Tindak balas aglutinasi (RA) ialah lekatan dan pemendakan mikrob atau sel lain di bawah pengaruh antibodi dengan kehadiran elektrolit. Mendakan yang terhasil dipanggil aglutinat.
RA digunakan:
1. Untuk mengesan antibodi dalam serum darah pesakit (serodiagnosis).
2. Untuk menentukan jenis dan serovar kultur tulen mikroorganisma patogen yang diasingkan daripada pesakit (serotyping).
Tindak balas aglutinasi digunakan untuk menentukan antibodi dalam serum darah pesakit, contohnya, dengan demam kepialu dan demam paratifoid (tindak balas Vidal), brucellosis (Tindak balas Wright, Heddleson), tularemia, leptospirosis dan lain-lain penyakit berjangkit, serta untuk menentukan patogen yang diasingkan daripada pesakit (jangkitan usus, batuk kokol, dll.). RA digunakan untuk menentukan kumpulan darah, faktor Rh, dsb.
Tindak balas memerlukan komponen berikut:
1. Antigen (aglutinogen) mestilah berbentuk korpuskular, iaitu, ia adalah penggantungan mikroorganisma hidup atau terbunuh (diagnostik m), eritrosit atau sel lain. Biasanya, budaya harian mikroorganisma yang ditanam pada slant agar digunakan. Kultur dibasuh dengan 3 - 4 ml larutan isotonik, dipindahkan ke tiub steril, dan ketumpatan ditentukan. Suspensi mestilah homogen dan mengandungi sehingga 3 bilion sel mikrob setiap 1 ml. Penggunaan penggantungan mikrob terbunuh - diagnosticums - memudahkan kerja (disediakan dalam pengeluaran).
2. Antibodi (aglutinin) terdapat dalam serum pesakit (semasa serodiagnosis) atau dalam serum aglutinasi (semasa serotyping). Sera aglutinasi diperoleh dengan mengimunkan arnab dengan bakteria yang telah dibunuh.
Titer aglutinasi serum dipanggil pencairan tertinggi, di mana ia bertindak balas dengan antigen yang sepadan di bawah keadaan eksperimen tertentu.
Sera aglutinasi boleh menjadi asli (tidak terserap) dan terjerap. Sera asli dalam pencairan kecil berinteraksi bukan sahaja dengan jenis mikroorganisma yang mana haiwan itu diimunisasi untuk mendapatkan serum, tetapi juga dengan jenis mikroorganisma yang berkaitan, kerana ia mengandungi antibodi kumpulan (antibodi kepada mikroorganisma yang mempunyai antigen biasa). Sera asli digunakan untuk tindak balas aglutinasi terperinci (untuk serodiagnosis), yang mengambil kira bukan sahaja kehadiran tindak balas, tetapi juga dinamik peningkatan titer antibodi.
Jika antibodi kumpulan diekstrak (terjerap) daripada serum asli melalui interaksi dengan bakteria berkaitan yang mempunyai antigen kumpulan, sera terserap diperoleh. Sera terjerap boleh menjadi monoreseptor (atau jenis khusus), mengandungi antibodi kepada hanya satu sera antigen yang terdiri daripada campuran beberapa sera terserap atau tidak terjerap. Sera terjerap digunakan untuk tindak balas aglutinasi kaca.
Apabila haiwan diimunisasi dengan bakteria motil dengan antigen H, sera pengaglutinasi H yang mengandungi antibodi H diperolehi (contohnya, serum pengaglutinasi Salmonella monoreceptor H). Dengan imunisasi dengan O-antigen, sera O-aglutinating yang mengandungi O-antibodi diperolehi (contohnya, serum O-agglutinating kumpulan Salmonella, serum O-agglutinating anticholera). Dengan imunisasi dengan H- dan O-antigen, sera dengan H- dan O-antibodi diperolehi.
Selain itu, O-aglutinin menghasilkan aglutinat berbutir halus, dan H-aglutinin menghasilkan sedimen berbutir kasar.
3. Elektrolit - larutan NaCl isotonik (larutan natrium klorida 0.9% disediakan dalam air suling).
Terdapat dua kaedah utama untuk melakukan tindak balas aglutinasi: tindak balas pada kaca (kadangkala dipanggil tindak balas indikatif atau plat) dan tindak balas terperinci (dalam tabung uji)
Menyediakan tindak balas aglutinasi pada kaca. Dua titik serum dan setitik larutan natrium klorida isotonik disapu pada slaid kaca tanpa lemak. Serum aglutinasi diagnostik diambil dalam satu pencairan, yang, bergantung pada titernya, ialah 1:10, 1:25, 1:50 atau 1:100. Kultur mikroorganisma yang dikaji ditambah ke dalam satu titis serum dan titisan larutan isotonik menggunakan gelung dan dicampur dengan teliti. Setitik natrium klorida dengan mikroorganisma adalah kawalan antigen, setitik serum tanpa mikroorganisma adalah kawalan serum. Anda tidak boleh memindahkan kultur dari setitik dengan serum ke setitik dengan NaCl. Tindak balas berlaku pada suhu bilik selama 1-3 minit. Jika kawalan serum kekal jelas, kekeruhan seragam diperhatikan dalam kawalan antigen, dan kepingan aglutinat muncul dalam titisan di mana budaya dicampur dengan serum, maka hasilnya dianggap positif. Sekiranya terdapat kekeruhan seragam dalam titisan dengan serum dan antigen, maka ini adalah hasil negatif. Reaksi lebih jelas kelihatan pada latar belakang gelap.
Serum
1. kawalan antigen
2. kawalan serum
13.1. Tindak balas antigen-antibodi dan aplikasinya
Apabila antigen diperkenalkan, antibodi terbentuk di dalam badan. Antibodi adalah pelengkap kepada antigen yang menyebabkan sintesisnya dan mampu mengikatnya. Pengikatan antigen kepada antibodi terdiri daripada dua fasa. Fasa pertama adalah khusus, di mana pengikatan pantas penentu antigen ke pusat aktif serpihan antibodi Fab berlaku. Perlu diingatkan bahawa pengikatan adalah disebabkan oleh daya van der Waals, hidrogen dan interaksi hidrofobik. Kekuatan ikatan ditentukan oleh tahap korespondensi spatial antara tapak aktif antibodi dan epitop antigen. Selepas fasa tertentu, fasa yang lebih perlahan bermula - tidak spesifik, yang ditunjukkan oleh fenomena fizikal yang kelihatan (contohnya, pembentukan serpihan semasa aglutinasi, dll.).
