Mājas Noņemšana Detalizēta aglutinācijas reakcija (RA). Aptuvenā aglutinācijas reakcija (RA)

Noņemšana

Detalizēta aglutinācijas reakcija (RA). Aptuvenā aglutinācijas reakcija (RA)

Netiešās (pasīvās) hemaglutinācijas reakcijas (IRHA) pamatā ir fakts, ka sarkanās asins šūnas, ja uz to virsmas tiek adsorbēts šķīstošs antigēns, mijiedarbojoties ar antivielām pret adsorbēto antigēnu, iegūst aglutinācijas spēju. RNGA diagramma ir parādīta attēlā. 34. RNGA plaši izmanto vairāku infekciju diagnostikā.

Rīsi. 34. Pasīvās hemaglutinācijas reakcijas (RPHA) shēma. A - eritrocītu diagnostikas iegūšana: B - RPGA: 1 - eritrocīts: 2 - tiek pētīts antigēns; 3 - eritrocītu diagnostika; 4 - antiviela pret pētāmo antigēnu: 5 - aglutināts

Reakcijas iestatīšana. Testējamo serumu karsē 30 minūtes 56°C temperatūrā, secīgi atšķaida proporcijā 1:10 - 1:1280 un lej 0,25 ml mēģenēs vai iedobēs, kur iepilina 2 pilienus eritrocītu diagnostikas (eritrocīti ar uz tiem adsorbētu antigēnu). ) pēc tam tiek pievienoti.

Kontroles: eritrocītu diagnostikas suspensija ar zināmu imūnserumu; diagnostikas apturēšana ar normālu serumu; normālu sarkano asins šūnu suspensija ar testa serumu. Pirmajā kontrolē jānotiek aglutinācijai, otrajā un trešajā tā nedrīkst notikt.

Izmantojot RIGA, jūs varat noteikt nezināmu antigēnu, ja zināmas antivielas ir adsorbētas uz sarkanajām asins šūnām.

Hemaglutinācijas reakciju var veikt 0,025 ml tilpumā (mikrometode), izmantojot Takachi mikrotitratoru.

Kontroles jautājumi

1. Ko liecina pozitīvs rentgena analīzes rezultāts starp sarkanajām asins šūnām un materiālu, kas tiek pārbaudīts attiecībā uz vīrusa klātbūtni?

2. Vai notiks sarkano asinsķermenīšu aglutinācija, ja tām pievieno vīrusu un tam atbilstošu serumu? Kā sauc reakciju, kas atklāj šo parādību?

Vingrinājums

Ņem vērā un reģistrē rezultātu RĪGA.

Nokrišņu reakcija

Izgulsnēšanas reakcijā tiek izgulsnēts specifisks imūnkomplekss, kas sastāv no šķīstoša antigēna (lizāta, ekstrakta, haptēna) un specifiskas antivielas elektrolītu klātbūtnē.

Duļķaino gredzenu vai nogulsnes, kas veidojas šīs reakcijas rezultātā, sauc par nogulsnēm. Šī reakcija no aglutinācijas reakcijas galvenokārt atšķiras ar antigēna daļiņu lielumu.

Nokrišņu reakciju parasti izmanto, lai noteiktu antigēnu vairāku infekciju diagnostikā ( Sibīrijas mēris, meningīts utt.); tiesu medicīnā - noteikt asiņu, spermas uc sugas; sanitārajos un higiēniskajos pētījumos - konstatējot produktu viltojumu; ar tās palīdzību tiek noteiktas dzīvnieku un augu filoģenētiskās attiecības. Reakcijai jums ir nepieciešams:

1. Antivielas (precipitīni) - imūnserums ar augstu antivielu titru (ne zemāku par 1:100 000). Izgulsnējošā seruma titru nosaka pēc antigēna augstākā atšķaidījuma, ar kuru tas reaģē. Serumu parasti lieto neatšķaidītu vai atšķaidījumā 1:5 – 1:10.

2. Antigēns - izšķīdušas proteīna vai lipoīdu polisaharīdu dabas vielas (pilni antigēni un haptēni).

3. Izotoniskais šķīdums.

Galvenās izgulsnēšanas reakcijas veikšanas metodes ir: gredzenveida izgulsnēšanas reakcija un izgulsnēšanas reakcija agarā (gelā).

Uzmanību! Visām nokrišņu reakcijā iesaistītajām sastāvdaļām jābūt pilnīgi caurspīdīgām.

Gredzena nokrišņu reakcija. Izmantojot Pasteur pipeti, nogulsnēšanas mēģenē pievienojiet 0,2-0,3 ml (5-6 pilienus) seruma (serums nedrīkst nokļūt uz mēģenes sieniņām). Antigēns tādā pašā tilpumā tiek rūpīgi uzklāts uz seruma, izlejot to ar plānu Pastēra pipeti gar mēģenes sieniņu. Mēģene tiek turēta slīpā stāvoklī. Ja tas ir pareizi uzklāts, starp serumu un antigēnu jābūt skaidrai robežai. Uzmanīgi, lai šķidrums nesajauktos, mēģeni ievieto statīvā. Ja reakcija ir pozitīva, antigēna un antivielas saskarnes vietā veidojas duļķains “gredzens” - nogulsnes (sk. 48. att.).

Reakcijai ir pievienotas vairākas kontroles (18. tabula). Ļoti svarīga ir reakcijas sastāvdaļu pievienošanas secība mēģenē. Jūs nevarat uzklāt serumu uz antigēna (kontrolē - uz izotoniskā šķīduma), jo seruma relatīvais blīvums ir lielāks, tas nogrims mēģenes apakšā, un robeža starp šķidrumiem netiks atklāta.

18. tabula. Gredzena izgulsnēšanas reakcijas iestatīšanas shēma

Piezīme. + “gredzena” klātbūtne; - “gredzena” trūkums.

