasil positif tindak balas. Ia menunjukkan bahawa serum mengandungi antibodi khusus untuk antigen yang diambil. Kompleks yang mereka bentuk mengikat pelengkap dan menghalang penyertaannya dalam tindak balas hemolisis. Jika hemolisis berlaku dalam tabung uji, keputusan tindak balas dinilai sebagai negatif. DALAM dalam kes ini tiada korespondensi antara antigen dan antibodi, pelengkap tidak terikat dan terlibat dalam tindak balas hemolisis.
Selari dengan serum pesakit, eksperimen yang sama dilakukan dengan serum yang jelas positif (iaitu, dengan serum yang mengandungi antibodi kepada antigen tertentu) dan serum yang jelas negatif, yang tidak mengandungi antibodi khusus. Jika percubaan disediakan dengan betul, dalam kes pertama harus ada kelewatan dalam hemolisis, dan dalam kes kedua, akan ada hemolisis.
Keamatan tindak balas dinyatakan seperti berikut:
Kelewatan lengkap hemolisis. Sel darah merah membentuk kekeruhan seragam atau mendap ke bahagian bawah. Dalam kes ini, cecair dalam tabung uji menjadi tidak berwarna;
Kira-kira 25% sel darah merah dilisiskan. Terdapat sedikit sedimen, cecair di atasnya berwarna merah jambu sedikit. Keputusan RSC juga dinilai sebagai sangat positif;
Kira-kira 50% sel darah merah dilisiskan. Sedimennya kecil, cecairnya berwarna merah jambu. Keputusan RSC positif;
Kira-kira 75% sel darah merah dilisiskan. Sedimen sedikit, di atasnya terdapat cecair berwarna pekat. Keputusan RSC yang boleh dipersoalkan;
Semua sel darah merah telah dihancurkan. Cecair berwarna pekat dan telus sepenuhnya. Keputusan RSK negatif.
Tindak balas ini digunakan untuk mengesan antibodi dalam serum darah pesakit dengan jangkitan bakteria, virus, protozoal, serta untuk mengenal pasti dan menaip virus yang diasingkan daripada pesakit.
RSC merujuk kepada tindak balas serologi kompleks di mana, sebagai tambahan kepada antigen, antibodi dan pelengkap, sistem hemolitik juga mengambil bahagian, mendedahkan hasil tindak balas. RSC meneruskan dalam dua fasa: yang pertama ialah interaksi antigen dengan antibodi dengan penyertaan pelengkap dan yang kedua ialah pengenalpastian tahap pengikatan pelengkap menggunakan sistem hemolitik. Sistem ini terdiri daripada sel darah merah biri-biri dan serum hemolitik yang diperolehi dengan mengimunkan haiwan makmal dengan sel darah merah. Eritrosit diproses - dipekakan dengan menambahkan serum padanya pada suhu 37°C selama 30 minit. Lisis eritrosit biri-biri yang tersensitisasi berlaku hanya jika ia bergabung dengan sistem pelengkap hemolitik. Dalam ketiadaannya, sel darah merah tidak berubah. Keputusan RSC bergantung kepada kehadiran antibodi dalam serum ujian. Jika serum mengandungi antibodi homolog dengan antigen yang digunakan dalam tindak balas, maka kompleks antigen-antibodi yang terhasil mengikat dan mengikat pelengkap. Apabila menambah sistem hemolitik, dalam kes ini, hemolisis tidak akan berlaku, kerana semua pelengkap dibelanjakan untuk ikatan khusus kompleks antigen-antibodi.
Sel darah merah kekal tidak berubah, jadi ketiadaan hemolisis dalam tiub ujian direkodkan sebagai RBC positif. Dengan ketiadaan antibodi yang sepadan dengan antigen dalam serum, kompleks antigen-antibodi tertentu tidak terbentuk dan pelengkap kekal bebas. Apabila sistem hemolitik ditambah, pelengkap melekat padanya dan menyebabkan hemolisis sel darah merah. Pemusnahan sel darah merah dan hemolisis mereka mencirikan tindak balas negatif.
Untuk peringkat RSC, perkara berikut diperlukan: serum pesakit, pelengkap, sistem hemolitik yang terdiri daripada eritrosit biri-biri dan serum hemolitik, serta larutan natrium klorida isotonik.
