Komplementa saistīšanās reakcija (CFR) ir balstīta uz faktu, ka specifisks antigēna-antivielu komplekss vienmēr adsorbē (saista) komplementu ar sevi.
Šo reakciju plaši izmanto antigēnu identificēšanā un infekciju, īpaši spirohetu (Wassermann reakcija), riketsijas un vīrusu izraisītu slimību, serodiagnozē.
RSC ir sarežģīta seroloģiska reakcija. Tas ietver komplementu un divas antigēnu-antivielu sistēmas. Būtībā tās ir divas seroloģiskas reakcijas.
Pirmā sistēma - galvenā sastāv no antigēna un antivielas (viena ir zināma, otra nav). Tam tiek pievienots zināms daudzums komplementa. Ja šīs sistēmas antigēns un antiviela sakrīt, tie savienos un saistās ar komplementu. Iegūtais komplekss ir smalki izkliedēts un nav redzams.
Šī kompleksa veidošanos nosaka, izmantojot otru hemolītisko vai indikatoru sistēmu. Tas ietver aitu sarkanās asins šūnas (antigēnu) un atbilstošo hemolītisko serumu (antivielu), t.i., gatavu imūnkompleksu. Šajā sistēmā sarkano asins šūnu līze var notikt tikai komplementa klātbūtnē. Ja komplements ir saistīts ar pirmo sistēmu (ja tajā atbilst antigēns un antiviela), tad otrajā sistēmā hemolīzes nebūs - jo nav brīva komplementa. Hemolīzes neesamība (mēģenes saturs ir duļķains vai apakšā ir eritrocītu nogulsnes) tiek reģistrēts kā pozitīvs RSC rezultāts.
Ja pirmajā sistēmā antigēns nesakrīt ar antivielu, tad imūnkomplekss neveidosies un komplements paliks brīvs! Paliekot brīvs, komplements piedalās otrajā sistēmā, izraisot hemolīzi; RSC rezultāts ir negatīvs (caurules saturs ir caurspīdīgs - "lakas asinis").
Komplementa fiksācijas reakcijas sastāvdaļas:
Antigēns - parasti lizāts, ekstrakts, haptēns; retāk apturēšana.
1.Pacienta sistēmas antivielu serums
2. Komplements - serums jūrascūciņas
3. Antigēns – aitas sarkanās asins šūnas
4.Antiviela – hemolizīns aitu sarkanajām asins šūnām
5.Izotoniskais šķīdums
Sakarā ar to, ka RSC ir iesaistīts liels skaits sarežģītu komponentu, tie vispirms ir jātitrē un jāievada reakcijā precīzos daudzumos un vienādos apjomos: 0,5 vai 0,25, retāk 0,2 ml. Attiecīgi viss eksperiments tiek veikts 2,5, 1,25 vai 1,0 ml tilpumos (lielāks tilpums dod precīzāku rezultātu). Reakcijas komponentu titrēšana tiek veikta tādā pašā tilpumā kā eksperiments, aizstājot trūkstošās sastāvdaļas ar izotonisku šķīdumu.
Sastāvdaļu sagatavošana
Hemolītiskais serums (hemolizīns). Serums tiek atšķaidīts 3 reizes mazāk nekā tā titrs (sk. 211. lpp.). Visam eksperimentam sagatavo vispārēju seruma atšķaidījumu, kura tilpumu nosaka, vienā mēģenē esošā seruma tilpumu (piemēram, 0,5 ml) reizinot ar mēģeņu skaitu, nedaudz pārsniedzot eksperimentā norādīto.
2. Aitu sarkanās asins šūnas. Pagatavo 3% nomazgātu aitas eritrocītu suspensiju (sk. 211. lpp.) visam eksperimenta mēģeņu skaitam. Lai sagatavotu hemolītisko sistēmu, 30 minūtes pirms pievienošanas eksperimentam sajauc vienādos daudzumos atšķaidīta hemolizīna un sarkano asins šūnu suspensijas, pievienojot serumu sarkanajām asins šūnām, rūpīgi samaisa un inkubē 30 minūtes 37°C temperatūrā.
3. Komplementu parasti atšķaida attiecībā 1:10. Pirms katra eksperimenta tas ir jātitrē. Komplementa titrs ir tā mazākais daudzums, pievienojot hemolītiskajai sistēmai, pilnīga hemolīze notiek 1 stundas laikā 37 ˚C temperatūrā. Komplementa titrēšanas shēma ir parādīta 21. tabulā.
Uzmanību! Titrē komplimentu tādā pašā tilpumā kā galvenajā eksperimentā, aizstājot trūkstošās sastāvdaļas ar izotonisku šķīdumu.