Rezultāti tiek reģistrēti pēc 5-30 minūtēm, dažos gadījumos pēc stundas, kā vienmēr, sākot ar vadīklām. “Gredzens” 2. mēģenē norāda imūnseruma spēju iekļūt specifiska reakcija ar atbilstošo antigēnu. 3-5 mēģenēs nedrīkst būt “gredzenu” - nav viens otram atbilstošu antivielu un antigēnu. "Gredzens" 1. mēģenē - pozitīvs reakcijas rezultāts - norāda, ka testa antigēns atbilst ņemtajam imūnserumam, "gredzena" neesamība ("gredzens" tikai 2. mēģenē) norāda uz to neatbilstību - negatīvu. reakcijas rezultāts.

Izgulsnēšanās reakcija agarā (gelā). Reakcijas īpatnība ir tāda, ka antigēna un antivielu mijiedarbība notiek blīvā vidē, t.i., gēlā. Iegūtās nogulsnes barotnes biezumā rada duļķainu svītru. Joslas trūkums norāda uz neatbilstību starp reakcijas komponentiem. Šo reakciju plaši izmanto biomedicīnas pētījumos, jo īpaši pētot toksīnu veidošanos difterijas izraisītājā.

Kontroles jautājumi

1. Kāda ir galvenā atšķirība starp aglutinācijas un nokrišņu reakcijām?

2. Kāpēc nokrišņu reakcijā nevar izmantot duļķainas sastāvdaļas?

Vingrinājums

1. Uzstādiet gredzena izgulsnēšanas reakciju un uzzīmējiet rezultātu.

2. Izpētiet antigēna un antivielu mijiedarbības raksturu izgulsnēšanās reakcijā agarā, ieskicējiet rezultātu (paņemiet krūzīti no skolotāja).

Līzes reakcija (imūnā citolīze)

Imūnlīze ir šūnu izšķīšana antivielu ietekmē, kad obligāta dalība papildināt. Reakcijai jums ir nepieciešams:

1. Antigēns – mikrobi, sarkanās asins šūnas vai citas šūnas.

2. Antiviela (lizīns) - imūnserums, retāk pacienta serums. Bakteriolītiskais serums satur antivielas, kas iesaistītas baktēriju lizē; hemolītiski - hemolizīni, kas veicina sarkano asinsķermenīšu līzi; spirohetu līzei nepieciešami spirohetolizīni, šūnas - itolizīni utt.

3. Papildināt. Visvairāk papildina serumu jūrascūciņas. Šo serumu (vairāku dzīvnieku maisījumu) parasti izmanto kā papildinājumu. Svaigs (vietējais) papildinājums ir nestabils un viegli iznīcina, karsējot, kratot vai uzglabājot, tāpēc to var lietot ne ilgāk kā divas dienas pēc saņemšanas. Lai saglabātu komplementu, tam pievieno 2%. borskābe un 3% nātrija sulfāts. Šo papildinājumu var uzglabāt 4°C temperatūrā līdz divām nedēļām. Visbiežāk izmanto sauso komplementu. Pirms lietošanas to izšķīdina izotoniskā šķīdumā līdz sākotnējam tilpumam (norādīts uz etiķetes).

4. Izotoniskais šķīdums.

Hemolīzes reakcija(19. tabula). Reakcijai jums ir nepieciešams:

1. Antigēns - 3% mazgātu aitu eritrocītu suspensija ar ātrumu 0,3 ml eritrocītu nogulsnes un 9,7 ml izotoniskā šķīduma.

2. Antiviela - hemolītiskais serums (hemolizīns) pret aitu eritrocītiem; parasti sagatavo ražošanā, liofilizē un titru norāda uz etiķetes.

Hemolizīna titrs ir augstākais seruma atšķaidījums, kurā komplementa klātbūtnē notiek pilnīga 3% sarkano asins šūnu suspensijas hemolīze. Hemolīzes reakcijai hemolizīnu ņem trīskāršā titrā, t.i., atšķaida 3 reizes mazāk nekā pirms titra. Piemēram, ar seruma titru 1:1200, serumu atšķaida 1:400 (0,1 ml seruma * un 39,9 ml izotoniskā šķīduma). Ir nepieciešams pārmērīgs hemolizīns, jo daļu no tā var adsorbēt citi reakcijas komponenti.

* (Jums nevajadzētu uzņemt mazāk par 0,1 ml seruma - mērījumu precizitāte cietīs.)

3. Komplementu atšķaida attiecībā 1:10 (0,2 ml komplementa un 1,8 ml izotoniskā šķīduma).

4. Izotoniskais šķīdums.

19. tabula. Hemolīzes reakcijas shēma

Rezultātu uzskaite. Ja reakcija tiek veikta pareizi, 1. mēģenē notiks hemolīze - tās saturs kļūs caurspīdīgs. Kontrolē šķidrums paliek duļķains: 2. mēģenē nav pietiekami daudz komplementa, lai notiktu hemolīze, 3. mēģenē nav hemolizīna, 4. mēģenē nav ne hemolizīna, ne komplementa, 5. mēģenē antigēns to dara. neatbilst antivielām,

Ja nepieciešams, hemolītisko serumu titrē atbilstoši sekojošā diagramma(20. tabula).

Pirms titrēšanas sagatavo sākotnējo seruma atšķaidījumu 1:100 (0,1 ml seruma un 9,9 ml izotoniskā šķīduma), no kura nepieciešamie atšķaidījumi, Piemēram:

No šiem atšķaidījumiem titrēšanas mēģenēs pievienojiet 0,5 ml seruma, kā parādīts tabulā. 20.

20. tabula. Titrēšanas shēma hemolītiskajam serumam (hemolizīns)

Tabulā sniegtajā piemērā. 20, hemolītiskā seruma titrs ir 1:1200.