Reaksi imun ialah interaksi antara antibodi dan antigen, dan tindak balas ini adalah khusus dan mempunyai sensitiviti yang tinggi. Mereka digunakan secara meluas dalam latihan perubatan. Dengan bantuan tindak balas imun, masalah berikut boleh diselesaikan:
Penentuan antibodi yang tidak diketahui oleh antigen yang diketahui (antigenic diagnosticum). Tugas ini berlaku apabila perlu untuk menentukan antibodi kepada patogen dalam serum darah pesakit (serodiagnosis). Mencari antibodi membolehkan anda mengesahkan diagnosis;
Penentuan antigen yang tidak diketahui menggunakan antibodi yang diketahui (serum diagnostik). Kajian ini dijalankan apabila mengenal pasti budaya patogen yang diasingkan daripada bahan pesakit (serotaip), serta apabila mengesan
antigen mikrob dan toksinnya dalam darah dan lain-lain cecair biologi. Terdapat banyak jenis tindak balas imun, berbeza dalam teknik pementasan dan kesan yang direkodkan. Ini adalah tindak balas aglutinasi (RA), tindak balas pemendakan (RP), tindak balas yang melibatkan pelengkap (RSC), tindak balas menggunakan komponen berlabel (RIF, ELISA, RIA).
13.2. Tindak balas aglutinasi
Tindak balas aglutinasi (RA) ialah tindak balas imun interaksi antigen dengan antibodi dengan kehadiran elektrolit, dan antigen berada dalam keadaan korpuskular (eritrosit, bakteria, zarah lateks dengan antigen terserap). Semasa aglutinasi, antigen korpuskular dilekatkan bersama oleh antibodi, yang ditunjukkan oleh pembentukan mendakan flokulen. Pembentukan kepingan berlaku disebabkan oleh fakta bahawa antibodi mempunyai dua pusat aktif, dan antigen adalah polivalen, i.e. mempunyai beberapa penentu antigen. RA digunakan untuk mengenal pasti patogen yang diasingkan daripada bahan pesakit, serta untuk mengesan antibodi kepada patogen dalam serum darah pesakit (contohnya, tindak balas Wright dan Heddleson untuk brucellosis, tindak balas Widal untuk demam kepialu dan demam paratifoid).
Cara paling mudah untuk mendiagnosis RA ialah tindak balas pada kaca; ini adalah anggaran RA, yang digunakan untuk menentukan patogen yang diasingkan daripada pesakit. Apabila tindak balas ditubuhkan, serum aglutinasi diagnostik digunakan pada slaid kaca (pada pencairan 1:10 atau 1:20), kemudian budaya dari pesakit ditambah. Tindak balas adalah positif jika sedimen flokulan muncul dalam titisan. Kawalan diletakkan berdekatan: bukannya serum, setitik larutan natrium klorida digunakan. Jika serum aglutinasi diagnostik tidak terserap 1, maka ia dicairkan (kepada titer - pencairan yang mana aglutinasi harus berlaku), i.e. masukkan RA yang diperkembangkan dalam tabung uji dengan peningkatan
1 Serum aglutinasi yang tidak terserap boleh mengaglutinasi bakteria berkaitan yang mempunyai antigen biasa (tindak balas silang). Oleh itu mereka menggunakansera aglutinasi terserap, daripadanya antibodi tindak balas silang telah dikeluarkan melalui penjerapan kepada bakteria yang berkaitan. Sera sedemikian mengekalkan antibodi yang khusus hanya untuk bakteria tertentu.
pencairan serum aglutinasi, yang mana 2-3 titis penggantungan patogen yang diasingkan daripada pesakit ditambah. Aglutinasi diambil kira oleh jumlah sedimen dan tahap pembersihan cecair dalam tabung uji. Tindak balas dianggap positif jika aglutinasi diperhatikan dalam pencairan yang hampir dengan titer serum diagnostik. Tindak balas disertai dengan kawalan: serum yang dicairkan dengan larutan natrium klorida isotonik harus telus, penggantungan mikrob dalam larutan yang sama harus keruh seragam, tanpa sedimen.
Untuk menentukan antibodi kepada patogen dalam serum darah pesakit, RA skala penuh digunakan. Semasa menyediakannya, serum darah pesakit dicairkan dalam tabung uji dan jumlah penggantungan diagnosticum (penggantungan mikrob yang terbunuh) yang sama ditambahkan ke dalam tabung uji. Selepas pengeraman, pencairan serum tertinggi di mana aglutinasi berlaku ditentukan, i.e. mendakan (titer serum) telah terbentuk. Dalam kes ini, tindak balas aglutinasi dengan O-diagnosticum (bakteria dibunuh oleh haba, mengekalkan O-antigen termostable) berlaku dalam bentuk aglutinasi berbutir halus. Tindak balas aglutinasi dengan H-diagnosticum (bakteria dibunuh oleh formaldehid, mengekalkan antigen flagellar termolabile H-antigen) adalah kasar dan berkembang lebih cepat.
Tindak balas hemagglutinasi tidak langsung (pasif).(RNGA atau RPGA) ialah sejenis RA. Kaedah ini sangat sensitif. Dengan bantuan RNGA, dua masalah boleh diselesaikan: untuk menentukan antibodi dalam serum darah pesakit, yang ditambah diagnosticum erythrocyte antigenik, iaitu eritrosit di mana antigen yang diketahui diserap; menentukan kehadiran antigen dalam bahan ujian. Dalam kes ini, tindak balas kadang-kadang dipanggil tindak balas hemagglutinasi tidak langsung terbalik (RONHA). Semasa prosedur, antibodi erythrocyte diagnosticum (eritrosit dengan antibodi terserap pada permukaannya) ditambah kepada bahan ujian. Dalam tindak balas ini, sel darah merah bertindak sebagai pembawa dan terlibat secara pasif dalam pembentukan agregat imun. Dengan tindak balas positif, sel darah merah yang dilekatkan secara pasif menutup bahagian bawah lubang dalam lapisan sekata dengan tepi bergigi ("payung"); jika tiada aglutinasi, sel darah merah terkumpul di ceruk tengah lubang, membentuk "butang" padat dengan tepi yang jelas.
