Ang complement fixation reaction (CFR) ay nakabatay sa katotohanan na ang isang partikular na antigen-antibody complex ay palaging nag-adsorb (nagbibigkis) ng complement sa sarili nito.
Ang reaksyong ito ay malawakang ginagamit sa pagtukoy ng mga antigen at sa serodiagnosis ng mga impeksyon, lalo na ang mga sakit* na dulot ng spirochetes (Wassermann reaction), rickettsia at mga virus.
Ang RSC ay isang komplikadong serological reaction. Ito ay nagsasangkot ng pandagdag at dalawang antigen-antibody system. Mahalaga, ang mga ito ay dalawang serological reaksyon.
Ang unang sistema - ang pangunahing isa ay binubuo ng isang antigen at isang antibody (ang isa ay kilala, ang isa ay hindi). Ang isang tiyak na halaga ng pandagdag ay idinagdag dito. Kung magkatugma ang antigen at antibody ng system na ito, magkokonekta sila at magbibigkis ng complement. Ang resultang kumplikado ay pinong dispersed at hindi nakikita.
Ang pagbuo ng complex na ito ay nakita gamit ang pangalawang hemolytic o indicator system. Kabilang dito ang mga pulang selula ng dugo ng tupa (antigen) at ang kaukulang hemolytic serum (antibody), ibig sabihin, isang ready-made na immune complex. Sa sistemang ito, ang lysis ng mga pulang selula ng dugo ay maaari lamang mangyari sa pagkakaroon ng pandagdag. Kung ang pandagdag ay nakasalalay sa unang sistema (kung ang antigen at antibody ay tumutugma dito), kung gayon sa pangalawang sistema ay walang hemolysis - dahil walang libreng pandagdag. Ang kawalan ng hemolysis (ang mga nilalaman ng tubo ay maulap o may sediment ng mga erythrocytes sa ibaba) ay naitala bilang isang positibong resulta ng RSC.
Kung sa unang sistema ang antigen ay hindi tumutugma sa antibody, kung gayon ang immune complex ay hindi bubuo at ang pandagdag ay mananatiling libre! Nananatiling libre, ang pandagdag ay nakikilahok sa pangalawang sistema, na nagiging sanhi ng hemolysis ang resulta ng RSC (ang mga nilalaman ng mga tubo ay transparent - "lacquer blood").
Mga bahagi ng reaksyon ng pag-aayos ng pandagdag:
Antigen - karaniwang lysate, extract, hapten; mas madalas na suspensyon.
1.Antibody-serum ng sistema ng pasyente
2. Complement - suwero mga guinea pig
3. Antigen - mga pulang selula ng dugo ng tupa
4.Antibody - hemolysin sa mga red blood cell ng tupa
5. Isotonic na solusyon
Dahil sa katotohanan na ang isang malaking bilang ng mga kumplikadong sangkap ay kasangkot sa RSC, dapat muna silang ma-titrate at dalhin sa reaksyon sa eksaktong dami at sa pantay na volume: 0.5 o 0.25, mas madalas 0.2 ml. Alinsunod dito, ang buong eksperimento ay isinasagawa sa mga volume na 2.5, 1.25 o 1.0 ml (ang mas malalaking volume ay nagbibigay ng mas tumpak na resulta). Ang titration ng mga bahagi ng reaksyon ay isinasagawa sa parehong dami ng eksperimento, na pinapalitan ang mga nawawalang sangkap ng isotonic solution.
Paghahanda ng mga Sangkap
Hemolytic serum (hemolysin). Ang serum ay natunaw ng 3 beses na mas mababa kaysa sa titer nito (tingnan ang p. 211). Maghanda ng pangkalahatang pagbabanto ng serum para sa buong eksperimento, ang dami nito ay natutukoy sa pamamagitan ng pagpaparami ng dami ng serum sa isang test tube (halimbawa, 0.5 ml) sa bilang ng mga test tube, bahagyang lumampas sa bilang sa eksperimento.
2. Mga pulang selula ng dugo ng tupa. Maghanda ng 3% na pagsususpinde ng mga nahugasang erythrocyte ng tupa (tingnan ang p. 211) para sa buong bilang ng mga test tube sa eksperimento. Upang ihanda ang hemolytic system, 30 minuto bago ito idagdag sa eksperimento, paghaluin ang pantay na dami ng diluted hemolysin at isang suspensyon ng mga pulang selula ng dugo, pagdaragdag ng serum sa mga pulang selula ng dugo, ihalo nang lubusan at i-incubate ng 30 minuto sa 37˚C.
3. Ang pandagdag ay karaniwang natunaw sa 1:10. Dapat itong i-titrate bago ang bawat eksperimento. Ang complement titer ay ang pinakamaliit na halaga nito, kapag idinagdag sa hemolytic system, ang kumpletong hemolysis ay nangyayari sa loob ng 1 oras sa 37˚C. Ang complement titration scheme ay ipinakita sa Talahanayan 21.
Pansin! I-titrate ang papuri sa parehong dami ng pangunahing eksperimento, palitan ang mga nawawalang sangkap ng isotonic solution.
Accounting para sa mga resulta. Hindi dapat magkaroon ng mga bakas ng hemolysis sa mga kontrol, dahil ang isa sa mga ito ay hindi naglalaman ng pandagdag, at ang isa ay hindi naglalaman ng hemolysin. Ang mga kontrol ay nagpapahiwatig na ang mga bahagi ng reaksyon ay walang hemotoxicity (ang kakayahang kusang mag-lyse ng mga pulang selula ng dugo).