Rezultātu uzskaite. Kontrolēs nedrīkst būt pat hemolīzes pēdas, jo viens no tiem nesatur komplementu, bet otrs nesatur hemolizīnu. Kontrole liecina, ka reakcijas sastāvdaļām nav hemotoksicitātes (spēja spontāni lizēt sarkanās asins šūnas).
Dotajā tabulā 21 piemērā komplementa titrs atšķaidījumā 1:10 ir 0,15 ml. Eksperimentā komplementa aktivitāte var samazināties, jo tā nespecifiski adsorbējas ar citiem reakcijas komponentiem, tāpēc eksperimentam komplementa daudzums tiek palielināts: tiek ņemta deva, kas seko titram. Šī ir darba deva. Dotajā piemērā tas ir vienāds ar 0,2 komplementu atšķaidījumā 1:10. Tā kā visas RSC iesaistītās sastāvdaļas ir jāuzņem vienādos daudzumos (mūsu piemērā tas ir 0:5 ml), komplementa darba devai (0,2 ml1:10) jāpievieno 0,3 ml izotoniskā šķīduma. Visam eksperimentam katra no tiem tilpums (komplements un izotoniskais šķīdums.
Visā eksperimentā katra no tām (komplementa un izotoniskā šķīduma) tilpums tiek reizināts ar mēģeņu skaitu, kas piedalās RSC. Piemēram, lai veiktu eksperimentu 50 mēģenēs, jums jāņem 10 ml komplementa 1:10 (0,2 mlx50) un 15 ml izotoniskā šķīduma (0,3 mlx50).
4. Antigēnu parasti iegūst gatavu ar norādītu tā titru, t.i. daudzums, kam pēc antigēna atšķaidīšanas jābūt 1 ml. piemēram, ar titru 0,4, to atšķaida 0,96 ml izotoniskā šķīduma. Eksperimentam es ņemu antigēna daudzumu, kas vienāds ar pusi no titra (0,5 ml). Tā ir viņa darba deva. Aprēķiniet kopējo antigēna atšķaidījumu visam eksperimentam, reizinot 0,5 ml ar mēģeņu skaitu eksperimentā.
5. Antiviela – pacienta serums. Svaigs serums pirms eksperimenta tiek inaktivēts, lai iznīcinātu tajā esošo komplementu. Lai to izdarītu, tas tiek karsēts 30 minūtes 56˚C ūdens vannā vai inaktivatorā ar termostatu. Pēdējā metode ir vēlama: tā novērš sūkalu pārkaršanas, t.i., to denaturācijas iespēju. Denaturēti serumi nav piemēroti testēšanai. Pacienta serumu parasti lieto atšķaidījumā no 1:10 līdz 1:160.
Tabula Nr.14
| Sastāvdaļas, ml | mēģenes | |||||||||||
| pieredze | kontrole | |||||||||||
| Hemolītiskā sistēma | sarkanās asins šūnas | |||||||||||
| Izotonisks šķīdums | 1,45 | 1,4 | 1,35 | 1,3 | 1,25 | 1,2 | 1,15 | 1,1 | 1,05 | 1,0 | 1,5 | 1,5 |
| Papildinājums 1:10 | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,35 | 0,4 | 0,45 | 0,5 | ― | 0,5 |
| Hemolītiskā sistēma | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | ― |
| 3% aitu sarkano asins šūnu suspensija | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | 0,5 |
| Mēģenes rūpīgi sakrata un inkubē 37 ˚C 1 stundu. | ||||||||||||
| rezultāts | Nav hemolīzes | Hemolīze | Nav hemolīzes |
Imūnserumus visbiežāk sagatavo ražošanas apstākļos un atbrīvo inaktivētus. Tos atšķaida proporcijā 1:50 un vairāk.
Visas sastāvdaļas ir sagatavotas ar nelielu pārpalikumu.
| Sastāvdaļas, ml | Mēģenes | |||||||
| Pieredzes kontrole | ||||||||
| serums | antigēns | Hemolītiskā sistēma | Papildināt darba devā | |||||
| ½ | ||||||||
| 1. fāze Izotoniskais šķīdums | ― | 0,5 | 0,5 | 1,5 | 1,25 | 1,0 | 0,5 | |
| Testa serums atšķaidīts 1:10 | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ― | |
| Antigēns darba devā | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ||
| Papildināt 1:10 darba devā | 0,5 | 0,5 | 0,5 | ― | 0,25 | 0,5 | 1,0 | |
| Mēģenes rūpīgi sakrata un inkubē 37°C temperatūrā 45 minūtes 1 stundu vai 4°C 18 stundas. | ||||||||
| 2. fāzes hemolītiskā sistēma | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | |
| Mēģenes rūpīgi sakrata un inkubē 37 °C temperatūrā līdz pilnīgai hemolīzei 2., 3., 6. un 7. mēģenēs. | ||||||||
| Rezultāts | Pozitīvi vai negatīvs | ― | ― | ++++ | (+) | ― | ― | |
Tabula Nr.15
Galvenā eksperimenta veikšana
Uzstādot eksperimentu, tas ir ārkārtīgi; Svarīga ir sastāvdaļu pievienošanas secība. Eksperiments tiek veikts divos posmos.