Tindak balas koaglutinasi digunakan untuk menentukan sel patogen (antigen) menggunakan antibodi yang terjerap pada Staphylococcus aureus, mengandungi protein A. Protein A mempunyai pertalian untuk serpihan Fc imunoglobulin. Terima kasih kepada ini, antibodi mengikat staphylococcus secara tidak langsung melalui serpihan Fc, dan serpihan Fab berorientasikan ke luar dan dapat berinteraksi dengan mikrob sepadan yang diasingkan daripada pesakit. Dalam kes ini, serpihan terbentuk.
Tindak balas perencatan hemaglutinasi (HAI) digunakan dalam diagnostik jangkitan virus, dan hanya jangkitan yang disebabkan oleh virus hemagglutinasi. Virus ini mengandungi protein pada permukaannya - hemagglutinin, yang bertanggungjawab untuk tindak balas hemagglutinasi (HRA) apabila sel darah merah ditambah kepada virus. RTGA melibatkan menyekat antigen virus dengan antibodi, akibatnya virus kehilangan keupayaan mereka untuk mengaglutinasi sel darah merah.
Reaksi Coombs - RA untuk penentuan antibodi yang tidak lengkap. Dalam beberapa penyakit berjangkit, seperti brucellosis, antibodi yang tidak lengkap kepada patogen beredar dalam serum darah pesakit. Antibodi yang tidak lengkap dipanggil antibodi menyekat kerana ia mempunyai satu tapak pengikat antigen, dan bukan dua, seperti antibodi penuh. Oleh itu, apabila diagnostikum antigenik ditambah, antibodi yang tidak lengkap mengikat antigen, tetapi jangan melekatkannya bersama-sama. Untuk menunjukkan tindak balas, serum antiglobulin (antibodi kepada imunoglobulin manusia) ditambah, yang akan membawa kepada aglutinasi kompleks imun (antigen diagnosticum + antibodi tidak lengkap) yang terbentuk pada peringkat pertama tindak balas.
Reaksi Coombs tidak langsung digunakan pada pesakit dengan hemolisis intravaskular. Dalam sesetengah pesakit ini, antibodi anti-Rhesus monovalen yang tidak lengkap dikesan. Mereka secara khusus berinteraksi dengan eritrosit Rh-positif, tetapi tidak menyebabkan aglutinasi mereka. Oleh itu, serum antiglobulin ditambah kepada sistem antibodi anti-Rh + eritrosit Rh-positif, yang menyebabkan aglutinasi eritrosit. Ujian Coombs digunakan untuk mendiagnosis keadaan patologi, dikaitkan dengan lisis intravaskular eritrosit asal imun, sebagai contoh, penyakit hemolitik bayi baru lahir yang disebabkan oleh konflik Rh.
RA untuk menentukan kumpulan darah adalah berdasarkan aglutinasi eritrosit oleh antibodi serum imun kepada antigen kumpulan darah A(II), B(III). Kawalan adalah serum yang tidak mengandungi antibodi, i.e. kumpulan darah serum AB(IV), dan antigen eritrosit kumpulan A(P) dan B(III). Kumpulan 0(I) sel darah merah digunakan sebagai kawalan negatif kerana ia tidak mempunyai antigen.
Untuk menentukan faktor Rh, sera anti-Rh digunakan (sekurang-kurangnya dua siri berbeza). Sekiranya terdapat antigen Rh pada membran eritrosit yang dikaji, aglutinasi sel-sel ini berlaku.
13.3. Reaksi pemendakan
RP ialah tindak balas imun interaksi antibodi dengan antigen dengan kehadiran elektrolit, dan antigen berada dalam keadaan larut. Semasa pemendakan, antigen larut dicetuskan oleh antibodi, yang ditunjukkan oleh kekeruhan dalam bentuk jalur pemendakan. Pembentukan mendakan boleh dilihat diperhatikan apabila kedua-dua reagen dicampur dalam nisbah yang setara. Lebihan salah satu daripadanya mengurangkan bilangan kompleks imun yang dimendakan. Terdapat pelbagai cara untuk melakukan tindak balas pemendakan.
Tindak balas pemendakan cincin diletakkan di dalam tiub pemendakan dengan diameter kecil. Serum imun dimasukkan ke dalam tabung uji dan antigen larut dilapisi dengan teliti. Jika keputusannya positif, cincin susu terbentuk di antara muka kedua-dua larutan. Tindak balas pemendakan cincin, yang digunakan untuk menentukan kehadiran antigen dalam organ dan tisu, ekstrak yang direbus dan ditapis, dipanggil tindak balas thermoprecipitation (tindak balas Ascoli untuk menentukan antigen antraks termostable).
Reaksi imunodifusi berganda Ouchterlony. Tindak balas ini dijalankan dalam gel agar. Dalam lapisan gel dengan ketebalan seragam, telaga dipotong pada jarak tertentu antara satu sama lain dan masing-masing diisi dengan antigen dan serum imun. Selepas ini, antigen dan antibodi meresap ke dalam gel, bertemu antara satu sama lain dan membentuk kompleks imun, yang memendakan dalam gel dan menjadi kelihatan sebagai garis ketepatan.
pemakanan. Tindak balas ini boleh digunakan untuk mengenal pasti antigen atau antibodi yang tidak diketahui, dan juga untuk menguji persamaan antara antigen yang berbeza: jika antigen adalah sama, garis pemendakan bergabung, jika antigen tidak serupa, garis pemendakan bersilang, jika antigen sebahagiannya sama, taji terbentuk.
Reaksi imunodifusi jejari. Antibodi ditambah kepada gel agar cair dan gel digunakan dalam lapisan yang sekata pada kaca. Telaga dipotong dalam gel dan isipadu standard larutan antigen dengan kepekatan yang berbeza ditambah kepada mereka. Semasa pengeraman, antigen meresap secara jejari dari telaga dan, bertemu antibodi, membentuk cincin pemendakan. Selagi antigen berlebihan kekal di dalam telaga, peningkatan beransur-ansur dalam diameter gelang pemendakan berlaku. Kaedah ini digunakan untuk menentukan antigen atau antibodi dalam larutan ujian (contohnya, untuk menentukan kepekatan imunoglobulin kelas yang berbeza dalam serum darah).
Imunoelektroforesis. Campuran antigen mula-mula diasingkan secara elektroforesis, kemudian antiserum pemendakan ditambah pada alur yang berjalan di sepanjang arah pergerakan protein. Antigen dan antibodi meresap ke dalam gel ke arah satu sama lain; berinteraksi, mereka membentuk garisan kerpasan arkuat.