Sa ibinigay na talahanayan Sa 21 halimbawa, ang complement titer sa isang dilution na 1:10 ay 0.15 ml. Sa isang eksperimento, ang aktibidad ng complement ay maaaring bumaba dahil sa hindi tiyak na adsorption nito ng iba pang mga bahagi ng reaksyon, samakatuwid, para sa eksperimento, ang halaga ng complement ay nadagdagan: ang dosis kasunod ng titer ay kinuha. Ito ang gumaganang dosis. Sa halimbawang ibinigay, ito ay katumbas ng 0.2 complement sa isang 1:10 dilution. Dahil ang lahat ng mga sangkap na kasangkot sa RSC ay dapat kunin sa pantay na dami (sa aming halimbawa ito ay 0:5 ml), kinakailangang magdagdag ng 0.3 ml ng isang isotonic na solusyon sa gumaganang dosis ng pandagdag (0.2 ml1:10). Para sa buong eksperimento, ang dami ng bawat isa sa kanila (complement at isotonic solution.
Para sa buong eksperimento, ang dami ng bawat isa sa kanila (complement at isotonic solution) ay pinarami ng bilang ng mga test tube na lumalahok sa RSC. Halimbawa, upang magsagawa ng eksperimento sa 50 test tubes, kailangan mong kumuha ng 10 ml ng complement 1:10 (0.2 mlx50) at 15 ml ng isotonic solution (0.3 mlx50).
4. Ang antigen ay kadalasang nakukuha na handa gamit ang titer nito na ipinahiwatig, i.e. ang halaga na, pagkatapos ng diluting ang antigen, ay dapat na nilalaman sa 1 ml. halimbawa, na may titer na 0.4, ito ay natutunaw sa 0.96 ml ng isotonic solution. Para sa eksperimento, kumukuha ako ng halaga ng antigen na katumbas ng kalahati ng titer (0.5 ml). Ito ang kanyang working dose. Kalkulahin ang kabuuang pagbabanto ng antigen para sa buong eksperimento sa pamamagitan ng pagpaparami ng 0.5 ml sa bilang ng mga test tube sa eksperimento.
5. Antibody – suwero ng pasyente. Ang sariwang serum ay hindi aktibo bago ang eksperimento upang sirain ang pandagdag na nasa loob nito. Upang gawin ito, pinainit ito ng 30 minuto sa 56˚C sa isang paliguan ng tubig o sa isang inactivator na may thermostat. Ang huling paraan ay mas kanais-nais: inaalis nito ang posibilidad ng sobrang pag-init ng whey, ibig sabihin, ang denaturation nito. Ang denatured sera ay hindi angkop para sa pagsubok. Ang serum ng pasyente ay karaniwang ginagamit sa isang pagbabanto ng 1:10 hanggang 1:160.
Talahanayan Blg. 14
| Mga sangkap, ml | mga test tube | |||||||||||
| karanasan | kontrol | |||||||||||
| Hemolytic system | pulang selula ng dugo | |||||||||||
| Isotonic na solusyon | 1,45 | 1,4 | 1,35 | 1,3 | 1,25 | 1,2 | 1,15 | 1,1 | 1,05 | 1,0 | 1,5 | 1,5 |
| Complement 1:10 | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,35 | 0,4 | 0,45 | 0,5 | ― | 0,5 |
| Hemolytic system | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | ― |
| 3% na pagsususpinde ng mga pulang selula ng dugo ng tupa | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | 0,5 |
| Ang mga tubo ay lubusang inalog at inilublob sa 37˚C sa loob ng 1 oras. | ||||||||||||
| resulta | Walang hemolysis | Hemolysis | Walang hemolysis |
Ang immune sera ay kadalasang inihahanda sa mga kondisyon ng produksyon at inilabas na hindi aktibo. Ang mga ito ay diluted 1:50 at mas mataas.
Ang lahat ng mga sangkap ay inihanda sa bahagyang labis.
| Mga sangkap, ml | Mga test tube | |||||||
| Kontrolin ang karanasan | ||||||||
| suwero | antigen | Hemolytic system | Makadagdag sa isang gumaganang dosis | |||||
| ½ | ||||||||
| Phase 1 Isotonic solution | ― | 0,5 | 0,5 | 1,5 | 1,25 | 1,0 | 0,5 | |
| Test serum diluted 1:10 | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ― | |
| Antigen sa gumaganang dosis | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ||
| Makadagdag sa 1:10 sa working dose | 0,5 | 0,5 | 0,5 | ― | 0,25 | 0,5 | 1,0 | |
| Ang mga tubo ay lubusang inalog at inilublob sa 37°C sa loob ng 45 minuto 1 oras o 4°C sa loob ng 18 oras | ||||||||
| Phase 2 hemolytic system | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | |
| Ang mga tubo ay lubusang inalog at inilublob sa 37˚C hanggang sa kumpletong hemolysis sa mga tubo 2, 3, 6 at 7 | ||||||||
| Resulta | Positibo o negatibo | ― | ― | ++++ | (+) | ― | ― | |
Talahanayan Blg. 15
Pagsasagawa ng pangunahing eksperimento
Kapag nagse-set up ng eksperimento, ito ay lubhang; Ang pagkakasunud-sunod ng pagdaragdag ng mga sangkap ay mahalaga. Ang eksperimento ay isinasagawa sa dalawang yugto.
