Реакція зв'язування комплементу (РСК) полягає в тому, що специфічний комплекс антиген - антитіло завжди адсорбує у собі (зв'язує) комплемент.
Цю реакцію широко застосовують при ідентифікації антигенів та в серодіагностиці інфекцій особливо захворювань* викликаних спірохетами (реакція Вассермана), рикетсіями та вірусами.
РСК – складна серологічна реакція. У ній беруть участь комплемент та дві системи антиген – антитіло. Фактично, це дві серологічні реакції.
Перша система - основна складається з антигену і антитіла (один відомий, інший немає). До неї додають певну кількість комплементу. За відповідністю антигену та антитіла цієї системи вони з'єднаються та зв'яжуть комплемент. Комплекс, що утворився, дрібнодисперсний і не видно.
Про утворення цього комплексу дізнаються за допомогою другої гемолітичної системи або індикаторної. До неї входять еритроцити барана (антиген) та відповідна їм гемолітична сироватка (антитіло), тобто готовий імунний комплекс. У цій системі лізис еритроцитів може статися лише у присутності комплементу. Якщо комплемент пов'язаний першою системою (відповідно до неї антигену і антитіла), то в другій системі гемолізу не буде - тому що немає вільного комплементу. Відсутність гемолізу (вміст каламутної пробірки або на дні її осад еритроцитів) реєструють як позитивний результат РСК.
Якщо першій системі антиген відповідає антитілу, то імунний комплекс не утворюється і комплемент залишиться вільним! Комплемент, що залишився вільним, бере участь у другій системі, викликаючи гемоліз, - результат РСК негативний (вміст пробірок прозоро - «лакова кров»).
Компоненти реакції зв'язування комплементу:
Антиген – зазвичай лізат, екстракт, гаптен; рідше завись.
1.Антитело-сироватка хворого система
2. Комплемент – сироватка морських свинок
3. Антиген – еритроцити барана
4. Антитіло - гемолізин до еритроцитів барана
5.Ізотонічний розчин
Зважаючи на те, що в РСК бере участь велика кількість складних компонентів, вони повинні бути попередньо відтитровані і взяті в реакцію в точних кількостях і в рівних обсягах: 0,5 або 0,25, рідше по 0,2 мл. Відповідно весь досвід проводять у обсягах 2,5, 1,25 або 1,0 мл (великі обсяги дають більш точний результат). Титрування компонентів реакції проводять у тому ж обсязі, в якому ставлять досвід, замінюючи відсутні інгредієнти ізотонічним розчином.
Підготовка інгредієнтів
Гемолітична сироватка (гемолізин). Сироватку розводять 3 рази менше за її титр (див. с. 211). Готують загальне розведення сироватки для всього досвіду, обсяг якого визначають, помноживши об'єм сироватки в одній пробірці (наприклад, 0,5 мл) на число пробірок, що трохи перевищує їх у досвіді.
2. Еритроцити барана. Готують 3% завись відмитих еритроцитів барана (див. с. 211) на всю кількість пробірок у досвіді. Для приготування гемолітичної системи за 30 хв до внесення її в досвід змішують рівні обсяги розведеного гемолізину і суспензії еритроцитів, приливаючи сироватку до еритроцитів, ретельно перемішують і інкубують 30 хв при 37?
3. Комплемент зазвичай розводять 1:10. перед кожним досвідом його обов'язково титрують. Титр комплементу - це його найменша кількість, при додаванні якого до гемолітичної системи відбувається повний гемоліз протягом 1год при 37? Схема титрування комплементу представлена в таблиці 21.
Увага! Титрують комплімент у такому ж обсязі, в якому ставлять основний досвід, замінюючи ізотонічним розчином інгредієнти, що відсутні.
Облік результатів. У контролю не повинно бути навіть слідів гемолізу, тому що в одному з них немає комплементу, в іншому – гемолізину. Контролі свідчать про відсутність у компонентів реакції гемотоксичності (здатність спонтанно лізувати еритроцити).