Tindak balas dijalankan dalam tiub serologi. Sel darah merah biri-biri diperoleh daripada darah biri-biri yang didefibrinasikan dengan membasuhnya tiga kali dengan larutan natrium klorida isotonik. Serum hemolitik dihasilkan siap dalam ampul, label yang menunjukkan titernya, iaitu, pencairan maksimum serum, yang masih menyebabkan hemolisis apabila ditambah kepada sel darah merah dengan kehadiran pelengkap. Serum hemolitik diperoleh dengan mengimunkan haiwan, seperti arnab, dengan sel darah merah biri-biri. Apabila menetapkan tindak balas, serum digunakan dalam titer tiga kali ganda. Sebagai contoh, titer serum hemolitik ialah 1: 1200, dan pencairan yang berfungsi ialah 1: 400. Serum darah guinea pig segar (dalam masa 24-48 jam) atau pelengkap kering dalam ampul digunakan sebagai pelengkap.
Sebelum menjalankan RSC, pelengkap dicairkan 1:10 dan dititrasi untuk mewujudkan titer - jumlah pelengkap terkecil yang dihasilkan oleh hemolisis sel darah merah apabila digabungkan dengan sistem hemolitik yang digunakan dalam tindak balas ini. Dengan mengambil kira kemungkinan sifat anti-pelengkap antigen, apabila melakukan tindak balas, peningkatan 20-30% dibuat kepada titer kerja pelengkap yang ditetapkan.
Antigen untuk RSC ialah penggantungan bakteria yang telah dibunuh, ekstrak yang disediakan daripada penggantungan ini, dan pecahan kimia individu mikrob. Keperluan utama untuk antigen ialah ketiadaan perencatan aktiviti pelengkap. Ia tidak sepatutnya mempunyai sifat anti-pelengkap. Untuk mengenal pasti sifat antigen ini, pelengkap dititrasi tambahan dengan kehadiran antigen yang digunakan dalam tindak balas. Terdapat skim tertentu untuk pementasan RSC. Keputusan tindak balas diambil kira oleh kehadiran atau ketiadaan hemolisis sel darah merah dalam sistem hemolitik. RSC digunakan dalam diagnosis sifilis (tindak balas Wassermann), gonorea (tindak balas Bordet-Gengou), toksoplasmosis, rickettsial dan penyakit virus.
Tindak balas penetapan pelengkap (CFR) ialah apabila antigen dan antibodi bersesuaian antara satu sama lain, ia membentuk kompleks imun yang mana pelengkap (C) dilekatkan melalui serpihan Fc antibodi, iaitu, pelengkap diikat oleh kompleks antigen-antibodi. Jika kompleks antigen-antibodi tidak terbentuk, maka pelengkap kekal bebas.
Interaksi khusus AG dan AT disertai dengan penjerapan (mengikat) pelengkap. Oleh kerana proses penetapan pelengkap tidak jelas secara visual, J. Bordet dan O. Zhangu mencadangkan menggunakan sistem hemolitik (sel darah merah biri-biri + serum hemolitik) sebagai penunjuk, yang menunjukkan sama ada pelengkap ditetapkan oleh kompleks AG-AT. Jika AG dan AT sepadan antara satu sama lain, iaitu kompleks imun telah terbentuk, maka pelengkap terikat oleh kompleks ini dan hemolisis tidak berlaku. Jika AT tidak sesuai dengan AG, maka kompleks tidak terbentuk dan melengkapi, kekal bebas, bergabung dengan sistem kedua dan menyebabkan hemolisis.
