Реакція аглютинації (Від лат. agglutinatio- склеювання) - склеювання корпускул (бактерій, еритроцитів та ін) антитілами в присутності електролітів.
Реакція аглютинаціїпроявляється у вигляді пластівців або осаду, що складаються з корпускул (наприклад, бактерій), «склеєних» антитілами (рис. 7.37). Реакцію аглютинації використовують для: визначення збудника, виділеного від хворого; визначення антитіл у сироватці крові хворого; визначення груп крові
Мал. 7.37 а,б. Реакція аглютинації зIgM-антитілами (а) таIgG-антитілами (б)
1. Визначення збудника, виділеного від хворого Орієнтовна реакція аглютинації на склі (рис. 7.38). До краплі аглютинуючої сироватки (розведення 1:20) додають завись бактерій, виділених від хворого. Утворюється пластовий осад.
Мал. 7.38.
Розгорнута реакція аглютинації із збудником, виділеним від хворого (рис. 7.39). До розведень аглютинуючої сироватки додають завись бактерій, виділених від хворого.
Мал. 52
2. Визначення антитіл у сироватці крові хворого
Розгорнута реакція аглютинації із сироваткою крові хворого (рис. 7.39). До розведення сироватки хворого додають діагностикум.
- Аглютинація з О-діагностикумом (бактерії, вбиті нагріванням, що зберегли 0-антиген) відбувається у вигляді дрібнозернистої аглютинації.
- Аглютинація з Н-діагностикумом (бактерії, вбиті формаліном, що зберегли джгутиковий Н-антиген) - великобавовняна і протікає швидше.
3. Реакція аглютинації для визначення груп кровіРеакцію аглютинації для визначення груп крові застосовують для встановлення системи АВО (табл. б) за допомогою аглютинації еритроцитів антитілами імунної сироватки проти антигенів груп крові А(І), В(ІІІ). Контролем служать: сироватка, яка містить антитіл, тобто. сироватка АВ(IV) групи крові; антигени, що містяться в еритроцитах груп А (ІІ), В (ІІІ). Негативний контроль не містить антигенів, тобто використовують еритроцити групи (I).
Таблиця 7.6. Визначення груп крові АВО
| Результати реакції |
Групова |
|
|
приналежність |
||
|
досліджуваної |
||
|
еритроцитів зі |
сироватки (плазми) |
|
|
стандартними |
зі стандартними |
|
|
сироватками | ||
Реакція аглютинації (РА) - це склеювання та випадання в осад мікробів або інших клітин під дією антитіл у присутності електроліту. Осад, що утворився, називають аглютинатом.
РА використовують:
1. Для виявлення антитіл у сироватці крові хворого (серодіагностика).
2. Для визначення виду та серовару виділеної від хворого чистої культури патогенних мікроорганізмів (серотипування).
Реакцію аглютинації використовують для визначення антитіл у сироватці крові хворих, наприклад, при черевному тифі та паратифах (реакція Відаля), бруцельозі (реакції Райта, Хеддлсона), туляремії, лептоспірозах та інших інфекційних хвороб, а також для визначення виділеного від хворого збудника ( кишкові інфекції, кашлюк та ін). РА застосовується визначення груп крові, резус - чинника та інших.
Для реакції необхідні такі компоненти:
1. Антиген (аглютиноген) повинен бути корпускулярним, тобто це завись живих або вбитих мікроорганізмів (діагностику м), еритроцитів або інших клітин. Зазвичай використовують добову культуру мікроорганізмів, вирощену на скошеному агарі. Культуру змивають 3 - 4 мл ізотонічного розчину, переносять у стерильну пробірку, визначають густину. Завис має бути гомогенною і містити до 3 млрд. мікробних клітин в 1 мл. Застосування суспензії вбитих мікробів - діагностикумів - полегшує роботу (готуються з виробництва).
2. Антитіла (аглютиніни) знаходяться у сироватці хворого (при серодіагностиці) або в аглютинуючій сироватці (при серотипуванні). Аглютинуючі сироватки отримують шляхом імунізації кроликів убитими бактеріями.
Титром аглютинуючоюсироватки називається найбільше її розведення, в якому не реагує з відповідним антигеном в певних умовах досвіду.
Аглютинуючі сироватки можуть бути нативними (неадсорбованими) та адсорбованими. Нативні сироватки в невеликих розведеннях взаємодіють не тільки з тим видом мікроорганізмів, яким імунізували тварину для отримання сироватки, але і з спорідненими видами мікроорганізмів, тому що в них є групові антитіла (антитіла до мікроорганізмів, що мають загальні антигени). Нативні сироватки використовуються для розгорнутої реакції аглютинації (при серодіагностиці), де враховується як наявність реакції, а й динаміка наростання титру антитіл.