У наведеному у табл. 21 приклад титр комплементу в розведенні 1:10 дорівнює 0,15 мл. У досвіді активність комплементу може знизитися за рахунок неспецифічної адсорбції його іншими компонентами реакції, тому для досвіду кількість компліменту збільшують: беруть дозу, що наступає за титром. Це – робоча доза. У наведеному прикладі вона дорівнює 0,2 комплементу у розведенні 1:10. Оскільки всі компоненти, що беруть участь у РЗК, повинна бути взята в рівних обсягах (у нашому прикладі він дорівнює 0:5 мл), необхідно до робочої дози комплементу (0,2 мл1:10) додати 0,3 мл ізотонічного розчину. Для всього досвіду об'єм кожного з них (комплементу та ізотонічного розчину).
Для всього досвіду обсяг кожного з них (комплементу та ізотонічного розчину) множать на число пробірок, що беруть участь у РЗК. Наприклад, для проведення досвіду в 50 пробірках потрібно взяти 10 мл комплементу 1:10 (0,2 млх50) та 15 мл ізотонічного розчину (0,3 млх50).
4. Антиген зазвичай одержують готовим із зазначенням його титру, тобто. тієї кількості, яка після розведення антигену повинна міститися в 1 мл. наприклад, при титрі 0,4 його розводять 0,96 мл ізотонічного розчину. У досвід беру кількість антигену, що дорівнює половині титру (0,5 мл). Це його робоча доза. Говорять загальне розведення антигену для всього досвіду, помножуючи 0,5 мл на кількість пробірок у досвіді.
5. Антитіло – сироватка хворого. Свіжу сироватку перед досвідом інактивують, щоб зруйнувати наявний у ній комплемент. Для цього її прогрівають 30 хв при 56С на водяній бані або в інактиваторі з терморегулятором. Останній спосіб кращий: він виключає можливість перегріву сироватки, тобто її денатурації. Денатуровані сироватки не придатні до досвіду. Сироватку хворого зазвичай застосовують у розведенні від 1:10 до 1:160.
Таблиця №14
| Інгредієнти, мл | пробірки | |||||||||||
| досвід | контроль | |||||||||||
| Гемолітична система | еритроцитів | |||||||||||
| Ізотонічний розчин | 1,45 | 1,4 | 1,35 | 1,3 | 1,25 | 1,2 | 1,15 | 1,1 | 1,05 | 1,0 | 1,5 | 1,5 |
| Комплемент 1:10 | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,35 | 0,4 | 0,45 | 0,5 | ― | 0,5 |
| Гемолітична система | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | ― |
| 3% завись еритроцитів барана | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | 0,5 |
| Пробірки ретельно струшують і інкубують при 37С 1 год | ||||||||||||
| результат | Ні гемолізу | Гемоліз | Ні гемолізу |
Імунні сироватки найчастіше готують у виробничих умовах та випускають інактивованими. Їх розводять 1:50 та вище.
Усі компоненти готують із невеликим надлишком.
| Інгредієнти, мл | Пробірки | |||||||
| Досвід контроль | ||||||||
| сироватки | антигену | Гемолітична система | Комплемент у робочій дозі | |||||
| ½ | ||||||||
| Фаза 1 Ізотонічний розчин | ― | 0,5 | 0,5 | 1,5 | 1,25 | 1,0 | 0,5 | |
| Випробувана сироватка у розведенні 1:10 | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ― | |
| Антиген а робочій дозі | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ||
| Комплемент 1:10 у робочій дозі | 0,5 | 0,5 | 0,5 | ― | 0,25 | 0,5 | 1,0 | |
| Пробірки ретельно струшують і інкубують при 37С 45 хв 1ч або 4С 18 год | ||||||||
| Фаза 2 гемолітична система | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | |
| Пробірки ретельно струшують та інкубують при 37˚С до повного гемолізу у 2, 3, 6 та 7 пробірках | ||||||||
| Результат | Покладе. або негативний | ― | ― | ++++ | (+) | ― | ― | |
Таблиця №15
Проведення основного досвіду
При постановці досвіду вкрай; важлива послідовність додавання компонентів. Досвід проводять у дві фази.