Kemajuan tindak balas
Tindak balas berlaku dalam dua fasa yang melibatkan dua sistem; bakteria dan hemolitik. Tindak balas pertama (spesifik) melibatkan antigen 4-+ antibodi + pelengkap. Hasil tindak balas positif, yang berlaku apabila antibodi sepadan dengan antigen, dicirikan oleh pembentukan kompleks antigen-antibodi bakteria tertentu dengan terjerap, atau, seperti yang mereka katakan, pelengkap "terikat". Kekal tidak kelihatan, kompleks itu tidak menyebabkan sebarang perubahan luaran dalam persekitaran di mana ia terbentuk. Keputusan RSC negatif berlaku jika tiada pertalian khusus antara antigen dan antibodi serum dan dicirikan oleh pemeliharaan pelengkap aktif bebas. Fasa pertama RSC boleh dijalankan dalam termostat pada 37°C (1-2 jam) atau dalam peti sejuk pada 3-4°C (18-20 jam). Dengan pembentukan kompleks imun antigen-antibodi yang berpanjangan dalam keadaan sejuk, pengikatan pelengkap yang lebih lengkap berlaku dan, akibatnya, sensitiviti tindak balas meningkat. Apabila menjalankan eksperimen perbandingan, ahli imunologi Soviet Akademik. V.I. Ioffe dan pelajarnya menunjukkan bahawa dalam keadaan penetapan pelengkap yang berpanjangan dalam keadaan sejuk, adalah mungkin untuk menangkap 100-500 kali lebih kecil jumlah antigen dan memperoleh keputusan yang positif pada pencairan serum imun yang lebih tinggi daripada dalam eksperimen penetapan pelengkap pada suhu 37 ° C selama 1-2 jam Fasa kedua tindak balas (penunjuk) berlaku di antara reagen sistem hemolitik (campuran 3% penggantungan eritrosit dan serum hemolitik dalam jumlah yang sama) pada suhu 37 °C hanya dengan kehadiran pelengkap yang kekal bebas daripada fasa pertama tindak balas (tindak balas negatif). Dengan ketiadaan pelengkap aktif bebas, hemolisis sel darah merah di bawah pengaruh hemolysin tertentu tidak berlaku (tindak balas adalah positif).
Komponen
Tindak balas fiksasi pelengkap (CFR) adalah tindak balas serologi yang kompleks. Untuk menjalankannya, 5 bahan diperlukan iaitu: AG, AT dan pelengkap (sistem pertama), eritrosit biri-biri dan serum hemolitik (sistem kedua).
Antigen untuk RSC boleh menjadi kultur pelbagai mikroorganisma yang terbunuh, lisatnya, komponen bakteria, diubah secara patologi dan organ biasa, lipid tisu, virus dan bahan yang mengandungi virus.
Serum guinea pig segar atau kering digunakan sebagai pelengkap.
Mekanisme tindak balas
RSK dijalankan dalam dua fasa: fasa 1 - pengeraman campuran yang mengandungi tiga komponen antigen + antibodi + pelengkap; Fasa ke-2 (penunjuk) - pengesanan pelengkap bebas dalam campuran dengan menambahkannya sistem hemolitik yang terdiri daripada eritrosit biri-biri dan serum hemolitik yang mengandungi antibodi kepada mereka. Pada fasa pertama tindak balas, apabila kompleks antigen-antibodi terbentuk, pelengkap mengikat, dan kemudian pada fasa ke-2, hemolisis eritrosit yang disensitisasi oleh antibodi tidak akan berlaku; tindak balas adalah positif. Jika antigen dan antibodi tidak sepadan antara satu sama lain (tiada antigen atau antibodi dalam sampel ujian), pelengkap kekal bebas dan dalam fasa ke-2 akan bergabung dengan kompleks antibodi eritrosit - anti-eritrosit, menyebabkan hemolisis; tindak balas adalah negatif.
Permohonan
Tindak balas fiksasi pelengkap boleh digunakan untuk:
1) pengenalpastian antibodi khusus dalam serum yang tidak diketahui berdasarkan interaksi mereka dengan antigen yang diketahui sifatnya;
2) mengkaji sifat antigen dalam tindak balas dengan serum khusus yang diketahui. Penyediaan bahan untuk pementasan RSC.
1. Serum darah yang diperoleh untuk penyelidikan, pada malam sebelum tindak balas, dipanaskan dalam mandi air pada suhu 56°C selama 30 minit untuk menyahaktifkan pelengkapnya sendiri. Serum yang tidak aktif boleh disimpan pada suhu 3-4°C selama 5-6 hari. Pada hari percubaan, serum dicairkan dengan larutan natrium klorida isotonik dalam nisbah 1:5 (0.1 ml serum ujian + 0.4 ml larutan natrium klorida isotonik).
2. Antigen untuk penghasilan CSC boleh menjadi kultur pelbagai mikrob, protein bakteria dan ekstrak yang diperoleh daripada kultur mikrob, organ dan tisu yang diubah secara patologi dan normal. Spesifik penyediaan antigen ditentukan oleh sifat proses berjangkit dan ciri-ciri patogennya.