I fāze. Mēģenēs ielej nepieciešamo izotoniskā nātrija hlorīda šķīduma daudzumu, pēc tam vajadzīgo daudzumu atšķaidītā seruma un antigēna un komplementa darba devas tādā pašā tilpumā. Eksperimentam ir jākontrolē visas tajā iesaistītās sastāvdaļas: serums, antigēns, hemolītiskā sistēma un komplements.
Mēģenes rūpīgi sakrata un inkubē 37°C 45 min-1 stundu vai 4°C (“RSC in the cold”) 18 stundas.Šajā laikā specifiska kompleksa klātbūtnē notiek komplementa saistīšanās. Reakcijas veikšana “aukstumā” ievērojami palielina tās jutīgumu un specifiskumu.
II fāze. Inkubācijas beigās visām mēģenēm pievieno 1 ml hemolītiskās sistēmas, ko iepriekš 30 minūtes tur termostatā (sensibilizēta). Mēģenes sakrata un ievieto atpakaļ termostatā.
Grāmatvedības rezultāts par. Mēģenes tiek atstātas termostatā līdz pilnīgai hemolīzei 2., 3., 6. un 7. mēģenēs (seruma, antigēna un komplementa kontrole vienai un divām devām). Hemolīze vispirms notiks 7. mēģenē, kas satur dubultu komplementa daudzumu. Pēc tam, kad šajā mēģenē notiek hemolīze un tās saturs kļūst pilnīgi caurspīdīgs, jums īpaši rūpīgi jāuzrauga atlikušās kontroles. Tiklīdz šķidrums 2., 3. un 6. mēģenē kļūst caurspīdīgs, jums nekavējoties jānoņem statīvs ar mēģenēm no termostata. Par to, ka eksperiments netika turēts termostatā ilgāk nekā nepieciešams, liecina neliela duļķainība (nepilnīga hemolīze) 5. mēģenē - tajā ir tikai puse no komplementa darba devas un pilnīga hemolīze nevar notikt, ja eksperiments ir iestatīt pareizi.
Hemolīze serumā un antigēna kontrole (2. un 3. mēģene) norāda, ka to devas ir izvēlētas pareizi un ka ne serums, ne pats antigēns nesaista komplementu.
Hemolītiskās sistēmas kontrolē (4. mēģene), ja tā darbojas pareizi, nedrīkst būt pat hemolīzes pēdas - tajā nav komplementa.
Kad esat pārliecināts, ka vadīklas tika veiktas pareizi, varat ņemt vērā pieredzi. Hemolīzes neesamība mēģenēs tiek uzskatīta par pozitīvu reakcijas rezultātu. Tas norāda, ka serumā ir antivielas, kas raksturīgas ņemtajam antigēnam. Komplekss, ko tie veidoja, saistīja komplementu un neļāva tam piedalīties hemolīzes reakcijā. Ja mēģenēs notiek hemolīze, reakcijas rezultāts tiek novērtēts kā negatīvs. IN šajā gadījumā nav atbilstības starp antigēnu un antivielu, komplements nav saistīts un ir iesaistīts hemolīzes reakcijā.
Paralēli pacienta serumam tiek veikts tāds pats eksperiments ar acīmredzami pozitīvu serumu (t.i., ar serumu, kas satur antivielas pret noteiktu antigēnu) un acīmredzami negatīvu serumu, kas nesatur specifiskas antivielas. Ja eksperiments ir pareizi iestatīts, pirmajā gadījumā hemolīzei vajadzētu būt aizkavētai, bet otrajā - hemolīzei.
Reakcijas intensitāti izsaka šādi:
Pilnīga hemolīzes aizkavēšanās. Sarkanās asins šūnas veido vienmērīgu duļķainību vai nosēžas apakšā. Šajā gadījumā šķidrums mēģenē kļūst bezkrāsains;
Apmēram 25% sarkano asins šūnu tiek lizēti. Nogulumu ir mazāk, šķidrums virs tiem ir viegli sārts. Arī RSC rezultāts tiek novērtēts kā izteikti pozitīvs;
Apmēram 50% sarkano asins šūnu tiek lizēti. Nogulsnes ir mazas, šķidrums ir rozā krāsā. Pozitīvs RSC rezultāts;
Apmēram 75% sarkano asins šūnu tiek lizēti. Nelielas nogulsnes, virs kurām ir intensīvas krāsas šķidrums. Apšaubāms RSC rezultāts;
Visas sarkanās asins šūnas tika lizētas. Šķidrums ir intensīvi krāsots un pilnīgi caurspīdīgs. Negatīvs RSK rezultāts.