Phase I. Ang kinakailangang halaga ng isotonic sodium chloride solution ay ibinubuhos sa mga test tube, pagkatapos ay ang kinakailangang dami ng diluted serum at ang gumaganang dosis ng antigen at pandagdag sa parehong dami. Ang eksperimento ay dapat na sinamahan ng kontrol ng lahat ng sangkap na kasangkot dito: serum, antigen, hemolytic system at pandagdag.
Ang mga tubo ay lubusang inalog at inilublob sa 37°C sa loob ng 45 min-1 oras o sa 4°C (“RSC sa lamig”) sa loob ng 18 oras, sa pagkakaroon ng isang partikular na complex, nangyayari ang complement binding. Ang pagsasagawa ng reaksyon "sa lamig" ay makabuluhang pinatataas ang pagiging sensitibo at pagtitiyak nito.
Phase II. Sa pagtatapos ng pagpapapisa ng itlog, 1 ml ng hemolytic system ay idinagdag sa lahat ng mga test tube, na paunang itinatago sa isang thermostat sa loob ng 30 minuto (sensitized). Ang mga test tube ay inalog at ibinalik sa thermostat.
Resulta ng accounting tungkol sa. Ang mga tubo ay iniiwan sa thermostat hanggang sa kumpletong hemolysis sa mga tubo 2, 3, 6 at 7 (kontrol ng serum, antigen at pandagdag para sa isa at dalawang dosis). Ang hemolysis ay unang magaganap sa ika-7 test tube, na naglalaman ng dobleng halaga ng pandagdag. Matapos mangyari ang hemolysis sa tubo na ito at maging ganap na transparent ang mga nilalaman nito, kailangan mong lalo na maingat na subaybayan ang natitirang mga kontrol. Sa sandaling maging transparent ang likido sa ika-2, ika-3 at ika-6 na test tube, dapat mong agad na alisin ang rack na may mga test tube mula sa thermostat. Ang katotohanan na ang eksperimento ay hindi itinatago sa thermostat nang mas mahaba kaysa sa kinakailangan ay ipinahiwatig ng pagkakaroon ng bahagyang labo (hindi kumpletong hemolysis) sa ika-5 test tube - naglalaman lamang ito ng kalahati ng gumaganang dosis ng pandagdag at kumpletong hemolysis ay hindi maaaring mangyari kung ang eksperimento ay i-set up nang tama.
Ang hemolysis sa serum at antigen control (mga tubo 2 at 3) ay nagpapahiwatig na ang kanilang mga dosis ay napili nang tama at hindi ang serum o ang antigen mismo ay nagbubuklod ng pandagdag.
Sa kontrol ng hemolytic system (test tube 4), kung ito ay gumagana nang maayos, hindi dapat magkaroon ng mga bakas ng hemolysis - walang pandagdag dito.
Sa sandaling kumpiyansa ka na nakumpleto nang tama ang mga kontrol, maaari mong isaalang-alang ang karanasan. Ang kawalan ng hemolysis sa mga test tube ay itinuturing na positibong resulta ng reaksyon. Ipinapahiwatig nito na ang serum ay naglalaman ng mga antibodies na tiyak sa antigen na kinuha. Ang kumplikadong nabuo nila ay nakagapos na pandagdag at pinigilan ang pakikilahok nito sa reaksyon ng hemolysis. Kung ang hemolysis ay nangyayari sa mga test tube, ang resulta ng reaksyon ay tinasa bilang negatibo. SA sa kasong ito walang pagsusulatan sa pagitan ng antigen at antibody, hindi nakagapos ang complement at nakikilahok sa reaksyon ng hemolysis.
Kaayon ng serum ng pasyente, ang parehong eksperimento ay isinasagawa na may malinaw na positibong serum (ibig sabihin, may serum na naglalaman ng mga antibodies sa isang partikular na antigen) at malinaw na negatibong serum, na walang mga partikular na antibodies. Kung ang eksperimento ay nai-set up nang tama, sa unang kaso ay dapat magkaroon ng pagkaantala sa hemolysis, at sa pangalawang kaso, magkakaroon ng hemolysis.
Ang intensity ng reaksyon ay ipinahayag tulad ng sumusunod:
Kumpletong pagkaantala ng hemolysis. Ang mga pulang selula ng dugo ay bumubuo ng pare-parehong labo o tumira sa ilalim. Sa kasong ito, ang likido sa test tube ay nagiging walang kulay;
Humigit-kumulang 25% ng mga pulang selula ng dugo ay lysed. Mayroong mas kaunting sediment, ang likido sa itaas nito ay bahagyang kulay-rosas. Ang resulta ng RSC ay tinasa rin bilang malakas na positibo;
Humigit-kumulang 50% ng mga pulang selula ng dugo ay lysed. Ang sediment ay maliit, ang likido ay kulay rosas. Positibong resulta ng RSC;
Humigit-kumulang 75% ng mga pulang selula ng dugo ay lysed. Isang bahagyang sediment, sa itaas kung saan mayroong isang matinding kulay na likido. Kaduda-dudang resulta ng RSC;
Ang lahat ng mga pulang selula ng dugo ay na-lysed. Ang likido ay matinding kulay at ganap na transparent. Negatibong resulta ng RSC.
Ang reaksyong ito ay ginagamit upang makita ang mga antibodies sa serum ng dugo ng mga pasyente na may bacterial, viral, protozoal na impeksyon, gayundin upang makilala at i-type ang mga virus na nakahiwalay sa mga pasyente.