3. Pelengkap ialah campuran serum yang diperolehi daripada 3-5 ekor guinea pig yang sihat, atau pelengkap kering dalam ampul.
Sejurus sebelum digunakan, serum guinea pig dicairkan dengan larutan isotonik natrium klorida dalam nisbah 1:10 untuk mendapatkan larutan stok.
4. Sebelum melakukan eksperimen, serum hemolitik dinyahaktifkan dengan memanaskan pada suhu 56 °C selama 30 minit. Untuk melakukan eksperimen RSC utama, serta untuk mentitrasi pelengkap dan antigen, serum hemolitik digunakan dalam titer tiga kali ganda. Sebagai contoh, jika titer serum hemolitik ialah 1: 1800, pencairan serum 1: 600 digunakan dalam tindak balas.
5. Eritrosit diperoleh daripada darah kambing biri-biri yang didefibrinasi. Untuk mengeluarkan filem fibrin, darah ditapis melalui penapis kasa tiga lapisan. Turasan yang terhasil disentrifugasi, serum disedut dan dikeringkan, dan eritrosit dibasuh dengan sentrifugasi 3-4 kali dengan larutan natrium klorida isotonik. Apabila sel darah merah dibasuh buat kali terakhir, lapisan cecair supernatan hendaklah telus sepenuhnya. Suspensi 3% disediakan daripada sel darah merah yang telah dibasuh dalam larutan natrium klorida isotonik. Setelah menyediakan bahan-bahan yang terlibat dalam RSC dengan cara di atas, teruskan ke pentitratan serum hemolitik, pelengkap dan antigen.
Buku teks mengandungi tujuh bahagian. Bahagian satu – “Mikrobiologi Am” – mengandungi maklumat tentang morfologi dan fisiologi bakteria. Bahagian kedua dikhaskan untuk genetik bakteria. Bahagian ketiga - "Mikroflora biosfera" - mengkaji mikroflora persekitaran, peranannya dalam kitaran bahan dalam alam semula jadi, serta mikroflora manusia dan kepentingannya. Bahagian empat - "Doktrin jangkitan" - ditumpukan kepada sifat patogenik mikroorganisma, peranannya dalam proses berjangkit, dan juga mengandungi maklumat tentang antibiotik dan mekanisme tindakannya. Bahagian lima - "Doktrin Kekebalan" - mengandungi idea-idea moden tentang imuniti. Bahagian keenam – “Virus dan penyakit yang ditimbulkannya” – memberikan maklumat tentang sifat biologi asas virus dan penyakit yang ditimbulkannya. Bahagian tujuh - "Mikrobiologi perubatan persendirian" - mengandungi maklumat tentang morfologi, fisiologi, sifat patogenik patogen banyak penyakit berjangkit, dan juga tentang kaedah moden diagnostik mereka, pencegahan khusus dan terapi.
Buku teks ditujukan untuk pelajar, pelajar siswazah dan guru perubatan tinggi institusi pendidikan, universiti, ahli mikrobiologi semua kepakaran dan doktor pengamal.
Edisi ke-5, disemak dan dikembangkan
Buku:
| <<< Назад
|
Ke hadapan >>> |
Tindak balas fiksasi pelengkap
Keupayaan unik pelengkap untuk mengikat secara khusus kepada kompleks antigen + antibodi yang berbeza sifat telah ditemui aplikasi yang luas dalam tindak balas fiksasi pelengkap (CFR). Kelebihan istimewa RSC ialah sifat antigen yang terlibat di dalamnya (korpuskular atau larut) tidak penting, kerana pelengkap mengikat serpihan Fc mana-mana antibodi yang berkaitan dengan IgG dan IgM, tanpa mengira kekhususan antibodinya. Di samping itu, RSA sangat sensitif: ia membolehkan anda mengesan jumlah antibodi 10 kali kurang daripada, sebagai contoh, dalam tindak balas pemendakan. RSC telah dicadangkan pada tahun 1901 oleh J. Bordet dan O. Zhang. Ia berdasarkan dua sifat pelengkap:
1) keupayaan untuk mengikat kompleks antigen + antibodi;
2) lisis sel darah merah yang digunakan untuk mendapatkan serum hemolitik.