Šo reakciju izmanto, lai noteiktu antivielas asins serumā pacientiem ar bakteriālām, vīrusu, vienšūņu infekcijām, kā arī identificētu un tipizētu no pacientiem izolētus vīrusus.
RSC attiecas uz sarežģītām seroloģiskām reakcijām, kurās bez antigēna, antivielas un komplementa piedalās arī hemolītiskā sistēma, atklājot reakcijas rezultātus. RSC notiek divās fāzēs: pirmā ir antigēna mijiedarbība ar antivielu, piedaloties komplementam, un otrā ir komplementa saistīšanās pakāpes noteikšana, izmantojot hemolītisko sistēmu. Šī sistēma sastāv no aitas sarkanajām asins šūnām un hemolītiskā seruma, kas iegūts, imunizējot laboratorijas dzīvniekus ar sarkanajām asins šūnām. Eritrocīti tiek apstrādāti – sensibilizēti, pievienojot tiem serumu 37°C temperatūrā 30 minūtes. Sensibilizēto aitu eritrocītu līze notiek tikai tad, ja tie pievienojas hemolītiskā komplementa sistēmai. Ja tā nav, sarkanās asins šūnas nemainās. RSC rezultāti ir atkarīgi no antivielu klātbūtnes testa serumā. Ja serumā ir antivielas, kas ir homologas reakcijā izmantotajam antigēnam, tad iegūtais antigēna-antivielu komplekss saista un saista komplementu. Pievienojot hemolītisko sistēmu, šajā gadījumā hemolīze nenotiks, jo viss komplements tiek iztērēts antigēna-antivielu kompleksa specifiskajai saitei.
Sarkanās asins šūnas paliek nemainīgas, tāpēc hemolīzes neesamība mēģenē tiek reģistrēta kā pozitīvs RBC. Ja serumā nav antigēnam atbilstošu antivielu, specifisks antigēna-antivielu komplekss neveidojas un komplements paliek brīvs. Kad tiek pievienota hemolītiskā sistēma, tai pievienojas komplements un izraisa sarkano asins šūnu hemolīzi. Sarkano asins šūnu iznīcināšana un to hemolīze raksturo negatīvu reakciju.
RSC stadijai nepieciešams: pacienta serums, komplements, hemolītiskā sistēma, kas sastāv no aitas eritrocītiem un hemolītiskā seruma, kā arī izotonisks nātrija hlorīda šķīdums.
Reakciju veic seroloģiskās mēģenēs. Aitu sarkanās asins šūnas tiek iegūtas no defibrinētām aitu asinīm, trīs reizes mazgājot tās ar izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu. Hemolītisko serumu ražo jau gatavu ampulās, uz kuru etiķetes ir norādīts tā titrs, t.i., maksimālais seruma atšķaidījums, kas, pievienojot sarkanajām asins šūnām komplementa klātbūtnē, tomēr izraisa hemolīzi. Hemolītisko serumu iegūst, imunizējot dzīvniekus, piemēram, trušus, ar aitas sarkanajām asins šūnām. Iestatot reakciju, serumu izmanto trīskāršā titrā. Piemēram, hemolītiskā seruma titrs ir 1:1200, un darba atšķaidījums ir 1:400. Kā komplementu izmanto svaigu jūrascūciņu asins serumu (24-48 stundu laikā) vai sauso komplementu ampulās.
Pirms RSC veikšanas komplementu atšķaida attiecībā 1:10 un titrē, lai noteiktu titru – mazāko komplementa daudzumu, kas rodas sarkano asins šūnu hemolīzes rezultātā, apvienojot to ar šajā reakcijā izmantoto hemolītisko sistēmu. Ņemot vērā antigēna iespējamās anti-komplementārās īpašības, veicot reakciju, noteiktais komplementa darba titrs tiek palielināts par 20-30%.
RSC antigēns ir nogalinātu baktēriju suspensijas, ekstrakti, kas pagatavoti no šīm suspensijām, un atsevišķas mikrobu ķīmiskās frakcijas. Galvenā prasība pēc antigēna ir komplementa aktivitātes kavēšanas trūkums. Tam nevajadzētu būt komplementārām īpašībām. Lai identificētu šīs antigēna īpašības, komplements tiek papildus titrēts reakcijā izmantotā antigēna klātbūtnē. Ir noteiktas shēmas RSC iestudēšanai. Reakcijas rezultāti tiek ņemti vērā, ņemot vērā sarkano asins šūnu hemolīzes esamību vai neesamību hemolītiskajā sistēmā. RSC izmanto sifilisa (Vasermana reakcija), gonorejas (Bordē-Gengo reakcija), toksoplazmozes, riketsiāla un vīrusu slimības.