Фаза I. У пробірки наливають необхідну кількість ізотонічного розчину натрію хлориду, потім - необхідний об'єм розведеної сироватки і в такому обсязі робочі дози антигену і комплементу. Досвід обов'язково супроводжують контролем усіх інгредієнтів, що беруть участь у ньому: сироватки, антигену, гемолітичної системи та комплементу.
Пробірки ретельно струшують і інкубують при 37°С 45 хв- 1 год або за 4 °С («РСК на холоді») 18 год. За цей час за наявності специфічного комплексу відбувається зв'язування комплементу. Проведення реакції «на холоді» значно підвищує її чутливість та специфічність.
Фаза ІІ. Після закінчення інкубації до всіх пробірок додають по 1 мл гемолітичної системи, яку попередньо витримують у термостаті 30 хв (сенсибілізують). Пробірки струшують і ставлять знову в термостат.
Облік результатів про ст. Пробірки залишають у термостаті до повного гемолізу в 2, 3, 6 і 7 пробірках (контроль сироватки, антигену і комплементу на одну і дві дози). Раніше гемоліз настане в 7-й пробірці, в якій знаходиться подвійна кількість комплементу. Після того, як у цій пробірці відбудеться гемоліз і вміст її стане абсолютно прозорим, потрібно особливо уважно стежити за рештою контролю. Як тільки рідина в 2, 3 і 6-й пробірках стане прозорою, слід негайно вийняти штатив з пробірками з термостата. Про те, що досвід не затримали в термостаті довше, ніж потрібно, говорить наявність легкої каламуті (неповного гемолізу) в 5 пробірці - в ній знаходиться тільки половина робочої дози комплементу і повного гемолізу при правильній постановці досвіду бути не може.
Гемоліз у контролі сироватки та антигену (пробірки 2 і 3) вказує на те, що їх дози були обрані правильно і що самі по собі ні сироватка, ні антиген комплемент не пов'язують.
У контролі гемолітичної системи (пробірка 4) за її правильної роботі має бути навіть слідів гемолізу - у ній відсутня комплемент.
Переконавшись, що контролі пройшли правильно, можна враховувати досвід. Відсутність гемолізу у пробірках досліду розцінюють як позитивний результат реакції. Він свідчить, що у сироватці є антитіла, специфічні щодо взятого антигену. Утворений ними комплекс пов'язав комплемент і перешкодив його участі реакції гемолізу. Якщо досвідчених пробірках настане гемоліз, результат реакції оцінюють як негативний. У даному випадкунемає відповідності між антигеном та антитілом, комплемент не пов'язаний та бере участь у реакції гемолізу.
Паралельно із сироваткою хворого ставлять такий самий досвід із свідомо позитивною сироваткою (тобто із сироваткою, в якій є антитіла до даного антигену) і свідомо негативною, в якій немає специфічних антитіл. При правильній постановці досвіду в першому випадку має бути затримка гемолізу, а в другому буде гемоліз.
Інтенсивність реакції виражають так:
Повна затримка гемолізу. Еритроцити утворюють рівномірну каламут або осідають на дно. В цьому випадку рідина в пробірці стає безбарвною;
Лізовано приблизно 25% еритроцитів. Осад менше, рідина над ним трохи рожева. Результат РЗК також оцінюють як різко позитивний;
Лізовано приблизно 50% еритроцитів. Осад невеликий, рідина рожева. Позитивний результат РЗК;
Лізовано приблизно 75% еритроцитів. Незначний осад, над ним інтенсивно забарвлена рідина. Сумнівний результат РЗК;
Лізовано всі еритроцити. Рідина інтенсивно забарвлена і прозора. Негативний результат РСК.