Ang RSC ay tumutukoy sa mga kumplikadong serological na reaksyon kung saan, bilang karagdagan sa antigen, antibody at complement, ang hemolytic system ay nakikilahok din, na inilalantad ang mga resulta ng reaksyon. Ang RSC ay nagpapatuloy sa dalawang yugto: ang una ay ang pakikipag-ugnayan ng antigen sa antibody na may partisipasyon ng pandagdag at ang pangalawa ay ang pagtuklas ng antas ng pagbubuklod ng pandagdag gamit ang hemolytic system. Ang sistemang ito ay binubuo ng mga pulang selula ng dugo ng tupa at hemolytic serum na nakuha sa pamamagitan ng pagbabakuna sa mga hayop sa laboratoryo na may mga pulang selula ng dugo. Ang mga erythrocytes ay pinoproseso - na-sensitize sa pamamagitan ng pagdaragdag ng serum sa kanila sa temperatura na 37°C sa loob ng 30 minuto. Ang lysis ng sensitized sheep erythrocytes ay nangyayari lamang kung sila ay sumali sa hemolytic complement system. Sa kawalan nito, ang mga pulang selula ng dugo ay hindi nagbabago. Ang mga resulta ng RSC ay nakasalalay sa pagkakaroon ng mga antibodies sa test serum. Kung ang serum ay naglalaman ng mga antibodies na homologous sa antigen na ginamit sa reaksyon, kung gayon ang nagreresultang antigen-antibody complex ay nagbubuklod at nagbubuklod sa pandagdag. Kapag nagdaragdag ng isang hemolytic system, sa kasong ito, ang hemolysis ay hindi mangyayari, dahil ang lahat ng pandagdag ay ginugol sa tiyak na bono ng antigen-antibody complex.
Ang mga pulang selula ng dugo ay nananatiling hindi nagbabago, kaya ang kawalan ng hemolysis sa test tube ay naitala bilang isang positibong RBC. Sa kawalan ng mga antibodies na tumutugma sa antigen sa suwero, ang isang tiyak na antigen-antibody complex ay hindi nabuo at ang pandagdag ay nananatiling libre. Kapag nagdagdag ng hemolytic system, nakakabit dito ang complement at nagiging sanhi ng hemolysis ng mga pulang selula ng dugo. Ang pagkasira ng mga pulang selula ng dugo at ang kanilang hemolysis ay nagpapakita ng negatibong reaksyon.
Upang i-stage ang RSC, ang mga sumusunod ay kailangan: ang serum ng pasyente, complement, isang hemolytic system na binubuo ng mga erythrocytes ng tupa at hemolytic serum, pati na rin ang isotonic sodium chloride solution.
Ang reaksyon ay isinasagawa sa serological tubes. Ang mga pulang selula ng dugo ng tupa ay nakukuha mula sa defibrinated na dugo ng tupa sa pamamagitan ng paghuhugas ng mga ito ng tatlong beses gamit ang isotonic sodium chloride solution. Ang hemolytic serum ay ginawa na handa sa mga ampoules, ang label na kung saan ay nagpapahiwatig ng titer nito, i.e., ang maximum na pagbabanto ng suwero, na nagiging sanhi pa rin ng hemolysis kapag idinagdag sa mga pulang selula ng dugo sa pagkakaroon ng pandagdag. Ang hemolytic serum ay nakukuha sa pamamagitan ng pagbabakuna ng mga hayop, tulad ng mga kuneho, na may mga pulang selula ng dugo ng tupa. Kapag nagse-set up ng reaksyon, ang serum ay ginagamit sa triple titer. Halimbawa, ang titer ng hemolytic serum ay 1: 1200, at ang gumaganang pagbabanto ay 1: 400. Ang sariwang guinea pig blood serum (sa loob ng 24-48 na oras) o dry complement sa ampoules ay ginagamit bilang pandagdag.
Bago magsagawa ng RSC, ang complement ay diluted 1:10 at titrated upang maitatag ang titer - ang pinakamaliit na halaga ng complement na nalilikha ng hemolysis ng mga pulang selula ng dugo kapag pinagsama sa hemolytic system na ginamit sa reaksyong ito. Isinasaalang-alang ang posibleng mga anti-complementary na katangian ng antigen, kapag nagtatanghal ng isang reaksyon, ang isang 20-30% na pagtaas ay ginawa sa itinatag na gumaganang titer ng pandagdag.
Ang antigen para sa RSC ay mga pagsususpinde ng mga napatay na bakterya, mga extract na inihanda mula sa mga pagsususpinde na ito, at mga indibidwal na chemical fraction ng microbes. Ang pangunahing kinakailangan para sa isang antigen ay ang kawalan ng pagsugpo sa aktibidad ng pandagdag. Hindi ito dapat magkaroon ng mga anti-complementary na katangian. Upang matukoy ang mga katangiang ito ng antigen, ang komplemento ay karagdagang titrated sa pagkakaroon ng antigen na ginamit sa reaksyon. Mayroong ilang mga scheme para sa pagtatanghal ng RSC. Ang mga resulta ng reaksyon ay isinasaalang-alang sa pamamagitan ng pagkakaroon o kawalan ng hemolysis ng mga pulang selula ng dugo sa hemolytic system. Ang RSC ay ginagamit sa diagnosis ng syphilis (Wassermann reaction), gonorrhea (Bordet-Gengou reaction), toxoplasmosis, rickettsial at mga sakit na viral.