Tindak balas flokulasi(menurut Ramon) - sejenis tindak balas pemendakan yang digunakan untuk menentukan aktiviti serum atau toksoid antitoksik. Tindak balas dijalankan dalam tabung uji. Dalam tabung uji di mana toksoid dan antitoksin berada dalam nisbah yang setara, kekeruhan diperhatikan.
13.4. Tindak balas fiksasi pelengkap
Antibodi, berinteraksi dengan antigen yang sepadan, mengikat pelengkap tambahan (sistem pertama). Penunjuk penetapan pelengkap ialah eritrosit yang tersensitisasi dengan serum hemolitik, i.e. antibodi kepada sel darah merah (sistem ke-2). Jika pelengkap tidak tetap dalam sistem 1, i.e. Jika tindak balas antigen-antibodi tidak berlaku, sel darah merah yang tersensitisasi akan dilisiskan sepenuhnya (tindak balas negatif). Apabila komplemen diperbaiki oleh kompleks imun sistem pertama selepas menambahkan eritrosit tersensitisasi, hemolisis daripada
tiada (tindak balas positif). Reaksi penetapan pelengkap digunakan untuk mendiagnosis penyakit berjangkit (gonorea, sifilis, influenza, dll.).
13.5. Tindak balas peneutralan
Mikrob dan toksinnya mempunyai kesan merosakkan pada organ dan tisu badan manusia. Antibodi mampu mengikat agen yang merosakkan ini dan menyekatnya, i.e. meneutralkan. Reaksi peneutralan diagnostik adalah berdasarkan ciri antibodi ini. Ia dijalankan dengan memasukkan campuran antigen-antibodi ke dalam haiwan atau ke dalam objek ujian sensitif (kultur sel, embrio). Sebagai contoh, untuk mengesan toksin dalam bahan pesakit, haiwan kumpulan pertama disuntik dengan bahan daripada pesakit. Haiwan kumpulan ke-2 disuntik dengan bahan yang sama, pra-rawatan dengan antiserum yang sesuai. Haiwan kumpulan pertama mati jika terdapat toksin dalam bahan. Kumpulan kedua haiwan bertahan; kesan merosakkan toksin tidak nyata, kerana ia dinetralkan.
13.6. Tindak balas menggunakan antibodi atau antigen berlabel
13.6.1. Tindak balas imunofluoresensi (RIF, kaedah Koons)
Kaedah ini digunakan untuk diagnostik ekspres. Ia boleh digunakan untuk mengesan kedua-dua antigen mikrob dan antibodi.
Kaedah RIF langsung- tindak balas imun interaksi antibodi dengan antigen, dan antibodi dilabelkan dengan fluorokrom - bahan yang mampu memancarkan kuanta cahaya pada panjang gelombang tertentu apabila terdedah kepada cahaya dengan panjang gelombang tertentu. Keistimewaan kaedah ini ialah keperluan untuk mengeluarkan komponen yang tidak bertindak balas untuk mengecualikan pengesanan luminescence tidak spesifik. Untuk melakukan ini, basuh antibodi yang tidak bertindak balas. Keputusan dinilai menggunakan mikroskop pendarfluor. Bakteria dalam sapuan dirawat dengan cahaya serum bercahaya seperti itu terhadap latar belakang gelap di sepanjang pinggiran sel.
Kaedah RIF tidak langsung digunakan lebih kerap daripada yang sebelumnya. Tindak balas ini dijalankan dalam dua peringkat. Pada peringkat pertama, antigen saling
berinteraksi dengan antibodi yang sepadan, membentuk kompleks imun. Semua komponen yang tidak bertindak balas (iaitu, bukan sebahagian daripada kompleks imun) mesti dikeluarkan dengan mencuci. Pada peringkat kedua, kompleks antigen-antibodi yang terhasil dikesan menggunakan serum antiglobulin fluorochromized. Akibatnya, kompleks mikrob + antibodi arnab antimikrob + antibodi kepada imunoglobulin arnab, yang dilabel dengan fluorochrome, terbentuk. Keputusan dinilai menggunakan mikroskop pendarfluor.
13.6.2. Kaedah atau ujian imunosorben enzim
ELISA - yang paling biasa kaedah moden, digunakan untuk diagnosis jangkitan virus, bakteria, protozoal, khususnya untuk diagnosis jangkitan HIV, hepatitis virus dan sebagainya.
Terdapat banyak pengubahsuaian ELISA. ELISA bukan persaingan fasa pepejal digunakan secara meluas. Ia dijalankan dalam plat polistirena 96-telaga (fasa pepejal). Apabila menjalankan tindak balas, adalah perlu untuk membasuh komponen yang tidak bertindak balas pada setiap peringkat. Apabila menentukan antibodi, serum darah ujian ditambah ke telaga di mana antigen diserap, kemudian serum antiglobulin dilabelkan dengan enzim. Tindak balas dijalankan dengan menambahkan substrat untuk enzim. Dengan kehadiran enzim, substrat berubah, dan kompleks enzim-substrat dipilih supaya produk yang terbentuk dalam tindak balas berwarna. Oleh itu, dengan tindak balas positif, perubahan dalam warna larutan diperhatikan. Untuk menentukan antigen, pembawa fasa pepejal dipekakan dengan antibodi, kemudian bahan ujian (antigen) dan serum berlabel enzim kepada antigen ditambah secara berurutan. Untuk tindak balas berlaku, substrat untuk enzim ditambah. Perubahan warna larutan berlaku dengan tindak balas positif.
13.6.3. Immunoblotting
Kaedah ini adalah berdasarkan gabungan elektroforesis dan ELISA. Apabila melakukan immunoblotting (blotting daripada bahasa Inggeris. hapuskan- bintik) campuran kompleks antigen mula-mula tertakluk kepada elektroforesis dalam gel poliakrilamida. Hasil pecahan anti-
peptida gen dipindahkan ke membran nitroselulosa. Blot kemudian dirawat dengan antibodi berlabel enzim kepada antigen tertentu, i.e. menjalankan ELISA blot. Immunoblotting digunakan dalam diagnosis jangkitan seperti HIV.
13.6.4. Mikroskopi elektron imun
Kaedah ini terdiri daripada mikroskop dalam mikroskop elektron virus (kurang biasa mikrob lain), pra-rawatan dengan serum imun yang sesuai yang dilabelkan dengan persediaan padat elektron-optik, contohnya feritin, protein yang mengandungi besi.