Цю реакцію застосовують для виявлення антитіл у сироватці крові хворих при бактеріальних, вірусних, протозойних інфекціях, а також для визначення та типування вірусів, виділених у хворих.
РЗК відноситься до складних серологічних реакцій, в яких, крім антигену, антитіла і комплементу, бере участь ще й гемолітична система, що виявляє результати реакції. РСК протікає у дві фази: перша – взаємодія антигену з антитілом за участю комплементу та друга – виявлення ступеня зв'язування комплементу за допомогою гемолітичної системи. Ця система складається з еритроцитів барана та гемолітичної сироватки, отриманої шляхом імунізації лабораторних тварин, еритроцитами. Еритроцити обробляють - сенсибілізують, приєднуючи до них сироватку при температурі 37 ° С протягом 30 хв. Ліза сенсибілізованих еритроцитів барана настає лише у разі приєднання до гемолітичної системи комплементу. За відсутності його еритроцити не змінюються. Результати РЗК залежать від наявності в досліджуваній сироватці антитіл. Якщо сироватка містить антитіла, гомологічні антигену, що використовується в реакції, то комплекс антиген, що утворюється, - антитіло приєднує, пов'язує комплемент. При додаванні гемолітичної системи у разі гемолізу не відбудеться, оскільки весь комплемент витрачається на специфічну зв'язок комплексу антиген — антитіло.
Еритроцити залишаються не зміненими, тому відсутність гемолізу в пробірці реєструють як позитивну РЗК. За відсутності у сироватці антитіл, що відповідають антигену, специфічний комплекс антиген-антитіло не утворюється і комплемент залишається вільним. При додаванні гемолітичної системи комплемент приєднується до неї та викликає гемодиз еритроцитів. Руйнування еритроцитів, їхній гемоліз характеризує негативну реакцію.
Для постановки РЗК необхідні: сироватка хворого, комплемент, гемолітична система, що складається з еритроцитів барана та гемолітичної сироватки, а також ізотонічний розчин хлориду натрію.
Реакцію ставлять у серологічних пробірках. Еритроцити барана одержують із дефібринованої крові барана шляхом триразового відмивання їх ізотонічним розчином хлориду натрію. Гемолітичну сироватку випускають у готовому вигляді в ампулах, на етикетці яких зазначений її титр, тобто максимальне розведення сироватки, яке викликає гемоліз при додаванні до еритроцитів у присутності комплементу. Гемолітичну сироватку одержують шляхом імунізації тварин, наприклад, кролика еритроцитами барана. При постановці реакції сироватку використовують у потрійному титрі. Наприклад, титр гемолітичної сироватки 1: 1200, а робоче розведення 1: 400. Як комплемент використовують свіжу сироватку крові морської свинки (протягом 24-48 год) або сухий комплемент в ампулах.
Попередньо перед постановкою РЗК комплемент розводять 1: 10 і титрують для встановлення титру - найменшої кількості комплементу, що дає гемоліз еритроцитів при з'єднанні з гемолітичною системою, що використовується в цій реакції. З огляду на можливі антикомплементарні властивості антигену при постановці реакції до встановленого робочого титру комплементу роблять 20-30% надбавку.
Антигеном для РСК є суспензії вбитих бактерій, екстракти, приготовані з цих суспензій, окремі хімічні фракції мікробів. Основна вимога до антигену – відсутність пригнічення активності комплементу. Він не повинен мати антикомплементарні властивості. Для виявлення цих властивостей антигену комплемент додатково титрують у присутності антигену, що використовується в реакції. Існують певні схеми постановки РЗК. Результати реакції враховують за наявністю чи відсутністю гемолізу еритроцитів у гемолітичній системі. РСК застосовують при діагностиці сифілісу (реакція Вассермана), гонореї (реакція Борде-Жангу), токсоплазмозу, рикетсіозних і вірусних захворювань.