Якщо з нативної сироватки витягти (адсорбувати) групові антитіла шляхом взаємодії з родинними бактеріями, що мають групові антигени, виходять адсорбовані сироватки. Адсорбовані сироватки можуть бути монорецепторними (або типоспецифічними), що містять антитіла тільки до одного антигенного рецептора. Полівалентні сироватки складаються із суміші декількох адсорбованих або неадсорбованих сироваток. Адсорбовані сироватки використовують для реакції аглютинації на склі.
При імунізації тварин рухомими бактеріями з Н-антигеном отримують Н-аглютинуючі сироватки, що містять Н-антитіла (наприклад, сальмонельозна монорецепторна Н-аглютинуюча сироватка). Імунізацією О-антигеном отримують О-аглютинуючі сироватки, що містять О-антитіла, (наприклад, сальмонельозна групова адсорбована О-аглютинуюча сироватка, протихолерна О-аглютинуюча сироватка). Імунізацією Н- та О-антигенами отримують сироватки з Н- та О-антитілами.
Причому О-аглютинини дають дрібнозернистий аглютинат, а Н-аглютиніни - бавовняний осад.
3. Електроліт – ізотонічний розчин NaCl (0,9 % розчин хлориду натрію, приготовлений на дистильованій воді).
Існує два основних методи постановки реакції аглютинації: реакція на склі (іноді її називають орієнтовною або пластинчастою) та розгорнута реакція (у пробірках)
Постановка реакції аглютинації на склі. На знежирене предметне скло наносять дві краплі сироватки та краплю ізотонічного розчину хлориду натрію. Діагностична аглютинуюча сироватка береться в одному розведенні, яке в залежності від її титру становить 1:10, 1:25, 1:50 або 1:100. В одну з крапель сироватки і краплю ізотонічного розчину петлею вносять культуру мікроорганізму, що досліджується, і ретельно перемішують. Крапля хлориду натрію з мікроорганізмами – контроль антигену, крапля сироватки без мікроорганізмів – контроль сироватки. Не можна переносити культуру з краплі із сироваткою в краплю з NaCl. Реакція протікає за кімнатної температури протягом 1-3 хв. Якщо контроль сироватки залишається прозорим, у контролі антигену спостерігається рівномірне помутніння, а краплі, де культура змішана з сироваткою, з'являються пластівці аглютинату, то результат вважають позитивним. Якщо краплі з сироваткою і антигеном рівномірне помутніння, це негативний результат. Реакція виразніше видно на темному тлі.
Сироватка
1. контроль антигену
2. контроль сироватки
Імунні реакції. Застосування імунних реакцій у діагностиці інфекційних захворювань.
ПЛАН:
Види імунних реакцій.
Умови проведення серологічних реакцій
Вимоги до сироватки.
Поняття позитивний та негативний результат.
НОВОВИЙ ЗМІСТ:
Види імунних реакцій.
Імунологічна реакція – це взаємодія антигену з антитілом, що визначається специфічною взаємодією активних центрів антитіла (паратопу) з епітопами антигенів.
Загальна класифікація імунологічних реакцій:
серологічні реакції – реакції між антигенами (Aг) та антитілами (Ig)
in vitro ;
клітинні реакції за участю імунокомпетентних клітин;
алергічні проби - Виявлення гіперчутливості.
Серологічні реакції: 1) визначення; 2) фази; 3) цілі постановки; 4) загальна класифікація.
1) Визначення
Серологічні методидослідження (від латів. Serum – сироватка та logos – вчення) за допомогою реакції антиген-антитіло.
2) Фази
2 фази взаємодії:
I. Специфічна (видима) – настає швидко, антитіла з'єднуються з відповідними антигенами. У цю фазу взаємодіють детермінантні групи антигенів (АГ) та активних центрів антитіл (АТ).
У освіті комплексу АГ+ АТ беруть участь сили:
Кулон;
Ван дер Ваальса
Водневі зв'язки.
Жодних видимих зміну цій фазі немає. При електронній мікроскопії комплекс АГ+АТ як решітки.
ІІ. Неспецифічна - настає повільно, що утворився комплекс антиген - антитіло реагує з додатковим неспецифічним фактором середовища, в яких відбувається реакція, і це мабуть оком - склеювання, розчинення, випадання пластівців осаду і т. п. У присутності електроліту знижується заряд, зменшується розчинність, утворюються видимі конгломерати , що випадають в осад (аглютинат).
3) Цілі постановки :
а) для ідентифікації антигену (антитіло відомо-діагностична сироватка):
серологічна ідентифікація (визначення виду);
серотипування (визначення серовару) – визначення штаму;
у патологічному матеріалі (експрес-діагностика);
у чистій культурі:
б) для виявлення антитіл (Ig) (антиген відомий-діагностикум):
наявності (якісні реакції);
кількості (наростання титру – метод «парних сироваток»).
4) Загальна класифікація серологічних реакцій :
а) прості (2-х компонентні: Ag+Ig):
реакції аглютинації РА (з корпускулярним антигеном);
реакції преципітації РП (з розчинним антигеном);
б) складні (3-х компонентні: Ag + Ig + C);
в) із використанням мітки.