RSK dijalankan dalam dua peringkat, dan dua sistem masing-masing terlibat di dalamnya - eksperimen, atau diagnostik, dan penunjuk. Sistem diagnostik terdiri daripada serum ujian (atau diagnostik), yang dipanaskan pada 56 °C selama 30 minit sebelum melakukan tindak balas untuk menyahaktifkan pelengkap dan antigen yang terdapat di dalamnya. Pelengkap standard ditambahkan pada sistem ini. Sumbernya ialah whey guinea pig segar atau kering. Campuran diinkubasi pada suhu 37 °C selama satu jam. Jika serum ujian mengandungi antibodi, ia akan berinteraksi dengan antigen tambahan, dan kompleks antigen + antibodi yang terhasil akan mengikat pelengkap tambahan. Sekiranya tiada antibodi dalam serum, pembentukan kompleks antigen + antibodi tidak akan berlaku, dan pelengkap akan kekal bebas. Biasanya tiada manifestasi yang dapat dilihat pada penetapan pelengkap pada peringkat tindak balas ini. Oleh itu, untuk menjelaskan persoalan sama ada penetapan pelengkap telah berlaku atau tidak, sistem penunjuk kedua (serum hemolitik yang tidak aktif + sel darah merah biri-biri) ditambah, dan campuran semua komponen RSC sekali lagi diinkubasi pada 37 °C selama 30 - 60 minit , selepas itu keputusan tindak balas dinilai. Jika pelengkap terikat pada peringkat pertama, dalam sistem diagnostik, iaitu terdapat antibodi dalam serum pesakit, dan pelengkap terikat oleh kompleks antibodi + + antigen, tidak akan ada lisis eritrosit - RBC adalah positif: cecair adalah tidak berwarna, terdapat sedimen eritrosit di bahagian bawah tiub . Sekiranya tiada antibodi khusus dalam serum dan pengikatan pelengkap tidak berlaku dalam sistem diagnostik, iaitu RSC negatif, maka pelengkap yang tidak digunakan dalam sistem diagnostik mengikat kompleks sel darah merah + antibodi sistem penunjuk dan hemolisis. berlaku: dalam tabung uji "darah lacquered", sedimen sel darah merah No. Keamatan RSC dinilai menggunakan sistem empat silang bergantung pada tahap kelewatan hemolisis dan kehadiran sedimen sel darah merah. Tindak balas disertai dengan kawalan yang sesuai: kawalan serum (tanpa antigen) dan kawalan antigen (tanpa serum), kerana sesetengah sera dan beberapa antigen mempunyai kesan anti-pelengkap. Sebelum menjalankan RSC, semua komponen yang terlibat di dalamnya, kecuali serum atau antigen ujian, tertakluk kepada pentitratan yang teliti. Ia amat penting untuk memperkenalkan dos pelengkap yang tepat ke dalam tindak balas, kerana kekurangan atau lebihannya boleh menyebabkan keputusan palsu. Titer pelengkap ialah jumlah minimum yang, dengan adanya dos kerja serum hemolitik, memastikan pembubaran lengkap sel darah merah. Untuk menyediakan percubaan utama, ambil dos pelengkap meningkat sebanyak 20–25% berbanding titer yang ditetapkan. Titer serum hemolitik ialah pencairan maksimumnya, yang, apabila dicampurkan dengan jumlah larutan pelengkap 10% yang sama, sepenuhnya mehemolisis dos sel darah merah yang sepadan dalam masa 1 jam pada suhu 37 °C. Percubaan utama melibatkan pengambilan serum yang dicairkan kepada 1/3 titernya.
Tindak balas penetapan pelengkap adalah salah satu yang tradisional tindak balas serologi, digunakan untuk mendiagnosis banyak penyakit virus, dan juga menjadi asas kepada beberapa kaedah pengesanan lain antibodi antivirus. Walaupun tindak balas peneutralan, perencatan hemaglutinasi, hemaglutinasi tidak langsung, ujian imunosorben berkaitan lebih baik daripada tindak balas penetapan pelengkap dalam sensitiviti, bagaimanapun, kesederhanaan teknik, pengesanan awal antibodi, serta pengesanan antigen virus yang tidak mempunyai sifat hemagglutinating menjelaskan penggunaannya yang meluas dalam kajian virologi.