Реакція зв'язування комплементу (РСК) полягає в тому, що відповідно один одному антигени і антитіла утворюють імунний комплекс, до якого через Fc-фрагмент антитіл приєднується комплемент (С), тобто відбувається зв'язування комплементу комплексом антиген-антитіло. Якщо ж комплекс антиген-антитіло не утворюється, то комплемент залишається вільним.
Специфічна взаємодія АГ та AT супроводжується адсорбцією (зв'язуванням) комплементу. Оскільки процес зв'язування комплементу не проявляється візуально, Ж. Борде та О. Жангу запропонували використовувати як індикатор гемолітичну систему (еритроцити барана + гемолітична сироватка), яка показує, чи комплемент фіксований комплексом АГ-АТ. Якщо АГ і AT відповідають одне одному, т. е. утворився імунний комплекс, то комплемент пов'язується цим комплексом і гемолізу немає. Якщо AT відповідає АГ, то комплекс не утворюється і комплемент, залишаючись вільним, з'єднується з другою системою і викликає гемоліз.
Перебіг реакції
Реакція протікає у дві фази за участю двох систем; бактеріальної та гемолітичної. У першій реакції (специфічна) беруть участь антиген 4+ антитіло + комплемент. Позитивний результат реакції, що настає відповідно антитіл антигену, характеризується утворенням специфічного бактеріального комплексу антиген - антитіло з адсорбованим, або, як кажуть, «пов'язаним», комплементом. Залишаючись невидимим, комплекс не викликає жодних зовнішніх змін того середовища, в якому він утворився. Негативний результат РЗК має місце за відсутності специфічної спорідненості між антигеном і антитілом сироватки і характеризується збереженням вільного активного комплементу. Перша фаза РЗК може проводитися в термостаті при 37°С (1-2 год) або в холодильнику при 3-4°С (18-20 год). При тривалому утворенні імунного комплексу антиген-антитіло на холоді відбувається повніше зв'язування комплементу і внаслідок цього чутливість реакції збільшується. При постановці порівняльних дослідів радянським імунологом акад. В. І. Іоффе та його учнями було показано, що в умовах тривалого зв'язування комплементу на холоді можна вловити у 100-500 разів менші кількості антигену та отримати позитивні результатипри великих розведеннях імунної сироватки, ніж у досвіді зв'язування комплементу при температурі 37 °С протягом 1-2 години. °С тільки за наявності комплементу, що залишився вільним від першої фази реакції (негативна реакція). За відсутності вільного активного комплементу гемолізу еритроцитів під дією специфічних гемолізинів не настає (позитивна реакція).
Компоненти
Реакція зв'язування комплементу відноситься до складних серологічних реакцій. Для її проведення необхідні 5 інгредієнтів, а саме: АГ, AT та комплемент (перша система), еритроцити барана та гемолітична сироватка (друга система).
Антигеном для РЗК можуть бути культури різних вбитих мікроорганізмів, їх лізати, компоненти бактерій, патологічно змінених і нормальних органів, тканинних ліпідів, віруси та вірусовмісні матеріали.
Як комплемент використовують свіжу або суху сироватку морської свинки.
Механізм реакції
РСК проводять у дві фази: 1-а фаза - інкубація суміші, що містить три компоненти антиген + антитіло + комплемент; 2-я фаза (індикаторна) - виявлення суміші вільного комплементу шляхом додавання до неї гемолітичної системи, що складається з еритроцитів барана, і гемолітичної сироватки, що містить антитіла до них. У 1-й фазі реакції при утворенні комплексу антиген-антитіло відбувається зв'язування ним комплементу, і тоді у 2-й фазі гемолізу сенсибілізованих антитілами еритроцитів не відбудеться; реакція позитивна. Якщо антиген та антитіло не відповідають один одному (у досліджуваному зразку немає антигену чи антитіла), комплемент залишається вільним і у 2-й фазі приєднається до комплексу еритроцит – антиеритроцитарне антитіло, викликаючи гемоліз; реакція негативна.