Варіанти реакції аглютинації та преципітації
Реакція аглютинації :
Реакція аглютинації (РА) – імунна реакція взаємодії суспензії АГ (еритроцитів, бактерій) з АТ у фізіологічному розчині.
При аглютинації відбувається склеювання частинок АТ з утворенням пластівцевого осаду.
Реакція пасивної гемаглютинації(РПГА) є різновидом реакції аглютинації, в якій використовують антильний або антигенний еритроцитарний діагностикум (еритроцити з адсорбованими на поверхні АТ або АГ).
Еритроцити у цій реакції виконують роль пасивних носіїв.
Оцінка результатів РПГА проводиться так:
- при позитивної реакції пасивно склеєні еритроцити покривають дно U- або V-подібної лунки рівним шаром з фестончастими краями (парасолька);
- при негативної реакції (відсутності аглютинації) еритроцити накопичуються в центральному заглибленні лунки, утворюючи компактний «ґудзичок» із різко окресленими краями.
Реакцію гальмування гемаглютинації (РТГА) використовують при діагностиці вірусних інфекцій. Деякі віруси містять на своїй поверхні білок гемаглютинін, що склеює еритроцити. Додавання специфічних противірусних АТ блокує вірусний гемаглютинін – гемаглютинація відсутня.
Реакцію непрямої гемаглютинації (РНГА) або реакцію Кумбса застосовують для визначення неповних АТ. Додавання антиглобулінової сироватки (АТ проти Ig людини) посилює результати реакції. РНГА застосовують щодо резус-фактора.
Для постановки реакції аглютинації (РА) необхідні три компоненти:
1) антиген (аглютиноген) АГ;
2) антитіло(аглютинін) АТ;
3)
електроліт
(Ізотонічний розчин натрію хлориду).
Аг + АТ + електроліт = аглютинат
Аглютинація (від лат. agglutinatio - склеювання) - склеювання корпускул (бактерій, еритроцитів та ін) антитілами в присутності електролітів - натрію хлориду.
РА проявляється у вигляді пластівців або осаду, що складаються з корпускул-тіл (наприклад, бактерій, еритроцитів), "склеєних" антитілами.
РА використовують для:
Реакція прямої аглютинації бактерій (РА).
У цій реакції антитіла (аглютиніни) безпосередньо аглютинують корпускулярні антигени (аглютиногени).
Зазвичай вони представлені суспензією інактивованих мікроорганізмів (реакція мікробної аглютинації).
Для визначення виду мікроорганізмів використовуютьстандартні діагностичні аглютинуючі сироватки (відомі АТ ).
Найбільш поширені пластинчаста (орієнтовна) та розгорнута РА.
Пластинчасту РА ставлять на склі. Використовують її як прискорений методвиявлення антитіл чи ідентифікації мікроорганізмів.
Компоненти:
1. стандартні діагностичні аглютинуючі сироватки (АТ);
2. досліджувана чиста культура пацієнта;
3. фіз.
У досліджуваній чистій культурі антигени (АГ) у вигляді частинок (мікробні клітини, еритроцити та інші корпускулярні антигени), які склеюються антитілами та випадають у осад.
Приклад:
Постановка орієнтовною реакції аглютинації (РА ) на склі з метою ідентифікації бактерій кишкової групи
На предметне скло наносять краплями:
1
дизентерії
;
2
-а крапля: - аглютинуюча сироватка до збудниківчеревного тифу
;
(1-2 діагностичні сироватки)
3
-я крапля: - Фізиологічний розчин (контроль).
Додають у кожну краплю досліджувану чисту культуру бактерій. Перемішують.
Результат
:
позитивний
- наявність пластівців аглютинату,
негативний
- відсутність пластівців аглютинату
Висновок:Досліджувані бактерії є збудниками черевного тифу (визначалися антигени).
Для визначення АТ у сироватці хворого (серологічний діагноз) використовують стандартний мікробнийдіагностикум , що містить зависвідомих мікробів або їх антигенівАГ .
Визначення груп крові системи АВО (Реакція гемаглютинації (РГА)) - аглютинують еритроцити.
Компоненти реакції:
1. АГ (еритроцити крові) досліджувана кров
2. АТ (еритротести- цоліклони)
Набір цоліклонів:
Реагент Цоліклон анти-А (рожевий)
Реагент Цоліклон анти-В (синій)
Реагент Цоліклон анти-АВ (безбарвний)
3. електроліт (фізіологічний розчин)
Техніка визначення:
1
.
У лунки планшета наноситься по одній краплі (0,1 мл) цоліклону анти-А, анти-В та анти-АВ (для контролю).
2.
Поруч із кожною краплею реагенту наноситься маленьку (0,05-0,01 мл) краплю досліджуваної крові.