Komplementa saistīšanās reakcija (CFR) ir tāda, ka tad, kad antigēni un antivielas atbilst viens otram, tie veido imūnkompleksu, kuram komplements (C) tiek piesaistīts caur antivielu Fc fragmentu, t.i., komplementu saista antigēna-antivielu komplekss. Ja antigēna-antivielu komplekss neveidojas, komplements paliek brīvs.
AG un AT specifisko mijiedarbību pavada komplementa adsorbcija (saistīšanās). Tā kā komplementa fiksācijas process nav vizuāli redzams, J. Bordet un O. Zhangu ierosināja izmantot hemolītisko sistēmu (aitas sarkanās asins šūnas + hemolītiskais serums) kā indikatoru, kas parāda, vai komplements ir fiksēts ar AG-AT kompleksu. Ja AG un AT atbilst viens otram, t.i., ir izveidojies imūnkomplekss, tad ar šo kompleksu saistās komplements un hemolīze nenotiek. Ja AT neatbilst AG, tad komplekss neveidojas un komplements, paliekot brīvs, savienojas ar otro sistēmu un izraisa hemolīzi.
Reakcijas gaita
Reakcija notiek divās fāzēs, iesaistot divas sistēmas; bakteriālas un hemolītiskas. Pirmā reakcija (specifiskā) ietver antigēnu 4-+ antivielu + komplementu. Pozitīvu reakcijas rezultātu, kas rodas, antivielām sakrītot ar antigēnu, raksturo specifiska baktēriju antigēna-antivielu kompleksa veidošanās ar adsorbētu jeb, kā saka, “saistītu” komplementu. Paliekot neredzams, komplekss neizraisa nekādas ārējas izmaiņas vidē, kurā tas veidojies. Negatīvs RSC rezultāts rodas, ja nav specifiskas afinitātes starp antigēnu un seruma antivielu, un to raksturo brīvā aktīvā komplementa saglabāšanās. Pirmo RSC fāzi var veikt termostatā 37°C (1-2 stundas) vai ledusskapī 3-4°C (18-20 stundas). Ilgstoši veidojoties antigēna-antivielu imūnkompleksam aukstumā, notiek pilnīgāka komplementa saistīšanās, un rezultātā palielinās reakcijas jutība. Veicot salīdzinošos eksperimentus, padomju imunologs akadēmiķis. V.I.Ioffe un viņa skolēni parādīja, ka ilgstošas komplementa fiksācijas apstākļos aukstumā ir iespējams notvert 100-500 reižu mazāku antigēna daudzumu un iegūt pozitīvi rezultāti pie lielākiem imūnseruma atšķaidījumiem nekā komplementa fiksācijas eksperimentā 37 ° C temperatūrā 1-2 stundas.Otrā reakcijas fāze (indikators) notiek starp hemolītiskās sistēmas reaģentiem (3% suspensijas maisījums eritrocīti un hemolītiskais serums vienādos tilpumos) 37 °C temperatūrā tikai komplementa klātbūtnē, kas palika brīvs no reakcijas pirmās fāzes (negatīva reakcija). Ja nav brīva aktīvā komplementa, sarkano asins šūnu hemolīze specifisku hemolizīnu ietekmē nenotiek (reakcija ir pozitīva).
Sastāvdaļas
Komplementa saistīšanās reakcija (CFR) ir sarežģīta seroloģiska reakcija. Lai to veiktu, ir nepieciešamas 5 sastāvdaļas, proti: AG, AT un komplements (pirmā sistēma), aitas eritrocīti un hemolītiskais serums (otrā sistēma).
RSC antigēns var būt dažādu nogalinātu mikroorganismu kultūras, to lizāti, baktēriju sastāvdaļas, patoloģiski izmainītas un normāli orgāni, audu lipīdi, vīrusi un vīrusus saturoši materiāli.
Kā papildinājumu izmanto svaigu vai kaltētu jūrascūciņu serumu.
Reakcijas mehānisms
RSK tiek veikts divās fāzēs: 1. fāze - maisījuma, kas satur trīs komponentus antigēns + antiviela + komplements, inkubācija; 2. fāze (indikators) - brīvā komplementa noteikšana maisījumā, pievienojot tam hemolītisko sistēmu, kas sastāv no aitu eritrocītiem un hemolītiskā seruma, kas satur antivielas pret tiem. Reakcijas 1.fāzē, veidojoties antigēna-antivielu kompleksam, saistās komplements, un tad 2.fāzē nenotiks ar antivielām sensibilizēto eritrocītu hemolīze; reakcija ir pozitīva. Ja antigēns un antiviela nesakrīt (pārbaudāmajā paraugā nav antigēna vai antivielas), komplements paliek brīvs un 2.fāzē pievienosies eritrocītu - antieritrocītu antivielu kompleksam, izraisot hemolīzi; reakcija ir negatīva.