Застосування
Реакцію зв'язування комплементу можна застосовувати для:
1) виявлення специфічних антитіл у невідомій сироватці на підставі взаємодії їх із антигеном відомої природи;
2) вивчення властивостей антигену реакції з відомою специфічною сироваткою. Підготовка інгредієнтів для постановки РЗК.
1. Сироватку крові, отриману для дослідження, напередодні постановки реакції прогрівають у водяній бані при 56°С протягом 30 хв для інактивації її власного комплементу. Інактивована сироватка може зберігатись при температурі 3-4°С протягом 5-6 днів. У день постановки-досвіду сироватку розводять ізотонічним розчином натрію хлориду у співвідношенні 1:5 (0,1 мл досліджуваної сироватки,+ 0,4 мл ізотонічного розчину хлориду натрію).
2. Антигеном для постановки РСК можуть бути культури різноманітних мікробів, бактеріальні білки та екстракти, отримані з мікробних культур, патологічно змінених та нормальних органів та тканин. Особливості приготування антигену визначаються характером інфекційного процесу та особливостями його збудника.
3. Комплементом є суміш сироваток, отримана від 3-5 здорових морських свинок, або сухий комплемент у ампулах.
Безпосередньо перед вживанням сироватку морської свинки розводять ізотонічним розчином хлориду атрію щодо 1: 10, отримуючи основний розчин.
4. Гемолітичну сироватку перед постановкою досліду інактивують прогріванням при температурі 56 °С протягом 30 хв. Для встановлення основного досвіду РСК, а також для титрування комплементу та антигену застосовують гемолітичну сироватку в потрійному титрі. Наприклад, якщо титр гемолітичної сироватки 1: 1800, реакції застосовують розведення сироватки 1: 600.
5. Еритроцити одержують з дефібринованої крові барана. Кров видалення плівок фібрину фільтрують через тришаровий марлевий фільтр. Отриманий фільтрат центрифугують, сироватку відсмоктують і зливають, а еритроцити промивають 3-4-кратним центрифугуванням з ізото - ним розчином хлориду натрію. При останньому промиванні еритроцитів надосадовий шар рідини має бути абсолютно прозорим. З відмитих еритроцитів готують 3% завись в ізотонічному розчині хлориду натрію. Підготувавши вказаним вище способом інгредієнти, що беруть участь у РЗК, приступають до титрування гемолітичної сироватки, комплементу та антигену.
Підручник складається із семи частин. Частина перша – «Загальна мікробіологія» – містить відомості про морфологію та фізіологію бактерій. Частина друга присвячена генетиці бактерій. У частині третій - "Мікрофлора біосфери" - розглядається мікрофлора довкілля, її роль у кругообігу речовин у природі, а також мікрофлора людини та її значення. Частина четверта – «Вчення про інфекцію» – присвячена патогенним властивостям мікроорганізмів, їх ролі в інфекційному процесі, а також містить відомості про антибіотики та механізми їх дії. Частина п'ята - "Вчення про імунітет" - містить сучасні уявлення про імунітет. У шостій частині – «Віруси та захворювання, які вони викликають» – представлені відомості про основні біологічні властивості вірусів і про ті захворювання, які вони викликають. Частина сьома – «Приватна медична мікробіологія» – містить відомості про морфологію, фізіологію, патогенні властивості збудників багатьох інфекційних захворювань, а також про сучасних методахїх діагностики, специфічної профілактикита терапії.