Потім крапля цоліклону змішується з краплею крові індивідуальною чистою скляною паличкою.
3.
Реакція аглютинації розвивається протягом перших 3-5 секунд при м'якому похитуванні пластинки.
Результати реакції враховуються через 2,5 – 3 хвилини після змішування крапель. Зліва направо у лунках анти-А, анти-В, анти-АВ.
Позитивний результат-поява зернистого осаду (аглютинату).
позитивна РА (+)
Негативний – осаду немає.
негативна РА(-)
4.
Аналіз результатів.
O(I) α β – аглютинації немає
A(II) β - аглютинація з анти-А
B(III) α - аглютинація з анти-В
AB(IV)О - аглютинація з анти-А, з анти-В
Схематичне зображення аглютинації.
Антигени АГ на еритроцитах (визначені) + антитілоАТ(Цоліклон) діагностична сироватка
Облік аглютинації у планшетах
Реакція преципітації:
Реакція преципітації - імунна реакція взаємодії АГ у розчинному стані з АТ у фізіологічному розчині.
При преципітації відбувається утворення макромолекулярного імунного комплексу, що проявляється переходом прозорого колоїдного розчину в непрозору суспензію або преципітат.
Кількість обох реагентів має бути у строго певних співвідношеннях, оскільки надлишок одного з них знижує результат.
Існують різні способипостановки реакції преципітації.
1. Реакцію кільцепреципітації ставлять у преципітаційних пробірках з малим діаметром. У пробірку вносять імунну сироватку і обережно нашаровують розчинну артеріальну гіпертензію. АГ та АТ змішуються за рахунок теплового руху молекул, і вони взаємодіють. При позитивному результатіна межі двох розчинів утворюється кільце непрозорого преципітату.
2. Реакцію подвійної імунодифузії по Оухтерлоні проводять в агаровому гелі, в лунки якого вносять за схемою або розчин АГ, або розчин АТ. АГ та АТ дифундують у гель назустріч один одному і при позитивному результаті реакції утворюють імунні комплекси, видимі як лінії преципітації.
Реакція преципітації -це формуванняі осадження комплексу молекулярного розчинного антигену з антитілами у вигляді помутніння, званого преципітатом. Він утворюється при змішуванні антигенів та антитіл в еквівалентних кількостях.
Компоненти РА:
преципітуюча сироватка (відоме АТ-преципітін);
досліджувана сироватка (невідомий АГ-преципітіноген);
фіз. розчин.
Реакцію преципітації ставлять або у спеціальних вузьких пробірках (реакція кільцепреципітації), або у чашках Петрі в гелях, поживних середовищах та ін.
Реакція кільцеприципітації
Постановка та облік результатів реакціїкільцепреципітаціїдля виявлення збудника сибірки(Асколі реакція).
Постановка .
1. Досліджуваний матеріал (шкіра, шерсть, повсть, щетина, сукно, м'ясо, земля, випорожнення тварин і т. д.) кип'ятять у фіз розчині5-45 хв. для здобуття ізотонічної витяжки (екстракту). Фільтрують.
2. У пробірку наливають преципітуючу протисибіркову сироватку.
3. Обережно нашаровують її досліджуваний матеріал (екстракт).
Облік .
Протягом найближчих 10 хв. на межі між сироваткою та екстрактом у позитивних випадках з'являється кільце помутніння (кільцепреципітація). Асколі реакція дуже чутлива та специфічна
З її допомогою вдається швидко виявити матеріали, інфіковані сибіркою.
Реакція преципітації в агарі
Постановка та облік результатівреакції преципітації в агарідля визначення токсигенності коринебактерій (збудники дифтерії)
Постановка
Ставиться на фосфатно-пептонному агарі у чашці Петрі.
1. Уздовж чашки посередині поміщають смужку стерильного фільтрувального паперу, змоченогоантитоксичною сироваткою.
2. Після підсушування на відстані 1 см від краю смужки бляшками діаметром 10 мм підсіваютьвиділені культури.
В одній чашці можна сіяти від 3 до 10 культур, одна з яких,контрольна, має бути свідомотоксигенної.
Посіви поміщають у термостат.
Облік
Аналіз проводять через 24-48-72 год.
Позитивний результат - (культуратоксигенна) - на деякій відстані від смужки паперу виникаютьлінії преципітату, « стріли-усики», які добре видно в світлі, що проходить.
На малюнку представлена реакція преципітації в агарі визначення токсигенності дифтерійних паличок. Середні культури не утворили стріл-усиків, це не токсикогенні збудники.
Штами збудника дифтерії можуть бути токсигенними (що продукують екзотоксин) та нетоксигенними. Утворення екзотоксин залежить від наявності в бактеріях профагу, що несе tox-ген, що кодує утворення екзотоксин.