Lietojot svaigu hemolītisko serumu, tas ir jāinaktivē, lai iznīcinātu tajā esošo komplementu. Lai to izdarītu, to 30 minūtes karsē 56 ° C temperatūrā ūdens vannā vai inaktivatorā ar termostatu. Pēdējā metode ir labāka: tā novērš sūkalu pārkaršanas iespēju, t.i., to denaturāciju. Denaturēti serumi nav piemēroti testēšanai.

Bakteriolīzes reakcija. Šajā reakcijā komplements lizē baktērijas atbilstoša (homologa) seruma klātbūtnē. Reakcijas shēma būtībā ir līdzīga hemolīzes reakcijas shēmai. Atšķirība ir tāda, ka pēc divu stundu inkubācijas visas mēģenes tiek iesētas Petri trauciņos ar eksperimentā ņemtajam mikroorganismam labvēlīgu barotni, lai noskaidrotu, vai tas ir lizēts. Ja eksperiments tiek veikts pareizi, kultūrām no 2-5 mēģenēm (kontroles) vajadzētu uzrādīt bagātīgu augšanu. Augšanas trūkums vai vāja augšana inokulācijā no 1. mēģenes (eksperiments) norāda uz mikrobu nāvi, t.i., ka tie ir homologi pret antivielu.

Uzmanību! Bakteriolīzes reakcija jāveic aseptiskos apstākļos.

Kontroles jautājumi

1. Kas notiks ar sarkanajām asins šūnām, ja izotoniskā nātrija hlorīda šķīduma vietā izmantos destilētu ūdeni? Kas ir šīs parādības pamatā?

2. Kāda reakcija notiks, kad eritrocīti mijiedarbosies ar homologu imūnserumu, ja nav komplementa?

Vingrinājums

Iestatiet hemolīzes reakciju. Ierakstiet un ieskicējiet rezultātu.

Saistītā informācija.

Tas izmanto sarkanās asins šūnas vai neitrālu sintētiskie materiāli(piemēram, lateksa daļiņas), uz kuras virsmas tiek sorbēti antigēni (baktēriju, vīrusu, audu) vai antivielas. To aglutinācija notiek, kad tiek pievienoti atbilstoši serumi vai antigēni. Sarkanās asins šūnas, kas sensibilizētas ar antigēniem, tiek sauktas par antigēnu eritrocītu diagnostiku un tiek izmantotas antivielu noteikšanai un titrēšanai. Ar antivielām sensibilizēti eritrocīti. sauc par imūnglobulīna eritrocītu diagnostiku un izmanto antigēnu noteikšanai.

Pasīvā hemaglutinācijas reakcija tiek izmantota, lai diagnosticētu slimības, ko izraisa baktērijas (tīfs un paratīfs, dizentērija, bruceloze, mēris, holēra u.c.), vienšūņi (malārija) un vīrusi (gripa, adenovīrusu infekcijas, vīrusu hepatīts B, masalas, ērču encefalīts, Krimas hemorāģiskais drudzis u.c.), kā arī noteiktu hormonu noteikšanai, identificēšanai. paaugstināta jutība pacietīgs līdz zāles un hormoni, piemēram, penicilīns un insulīns.

Pasīvā hemaglutinācijas reakcija (RPHA). Pasīvās hemaglutinācijas tests ir jutīga metode seroloģiskā diagnostika un tiek izmantota gan agrīnai, gan retrospektīvai diagnostikai, kā arī vakcinēto cilvēku imunopoģiskā stāvokļa noteikšanai. Pacientiem ar tularēmiju antivielas parasti tiek konstatētas slimības 1. vai 2. nedēļas beigās, pēc 1-1,5 mēnešiem RPHA titri sasniedz maksimālā veiktspēja(1:100000-1:20000, retāk augstāk), pēc tam tie samazinās un ilgstoši saglabājas 1:100-1:200 līmenī.

Vakcinētiem cilvēkiem antivielas tiek konstatētas arī pastāvīgi, tomēr zemākos titros, nepārsniedzot 1:2000-1:5000 1-1,5 mēnešus pēc vakcinācijas, un vairākus gadus saglabājas zemā līmenī 1:20-1:80.

Antigēns RPHA noteikšanai ir tularēmijas eritrocītu diagnostika (antigēns). Zāles ir formalinizētas aitas sarkanās asins šūnas, sensibilizētas ar tularēmijas antigēnu, pieejamas šķidrā un sausā veidā. Šķidrais preparāts - 10% sarkano asins šūnu suspensija 10% koncentrācijas formaldehīda šķīdumā. Sausais liofilizēts preparāts ir vakuumā kaltēta 10% sarkano asins šūnu suspensija bez konservanta. Pirms lietošanas to atšķaida saskaņā ar norādījumiem uz etiķetes. Lai izveidotu reakciju polistirola plāksnēs, abas zāles izmanto 2,5% koncentrācijā, un, veidojot reakciju mikrotilpumos - 0,5% koncentrācijā.

RPGA iestatīšanas tehnika. Testa serumus atšķaida ar fizioloģisko šķīdumu attiecībā 1:5 (1:10) un karsē 56 °C temperatūrā 30 minūtes. Pēc tam, lai atdalītu neviendabīgās antivielas pret aitu eritrocītiem, serumus apstrādā ar formalinizētu aitu eritrocītu 50% suspensiju. Lai to izdarītu, pievienojiet sarkanās asins šūnas ar ātrumu 2 pilieni (0,05 ml) uz 1 ml seruma un rūpīgi samaisiet, kratot. Serumu atstāj, līdz eritrocīti ir pilnībā nosēdušies, vai pēc stundas centrifugē istabas temperatūrā, pēc tam tas ir gatavs izmeklēšanai.