13.7. Sitometri aliran
Sel darah dibezakan berdasarkan sitofluorometri laser. Untuk melakukan ini, sel yang dikehendaki diwarnai dengan antibodi monoklonal pendarfluor kepada antigen CD. Sampel darah, selepas dirawat dengan antibodi berlabel, disalurkan melalui tiub nipis dan pancaran laser melaluinya, yang merangsang fluorochrome untuk bersinar. Keamatan pendarfluor berkorelasi dengan ketumpatan antigen pada permukaan sel dan boleh diukur secara kuantitatif menggunakan tiub photomultiplier. Keputusan yang diperolehi ditukarkan kepada histogram.
Sitometri aliran digunakan untuk menentukan status imun(kandungan populasi utama limfosit, kandungan sitokin intrasel dan ekstraselular, aktiviti fungsi sel NK, aktiviti fagositosis, dll.).
KAJIAN IMUNOMIKROBIOLOGI
Kaedah imunologi digunakan untuk menyelesaikan banyak masalah:
1. Penilaian keadaan sistem imun orang (status imun) dengan menentukan kuantitatif dan ciri fungsi sel sistem imun dan produknya.
2. Penentuan komposisi dan ciri-ciri tisu manusia: kumpulan darah, faktor Rh, antigen pemindahan.
3. Diagnosis penyakit berjangkit dan ketahanan terhadapnya dengan mengesan dan mewujudkan titer antibodi (serodiagnosis), mengenal pasti antigen patogen dalam badan, dan menentukan tindak balas selular terhadap antigen ini.
4. Pengenalpastian seroid kultur bakteria dan virus yang diasingkan daripada badan manusia dan haiwan.
5. Pengesanan dalam badan manusia dan dalam persekitaran luaran sebarang bahan dengan sifat antigenik atau hapten (hormon, enzim, racun, dadah, dadah, dll.).
6. Pengenalpastian keadaan imunopatologi, alahan, pemindahan dan tindak balas antitumor.
Proses interaksi antara antigen dan antibodi tindak balas serologi berlaku dalam dua fasa:
1) khusus- fasa interaksi di mana gabungan pelengkap pusat aktif antibodi (paratopes) dan epitop antigen berlaku. Biasanya fasa ini berlangsung beberapa saat atau minit;
2) tidak spesifik- fasa manifestasi, dicirikan tanda-tanda luaran pembentukan kompleks imun. Fasa ini boleh berkembang dari beberapa minit hingga beberapa jam.
Interaksi spesifik optimum antibodi dengan antigen berlaku dalam larutan isotonik dengan pH hampir neutral. Tindak balas antigen-antibodi dalam sistem in vitro boleh disertai dengan berlakunya beberapa fenomena.
· penggumpalan,
· hujan,
· lisis.
Manifestasi luaran tindak balas bergantung kepada sifat fizikokimia antigen (saiz zarah, keadaan fizikal), kelas dan jenis antibodi (lengkap dan tidak lengkap), serta keadaan eksperimen (konsistensi sederhana, kepekatan garam, pH, suhu).
Polivalensi antigen dan antibodi memastikan pembentukan agregat dapat dilihat dengan mata kasar. Ini berlaku mengikut teori pembentukan rangkaian, mengikut mana molekul antibodi dan antigen lain secara berurutan dilekatkan pada kompleks antigen-antibodi yang terhasil. Akibatnya, struktur rangkaian terbentuk, yang bertukar menjadi agregat yang mendakan. Sifat dan keterukan tindak balas bergantung kepada nisbah kuantitatif antigen dan antibodi. Tindak balas adalah paling sengit apabila bahan tindak balas berada dalam perkadaran yang setara.
Prasyarat pembentukan kekisi (rangkaian) - kehadiran lebih daripada tiga penentu antigen untuk setiap molekul antigen dan dua pusat aktif untuk setiap molekul antibodi. Molekul antigen ialah nod kekisi, dan molekul antibodi adalah pautan penghubung. Kawasan nisbah optimum (zon kesetaraan) antigen dan kepekatan antibodi, apabila antigen bebas atau antibodi bebas tidak dikesan dalam supernatan selepas pembentukan sedimen.
Agregat yang boleh mendakan terbentuk apabila antigen bergabung dengan antibodi penuh. Antibodi yang tidak lengkap (monovalen) tidak menyebabkan pembentukan struktur rangkaian dan agregat besar. Untuk mengesan antibodi tersebut, gunakan kaedah khas berdasarkan penggunaan antiglobulin (tindak balas Coombs).
Ujian serologi, kerana kekhususan dan sensitiviti yang tinggi, digunakan untuk mengesan dan kuantifikasi antigen dan antibodi. Jumlah imunoreagen dalam tindak balas dinyatakan dengan titer - pencairan maksimum serum atau antigen di mana tindak balas masih diperhatikan.
Reaksi serologi dalam makmal mikrobiologi dan imunologi digunakan untuk dua tujuan:
1) untuk seroidentifikasi mikroorganisma, toksin, antigen secara umum menggunakan antibodi yang diketahui (serum diagnostik imun),
2) untuk serodiagnosis - menentukan sifat antibodi dalam serum darah pesakit untuk bakteria, virus, dan penyakit berjangkit lain yang kurang kerap menggunakan antigen yang diketahui (diagnosticum).
Untuk menentukan generik, spesies dan jenis antigen, sera diagnostik imun yang diketahui diperlukan. Ia diperoleh melalui pemberian berulang kepada haiwan (biasanya arnab) dalam meningkatkan dos mikroorganisma yang terbunuh atau hidup, produk pereputannya, toksin yang dineutralkan atau asli. Selepas kitaran imunisasi haiwan tertentu, pendarahan besar-besaran atau pendarahan total haiwan dilakukan. Darah yang dikumpul dalam bekas steril mula-mula diletakkan dalam termostat pada suhu 37°C selama 4 - 6 jam untuk mempercepatkan pembekuan, kemudian dalam peti ais selama sehari. Serum telus yang terhasil disedut ke dalam bekas steril, pengawet ditambah, titer antibodi ditentukan, diperiksa untuk kemandulan dan dituangkan ke dalam ampul.
Digunakan tidak terserap Dan terserap sera diagnostik. Serum yang tidak diserap mempunyai titer tinggi antibodi, tetapi mampu memberikan tindak balas kumpulan (silang).