При захворюванні всі збудники дифтерії тестуються на токсигенність - продукцію дифтерійного екзотоксин за допомогою реакції преципітації в агарі
Складні серологічні реакції ( 3-х компонентні:Aг+Ig+C):
Реакція зв'язування комплементу (РЗК).
Реакцію проводять у два етапи.
На першому етапі АТ взаємодіють з АГ та комплементом, на другому етапі додають індикатор - гемолітичну систему (суміш еритроцитів та антиеритроцитарної сироватки).
При позитивному результаті першому етапі АТ утворюють з АГ імунний комплекс, що зв'язує комплемент реакційної суміші.
І тут еритроцити гемолітичної системи, додані другого етапу, не руйнуються.
В іншому випадку незв'язаний комплемент викликає лізис індикаторних еритроцитів.
Для її проведення необхідно п'ять інгредієнтів: АГ, AT та комплемент (перша система), еритроцити барана та гемолітична сироватка (друга система) (рис.1).
Реакція протікає дві фази (рис. 3).
Перша фаза - взаємодія антигену та антитіл при обов'язкову участькомплементу.
Друга - Виявлення результатів реакції за допомогою індикаторної гемолітичної системи (еритроцити барана та гемолітична сироватка). Руйнування еритроцитів гемолітичною сироваткою відбувається лише у разі приєднання комплементу до гемолітичної системи. Якщо комплемент адсорбувався раніше на комплексі антиген-антитіло, то гемоліз еритроцитів не настає (рис).
Результат досвіду
оцінюють (рис.2), відзначаючи наявність чи відсутність гемолізу у всіх пробірках. Реакцію вважають позитивною при повній затримці гемолізу, коли рідина в пробірці безбарвна та еритроцити осідають на дно, негативною – при повному лізисі еритроцитів, коли рідина інтенсивно забарвлена («лакова» кров).
Ступінь затримки гемолізу оцінюють залежно від інтенсивності фарбування рідини та величини осаду еритроцитів на дні (++++, +++, ++, +).
Мал. 4. Постановка та результат РСК.
Висновок:У досліджуваній сироватці виявлено антитіла.
РЗК дозволяє виявити антитіла до будь-якого штаму одного і того ж серотипу вірусу.
чотириразове збільшення титру антитіл у парних сироватках (у період епідемії грипу);
дворазове наростання у сироватках крові хворих при характерній клінічній картині.
Реакції з використанням мітки :
Ці методи є високочутливими. Як мітки антигенів або антитіл застосовують барвники, радіоактивні ізотопи, ферменти та ін.
РІФ – реакція імунофлюоресценції
Реакція імунофлуоресценції заснована на світловій індикації комплексу антиген-антитіло
Імуноферментний аналіз.
Сучасне лабораторне дослідження, під час якого ведеться пошук специфічних антитіл у крові чи антигенів до конкретних захворювань із єдиною метою виявлення як етіології, а й стадії хвороби.
Результати ІФА можуть видаватися якісно та кількісно.
В даний час ІФА застосовується в таких ситуаціях:
1) пошук специфічних антитіл до будь-якого інфекційного захворювання;
2) пошук антигенів будь-яких захворювань (інфекційних, венерологічних);
3) дослідження гормонального статусупацієнта;
4) обстеження на онкомаркери;
5) обстеження щодо наявності аутоімунних захворювань.
На малюнку твердофазний ІФА - відомі АГ (ліворуч) адсорбована на лунці планшета, (праворуч) на лунках планшета відомі АТ
Переваги методу ІФА:
1) Висока специфічність та чутливість методу ІФА (понад 90%).
2) Можливість визначення захворювання та відстеження динаміки процесу, тобто порівняння кількості антитіл у різних часових проміжках.
3) Доступність ІФА-діагностики в будь-якій медичній установі.
Відносний недолік: Виявлення імунної відповіді (антитіл), але не самого збудника, кон'югованих з ферментом-міткою.
Постановка ІФА (загальний механізм):
Основу імуноферментного аналізу становить імунна реакція антигену та антитіла з утворенням імунного комплексу: антиген-антитіло, в результаті якого відбувається зміна ферментативної активності специфічних міток на поверхні антитіл.
Компоненти реакції:
1. АГ(АТ) відоме - на лунці планшета.
2. АТ (АГ) досліджуване.
3. АТ із ферментом, специфічне комплексу АТ(АГ)-АГ(АТ)
4.хромогенний субстрат, що взаємодіє з ферментом
5. стоп розчин
Основні етапи проведення ІФА
1. На поверхні лунок планшета знаходиться очищений антиген певного збудника. У них додається біологічний матеріалпацієнта відбувається специфічна реакція між цим антигеном та шуканим антитілом (імуноглобуліном). Утворюється комплекс.
2. Додається кон'югант – АТ із ферментом. Кон'югант специфічний до комплексу АТ-АГ першого етапу. Фермент активізується.
3. Додається субстрат та активний фермент взаємодіє з ним, змінюючи безбарвний колір розчину.