Atšķaidīšanas šķidrumu 0,5 ml tilpumā ielej polistirola plāksnes iedobju rindā. Sākotnējās seruma izpētes laikā ir ieteicams tos pārbaudīt, iestatot reakciju īsā plāksnes rindā (6 iedobes). Ja antivielas tiek konstatētas īsā sērijā, serumus atkārtoti pārbauda ilgā atšķaidījumu sērijā (12 iedobes). Pēc atšķaidīšanas šķidruma izliešanas katras rindas pirmajai iedobei (īsai vai garai) pievienojiet 0,5 ml testa seruma atšķaidījumā 1:5. Pēc tam tos pašus seruma tilpumus titrē ar divkāršiem atšķaidījumiem. Tādējādi seruma atšķaidījumus iegūst īsajās sērijās no 1:10 līdz 1:320 un garajās sērijās no 1:10 līdz 1:20480. Pēc seruma titrēšanas katrā iedobē pievieno vienu pilienu (0,05 ml) sensibilizēto eritrocītu darba 2,5% suspensijas. Plākšņu saturu rūpīgi sakrata, līdz iegūst viendabīgu suspensiju. Plāksnes atstāj istabas temperatūrā uz stacionāras galda virsmas. Reakcijas iepriekšēju reģistrēšanu veic pēc 2-3 stundām, galīgo titra noteikšanu veic pēc pilnīgas sarkano asins šūnu sedimentācijas iedobēs. Reakcijai ir paredzētas šādas kontroles: 1) testa serums, kas atšķaidīts 1:10 0,5 ml tilpumā + 1 piliens 2,5% nesensibilizētu eritrocītu suspensijas; 2) atšķaidīšanas šķidrums 0,5 ml tilpumā + 1 piliens 2,5% nesensibilizētu eritrocītu suspensijas; 3) atšķaidīšanas šķidrums 0,5 ml tilpumā + 1 piliens 2,5% sensibilizētu eritrocītu suspensijas. Visām kontrolēm jāsniedz nepārprotami negatīva reakcija.

RPGA uzskaite un novērtēšana. Reakciju novērtē pēc šādas shēmas:

1) asi pozitīva reakcija(++++) - sarkanās asins šūnas vienmērīgā slānī nokrīt cauruma apakšā “lietussarga” veidā, kam bieži ir šķautne malu kušana;

2) pozitīva reakcija (+++) - sarkanās asins šūnas nosedz vismaz 2/3 no akas dibena;

3) vāji pozitīva reakcija (++) - aglutināts ir mazs un atrodas pašā akas centrā;

4) apšaubāma reakcija (+) - ap eritrocītu nogulsnēm pašā akas centrā ir atsevišķi aglutināta graudi;

5) negatīvs (-) - cauruma apakšā sarkanās asins šūnas nogulsnējas “pogas” vai neliela gredzena veidā ar gludām, asi izteiktām malām.

Seruma titru ņem vērā, pamatojoties uz pēdējo seruma atšķaidījumu, kas deva ļoti skaidru reakciju (vismaz trīs plusi). Atšķaidījums 1:100 vai lielāks tiek uzskatīts par diagnostisko titru, taču, tāpat kā RA gadījumā, ir jāuzrauga tā palielināšanās.

RPGA tularēmijai ir diezgan specifiska un atklāj dažus krusteniskās reakcijas tikai ar brucelozes serumiem. Diferenciāldiagnoze iespējams pēc titru augstuma RPGA, kas ir ievērojami augstāki ar homologo antigēnu.

Tehnika RPHA iestatīšanai mikroapjomos. RPGA var veikt mikroapjomos, izmantojot Takachi tipa mikrotitratoru (vai apaļas dibena mikroplates ar mikropipetēm), kas ļauj titrēt materiālu 25 μl un 50 μl tilpumos. Reakcijas tehnika un visu darbību secība ir tāda pati kā pētot polistirola plāksnēs. Tomēr jāpatur prātā, ka mikrometodes jutība parasti ir par vienu atšķaidījumu (t.i., 2 reizes) mazāka nekā makrometodes jutība.

Lai izveidotu reakciju mikrotitratorā, katrā iedobē, izmantojot pipeti ar pilinātāju, pievieno atšķaidīšanas šķidrumu 50 μl tilpumā. Pēc tam, izmantojot titrētājus ar 50 μl galviņu, testa serumu savāc, iegremdējot tajā galvu. Pārliecinieties, vai šķidrums ir piepildījis titratora galviņu. Titrators ar serumu tiek pārnests uz pirmo iedobi un, turot to iekšā vertikālā pozīcija, veiciet vairākas rotācijas kustības turp un atpakaļ. Pēc tam titratoru pārnes uz nākamo iedobi un manipulāciju atkārto. Titrēšanu var veikt vienlaikus vairākās rindās. Pēc visas sērijas titrēšanas titrētāju mazgā ar destilētu ūdeni (mainot 2 porcijas) ar rotējošām kustībām, ūdeni no galvas noņem ar tamponu un sadedzina uz degļa liesmas.

Pēc titrēšanas iedobēm pievieno 25 μl eritrocītu diagnostikas šķidruma. Diagnostikas koncentrācijai RPHA mikroapjomos jābūt 0,5% (t.i., 2,5% sarkano asins šūnu suspensiju papildus atšķaida 5 reizes). Pēc sarkano asins šūnu pievienošanas plāksnes nedaudz jāsakrata, līdz tiek iegūta viendabīga suspensija. Rezultātus var reģistrēt 1-1,5 stundu laikā, kas ir būtiska RPGA priekšrocība mikrotitrā. Turklāt šim paņēmienam ir nepieciešams neliels daudzums visu reakcijas sastāvdaļu un testa serumu.

Reakciju ņem vērā saskaņā ar šādu shēmu:

1) “+” – pilnīga hemaglutinācija, kurā sarkanās asins šūnas nokrīt akas dibenā vienmērīgā slānī “lietussarga” veidā, aizņemot vismaz 2/3 no dibena;

2) "+-" - daļēja hemaglutinācija, kurā sarkanās asins šūnas nokrīt apakšā maza izmēra vaļīga gredzena veidā;

3) "-" – hemaglutinācijas trūkums, kad sarkanās asins šūnas nokrīt apakšā nelielas pogas vai gredzena veidā ar gludu malu.