Sera terjerap dicirikan oleh kekhususan tindakan yang ketat (mereka bertindak balas hanya dengan antigen homolog). Sera yang mengandungi antibodi kepada hanya satu antigen tertentu dipanggil monoreseptor.
Mereka juga menghasilkan serum yang dilabel dengan fluorochromes, enzim, dan radioisotop, yang membolehkan kesan antigen yang sama dikesan dengan tahap ketepatan yang tinggi.
Penggantungan bakteria hidup atau mati, produk pecahannya, toksin dan virus digunakan sebagai antigen (diagnostik) dalam tindak balas serologi. Dalam sesetengah kes, ekstrak atau antigen terpencil secara kimia daripada mikroorganisma dan tisu haiwan digunakan.
Semua kaedah imunomikrobiologi boleh dibahagikan kepada 3 kumpulan:
1) berdasarkan interaksi langsung antigen dengan antibodi(fenomena aglutinasi, pemendakan, hemagglutinasi, imobilisasi, dll.);
2) berdasarkan Interaksi pengantara antigen dengan antibodi(tindak balas hemaglutinasi tidak langsung, koaglutinasi, aglutinasi lateks, aglomerasi karbon, aglutinasi bentonit, fiksasi pelengkap, dsb.);
3) menggunakan antibodi atau antigen berlabel(kaedah antibodi pendarfluor, imunosorben berkaitan enzim dan radioimunoassays dan kaedah lain).
TINDAK BALAS PENGGULATAN
Tindak balas ini melibatkan antigen dalam bentuk zarah (sel mikroba, sel darah merah dan antigen korpuskular lain), yang dilekatkan bersama oleh antibodi dan mendakan.
Untuk melakukan tindak balas aglutinasi(RA) tiga komponen diperlukan: 1) antigen (aglutinogen);
2) antibodi (aglutinin)
3) elektrolit (larutan natrium klorida isotonik).
Anggaran tindak balas aglutinasi (RA)
Indikatif, atau plat, RA diletakkan pada slaid kaca pada suhu bilik. Untuk melakukan ini, gunakan pipet Pasteur untuk menyapu setitik serum pada pencairan 1:10 hingga 1:20 dan titisan kawalan larutan natrium klorida isotonik secara berasingan pada kaca. Koloni atau budaya harian bakteria (setitis diagnosticum) dimasukkan ke dalam kedua-dua gelung bakteriologi dan dicampur dengan teliti. Tindak balas diambil kira secara visual selepas beberapa minit, kadangkala menggunakan kanta pembesar (x5). Dengan RA positif, penampilan serpihan besar dan kecil dalam penurunan serum dicatatkan dengan RA negatif, serum kekal mendung seragam.
Tindak balas aglutinasi terperinci untuk mengenal pasti titer antibodi spesifik dalam pesakit.
RA penuh untuk serodiagnosis dibuat dalam serum pesakit. Ia juga dicairkan dalam larutan natrium klorida isotonik dari 1:50 - 1:100 hingga 1:800 atau 1:1600 Oleh kerana titer serum yang lebih rendah mungkin mengandungi aglutinin biasa yang terdapat dalam orang yang sihat atau pesakit dengan diagnosis lain (titer diagnostik). Sebagai antigen dalam tindak balas ini, diagnosticum digunakan - penggantungan yang diketahui, biasanya bakteria yang terbunuh.
1 ml larutan natrium klorida isotonik dituang dahulu ke dalam tiub penggumpalan. 1 ml serum yang dicairkan 1:100 ditambah kepada yang pertama, dan selepas mencampurkannya, 1 ml dipindahkan ke yang kedua, dari yang kedua ke yang ketiga, dsb. 1-2 titik penggantungan bakteria yang mengandungi 3 bilion badan mikrob dalam 1 ml ditambah kepada pencairan dua kali ganda sera yang terhasil (dari 1:100 hingga 1:1600 atau lebih). Tiub digoncang dan diletakkan dalam termostat pada 37°C selama 2 jam, kemudian disimpan pada suhu bilik selama 24 jam.
Tindak balas aglutinasi terperinci diambil kira dengan menilai setiap tabung uji secara berurutan, bermula dengan yang kawalan, dengan goncangan lembut. Seharusnya tiada aglutinasi dalam tiub kawalan. Keamatan tindak balas aglutinasi ditandakan dengan tanda-tanda berikut: ++++ - aglutinasi lengkap (serpihan aglutinasi dalam cecair telus mutlak); +++ - aglutinasi tidak lengkap (serpihan dalam cecair sedikit opalescent); ++ - penggumpalan separa (serpihan kelihatan jelas, cecair sedikit keruh); + - penggumpalan yang lemah, dipersoalkan - cecair sangat keruh, kepingan di dalamnya kurang dapat dibezakan; - - ketiadaan aglutinasi (cecair adalah keruh seragam).