4. Додається стоп розчин для припинення взаємодії фермент-субстрат.
Облік.
Позитивний результат-змінакольору, малюнку – жовтий колір.
Імунохроматографічний аналіз
Метод імунохроматографічного аналізу (ІХА, експрес-тести) – якісний скринінговий попередній метод, що дозволяє швидко протягом кількох хвилин провести аналіз у будь-яких умовах, у т.ч. "польових".
До переваг ІХА слід віднести:
Швидкість та легкість у використанні;
Малі обсяги зразка, відсутність пробопідготовки;
Дешевизну для виробника та споживача;
Можливість виробництва тестів у великих обсягах;
Простоту читання та інтерпретації результату;
Високу чутливість та відтворюваність;
Можливість кількісного визначення;
Можливість використання портативних рідерів, сумісних із комп'ютером;
Можливість мультианалізу.
Компоненти (нанесені на тест-смужку):
1. Кон'югат з міткою колоїдного золота - специфічний до АГ, що визначається.
2. АТ тестової лінії – специфічні до комплексу АТ-АГ
3. АТ контрольної лінії – специфічні до кон'югату.
Постановка ІХА:
1.Нанесення зразка на позначену стартову ділянку смужки.
2. Отримання результату як появи пофарбованих смуг дома тестової і контрольної лінії.
Облік
Позитивний – при фарбуванні тестової лінії.
Негативний – за відсутності фарбування тестової лінії.
Недостовірний – за відсутності фарбування контрольної лінії.
Загальний механізм ІХА:
1. Зразок вноситься на стартове поле (подушку зразка) та зв'язується з кон'югатом (специфічне тіло з кольоровою міткою), які знаходяться на подушці кон'югату. Внаслідок цього утворюється пофарбований комплекс.
2. Пофарбований імунний комплекс, що утворився, рухається під дією капілярних сил уздовж нітроцелюлозної мембрани.і взаємодієз тестової лінії АТ.В результаті з'являється одна забарвлена рожево-червона смуга.
3. Не зв'язалися на смузі АТ, що тестується (кон'югат)рухається далі і досягає контрольної лінії, що зв'язується з АТ контрольної лінії.В результаті з'являється друга забарвлена смуга.Якщо аналіз проведено правильно, Контрольна лінія повинна виявлятися завжди незалежно від присутності досліджуваного антигену (антитіла) у зразку біологічної рідини.
2. Умови проведення серологічних реакцій.
1. Наявність гомологічних – відповідних один одному антигену та антитіла.
2. Чистий, сухий посуд.
3. Певне співвідношення препаратів (найчастіше рівне).
4. Обов'язкова присутність електроліту (ізотонічний розчин NaCl).
5. рН нейтральний або близький до слаболужного.
6. Температура +37 ° С або кімнатна (обов'язково плюсова).
7. Проводиться контроль антигену та контроль сироватки (антитіл).
3 Вимоги до сироватки
Сироватка має бути абсолютно прозора без домішки клітин.
Одержують на 2 тижні хвороби зазвичай, коли вже є антитіла.
Кров беруть у кількості 3-5 мл натще або через 6 ч. після їди.
Для отримання сироватки кров залишають на 1:00 при кімнатній температурі або центрифугують. Відсмоктують сироватку дуже обережно, щоб не захопити формені елементи.
Імунні сироватки одержують із крові людей або тварин (частіше за кроликів та коней), імунізованих за певною схемою відповідним антигеном (вакциною). Готують сироватки зазвичай з виробництва.
4. Поняття позитивний та негативний результат.
РА.
При позитивній реакції пасивно склеєні еритроцити покривають дно лунки рівним шаром з фестончастими краями (парасолька); за відсутності аглютинації еритроцити накопичуються в центральному заглибленні лунки, утворюючи компактний «гудзик» з різко окресленими краями (див. малюнки вище).
РП.
При позитивному результаті межі двох розчинів утворюється кільце молочного кольору (див. малюнки вище).
ІФА.
Зміна кольору розчину відбувається за позитивної реакції.
РЗК.
Затримка гемолізу – реакція позитивна; якщо комплемент вільний, спостерігається гемоліз – реакція негативна(Див. малюнки вище).
Результати реакції Вассермана:
а - повна затримка гемолізу (++++);
б - виражена затримка гемолізу (++);
в – часткова затримка гемолізу (++);
г – слабка затримка гемолізу (+);
д – повний гемоліз (-).
Реакція позитивна при частковій, вираженій та повній затримці гемолізу, що визначається за ступенем фарбування вмісту пробірок від світло-рожевого до яскраво-червоного; негемолізовані еритроцити згодом утворюють осад червоного кольору.
1. Вивчіть матеріал
Складіть 3 конспекти з відео
з мікробіології
«Реакція аглютинації та її види (РА)»
План:
1. Вступ……………………………………………………………………………………..3
2. РА на склі………………………………………………………………………………….4
3. Пробіркова РА…………………………………………………………………………….5
4. Використовувана литература…………………………………………………………………..7
1. Введення.