Specifiskums pozitīvs rezultāts, kas iegūts RPHA, var pārbaudīt, izmantojot trīskomponentu reakciju – pasīvās hemaglutinācijas (RPHA) inhibēšanas reakciju.

RTPGA iestatīšanas tehnika. Šo reakciju izmanto, lai apstiprinātu pozitīva RPGA rezultāta specifiku, ja tas rada šaubas vai ir īpaši epidemioloģiski interesants. Reakcijas mehānisms ir specifiska hemaglutinācijas inhibīcija, kad testa serumam pievieno nogalinātu tularēmijas baktēriju suspensiju. Reakcijā mijiedarbojas trīs komponenti: testa serums, specifiskais tularēmijas antigēns un antigēnais eritrocītu diagnostiskais RTPHA parasti tiek ievietots 7-8 iedobju rindā. Ir ieteicams uzstādīt atkārtotu RPGA paralēli RTPGA. Divās iedobju rindās ielej 0,25 ml atšķaidīšanas šķidruma, pēc tam abu rindu pirmajās iedobēs pievieno testa serumu 0,25 ml tilpumā un veic titrēšanu.Iegūst divas identiskas seruma atšķaidījumu rindas. Pievienojiet 0,25 ml atšķaidīšanas šķidruma visās otrās rindas iedobēs un 0,25 ml tularēmijas baktēriju suspensijas pirmās rindas iedobēs. Tiek izmantots tularemia diagnosticum (satur 25 miljardus tularēmijas baktēriju 1 ml), iepriekš atšķaidīts 50 reizes. Šī suspensija satur 500 miljonus baktēriju 1 ml vai 125 miljonus 0,25 ml tilpumā. Pēc antigēna pievienošanas plāksni atstāj uz 1 stundu istabas temperatūrā, pēc tam uz visām abu rindu iedobēm pievieno vienu pilienu (0,05 ml) eritrocītu diagnostikas, plāksni sakrata un atstāj uz līdzenas galda virsmas. Grāmatvedība tiek veikta pēc 2-3 stundām.

RTPGA uzskaite un novērtēšana. Ja testa serums satur specifiskas tularēmijas antivielas, tās neitralizē pievienotais antigēns un pirmajā iedobju rindā nenotiks hemaglutinācija vai, ja augsts titrs serumā, hemaglutinācija tiks novērota mazākā (2-4) iedobē nekā rindā ar RPGA. Šajā gadījumā tika apstiprināta rezultātu specifika. Ja abās rindās ir atzīmēta hemaglutinācija, t.i. Ja RTPGA un RPGA rezultāti sakrīt, tas norāda, ka testa serumā nav tularēmijas antivielu. Šajā gadījumā primārais RPGA rezultāts tiek uzskatīts par nespecifisku.

RTHG inscenēšanas tehnika mikroapjomos. RTPGA, tāpat kā RPGA, var veikt mikroapjomos, izmantojot Takachi tipa mikrotitru. Lai to izdarītu, mikroplašu iedobēs pievienojiet 0,25 μl atšķaidīšanas šķidruma divās rindās pa 7-8 iedobēm katrā. Pēc tam, izmantojot titrētāju, pievieno 0,25 μl testa seruma un titrē abās rindās. Pēc tam katrai pirmās rindas iedobei pievieno 25 μl tularēmijas antigēna (kura koncentrācija ir 500 miljoni tularēmijas baktēriju 1 ml), bet otrajā rindā pievieno 25 μl atšķaidīšanas šķidruma. Plāksnes atstāj uz 1 stundu istabas temperatūrā, pēc tam visām abu rindu iedobēm pievieno 25 μl antigēna zritrocytic diagnosticum (0,5% koncentrācija). Rezultātu uzskaite un novērtēšana tiek veikta līdzīgi kā reakcijas makroapjomos.

Tēmas "Imūnmodulatori. Infekcijas slimību imūndiagnoze" satura rādītājs:

Pasīvās aglutinācijas reakcijas. Netiešas aglutinācijas reakcijas. Netieša vai pasīva hemaglutinācijas reakcija (IRHA, RPHA). Apgrieztā RNGA. Pasīvā hemaglutinācijas inhibīcijas reakcija (PHA).

Šie reakcijas tiek saukti netiešs (pasīvs), jo tie izmanto Ag (vai AT), kas mākslīgi sorbēts uz dažādu korpuskulāro daļiņu virsmas.

Netieša vai pasīva hemaglutinācijas reakcija (RNGA, RPGA) ir viena no jutīgākajām seroloģiskajām reakcijām. Tas ir balstīts uz AT spēju mijiedarboties ar Ag, kas fiksēts uz dažādām sarkanajām asins šūnām, kuras pēc tam aglutinējas. Lai nodrošinātu lielāku diagnostikas stabilitāti, sarkanās asins šūnas tiek formalizētas.

Apgrieztā RNGA izmanto, lai noteiktu Ag asins serumā; Šim nolūkam uz eritrocītiem tiek fiksēts nevis Ag, bet AT. Šāda veida reakcijas tiek plaši izmantotas, lai diagnosticētu infekcijas slimības, noteiktu grūtniecību, noteiktu paaugstinātu jutību pret zālēm utt.

Pasīvā hemaglutinācijas inhibīcijas reakcija (RTPGA) - tālākai attīstībai RNGA; savā ziņā kontrolē savu specifiku. Atšķirībā no RNGA, ietver trīs sastāvdaļas; Ag, AT un Ag (AT), kas adsorbēti uz eritrocītiem. Sākotnēji Ag reaģē ar AT (standarta antiserumu), pēc tam maisījumam pievieno eritrocītus, kas sensibilizēti ar to pašu Ag (vai AT). Ja Ag mijiedarbības laikā ar AT sistēmā nepaliek brīvs AT (vai Ag), tad eritrocītu diagnostiskā aglutinācija netiek novērota.