Titer serum dianggap sebagai pencairan terakhirnya, di mana keamatan aglutinasi dinilai sebagai tidak kurang daripada dua tambah (++)
Tindak balas aglutinasi Tindak balas aglutinasi
(RA) ialah kaedah untuk mengenal pasti dan mengukur Ag dan Ab, berdasarkan keupayaan mereka untuk membentuk aglomerat yang boleh dilihat dengan mata kasar. Di jabatan penyakit berjangkit. penyakit atau untuk tujuan lain digunakan untuk mengenal pasti mikrob dan sel yang tidak diketahui, untuk menentukan kehadiran dan jumlah Ab dalam darah dan cecair lain. Prinsip penentuan adalah berdasarkan kekhususan interaksi antara Ag dan Ab dan terdiri daripada mencari yang diketahui daripada yang tidak diketahui. Terdapat banyak pilihan untuk RA: kuantitatif dan kualitatif, tabung uji dan kaca, volumetrik dan titisan, kaedah konvensional, dipercepat dan ekspres. Untuk peringkat RA anda perlukan: 1) s-ka darah. Dalam varian dengan menentukan jenis (var) bakteria, ujian aglutinasi industri digunakan, dihasilkan oleh arnab yang mengimunkan. Dalam varian dengan penentuan jenis Ab, sampel darah diambil daripada ujian. manusia atau haiwan. Larutan mestilah steril dan bebas daripada zarah terampai. Sediakan pencairan asas dalam larutan garam. Ia sepatutnya 2-4 kali lebih rendah daripada titer diagnostik untuk penyakit ini; 2) Ag. Dalam versi tindak balas dengan penentuan jenis Ab, kit diagnostik industri digunakan; dalam varian dengan penentuan Ag, diagnosticums disediakan sendiri dalam bentuk penggantungan 1-3 bilion dalam larutan garam ujian agar-agar 18-20 jam (kurang kerap sup). mikrob dinyahaktifkan dengan memanaskan dalam tab mandi air pada suhu 70°C selama 1 jam atau dengan pengeraman 24 jam pada suhu 37°C dengan formaldehid (kepekatan akhir 0.2%); 3) elektrolit dalam bentuk larutan garam. Teknik pementasan tiub bersiri volumetrik RA untuk menentukan titer Ab dalam s-ki: beberapa baris pencairan kerja disediakan daripada pencairan utama s-ki. Bilangan baris bergantung pada bilangan diagnostik yang diambil ke dalam eksperimen; bilangan dan faktor pencairan ditentukan oleh titer diagnostik penyakit yang disyaki. Siri mestilah sekurang-kurangnya mengandungi pencairan yang sepadan dengan titer Ab diagnostik, dua pencairan di bawah dan dua pencairan di atasnya. sebagai contoh, jika titer diagnostik ialah 1:100, maka dengan kaedah volumetrik pementasan RA, pencairan berikut perlu disediakan: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; dengan titisan kaedah, pencairan pertama (1:25) tidak diperlukan, tetapi pencairan lain yang lebih tinggi diperlukan - 1:800 B. kajian saintifik s-ku dititrasi ke reaksi negatif. Ia dicairkan seperti berikut: 0.25 ml larutan garam dituangkan ke dalam semua tabung uji, kecuali yang pertama, apabila tindak balas dilakukan dalam isipadu 0.5 ml, dan 0.5 ml apabila tindak balas dilakukan dalam jumlah 1. ml. Tuangkan 0.25 (0.5) ml pencairan utama ke dalam tabung uji pertama dan kedua, dari tabung uji kedua, ke dalam isipadu potongan dan pembiakan s-k dan meningkat 2 kali ganda, 0.25 (0.5) ml dipindahkan ke yang ke-3, dari yang ke-3 ke yang ke-4, dsb. hingga yang terakhir, daripada potongan 0.25 (0.5) ml dituangkan ke dalam segala-galanya untuk mengimbangi isipadu. Setiap pencairan dijalankan menggunakan pipet berasingan. Jika beberapa diagnosticum diambil ke dalam eksperimen, maka bagi setiap daripada mereka siri pencairannya sendiri disediakan dengan cara yang sama. Diagnosticum ditambah kepada setiap pencairan tabung uji dalam isipadu yang sama dengan isipadu tabung uji, akibatnya pencairan dalam setiap tabung uji digandakan. Eksperimen sepadan dengan kawalan s-ki (0.25 - 0.5 ml pencairan utama s-ki dan jumlah larutan garam yang sama) dan kawalan Ag (0.25 - 0.5 ml diagnostikum dan jumlah larutan garam yang sama). Jika beberapa diagnosticum digunakan dalam eksperimen, maka masing-masing mempunyai kawalan antigen sendiri. Rak dengan tabung uji digoncang dengan baik dan diletakkan dalam termostat pada suhu 37°C selama 4 jam, dan kemudian dibiarkan pada suhu bilik sehingga keesokan harinya, selepas itu PA direkodkan berdasarkan jumlah sedimen dan tahap pembersihan cecair itu. Penentuan penunjuk ini, bergantung pada sifat aglutinat, dilakukan dengan mata kasar pada latar belakang gelap, dalam agglutinoscope atau di atas permukaan cekung cermin mikroskop. Perakaunan bermula dengan kawalan: kawalan C harus telus, Ag harus keruh seragam (selepas menggoncang tiub). Jika kawalan adalah baik, wujudkan kehadiran dan tahap aglutinasi dalam semua tabung uji, yang ditetapkan oleh tambah: sedimen besar dan pembersihan lengkap cecair - 4 tambah; sedimen besar dan pembersihan cecair yang tidak lengkap - 3 tambah; sedimen ketara dan pembersihan ketara cecair adalah 2 tambah. Selepas ini, titer ditentukan: pencairan tertinggi dengan keamatan aglutinasi sekurang-kurangnya 2 tambah. Penyelidikan tajuk s-ki dibandingkan dengan titer diagnostik untuk penyakit ini. Jika titer diteliti. s-ki adalah 2 kali lebih rendah daripada nilai diagnostik, tindak balas dinilai sebagai ragu; jika titer adalah sama diagnostik - bagaimana lemah positif; jika ia adalah 2-4 kali lebih tinggi, ia dianggap positif; jika ia adalah 8 atau lebih tinggi, ia dianggap positif secara mendadak. Apabila Ab tersebar luas pada orang yang sihat, peningkatan titer Ab digunakan untuk menilai RA. Untuk menentukan jenis Ar dalam siri RA, bilangan baris mesti sepadan dengan nombor yang diambil untuk pengenalan ujian diagnostik. Daripada pencairan utama ujian diagnostik, satu siri pencairan dua kali ganda berturut-turut disediakan dengan cara yang sama seperti dalam RA untuk menentukan titer Ab. Faktor pencairan bergantung kepada titer ujian aglutinasi Dalam eksperimen, kehadiran pencairan yang sama dengan titer ujian adalah perlu, serta 2, 4, 6, 8 kali lebih rendah daripada itu titer ujian diagnostik ialah 1 3200, maka anda harus menggunakan pencairan 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 Isipadu yang sama bagi Ag yang diuji ditambah kepada pencairan ujian, sebagai hasilnya, pencairan ujian bertambah sebanyak 2 kali ganda dan Ag ditambah kepada eksperimen Jika dalam eksperimen itu beberapa s-k terlibat, maka setiap satu daripadanya memerlukan kawalan sendiri Setelah selesai tindak balas, dirian digoncang dengan kuat dan diletakkan dalam termostat pada 37 ° C. Keputusan diambil kira seperti yang dinyatakan di atas Penilaian tindak balas mempunyai ciri-ciri Untuk membuat kesimpulan tentang pematuhan kajian. Ag diambil ke dalam eksperimen, titer tindak balas mesti sepadan dengan sekurang-kurangnya separuh titer ujian diagnostik standard Titer 1 4 dan ke bawah dianggap sebagai tindak balas kumpulan Titiskan md pementasan RA berbeza daripada isipadu kerana s-ku dicairkan dalam isipadu 1 ml, Ag digunakan dalam kepekatan yang lebih tinggi (10 bilion/ml) dan ia ditambah 1 - 2 jatuh ke dalam tabung uji Pencairan ubat selepas menambah Ag dianggap tidak berubah Jika tidak, kaedah penetapan, rakaman dan penilaian adalah serupa dengan kaedah volumetrik
(Sumber: Kamus Istilah Mikrobiologi)
Tindak balas aglutinasi.