Pengeluarannya tidak memerlukan tahap kepekatan dan ketulenan ubat antigen yang begitu tinggi, yang diperlukan untuk beberapa tindak balas imunologi yang lain. Di samping itu, kekhususan kumpulan antigen penetapan pelengkap bagi banyak virus memungkinkan untuk menggunakan tindak balas penetapan pelengkap dalam diagnostik massa: tindak balas ini tidak mendedahkan perbezaan terikan dan mempunyai nilai tertentu apabila mengkaji hubungan antigen antara virus.
Nama itu sendiri sebahagian besarnya mencerminkan intipati kaedah, yang terdiri daripada dua tindak balas yang berasingan. Pada peringkat pertama, tindak balas melibatkan antigen dan antibodi (salah satu daripada komponen ini diketahui terlebih dahulu), serta pelengkap dalam jumlah yang dititrasi. Jika antigen dan antibodi sepadan, kompleks mereka mengikat pelengkap, yang dikesan pada peringkat kedua menggunakan sistem penunjuk (campuran sel darah merah biri-biri dan antiserum kepada mereka). Jika pelengkap terikat semasa interaksi antigen dan antibodi, maka lisis sel darah merah biri-biri tidak berlaku ( reaksi positif penetapan pelengkap). Dalam kes tindak balas penetapan pelengkap negatif, pelengkap tidak tetap menggalakkan hemolisis, yang digunakan untuk menilai keputusan tindak balas.
Komponen utama tindak balas penetapan pelengkap ialah antigen (dikenali atau dikesan), antibodi (antisera atau sera ujian yang diketahui), pelengkap, serum hemolitik dan sel darah merah biri-biri; Larutan natrium klorida isotonik (pH 7.2-7.4) atau pelbagai larutan penimbal digunakan sebagai pelarut. Antigen dan sera mungkin anti-pelengkap, i.e. keupayaan untuk menyerap pelengkap, yang melambatkan hemolisis dan mengganggu hasil tindak balas.
Antigen untuk CSC disediakan daripada organ haiwan yang dijangkiti, cecair allantoik atau amniotik embrio ayam yang dijangkiti, serta cecair kultur selepas menanam virus dalam kultur sel tisu. Persediaan antigen sentiasa mengandungi banyak bahan balast daripada sel haiwan atau kultur tisu, yang juga boleh memesongkan hasil tindak balas.
Antigen virus yang terhasil tidak diaktifkan, dos kerja, serta sifat anti-pelengkap dan hemolitik ditentukan. Antigen kemudiannya dititrasi dengan kehadiran pelengkap.
Komponen utama kedua dalam pementasan tindak balas ialah pelengkap. Istilah ini bermaksud sistem yang kompleks protein dan faktor yang terdapat dalam darah haiwan dan manusia. Biasanya, serum darah guinea pig digunakan dalam tindak balas penetapan pelengkap. Aktiviti (titer) pelengkap adalah jumlah terkecilnya, dengan kehadiran hemolysin menyebabkan hemolisis lengkap sistem hemolitik yang digunakan.
Untuk mengenal pasti antibodi penetap pelengkap kepada virus, serum perlu dinyahaktifkan untuk menghilangkan pelengkap pada suhu 560C selama 30 minit. Sera daripada haiwan yang diimunisasi biasanya digunakan sebagai sera rujukan. Selain itu, untuk imunisasi, antigen virus digunakan yang dibersihkan secara menyeluruh daripada kekotoran tisu, kerana jika tidak, tindak balas tidak spesifik yang jelas berlaku.
Komponen wajib tindak balas penetapan pelengkap ialah sistem hemolitik, yang merangkumi eritrosit biri-biri dan serum hemolitik yang diperolehi dengan hiperimunisasi arnab dengan eritrosit biri-biri.
Untuk melaksanakan tindak balas penetapan pelengkap, pengubahsuaian berikut digunakan: kaedah mikro tindak balas penetapan pelengkap dalam mikrotitrator sistem Takachi, tindak balas penetapan pelengkap jangka panjang, tindak balas penetapan pelengkap tidak langsung, tindak balas penetapan pelengkap dalam gel, titisan mikro tindak balas penetapan pelengkap, tindak balas penetapan pelengkap berasaskan pepejal.
Walaupun sensitiviti tindak balas penetapan pelengkap adalah rendah, ia mempunyai kekhususan yang tinggi. Dalam hal ini, ia digunakan secara meluas untuk diagnosis pneumoenteritis virus dalam lembu muda.