11621 0

Seroloģiskās reakcijas tiek apzīmētas saskaņā ar parādībām, kas saistītas ar antigēna-antivielu kompleksa veidošanos komponentu ar dažādām īpašībām mijiedarbības laikā. Ir aglutinācijas, nokrišņu un līzes reakcijas.

Aglutinācijas reakcija (RA)

Aglutinācijas reakcijas (RA) pamatā ir korpuskulāra antigēna (baktēriju suspensijas, sensibilizētu eritrocītu, lateksa daļiņu u.c.) izmantošana, mijiedarbojoties ar specifiskām antivielām, kā rezultātā izveidojas antigēna-antivielu kompleksa nogulsnēšanās. Šo reakciju plaši izmanto laboratorijas praksē seroloģiskai diagnostikai. bakteriālas infekcijas un izolētu mikroorganismu identificēšanai.

RA izmanto daudzu infekcijas slimību diagnosticēšanai: bruceloze (Raita, Hedlesona reakcija), tularēmija, leptospiroze (RAL – Leptospira aglutination and lysis response), listerioze, tīfs (RAR – Rickettsia agglutination response), šigeloze, jersinioze, pseidotuberkuloze utt.

Netieša vai pasīva aglutinācijas reakcija (RIGA vai RPGA).

Lai iestudētu šo reakciju, tiek izmantotas ar antivielām vai antigēnu sensibilizētas dzīvnieku (aitu, pērtiķu, jūrascūciņu, dažu putnu) sarkanās asins šūnas, ko panāk, inkubējot sarkano asins šūnu suspensiju un antigēna vai imūnseruma šķīdumu.

Tiek sauktas diagnostikas, kas iegūtas, pamatojoties uz eritrocītiem, kas sensibilizēti ar antigēniem antigēnu eritrocītu diagnostika. Tie ir paredzēti antivielu noteikšanai asins serumu sērijveida atšķaidījumos, piemēram, eritrocītu šigella diagnostikas, eritrocītu salmonellas O-diagnosticums.

Attiecīgi tiek saukta diagnostika, kuras pamatā ir eritrocīti, kas sensibilizēti ar specifiskiem imūnglobulīniem antivielas(imūnglobulīns) diagnostikas un tie kalpo antigēnu noteikšanai dažādos materiālos, piemēram, eritrocītu imūnglobulīna difterijas diagnostikā RĪGA, ko izmanto korinebaktēriju difterijas eksotoksīna noteikšanai šķidrā barotnē, kad tajā tiek inokulēts materiāls no deguna un orofarneksa.

Hemaglutinācijas reakciju izmanto, lai diagnosticētu gan bakteriālas (vēdertīfs, paratīfs, dizentērija, bruceloze, mēris, holēra u.c.), gan vīrusu (gripa, adenovīrusu infekcijas, masalas u.c.) infekcijas. Jūtības un specifiskuma ziņā RIGA ir pārāka par RA.

Hemaglutinācijas inhibīcijas reakcija (HAI)

Hemaglutinācijas inhibīcijas reakciju (HAI) izmanto, lai titrētu pretvīrusu antivielas asins serumā, kā arī lai noteiktu izolēto vīrusu kultūru veidu. RTGA var izmantot, lai tos diagnosticētu vīrusu infekcijas, kuras patogēniem piemīt hemaglutinējošas īpašības.

Metodes princips ir tāds, ka serums, kas satur antivielas pret noteiktu vīrusu tipu, nomāc tā hemaglutinējošo aktivitāti un sarkanās asins šūnas paliek neaglutinētas.

Pasīvā hemaglutinācijas inhibīcijas (aizkavēšanās) reakcija (RPHA).

RTPGA ir iesaistīti trīs komponenti: imūnserums, antigēns (testa materiāls) un sensibilizēti eritrocīti.

Ja testa materiāls satur antigēnu, kas specifiski reaģē ar imūno antivielām standarta serums, tad tas tos saista, un pēc tam pievienojot eritrocītus, kas sensibilizēti ar serumam homologu antigēnu, hemaglutinācija nenotiek.

RTPHA izmanto mikrobu antigēnu noteikšanai, to kvantitatīvai noteikšanai, kā arī RTPGA specifikas kontrolei.

Lateksa aglutinācijas reakcija (RLA)

Lateksa daļiņas tiek izmantotas kā antivielu (imūnglobulīnu) nesējs. RLA ir ekspresmetode infekcijas slimību diagnosticēšanai, ņemot vērā nepieciešamo laiku (līdz 10 minūtēm) un spēju noteikt antigēnu nelielā testa materiāla tilpumā.

RLA izmanto Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae b tipa, Neisseria meningitidis antigēnu noteikšanai cerebrospinālajā šķidrumā, A grupas streptokoku noteikšanai rīkles uztriepes, salmonelozes, jersiniozes un citu slimību diagnosticēšanai. Metodes jutība ir 1-10 ng/ml jeb 10³ -10⁶ baktēriju šūnas 1 µl.

Koaglutinācijas reakcija (CoA)

Koaglutinācijas reakcija (CoA) balstās uz stafilokoku proteīna A spēju piesaistīt specifiskus imūnglobulīnus. RCA - ekspresdiagnostikas metode - kalpo šķīstošo termostabilu antigēnu identificēšanai cilvēka sekrēcijās un cirkulējošo imūnkompleksu (CIC) sastāvā. Specifisku antigēnu noteikšanai CEC sastāvā ir nepieciešama to iepriekšēja izgulsnēšana no asins seruma.