Pieteikums
Komplementa fiksācijas reakciju var izmantot, lai:
1) specifisku antivielu identificēšana nezināmā serumā, pamatojoties uz to mijiedarbību ar zināma rakstura antigēnu;
2) antigēna īpašību izpēte reakcijā ar zināmu specifisku serumu. Sastāvdaļu sagatavošana RSC iestudēšanai.
1. Pētījumiem iegūto asins serumu reakcijas priekšvakarā 30 minūtes karsē ūdens vannā 56°C, lai inaktivētu savu komplementu. Inaktivētu serumu var uzglabāt 3-4°C temperatūrā 5-6 dienas. Eksperimenta dienā serumu atšķaida ar izotoniskā nātrija hlorīda šķīdumu attiecībā 1:5 (0,1 ml testa seruma + 0,4 ml izotoniskā nātrija hlorīda šķīduma).
2. Antigēns CSC ražošanai var būt dažādu mikrobu kultūras, baktēriju proteīni un ekstrakti, kas iegūti no mikrobu kultūrām, patoloģiski izmainītiem un normāliem orgāniem un audiem. Antigēna sagatavošanas specifiku nosaka infekcijas procesa raksturs un tā patogēna īpašības.
3. Komplements ir serumu maisījums, kas iegūts no 3-5 veselām jūrascūciņām, vai sausais komplements ampulās.
Tieši pirms lietošanas jūrascūciņu serumu atšķaida ar izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu attiecībā 1:10, lai iegūtu izejas šķīdumu.
4. Pirms eksperimenta veikšanas hemolītisko serumu inaktivē, karsējot 56 °C temperatūrā 30 minūtes. Lai veiktu galveno RSC eksperimentu, kā arī titrētu komplementu un antigēnu, hemolītisko serumu izmanto trīskāršā titrā. Piemēram, ja hemolītiskā seruma titrs ir 1:1800, reakcijā izmanto seruma atšķaidījumu 1:600.
5. Eritrocītus iegūst no defibrinētām aitas asinīm. Lai noņemtu fibrīna plēves, asinis filtrē caur trīsslāņu marles filtru. Iegūto filtrātu centrifugē, serumu atsūc un notecina, un eritrocītus mazgā, 3-4 reizes centrifugējot ar izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu. Kad sarkanās asins šūnas tiek mazgātas pēdējo reizi, šķidruma supernatantam jābūt pilnīgi caurspīdīgam. 3% suspensiju pagatavo no mazgātām sarkanajām asins šūnām izotoniskā nātrija hlorīda šķīdumā. Sagatavojot RSC iesaistītās sastāvdaļas iepriekšminētajā veidā, pārejiet pie hemolītiskā seruma, komplementa un antigēna titrēšanas.
Mācību grāmata sastāv no septiņām daļām. Pirmā daļa – “Vispārīgā mikrobioloģija” – satur informāciju par baktēriju morfoloģiju un fizioloģiju. Otrā daļa ir veltīta baktēriju ģenētikai. Trešajā daļā “Biosfēras mikroflora” tiek pētīta mikroflora vidi, tās lomu vielu apritē dabā, kā arī cilvēka mikrofloru un tās nozīmi. Ceturtā daļa “Infekcijas doktrīna” ir veltīta mikroorganismu patogēnajām īpašībām, to lomai. infekcijas process, kā arī satur informāciju par antibiotikām un to darbības mehānismiem. Piektā daļa – “Imunitātes doktrīna” – satur mūsdienīgas idejas par imunitāti. Sestajā daļā – “Vīrusi un to izraisītās slimības” – sniegta informācija par vīrusu bioloģiskajām pamatīpašībām un to izraisītajām slimībām. Septītā daļa - “Privātā medicīniskā mikrobioloģija” - satur informāciju par daudzu patogēnu morfoloģiju, fizioloģiju, patogēnajām īpašībām. infekcijas slimības, un arī par modernas metodes viņu diagnostika, specifiska profilakse un terapija.
Mācību grāmata ir paredzēta studentiem, maģistrantiem un augstākās medicīnas pasniedzējiem izglītības iestādēm, universitātes, visu specialitāšu mikrobiologi un praktizējoši ārsti.