Ang complement fixation reaction (CFR) ay kapag ang mga antigen at antibodies ay tumutugma sa isa't isa, sila ay bumubuo ng isang immune complex kung saan ang complement (C) ay nakakabit sa pamamagitan ng Fc fragment ng mga antibodies, ibig sabihin, ang complement ay nakatali ng antigen-antibody complex. Kung hindi nabuo ang antigen-antibody complex, mananatiling libre ang complement.
Ang tiyak na pakikipag-ugnayan ng AG at AT ay sinamahan ng adsorption (pagbubuklod) ng pandagdag. Dahil ang proseso ng pag-aayos ng pandagdag ay hindi nakikita sa paningin, iminungkahi nina J. Bordet at O. Zhangu ang paggamit ng hemolytic system (mga pulang selula ng dugo ng tupa + hemolytic serum) bilang isang tagapagpahiwatig, na nagpapakita kung ang pandagdag ay naayos ng AG-AT complex. Kung ang AG at AT ay tumutugma sa isa't isa, ibig sabihin, nabuo ang isang immune complex, kung gayon ang complement ay nakatali sa kumplikadong ito at hindi nangyayari ang hemolysis. Kung ang AT ay hindi tumutugma sa AG, kung gayon ang kumplikado ay hindi nabuo at umakma, nananatiling libre, pinagsasama sa pangalawang sistema at nagiging sanhi ng hemolysis.
Pag-unlad ng reaksyon
Ang reaksyon ay nangyayari sa dalawang yugto na kinasasangkutan ng dalawang sistema; bacterial at hemolytic. Ang unang reaksyon (tiyak) ay nagsasangkot ng antigen 4-+ antibody + complement. Ang isang positibong resulta ng reaksyon, na nangyayari kapag ang mga antibodies ay tumutugma sa isang antigen, ay nailalarawan sa pamamagitan ng pagbuo ng isang partikular na bacterial antigen-antibody complex na may adsorbed, o, gaya ng sinasabi nila, "nakagapos" na pandagdag. Ang nananatiling hindi nakikita, ang complex ay hindi nagiging sanhi ng anumang mga panlabas na pagbabago sa kapaligiran kung saan ito nabuo. Ang isang negatibong resulta ng RSC ay nangyayari sa kawalan ng tiyak na pagkakaugnay sa pagitan ng antigen at serum antibody at nailalarawan sa pamamagitan ng pagpapanatili ng libreng aktibong pandagdag. Ang unang yugto ng RSC ay maaaring isagawa sa isang thermostat sa 37°C (1-2 oras) o sa refrigerator sa 3-4°C (18-20 oras). Sa matagal na pagbuo ng antigen-antibody immune complex sa malamig, ang mas kumpletong pagbubuklod ng pandagdag ay nangyayari at, bilang isang resulta, ang sensitivity ng reaksyon ay tumataas. Kapag nagsasagawa ng mga paghahambing na eksperimento, ang Soviet immunologist na Academician. Ipinakita ni V.I. Ioffe at ng kanyang mga mag-aaral na sa ilalim ng mga kondisyon ng matagal na pag-aayos ng pandagdag sa lamig, posible na makuha ang 100-500 beses na mas maliit na halaga ng antigen at makakuha ng positibong resulta
sa mas mataas na mga dilution ng immune serum kaysa sa eksperimento sa pag-aayos ng pandagdag sa temperatura na 37 ° C sa loob ng 1-2 oras Ang pangalawang yugto ng reaksyon (tagapagpahiwatig) ay nangyayari sa pagitan ng mga reagents ng hemolytic system (isang halo ng 3% na suspensyon ng. erythrocytes at hemolytic serum sa pantay na dami) sa temperatura na 37 °C lamang sa pagkakaroon ng pandagdag na nanatiling libre mula sa unang yugto ng reaksyon (negatibong reaksyon). Sa kawalan ng libreng aktibong pandagdag, ang hemolysis ng mga pulang selula ng dugo sa ilalim ng impluwensya ng mga tiyak na hemolysin ay hindi nangyayari (positibo ang reaksyon).
Ang complement fixation reaction (CFR) ay isang komplikadong serological reaction. Upang maisakatuparan ito, 5 sangkap ang kailangan, katulad ng: AG, AT at complement (unang sistema), sheep erythrocytes at hemolytic serum (second system).
Ang antigen para sa RSC ay maaaring mga kultura ng iba't ibang napatay na mikroorganismo, ang kanilang mga lysate, mga bahagi ng bakterya, binago ng pathological at mga normal na organo, tissue lipids, mga virus at mga materyales na naglalaman ng virus.
Ang sariwa o pinatuyong guinea pig serum ay ginagamit bilang pandagdag.
Mekanismo ng reaksyon
Ang RSK ay isinasagawa sa dalawang yugto: 1st phase - pagpapapisa ng itlog ng isang halo na naglalaman ng tatlong sangkap na antigen + antibody + pandagdag; 2nd phase (indicator) - pagtuklas ng libreng pandagdag sa pinaghalong sa pamamagitan ng pagdaragdag dito ng isang hemolytic system na binubuo ng mga erythrocytes ng tupa at hemolytic serum na naglalaman ng mga antibodies sa kanila. Sa 1st phase ng reaksyon, kapag ang antigen-antibody complex ay nabuo, complement binds, at pagkatapos ay sa 2nd phase, hemolysis ng erythrocytes sensitized sa pamamagitan ng antibodies ay hindi mangyayari; positibo ang reaksyon. Kung ang antigen at antibody ay hindi tumutugma sa isa't isa (walang antigen o antibody sa sample ng pagsubok), ang pandagdag ay nananatiling libre at sa ika-2 yugto ay sasali sa erythrocyte - anti-erythrocyte antibody complex, na nagiging sanhi ng hemolysis; negatibo ang reaksyon.