Nokrišņu reakcija

Nokrišņu reakcijā (RP) antivielu mijiedarbības rezultātā ar ļoti izkliedētiem šķīstošiem antigēniem (olbaltumvielām, polisaharīdiem) veidojas kompleksi, piedaloties komplementam - nogulsnēm. Tas ir jutīgs tests, ko izmanto, lai noteiktu un raksturotu dažādus antigēnus un antivielas. Vienkāršākais augstas kvalitātes RP piemērs ir necaurspīdīgas nokrišņu joslas veidošanās mēģenē pie imūnseruma antigēna slāņošanās robežas - gredzena izgulsnēšanās reakcija. Plaši tiek izmantoti dažādi RP veidi pusšķidrā agara vai agarozes gēlos (dubultās imūndifūzijas metode, radiālās imūndifūzijas metode, imūnelektroforēze).

Komplementa fiksācijas reakcija (CFR)

Komplementa fiksācijas reakcijas (CFR) pamatā ir hemolīzes fenomens ar komplementa piedalīšanos, t.i. spēj noteikt tikai komplementu fiksējošas antivielas.

RSC plaši izmanto daudzu bakteriālu un vīrusu infekciju, riketsiālo infekciju, hlamīdiju, infekciozā mononukleoze, vienšūņu infekcijas, helmintoze. RSK ir sarežģīta seroloģiskā reakcija, kurā ir iesaistītas divas sistēmas: testa sistēma (asins serums), ko pārstāv antigēna-antivielu un komplementa sistēma, un hemolītiskā sistēma (aitas sarkanās asins šūnas + hemolītiskais serums). Hemolītiskais serums ir termiski inaktivēts trušu asins serums, kas imunizēts ar aitas eritrocītiem. Tas satur antivielas pret aitu sarkanajām asins šūnām.

Pozitīvs RSC rezultāts - hemolīzes neesamība - tiek novērots, ja testa serumā ir antivielas, kas ir homologas antigēnam. Šajā gadījumā iegūtais antigēna-antivielu komplekss saistās ar komplementu, un, ja nav brīva komplementa, hemolītiskās sistēmas pievienošana nav saistīta ar hemolīzi. Ja serumā nav antigēnam atbilstošu antivielu, antigēna-antivielu kompleksa veidošanās nenotiek, komplements paliek brīvs un serums izraisa sarkano asins šūnu hemolīzi, t.i. hemolīzes klātbūtne ir negatīvs reakcijas rezultāts.

Juščuks N.D., Vengerovs Yu.Ya.

Aglutinācijas reakcija - RA(no lat. aglutinācija- adhēzija) ir vienkārša reakcija, kurā antivielas saistās ar korpuskulārajiem antigēniem (baktērijas, eritrocītus vai citas šūnas, nešķīstošās daļiņas ar uz tām adsorbētiem antigēniem, kā arī makromolekulāros agregātus). Tas notiek elektrolītu klātbūtnē, piemēram, pievienojot izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu.

Pieteikties dažādas iespējas aglutinācijas reakcijas: plašas, indikatīvas, netiešas utt. Aglutinācijas reakcija izpaužas kā pārslu vai nogulumu veidošanās

RA tiek izmantots:

antivielu noteikšana asins serumā pacientiem, piemēram, ar brucelozi (Raita, Hedelsona reakcijas), vēdertīfs un paratīfs (Vidal reakcija) un citi infekcijas slimības;

no pacienta izolēta patogēna noteikšana;

asins grupu noteikšana, izmantojot monoklonālās antivielas pret eritrocītu alloantigēniem.

Lai noteiktu antivielas pacientam ieliecietpaplašināts aglutinācijas reakcija: pievienot pacienta asins seruma atšķaidījumiem diagnosticum(nogalinātu mikrobu suspensija) un pēc vairāku stundu inkubācijas 37 °C temperatūrā tiek atzīmēts augstākais seruma atšķaidījums (seruma titrs), pie kura notika aglutinācija, t.i., veidojās nogulsnes.

Aglutinācijas raksturs un ātrums ir atkarīgs no antigēna un antivielu veida. Kā piemēru var minēt diagnostikas līdzekļu (O- un R-antigēnu) mijiedarbības īpatnības ar specifiskām antivielām. Aglutinācijas reakcija ar O-diagnostika(baktērijas iznīcina karstums, saglabājot siltuma stabilitāti O-antigēns) notiek smalkgraudainas aglutinācijas veidā. Aglutinācijas reakcija ar H-diagnosticum (baktērijas, ko iznīcina formaldehīds, saglabājot termolabilu flagellar H-antigēnu) ir rupja un norit ātrāk.

Ja nepieciešams noteikt no pacienta izolētu patogēnu, ielieciet indikatīva aglutinācijas reakcija, izmantojot diagnostiskās antivielas (aglutinējošo serumu), t.i., tiek veikta patogēna serotipēšana. Indikatīvu reakciju veic uz stikla priekšmetstikliņa. No pacienta izolētu patogēna tīrkultūru pievieno pilienam diagnostiskā aglutinējošā seruma atšķaidījumā 1:10 vai 1:20. Tuvumā tiek novietota kontrole: seruma vietā tiek uzklāts piliens nātrija hlorīda šķīduma. Kad pilē, kas satur serumu un mikrobus, parādās flokulējošas nogulsnes, a plaša aglutinācijas reakcija mēģenēs ar pieaugošiem aglutinējošā seruma atšķaidījumiem, kam pievieno 2-3 pilienus patogēna suspensijas. Aglutināciju ņem vērā, ņemot vērā nogulšņu daudzumu un šķidruma dzidrības pakāpi. Reakciju uzskata par pozitīvu, ja aglutināciju novēro atšķaidījumā, kas ir tuvu diagnostikas seruma titram. Tajā pašā laikā tiek ņemtas vērā kontroles: serumam, kas atšķaidīts ar izotonisku nātrija hlorīda šķīdumu, jābūt caurspīdīgam, mikrobu suspensijai tajā pašā šķīdumā jābūt vienmērīgi duļķainai, bez nogulsnēm.