Взаємодія мікробного антигену та антитіл носить строго специфічний характер і спрямована у тваринному організмі на нейтралізацію збудника та його токсинів. Взаємодія антигену та антитіл in vitro за певних умов супроводжують видимі феномени (аглютинація, преципітація, імунний лізис), що дозволяє використовувати АГ-АТ-реакції, що отримали назву серологічних (від латів. serum-сироватка), у практичних цілях. Біофабрики випускають антигени та імунні сироватки (антитіла) відомої специфічної спрямованості (діагностичні). За допомогою таких сироваток у серологічних реакціях можна ідентифікувати невідомий мікроорганізм або, застосовуючи відомий антиген, виявити в організмі антитіла, синтезовані у відповідь на впровадження збудника, і таким чином встановити діагноз (серологічна діагностика). Крім того, серологічні реакції можна використовувати для оцінки інтенсивності імунної відповіді після вакцинації чи перенесеної інфекційної хвороби.
Реакції аглютинації, наприклад непрямої аглютинації і Кумбса засновані на взаємодії in vitro корпускулярних антигенів з антитілами і здатності комплексів, що утворилися, випадати в осад. Як корпускулярні антигени використовують бактеріальні клітини або розчинні антигени, екстраговані з мікроорганізмів і сорбовані на корпускулах носіїв: еритроцитах, частинках латексу і т.д.
Антигенні детермінанти корпускулярних антигенів специфічно взаємодіють з гомологічними антитілами (специфічна, невидима фаза реакції), а потім комплекси антиген-антитіло утворюють великі конгломерати, що ідуть неозброєним оком, які випадають в осад - аглютинат (неспецифічна, видима). У безжгутикових форм мікробів (бруцелл) утворюються зернисті аглютинанти, у джгутикових (ешерихії, салмонели) - великобавовняні, які осідають на дно пробірки у вигляді перевернутої парасольки і при струшуванні легко розбиваються. Антигени та антитіла взаємодіють лише у присутності електроліту (у 0,8%-му розчині хлориду натрію). Протягом реакції впливають концентрація солі в електроліті, кількість мікробних клітин у суспензії, концентрація сироватки, рН, температура та інші фактори.
Реакція аглютинації (ра).
Розрізняють аглютинацію специфічну, в основі якої лежить взаємодія антигену згомологічним антитілом , що міститься в організмі тварини, до-рому був введений даний антиген (імуноаглютинація); неспецифічну (хімічну), що виникає від зміни рН середовища, концентрації електролітів; спонтанну, яку спостерігають при суспендуванні бактерій (що знаходяться в R-формі) у фізіологічному розчині і при нагріванні, що пов'язано зі зміною колоїдного стану бактеріальної клітини. Антиген , що бере участь у РА, називається аглютиногеном, антитіло - аглютиніном, осад, що утворюється, - аглютинатом. При утворенні аглютинату має значення кількісне співвідношення антигену та антитіл (феномен оптимуму). При надлишку чи нестачі антитіл відбувається затримка А.
Реакція аглютинації (РА) одна з перших імунологічних реакцій, яку застосовують у мікробіологічній практиці. Вперше (1895) РА для діагностики черевного тифу застосував Ф. Відаль. Пізніше (1897) цю реакцію для діагностики бруцельозу люди використовував А. Райт. РА знайшла застосування також при діагностиці пуллорозу курчат, лептоспірозу, інфекційного аборту кобил, а також для типізації невідомих культур мікробів за свідомовідомою аглютинуючою сироваткою. РА високочутлива; за її допомогою можна виявити 0,01 мкг азоту білка антитіл в 1 мл.
Розроблено кілька варіантів реакції аглютинації, що розрізняються за методичним виконанням та метою дослідження.
2. Ра на склі.
При цьому варіанті РА випробуваними можуть бути як сироватка, так і антиген, але найчастіше цей варіант використовують для ідентифікації мікроорганізмів.
1. Для ідентифікації мікроорганізму (м/о) на знежирене предметне скло наносять окремо краплю відомої аглютинуючої сироватки, наприклад сальмонеліозної, і краплю фізіологічного розчину (контроль). Потім бактеріологічною петлею беруть бактеріальну масу культури, що вивчається з колонії в чашці Петрі або з поверхні скошеного МПА в пробірці і суспендують окремо в імунній сироватці і фізіологічному розчині до отримання гомогенної суспензії. Результат враховують через 2…4 хв.
Облік результатів: у контрольній пробі зміни мають бути відсутніми. При специфічній відповідності культури бактерій імунної сироватці з'являються пластівці аглютинату (позитивний результат), у разі відсутності феномену аглютинації роблять висновок про те, що культура, що досліджується, бактерій не відповідає імунній сироватці.