5. izdevums, pārskatīts un paplašināts
Grāmata:
| <<< Назад
|
Uz priekšu >>> |
Komplementa fiksācijas reakcija
Ir atklāta unikālā komplementa spēja specifiski saistīties ar dažāda rakstura antigēna + antivielu kompleksiem plašs pielietojums komplementa saistīšanās reakcijā (CFR). Īpaša RSC priekšrocība ir tā, ka tajā iesaistītā antigēna raksturam (korpuskulārajam vai šķīstošajam) nav nozīmes, jo komplements saistās ar jebkuras ar IgG un IgM saistītas antivielas Fc fragmentu neatkarīgi no tā antivielu specifiskuma. Turklāt RSA ir ļoti jutīga: tā ļauj noteikt antivielu daudzumu 10 reizes mazāk nekā, piemēram, nokrišņu reakcijā. RSC 1901. gadā ierosināja J. Bordet un O. Zhang. Tas ir balstīts uz divām komplementa īpašībām:
1) spēja saistīties ar antigēna + antivielu kompleksu;
2) hemolītiskā seruma iegūšanai izmantoto sarkano asins šūnu līze.
RSK tiek veikts divos posmos, un tajā ir iesaistītas attiecīgi divas sistēmas - eksperimentālā jeb diagnostikas un indikatora. Diagnostikas sistēma sastāv no testa (vai diagnostikas) seruma, kas tiek karsēts 56 °C temperatūrā 30 minūtes pirms reakcijas, lai inaktivētu tajā esošo komplementu un antigēnu. Šai sistēmai ir pievienots standarta papildinājums. Tās avots ir svaigas vai kaltētas jūrascūciņu sūkalas. Maisījumu vienu stundu inkubē 37 °C temperatūrā. Ja testa serumā ir antivielas, tās mijiedarbosies ar pievienoto antigēnu, un iegūtie antigēna + antivielu kompleksi saistīs pievienoto komplementu. Ja serumā nav antivielu, antigēna + antivielu kompleksa veidošanās nenotiks, un komplements paliks brīvs. Šajā reakcijas stadijā parasti nav redzamu komplementa fiksācijas izpausmju. Tāpēc, lai noskaidrotu jautājumu, vai ir notikusi komplementa saistīšanās vai nē, pievieno otru indikatoru sistēmu (inaktivēts hemolītiskais serums + aitas sarkanās asins šūnas) un visu RSC komponentu maisījumu vēlreiz inkubē 37 °C 30 - 60 minūtes. , pēc kura tiek novērtēti reakcijas rezultāti. Ja komplements ir saistīts pirmajā stadijā, diagnostikas sistēmā, t.i., pacienta serumā ir antivielas, bet komplementu saista antivielu + + antigēnu komplekss, eritrocītu līze nenotiks - RBC ir pozitīvs: šķidrums ir bezkrāsains, mēģenes apakšā ir eritrocītu nogulsnes. Ja serumā nav specifisku antivielu un diagnostikas sistēmā nenotiek komplementa saistīšanās, t.i., RSC ir negatīvs, tad diagnostikas sistēmā neiztērētais komplements saistās ar sarkano asins šūnu kompleksu + indikatoru sistēmas antivielas un hemolīzi. notiek: mēģenē “lakotas asinis”, sarkano asins šūnu nogulsnes Nr. RSC intensitāti novērtē, izmantojot četru krustu sistēmu atkarībā no hemolīzes aizkavēšanās pakāpes un sarkano asins šūnu nogulumu klātbūtnes. Reakciju papildina atbilstošas kontroles: seruma kontrole (bez antigēna) un antigēna kontrole (bez seruma), jo dažiem serumiem un dažiem antigēniem ir anti-komplementāra iedarbība. Pirms RSC veikšanas visas tajā iesaistītās sastāvdaļas, izņemot testa serumu vai antigēnu, tiek rūpīgi titrētas. Īpaši svarīgi ir reakcijā ievadīt precīzu komplementa devu, jo tā trūkums vai pārmērība var izraisīt nepatiesi rezultāti. Komplementa titrs ir minimālais daudzums, kas hemolītiskā seruma darba devas klātbūtnē nodrošina pilnīgu sarkano asins šūnu izšķīšanu. Lai izveidotu galveno eksperimentu, lietojiet komplementa devu, kas palielināta par 20–25%, salīdzinot ar noteikto titru. Hemolītiskā seruma titrs ir tā maksimālais atšķaidījums, kas, sajaucot ar vienādu tilpumu 10% komplementa šķīduma, 1 stundas laikā 37 °C temperatūrā pilnībā hemolizē atbilstošo sarkano asins šūnu devu. Galvenais eksperiments ietver seruma ņemšanu, kas atšķaidīts līdz 1/3 no tā titra.
Komplementa fiksācijas reakcija ir viena no tradicionālajām seroloģiskās reakcijas, ko izmanto daudzu vīrusu slimību diagnosticēšanai, kā arī veido pamatu dažām citām noteikšanas metodēm pretvīrusu antivielas. Kaut arī neitralizācijas reakcija, hemaglutinācijas kavēšana, netiešā hemaglutinācija, saistītais imūnsorbcijas tests jutības ziņā pārāka par komplementa saistīšanas reakciju, tomēr tehnikas vienkāršība, agrīna antivielu noteikšana, kā arī vīrusu antigēnu noteikšana, kuriem nepiemīt hemaglutinējošas īpašības, izskaidro tās plašo izmantošanu virusoloģiskajos pētījumos.