Ar vienu un to pašu diagnostisko aglutinācijas serumu var aglutinēt dažādas radniecīgas baktērijas, kas apgrūtina to identificēšanu. Tāpēc viņi izmanto adsorbēti aglutinējošie serumi, no kuriem, adsorbējot radniecīgās baktērijās, ir izņemtas krusteniski reaģējošas antivielas. Šādi serumi saglabā antivielas, kas ir specifiskas tikai konkrētai baktērijai. Īpašu monoreceptoru diagnostikas aglutinējošu serumu ražošanu ierosināja A. Castellani (1902).

Netiešā (pasīvā) hemaglutinācijas reakcija(RNGA, RPGA) pamatā ir sarkano asins šūnu izmantošana ar uz to virsmas adsorbētiem antigēniem vai antivielām, kuru mijiedarbība ar attiecīgajām antivielām vai asins seruma antigēniem izraisa sarkano asins šūnu pielipšanu un nogulsnēšanos uz to virsmas. mēģene vai šūna Vķemmētu nogulumu veidā (13.2. att.). Plkst negatīva reakcija sarkanās asins šūnas nosēžas ■ “pogas” veidā. Parasti antivielas tiek noteiktas RNGA, izmantojot antigēnu eritrocītu diagnostikas līdzekli, kas ir eritrocīti ar adsorbētu. ieslēgts tos ar antigēniem. Dažreiz tiek izmantota anti-A eritrocītu diagnostika, uz kuras tiek adsorbētas antivielas. Piemēram, botulīna toksīnu var noteikt, pievienojot tam eritrocītu antivielu botulīna toksīnu (šo reakciju sauc apgrieztā netiešā hemaglutinācijas reakcija- RONG). RNGA izmanto, lai diagnosticētu infekcijas slimības un noteiktu gonadotropo hormonu V urīns, nosakot grūtniecību, lai noteiktu paaugstinātu jutību pret medikamentiem, hormoniem un dažos citos gadījumos.

ĶEMMES REAKCIJA

(Kumbsa tests) - metode Rh antivielu noteikšanai uz sarkano asins šūnu virsmas, kas izraisa globulīnu izgulsnēšanos asins serumā. Šo testu izmanto diagnozei hemolītiskā anēmija zīdaiņiem ar Rh nesaderību, kuriem ir sarkano asins šūnu iznīcināšana.

Koaglutinācijas reakcija. Patogēnu šūnas tiek noteiktas, izmantojot stafilokokus, kas iepriekš apstrādāti ar imūndiagnostikas serumu. Stafilokoki, kas satur proteīnu A, kam ir afinitāte pret imūnglobulīnu Fc fragmentu, nespecifiski adsorbē pretmikrobu antivielas, kas pēc tam mijiedarbojas ar aktīvajiem centriem ar attiecīgajiem mikrobiem, kas izolēti no pacientiem. Koaglutinācijas rezultātā veidojas pārslas, kas sastāv no stafilokokiem, diagnostiskajām seruma antivielām un konstatētā mikroba.

Hemaglutinācijas inhibīcijas reakcija(RTGA) pamatā ir bloķēšana, vīrusu antigēnu nomākšana ar imūnseruma antivielām, kā rezultātā vīrusi zaudē spēju aglutinēt sarkanās asins šūnas (13.3. att.). RTGA izmanto daudzu vīrusu slimību diagnosticēšanai, kuru izraisītāji (gripas vīrusi, masalas, masaliņas, ērču encefalīts u.c.) var aglutinēt dažādu dzīvnieku sarkanās asins šūnas.

PVO ārstu grupa ieradās Indijā, lai identificētu pacientus ar poliomielītu un palīdzētu veikt vispārēju vakcināciju pret poliomielītu. Vienā no aptaujātajiem ciemiem pie ārstiem no daudzbērnu ģimenes nogādāts 6 gadus vecs zēns, kurš pirms 5 dienām saslimis. Pēkšņi paaugstinājās temperatūra, bija stipras galvassāpes, atkārtota vemšana, sāpes rokās un kājās. Pēc pārbaudes: karstums, smags vājums, meningeāli simptomi, uz labā kāja samazināts muskuļu tonuss, cīpslu refleksi ir strauji novājināti, pēda karājas uz leju. Mugurkaula kanāla punkcijas laikā zem tā iztecēja cerebrospinālais šķidrums augsts asinsspiediens, palielinās limfocītu skaits, netiek izolētas baktērijas. Piegādāts provizoriskā diagnoze"Paralītiskā poliomielīta forma". Kā zēns varēja inficēties? Kā tiek veikta īpaša aktīva poliomielīta profilakse? Vai šajā ģimenē pastāv risks inficēt citus bērnus, kas jādara?

Atbilde: Zēns varēja inficēties fekāli-orālā ceļā ar pārtiku, ūdeni un arī ar gaisā esošām pilieniņām. Galvenais poliomielīta profilakses pasākums ir imunizācija ar dzīvkultūras vakcīnu no 3 Sabin celmu serotipiem.Krievijā to izmanto vakcinācija pret poliomielītu perorālai lietošanai, ko ražojis Poliomielīta un vīrusu encefalīta institūts. M.P. Čumakova. Vakcīna ir trīsvērtīgs poliomielīta vīrusa 1., 2., 3. tipa Sabin celmu preparāts, kas iegūts no Āfrikas zaļo pērtiķu nieru šūnu primārās kultūras. . Bērni vecumā no 3 mēnešiem līdz 6 gadiem tiek regulāri vakcinēti pret poliomielītu. Vakcinācijas ar perorālo poliomielīta vakcīnu tiek veiktas ar 2 vai 4 pilieniem vakcīnas iekšķīgi trīs reizes 3, 4, 5 un 6 mēnešos ar trīs revakcinācijām 18, 20 mēnešu un 14 gadu vecumā. Slimais zēns jā hospitalizē, un visi pārējie šīs ģimenes bērni jāvakcinē ar dzīvu poliomielīta vakcīnu.