Aplikasyon
Maaaring gamitin ang complement fixation reaction sa:
1) pagkakakilanlan ng mga tiyak na antibodies sa hindi kilalang suwero batay sa kanilang pakikipag-ugnayan sa isang antigen ng kilalang kalikasan;
2) pag-aaral ng mga katangian ng antigen bilang reaksyon sa isang kilalang tiyak na suwero. Paghahanda ng mga sangkap para sa pagtatanghal ng RSC.
1. Ang serum ng dugo na nakuha para sa pananaliksik, sa bisperas ng reaksyon, ay pinainit sa isang paliguan ng tubig sa 56°C sa loob ng 30 minuto upang hindi aktibo ang sarili nitong pandagdag. Ang inactivated na serum ay maaaring maimbak sa 3-4°C sa loob ng 5-6 na araw. Sa araw ng eksperimento, ang serum ay diluted na may isotonic sodium chloride solution sa ratio na 1:5 (0.1 ml ng test serum + 0.4 ml ng isotonic sodium chloride solution).
2. Ang antigen para sa produksyon ng CSC ay maaaring mga kultura ng iba't ibang microbes, bacterial proteins at extracts na nakuha mula sa microbial culture, pathologically altered at normal na organs at tissues. Ang mga detalye ng paghahanda ng antigen ay tinutukoy ng likas na katangian ng nakakahawang proseso at ang mga katangian ng pathogen nito.
3. Complement ay isang halo ng mga serum na nakuha mula sa 3-5 malusog na guinea pig, o tuyong pandagdag sa mga ampoules.
Kaagad bago gamitin, ang guinea pig serum ay diluted na may isotonic solution ng sodium chloride sa ratio na 1:10 para makakuha ng stock solution.
4. Bago isagawa ang eksperimento, ang hemolytic serum ay hindi aktibo sa pamamagitan ng pag-init sa temperatura na 56 °C sa loob ng 30 minuto. Upang maisagawa ang pangunahing eksperimento sa RSC, pati na rin ang pag-titrate ng complement at antigen, ang hemolytic serum ay ginagamit sa triple titer. Halimbawa, kung ang titer ng hemolytic serum ay 1: 1800, isang serum dilution na 1: 600 ang ginagamit sa reaksyon.
5. Ang mga erythrocytes ay nakukuha mula sa defibrinated na dugo ng tupa. Upang alisin ang mga fibrin film, ang dugo ay sinasala sa pamamagitan ng isang tatlong-layer na gauze filter. Ang resultang filtrate ay centrifuged, ang serum ay sinipsip at pinatuyo, at ang mga erythrocytes ay hinuhugasan ng 3-4 beses na sentripugasyon na may isotonic sodium chloride solution. Kapag ang mga pulang selula ng dugo ay hinugasan sa huling pagkakataon, ang supernatant layer ng likido ay dapat na ganap na transparent. Ang isang 3% na suspensyon ay inihanda mula sa hugasan na mga pulang selula ng dugo sa isang isotonic sodium chloride solution. Ang pagkakaroon ng paghahanda ng mga sangkap na kasangkot sa RSC sa paraang nasa itaas, magpatuloy sa titration ng hemolytic serum, complement at antigen.
Ang aklat-aralin ay binubuo ng pitong bahagi. Unang bahagi – “General Microbiology” – naglalaman ng impormasyon tungkol sa morpolohiya at pisyolohiya ng bakterya. Ang ikalawang bahagi ay nakatuon sa genetika ng bakterya. Ikatlong bahagi - "Microflora ng biosphere" - sinusuri ang microflora kapaligiran, ang papel nito sa ikot ng mga sangkap sa kalikasan, pati na rin ang microflora ng tao at ang kahalagahan nito. Ikaapat na bahagi - "Ang doktrina ng impeksyon" - ay nakatuon sa mga pathogenic na katangian ng mga microorganism, ang kanilang papel sa nakakahawang proseso, at naglalaman din ng impormasyon tungkol sa mga antibiotic at ang kanilang mga mekanismo ng pagkilos. Ikalimang bahagi – “The Doctrine of Immunity” – naglalaman ng mga modernong ideya tungkol sa immunity. Ang ikaanim na bahagi - "Mga Virus at ang mga sakit na dulot nito" - ay nagbibigay ng impormasyon tungkol sa mga pangunahing biological na katangian ng mga virus at ang mga sakit na dulot nito. Ikapitong bahagi - "Pribadong medikal na mikrobiyolohiya" - naglalaman ng impormasyon tungkol sa morpolohiya, pisyolohiya, mga katangian ng pathogen ng mga pathogen ng marami mga nakakahawang sakit, at tungkol din sa makabagong pamamaraan kanilang mga diagnostic, tiyak na pag-iwas at therapy.
Ang aklat-aralin ay inilaan para sa mga mag-aaral, nagtapos na mga mag-aaral at mga guro ng mas mataas na medikal mga institusyong pang-edukasyon, mga unibersidad, mga microbiologist ng lahat ng mga specialty at nagsasanay na mga doktor.