Tās ražošanai nav nepieciešama tik augsta antigēnu zāļu koncentrācijas un tīrības pakāpe, kas nepieciešama vairākām citām imunoloģiskām reakcijām. Turklāt daudzu vīrusu komplementu fiksējošo antigēnu grupas specifika ļauj izmantot komplementa saistīšanas reakciju masu diagnostikā: šī reakcija neatklāj celmu atšķirības un ir īpaši vērtīga, pētot antigēnu attiecības starp vīrusiem.
Pats nosaukums lielā mērā atspoguļo metodes būtību, kas sastāv no divām atsevišķām reakcijām. Pirmajā posmā reakcija ietver antigēnus un antivielas (viena no šīm sastāvdaļām ir iepriekš zināma), kā arī komplementu titrētā daudzumā. Ja antigēns un antivielas sakrīt, to komplekss saista komplementu, kas tiek noteikts otrajā posmā, izmantojot indikatoru sistēmu (aitas sarkano asins šūnu un to antiseruma maisījumu). Ja antigēna un antivielu mijiedarbības laikā tiek piesaistīts komplements, tad aitas sarkano asins šūnu līze nenotiek ( pozitīva reakcija komplementa fiksācija). Negatīvās komplementa saistīšanās reakcijas gadījumā nefiksēts komplements veicina hemolīzi, ko izmanto, lai spriestu par reakcijas rezultātiem.
Komplementa fiksācijas reakcijas galvenie komponenti ir antigēni (zināmi vai nosakāmi), antivielas (zināmi antiserumi vai testa serumi), komplements, hemolītiskais serums un aitas sarkanās asins šūnas; Kā atšķaidītāju izmanto izotonisko nātrija hlorīda šķīdumu (pH 7,2-7,4) vai dažādus buferšķīdumus. Antigēni un serumi var būt anti-komplementāri, t.i. spēja adsorbēt komplementu, kas aizkavē hemolīzi un izkropļo reakcijas rezultātu.
CSC antigēnus sagatavo no inficētu dzīvnieku orgāniem, inficētu vistu embriju alantoiskā vai amnija šķidruma, kā arī kultūras šķidruma pēc vīrusu kultivēšanas audu šūnu kultūrās. Antigēnu preparātu sastāvā vienmēr ir daudz balasta vielu no dzīvnieku šūnām vai audu kultūrām, kas var arī izkropļot reakcijas rezultātus.
Iegūtie vīrusu antigēni tiek inaktivēti, tiek noteikta darba deva, kā arī antikomplementārās un hemolītiskās īpašības. Pēc tam antigēnu titrē komplementa klātbūtnē.
Otrais galvenais komponents reakcijas inscenēšanā ir komplements. Šis termins nozīmē sarežģīta sistēma olbaltumvielas un faktori, kas atrodas dzīvnieku un cilvēku asinīs. Parasti komplementa fiksācijas reakcijā izmanto jūrascūciņu asins serumu. Komplementa aktivitāte (titrs) ir tā mazākais daudzums, kura klātbūtnē hemolizīns izraisa pilnu izmantotās hemolītiskās sistēmas hemolīzi.
Lai identificētu komplementu fiksējošās antivielas pret vīrusiem, serums ir jāinaktivē, lai 560C temperatūrā 30 minūtes likvidētu komplementu. Serumus no imunizētiem dzīvniekiem parasti izmanto kā atsauces serumus. Turklāt imunizācijai tiek izmantoti vīrusu antigēni, kas ir rūpīgi attīrīti no audu piemaisījumiem, jo pretējā gadījumā notiek izteikta nespecifiska reakcija.
Komplementa saistīšanās reakcijas obligāta sastāvdaļa ir hemolītiskā sistēma, kurā ietilpst aitu eritrocīti un hemolītiskais serums, kas iegūts, trušus hiperimunizējot ar aitas eritrocītiem.
Komplementa saistīšanas reakcijas veikšanai tiek izmantotas šādas modifikācijas: komplementa saistīšanas reakcijas mikrometode Takachi sistēmas mikrotitratorā, ilgstoša komplementa saistīšanās reakcija, netiešā komplementa saistīšanās reakcija, komplementa saistīšanas reakcija gēlā, mikropiliens. komplementa saistīšanas reakcija, komplementa saistīšanās reakcija uz cietas bāzes.
Lai gan komplementa fiksācijas reakcijas jutība ir zema, tai ir augsta specifika. Šajā sakarā to plaši izmanto vīrusu pneimoenterīta diagnosticēšanai jaunlopiem.