Tindak balas aglutinasi ialah pelekatan dan pemendakan mikrob atau sel lain (eritrosit) di bawah pengaruh antibodi dengan kehadiran elektrolit. Kesan tindak balas yang boleh dilihat (fenomena aglutinasi) ialah pembentukan mendakan yang dipanggil aglutinat.
Tindak balas ini digunakan untuk serodiagnosis Dan pengenalpastian sero. RA digunakan untuk serodiagnosis (pengesanan antibodi dalam serum darah pesakit) demam kepialu dan paratifoid(reaksi Vidal), brucellosis(reaksi Wright), tularemia dan leptospirosis. RA digunakan untuk pengecaman sero (menentukan jenis patogen yang diasingkan daripada pesakit) apabila jangkitan usus, batuk kokol, taun dan sebagainya.
Komponentindak balas:
1. A ntigen (aglutinogen) – ini adalah keseluruhan (tidak dimusnahkan) mikrob atau sel lain ( korpuskular, antigen tidak larut). Aglutinogen- ini adalah penggantungan hidup atau dibunuh sel mikrob atau mana-mana sel lain. Antigen boleh sama ada tidak diketahui atau diketahui. Aglutinogen yang tidak diketahui ialah budaya mikrob yang diasingkan daripada badan pesakit yang perlu ditentukan. Antigen yang diketahui - diagnosticum- ubat diagnostik - penggantungan orang mati mikrob spesies yang diketahui dalam larutan garam. Penggantungan ini mendung (legap), kerana sel mikrob tidak larut, tetapi kekal utuh. Aglutinogen yang diketahui akan digunakan untuk mengesan antibodi yang tidak diketahui dalam serum darah pesakit.
2. Antibodi (aglutinin)- terdapat dalam serum darah. Antibodi juga boleh sama ada tidak diketahui atau diketahui. Antibodi yang tidak diketahui untuk ditentukan berada dalam serum darah orang sakit. Antibodi yang diketahui terdapat dalam imun sera diagnostik yang dipanggil sera penggumpal. Mereka digunakan untuk pengenalan sero, i.e. untuk menentukan antigen yang tidak diketahui - sejenis kultur mikrob.
3. Elektrolit– 0.9% larutan natrium klorida.
Kaedah untuk pementasan RA.
1. Anggaran (lamellar) RA– dijalankan pada kaca. Sapukan 2 titis serum dan 1 titis larutan isotonik pada slaid kaca. Kultur mikrob dimasukkan ke dalam salah satu titisan serum dan ke dalam titisan larutan isotonik dalam gelung dan dicampur. Setitik larutan isotonik dengan kuman – kawalan antigen, setitik serum bebas kuman – kawalan antibodi, setitik serum dengan mikrob – pengalaman. Jika serum mengandungi antibodi yang sepadan dengan antigen mikrob yang bercampur dengannya, maka antibodi dan antigen secara khusus akan mengikat satu sama lain dan selepas 1-3 minit kepingan aglutinat akan muncul dalam titisan ujian. Kawalan antigen hendaklah keruh dan kawalan antibodi harus jelas. Keputusan tindak balas direkodkan berdasarkan penampilan kepingan aglutinat . Jika serpihan jatuh, tindak balas adalah positif, i.e. Antigen sepadan dengan antibodi dan antigen boleh digunakan untuk menentukan antibodi atau sebaliknya. Jika kekeruhan kekal, tindak balas adalah negatif.
2. Tindak balas aglutinasi terperinci - dijalankan dalam tabung uji. Pertama, sediakan 2 kali ganda pencairan serum darah orang sakit dari 1:50 hingga 1:1600. 1 ml larutan natrium klorida isotonik dituang ke dalam 6 tabung uji. 1 ml serum darah pesakit pada pencairan 1:50 dimasukkan ke dalam tabung uji pertama, dicampur dan pencairan 1:100 diperoleh, kemudian 1 ml pencairan 1:100 dipindahkan ke tabung uji kedua dan pencairan 1:200 diperolehi, dsb. Dua tiub disimpan untuk kawalan antigen dan serum. Pada kawalan serum tambahkan hanya serum pada pencairan 1:50, kepada kawalan antigen - hanya antigen. Tambah 0.1 ml antigen - diagnosticum (O- atau H-) ke semua tabung uji lain dan letakkan semua tabung uji dalam termostat pada 37°C selama 18-20 jam. Keputusan tindak balas direkodkan mengikut sifat, jumlah mendakan (aglutinat) yang terbentuk dan tahap kekeruhan. Perakaunan dijalankan hanya dengan keputusan berikut dalam kawalan: kawalan serum - telus, kawalan antigen - mendung. O-antibodi memberikan mendakan berbutir halus. H-antibodi - berbutir kasar. Berdasarkan tabung uji terakhir di mana tindak balas aglutinasi masih kelihatan, ia ditubuhkan titer diagnostik.
Apabila serodiagnosis penyakit, penting bukan sahaja untuk mengesan antibodi khusus kepada patogen tertentu, tetapi juga untuk mengenal pasti kuantiti mereka, i.e. mewujudkan titer antibodi supaya kita boleh bercakap tentang kehadiran penyakit yang disebabkan oleh patogen ini. Titer ini dipanggil titer diagnostik. Sebagai contoh, untuk mendiagnosis demam kepialu, anda perlu mengenal pasti titer antibodi 1:400, tetapi tidak kurang. Keputusan yang lebih tepat diperoleh dengan mengesan peningkatan antibodi dalam serum berpasangan Serum pesakit dikumpulkan pada permulaan penyakit dan selepas 3-5 atau lebih hari. Sekiranya titer antibodi meningkat sekurang-kurangnya 4 kali ganda, oleh itu, kita boleh bercakap tentang penyakit semasa.