Ika-5 edisyon, binago at pinalawak
Aklat:
| <<< Назад
|
Pasulong >>> |
Makadagdag sa reaksyon ng pag-aayos
Ang natatanging kakayahan ng pandagdag na partikular na magbigkis sa mga antigen + antibody complex na may iba't ibang kalikasan ay natagpuan malawak na aplikasyon sa complement fixation reaction (CFR). Ang isang espesyal na bentahe ng RSC ay ang likas na katangian ng antigen na kasangkot dito (corpuscular o natutunaw) ay hindi mahalaga, dahil ang complement ay nagbubuklod sa Fc fragment ng anumang antibody na nauugnay sa IgG at IgM, anuman ang pagiging tiyak ng antibody nito. Bilang karagdagan, ang RSA ay napaka-sensitibo: pinapayagan ka nitong makita ang dami ng mga antibodies ng 10 beses na mas mababa kaysa, halimbawa, sa reaksyon ng pag-ulan. Ang RSC ay iminungkahi noong 1901 nina J. Bordet at O. Zhang. Ito ay batay sa dalawang katangian ng pandagdag:
1) ang kakayahang magbigkis sa antigen + antibody complex;
2) lysis ng mga pulang selula ng dugo na ginagamit upang makakuha ng hemolytic serum.
Ang RSK ay isinasagawa sa dalawang yugto, at dalawang sistema ang kasangkot dito - eksperimental, o diagnostic, at tagapagpahiwatig. Ang diagnostic system ay binubuo ng test (o diagnostic) na serum, na pinainit sa 56 °C sa loob ng 30 minuto bago isagawa ang reaksyon upang hindi aktibo ang complement at antigen na nasa loob nito. Ang karaniwang pandagdag ay idinagdag sa sistemang ito. Ang pinagmulan nito ay sariwa o pinatuyong guinea pig whey. Ang halo ay incubated sa 37 °C sa loob ng isang oras. Kung ang test serum ay naglalaman ng mga antibodies, makikipag-ugnayan sila sa idinagdag na antigen, at ang magreresultang antigen + antibody complex ay magbubuklod sa idinagdag na pandagdag. Kung walang mga antibodies sa suwero, ang pagbuo ng isang antigen + antibody complex ay hindi magaganap, at ang pandagdag ay mananatiling libre. Karaniwang walang nakikitang mga pagpapakita ng pag-aayos ng pandagdag sa yugtong ito ng reaksyon. Samakatuwid, upang linawin ang tanong kung naganap ang pag-aayos ng komplemento o hindi, ang isang pangalawang sistema ng tagapagpahiwatig (hindi aktibo na hemolytic serum + mga pulang selula ng dugo ng tupa) ay idinagdag, at ang pinaghalong lahat ng mga sangkap ng RSC ay muling incubated sa 37 °C sa loob ng 30 - 60 minuto , pagkatapos kung saan ang mga resulta ng reaksyon ay tinasa. Kung ang complement ay nakatali sa unang yugto, sa diagnostic system, i.e. may mga antibodies sa serum ng pasyente, at ang complement ay nakatali sa antibody + + antigen complex, walang lysis ng erythrocytes - RBC ay positibo: ang likido ay walang kulay, mayroong sediment ng mga erythrocytes sa ilalim ng tubo . Kung walang mga tiyak na antibodies sa suwero at ang pagbubuklod ng pandagdag ay hindi nangyayari sa diagnostic system, i.e. negatibo ang RSC, kung gayon ang hindi nagamit na pandagdag sa diagnostic system ay nagbubuklod sa kumplikadong mga pulang selula ng dugo + mga antibodies ng indicator system at hemolysis. nangyayari: sa test tube na "lacquered blood", red blood cell sediment No. Ang intensity ng RSC ay tinasa gamit ang isang four-cross system depende sa antas ng pagkaantala ng hemolysis at ang pagkakaroon ng erythrocyte sediment. Ang reaksyon ay sinamahan ng naaangkop na mga kontrol: serum control (walang antigen) at antigen control (walang serum), dahil ang ilang sera at ilang antigens ay may anti-complementaryong epekto. Bago magsagawa ng RSC, ang lahat ng mga sangkap na kasangkot dito, maliban sa test serum o antigen, ay napapailalim sa maingat na titration. Ito ay lalong mahalaga upang ipakilala ang eksaktong dosis ng pandagdag sa reaksyon, dahil ang kakulangan o labis nito ay maaaring humantong sa maling resulta. Ang complement titer ay ang pinakamababang halaga na, sa pagkakaroon ng gumaganang dosis ng hemolytic serum, tinitiyak ang kumpletong pagkalusaw ng mga pulang selula ng dugo. Upang i-set up ang pangunahing eksperimento, kumuha ng dosis ng pandagdag na tumaas ng 20–25% kumpara sa naitatag na titer. Ang titer ng hemolytic serum ay ang pinakamataas na pagbabanto nito, na, kapag hinaluan ng pantay na dami ng 10% complement solution, ganap na na-hemolyze ang kaukulang dosis ng mga pulang selula ng dugo sa loob ng 1 oras sa temperatura na 37 °C. Ang pangunahing eksperimento ay kinabibilangan ng pagkuha ng serum na diluted sa 1/3 ng titer nito.
Ang reaksyon ng pag-aayos ng pandagdag ay isa sa tradisyonal serological reaksyon, ginagamit upang masuri ang maraming mga sakit na viral, at bumubuo rin ng batayan ng ilang iba pang mga paraan ng pagtuklas antiviral antibodies. Bagaman ang reaksyon ng neutralisasyon, pagsugpo ng hemagglutination, hindi direktang hematglutination, enzyme immunoassay malampasan ang reaksyon ng pag-aayos ng pandagdag sa pagiging sensitibo, gayunpaman, ang pagiging simple ng pamamaraan, maagang pagtuklas ng mga antibodies, pati na rin ang pagtuklas ng mga viral antigen na walang mga katangian ng hemagglutinating ay nagpapaliwanag ng malawakang paggamit nito sa mga pag-aaral ng virological.