Підручник призначений для студентів, аспірантів та викладачів вищих медичних навчальних закладів, університетів, мікробіологів усіх спеціальностей та практичних лікарів
5-те видання, виправлене та доповнене
Книга:
| <<< Назад
|
Вперед >>> |
Реакція зв'язування комплементу
Унікальна здатність комплементу специфічно зв'язуватися з різними за своєю природою комплексами антиген + антитіло знайшла широке застосуванняреакції зв'язування комплементу (РСК). Особлива перевага РСК полягає в тому, що природа антигену, що бере участь у ній (корпускулярний або розчинний), не має значення, оскільки комплемент зв'язується з Fc-фрагментом будь-якого антитіла, що відноситься до IgG та IgM, незалежно від його антитільної специфічності. Крім того, РЗК дуже чутлива: вона дозволяє виявити кількість антитіл в 10 разів менше, ніж, наприклад, у реакції преципітації. РСК було запропоновано в 1901 р. Ж. Борде та О. Жангу. В її основі лежать дві властивості комплементу:
1) здатність зв'язуватися з комплексом антиген + антитіло;
2) лізування еритроцитів, використаних для одержання гемолітичної сироватки.
РСК ставлять у два етапи, і в ній відповідно беруть участь дві системи - дослідна, або діагностична, та індикаторна. Діагностична система складається з досліджуваної (або діагностичної) сироватки, яку перед постановкою реакції прогрівають при 56 °C протягом 30 хв для інактивації наявного в ній комплементу та антигену. До цієї системи додають стандартний комплемент. Його джерелом є свіжа або висушена сироватка морської свинки. Суміш інкубують при 37 °C протягом однієї години. Якщо в досліджуваній сироватці є антитіла, відбудеться їх взаємодія з доданим антигеном, і комплекси, що утворюються антиген + антитіло зв'яжуть доданий комплемент. Якщо ж у сироватці антитіла відсутні, утворення комплексу антиген + антитіло не станеться і комплемент залишиться вільним. Жодних видимих проявів зв'язування комплементу цієї стадії реакції зазвичай немає. Тому для з'ясування питання, чи відбулося зв'язування комплементу, додають другу, індикаторну систему (інактивована гемолітична сироватка + еритроцити барана), і суміш усіх компонентів РСК знову інкубують при 37 °C протягом 30 - 60 хв, після чого оцінюють результати реакції. У випадку, якщо комплемент зв'язався на першій стадії, в діагностичній системі, тобто в сироватці хворого є антитіла, і відбулося зв'язування комплементу комплексом антитіло + антиген, лізису еритроцитів не буде - РСК позитивна: рідина безбарвна, на дні пробірки осад еритроцитів . Якщо ж у сироватці специфічні антитіла відсутні і зв'язування комплементу в діагностичній системі не відбудеться, тобто РСК негативна, то невитрачений в діагностичній системі комплемент пов'язується з комплексом еритроцити + антитіла індикаторної системи і відбудеться гемоліз: в пробірці лакова ні. Інтенсивність РСК оцінюють за чотирихресною системою залежно від ступеня затримки гемолізу та наявності осаду еритроцитів. Реакція супроводжується відповідними контролюми: контроль сироватки (без антигену) і контроль антигену (без сироватки), так як деякі сироватки і деякі антигени мають антикомплементарну дію. Перед постановкою РСК всі компоненти, що у ній, крім досліджуваної сироватки чи антигену, піддаються ретельному титруванню. Особливо важливо ввести в реакцію точну дозу комплементу, оскільки його нестача або надлишок можуть призвести до хибним результатам. Титром комплементу є та його мінімальна кількість, яка у присутності робочої дози гемолітичної сироватки забезпечує повне розчинення еритроцитів. Для встановлення основного досвіду беруть дозу комплементу, збільшену на 20 – 25 % порівняно зі встановленим титром. Титром гемолітичної сироватки є те її максимальне розведення, яке змішане з рівним об'ємом 10 % розчину комплементу, повністю гемолізує відповідну дозу еритроцитів протягом 1 год при температурі 37 °C. В основний досвід беруть сироватку, розведену до 1/3 свого титру.
Реакція зв'язування комплементу є однією з традиційних серологічних реакцій, що застосовуються для діагностики багатьох вірусних захворювань, а також становить основу деяких інших методів виявлення противірусних антитіл. Хоча реакція нейтралізації, гальмування гемаглютинації, непрямої гемаглютинації, імуноферментний аналізперевершують реакцію зв'язування комплементу за чутливістю, проте простота методики, раннє виявлення антитіл, а також виявлення вірусних антигенів, що не володіють гемагглютинуючими властивостями, пояснюють її широке застосування у вірусологічних дослідженнях.