Ang paggawa nito ay hindi nangangailangan ng ganoong mataas na antas ng konsentrasyon at kadalisayan ng mga antigenic na gamot, na kinakailangan para sa isang bilang ng iba pang mga immunological na reaksyon. Bilang karagdagan, ang pagtitiyak ng pangkat ng mga antigen sa pag-aayos ng komplemento ng maraming mga virus ay ginagawang posible na gamitin ang reaksyon ng pag-aayos ng komplemento sa mass diagnostics: ang reaksyong ito ay hindi naghahayag ng mga pagkakaiba sa strain at may partikular na halaga kapag pinag-aaralan ang mga antigenic na relasyon sa pagitan ng mga virus.
Ang pangalan mismo ay higit na sumasalamin sa kakanyahan ng pamamaraan, na binubuo ng dalawang magkahiwalay na reaksyon. Sa unang yugto, ang reaksyon ay nagsasangkot ng mga antigen at antibodies (isa sa mga sangkap na ito ay kilala nang maaga), pati na rin ang pandagdag sa isang titrated na halaga. Kung ang antigen at antibodies ay magkatugma, ang kanilang mga kumplikadong nagbubuklod ay umakma, na makikita sa ikalawang yugto gamit ang isang sistema ng tagapagpahiwatig (isang pinaghalong mga pulang selula ng dugo ng tupa at antiserum sa kanila). Kung ang pandagdag ay nakagapos sa panahon ng pakikipag-ugnayan ng antigen at antibodies, kung gayon ang lysis ng mga pulang selula ng dugo ng tupa ay hindi mangyayari ( positibong reaksyon pandagdag sa pag-aayos). Sa kaso ng negatibong complement fixation reaction, ang unfixed complement ay nagtataguyod ng hemolysis, na ginagamit upang hatulan ang mga resulta ng reaksyon.
Ang mga pangunahing bahagi ng reaksyon ng pag-aayos ng pandagdag ay mga antigens (kilala o nakikita), antibodies (kilalang antisera o test sera), pandagdag, hemolytic serum at mga pulang selula ng dugo ng tupa; Ang isotonic sodium chloride solution (pH 7.2-7.4) o iba't ibang buffer solution ay ginagamit bilang diluent. Ang mga antigen at sera ay maaaring anti-complementary, i.e. ang kakayahang mag-adsorb ng pandagdag, na nagpapaantala sa hemolysis at nakakasira ng resulta ng reaksyon.
Ang mga antigen para sa CSC ay inihanda mula sa mga organo ng mga infected na hayop, allantoic o amniotic fluid ng mga nahawaang embryo ng manok, pati na rin ang culture fluid pagkatapos magtanim ng mga virus sa tissue cell culture. Ang mga antigenic na paghahanda ay palaging naglalaman ng maraming mga ballast substance mula sa mga selula ng hayop o tissue culture, na maaari ring i-distort ang mga resulta ng reaksyon.
Ang mga nagresultang viral antigens ay hindi aktibo, ang gumaganang dosis, pati na rin ang mga anti-complementary at hemolytic na katangian ay tinutukoy. Ang antigen ay pagkatapos ay titrated sa pagkakaroon ng pandagdag.
Ang pangalawang pangunahing bahagi sa pagtatanghal ng reaksyon ay pandagdag. Ang ibig sabihin ng katagang ito kumplikadong sistema mga protina at salik na nasa dugo ng mga hayop at tao. Kadalasan, ginagamit ang guinea pig blood serum sa complement fixation reaction. Ang aktibidad (titer) ng pandagdag ay ang pinakamaliit na halaga nito, kung saan ang hemolysin ay nagiging sanhi ng kumpletong hemolysis ng hemolytic system na ginamit.
Upang matukoy ang mga complement-fixing antibodies sa mga virus, ang serum ay kinakailangang i-inactivate upang maalis ang complement sa 560C sa loob ng 30 minuto. Ang sera mula sa mga nabakunahang hayop ay kadalasang ginagamit bilang reference sera. Bukod dito, para sa pagbabakuna, ang mga viral antigen ay ginagamit na lubusan na nililinis mula sa mga dumi ng tisyu, dahil kung hindi man ay nangyayari ang isang binibigkas na hindi tiyak na reaksyon.
Ang isang obligadong bahagi ng reaksyon ng pag-aayos ng pandagdag ay ang hemolytic system, na kinabibilangan ng mga erythrocytes ng tupa at hemolytic serum na nakuha sa pamamagitan ng hyperimmunizing rabbits na may mga erythrocytes ng tupa.
Upang maisagawa ang complement fixation reaction, ang mga sumusunod na pagbabago ay ginagamit: ang micromethod ng complement fixation reaction sa isang Takachi system microtitrator, ang pangmatagalang complement fixation reaction, ang hindi direktang complement fixation reaction, ang complement fixation reaction sa isang gel, ang microdroplet complement fixation reaction, ang solid-based na complement fixation reaction.
Bagama't mababa ang sensitivity ng complement fixation reaction, mayroon itong mataas na specificity. Kaugnay nito, malawak itong ginagamit para sa pagsusuri ng viral pneumoenteritis sa mga batang baka.