Для її постановки не потрібен такий високий ступінь концентрації та чистоти антигенних препаратів, які необхідні ряду інших імунологічних реакцій. Крім того, групова специфічність комплементзв'язувальних антигенів багатьох вірусів дозволяє використовувати реакцію зв'язування комплементу при масовій діагностиці: ця реакція не виявляє штамових відмінностей, набуває особливої цінності при вивченні антигенних взаємозв'язків між вірусами.
Сама назва значною мірою відображає суть методу, що складається із двох окремих реакцій. На першому етапі реакції беруть участь антигени і антитіла (один з цих компонентів заздалегідь відомий), а також комплемент в відтитрованій кількості. За відповідністю антигену та антитіл їх комплекс пов'язує комплемент, що виявляється на другому етапі за допомогою індикаторної системи (суміш баранячих еритроцитів та антисироватки до них). Якщо комплемент зв'язався при взаємодії антигену та антитіл, то лізис баранячих еритроцитів не відбувається ( позитивна реакціязв'язування комплементу). При негативній реакції зв'язування комплементу незв'язаний комплемент сприяє гемолізу, за яким судять про результати реакції.
Основними компонентами реакції зв'язування комплементу є антигени (відомі або виявляються), антитіла (відомі антисироватки або досліджувані сироватки), комплемент, гемолітична сироватка та еритроцити барана; як розріджувач використовують ізотонічний розчин натрію хлориду (pH 7,2-7,4) або різні буферні розчини. Антигени і сироватки можуть мати антикомплементарність, тобто. здатністю адсорбувати комплемент, що затримує гемоліз та спотворює результат реакції.
Антигени для РЗК готують з органів заражених тварин, алантоїсної або амніотичної рідини заражених курячих ембріонів, а також культуральної рідини після культивування вірусів у тканинних культурах клітин. В антигенних препаратах завжди міститься багато баластних речовин із клітин тварин або культур тканини, що може також спотворити результати реакції.
Отримані вірусні антигени інактивують, визначають робочу дозу, а також антикомплементарні та гемолітичні властивості. Після цього антиген титрують у присутності комплементу.
Другим основним компонентом під час постановки реакції є комплемент. Цим терміном позначають складну системубілків та факторів, присутніх у крові тварин та людини. Зазвичай у реакції зв'язування комплементу застосовують сироватку крові морських свинок. Активність (титр) комплементу - це його найменша кількість, у присутності якого гемолізин викликає повний гемоліз гемолітичної системи, що використовується.
Для виявлення комплемент-зв'язуючих антитіл до вірусів проводять обов'язкову інактивацію сироватки усунення комплементу при 560С протягом 30 хв. Як референс-сироваток зазвичай використовують сироватки імунізованих тварин. Причому для імунізації застосовують вірусні антигени, ретельно очищені від тканинних домішок, оскільки до іншого виникає виражена неспецифічна реакція.
Обов'язковим компонентом реакції зв'язування комплементу є гемолітична система, до якої входять еритроцити барана та гемолітична сироватка, отримана гіперімунізацією кроликів еритроцитами барана.
Для постановки реакції зв'язування комплементу використовують такі модифікації: мікрометод реакції зв'язування комплементу в мікротитраторі системи Такачі, реакцію тривалого зв'язування комплементу, реакцію непрямого зв'язування комплементу, реакцію зв'язування комплементу в гелі, реакцію зв'язування комплементу мікрокрапельним методом, реакцію зв'язування комплементу.
Хоча чутливість реакції зв'язування комплементу невисока, проте має високу специфічність. У зв'язку з цим вона широко застосовується для діагностики вірусних пневмоентеритів молодняку великої рогатої худоби.