2. Виявлення аніттел у досліджуваній сироватці крові розглянемо з прикладу роз-бенгал проби, застосовуваної при серодиагностике бруцельозу. На предметне скло наносять 0,3 мл досліджуваної сироватки крові тварини і 0,03 мл бруцельозного антигену (забарвлені рожево-бенгальською клітиною бруцел). Компоненти ретельно перемішують похитування скла і через 4 хв враховують результат.
Облік результатів: при позитивній реакції з'являються рожеві пластівці аглютинату. Серологічну реакцію подібного типу відносять до якісної, тому що з її допомогою можна виявляти антитіла до збудника у сироватці крові тварини, але неможливо оцінити їхній кількісний вміст.
1.1. РЕАКЦІЯ АГГЛЮТИНАЦІЇ (РА)
РЕАКЦІЯ АГГЛЮТИНАЦІЇ (РА)
Завдяки своїй специфічності, простоті постановки та демонстративності, реакція аглютинації набула широкого поширення в мікробіологічній практиці для діагностики багатьох інфекційних захворювань.
Реакція аглютинації заснована на специфічності взаємодії антитіл (аглютинінів) з цілими мікробними або іншими клітинами (аглютиногенами). В результаті такої взаємодії утворюються частинки ¦ агломерати, що випадають в осад (аглютинат) у вигляді пластівців.
У реакції аглютинації можуть брати участь як живі, так і вбиті бактерії, спірохети, гриби, найпростіші, рикетсії, а також еритроцити та інші клітини. Реакція протікає у дві фази: перша (невидима) специфічна, з'єднання антигену і антитіл, друга (видима) неспецифічна, склеювання антигенів, тобто. утворення аглютинату.
Аглютинат утворюється при з'єднанні одного активного центру двовалентного антитіла з групою детермінантної антигену. Реакція аглютинації, як будь-яка серологічна реакція, протікає у присутності електролітів.
Зовнішній прояв позитивної реакції аглютинації має двоякий характер. У безжгутикових мікробів, що мають тільки соматичний антиген, відбувається склеювання безпосередньо самих мікробних клітин. Така аглютинація називається дрібнозернистою. Він відбувається протягом 18-22 годин. v
У джгутикових мікробів є два антигени соматичний О антиген і джгутиковий Н антиген. Якщо клітини склеюються джгутиками, утворюються великі пухкі пластівці і така реакція аглютинації називається крупнозернистою. Вона настає протягом 2…4 годин.
Реакцію аглютинації можна ставити як з метою якісного та кількісного визначення специфічних антитіл у сироватці крові хворого, так і з метою визначення видової приналежності виділеного збудника. v
Реакцію аглютинації можна ставити як у розгорнутому варіанті, що дозволяє працювати з розведеною сироваткою до діагностичного титру, так і у варіанті постановки орієнтовної реакціїщо дозволяє в принципі виявити специфічні антитіла або визначити видову приналежність збудника.
При постановці розгорнутої реакції аглютинації, з метою виявлення в сироватці крові специфічних антитіл, що обстежується, досліджувану сироватку беруть у розведенні 1:50 або 1:100. Це зумовлено тим, що в цілісній або малорозведеній сироватці можуть бути нормальні антитіла в дуже високій концентрації, і тоді результати реакції можуть бути неточними. Досліджуваним матеріалом у цьому варіанті постановки реакції є кров хворого.
Кров беруть натще або не раніше ніж через 6 годин після їжі (інакше в сироватці крові можуть бути крапельки жиру, що роблять її каламутною та непридатною для дослідження). Сироватку крові хворого зазвичай отримують на другому тижні захворювання, набираючи стерильно з ліктьової вени 3…4 мл крові (до цього часу концентрується максимальна кількість специфічних антитіл). Як відомий антиген використовується діагностикум, приготований з убитих, але не зруйнованих мікробних клітин конкретного виду з конкретною антигенною структурою.
При постановці розгорнутої реакції аглютинації з метою визначення видової, типової приналежності збудника антигеном є живий збудник, виділений з досліджуваного матеріалу. Відомими є антитіла, що містяться в імунній діагностичній сироватці. v
Імунну діагностичну сироваткуодержують із крові вакцинованого кролика. Визначивши титр (максимальне розведення, в якому виявляються антитіла), діагностичну сироватку розливають ампули з додаванням консерванту. Цю сироватку і використовують для ідентифікації антигенної структури виділеного збудника.
ВАРІАНТИ РЕАКЦІЇ АГГЛЮТИНАЦІЇ
У цих реакціях беруть участь антигени у вигляді частинок (мікробні клітини, еритроцити та інші корпускулярні антигени), які склеюються антитілами та випадають у осад.
Для постановки реакції аглютинації (РА) необхідні три компоненти: 1) антиген (аглютиноген); 2) антитіло (аглютинін) та 3) електроліт (ізотонічний розчин натрію хлориду).
ОРІЄНТУВАЛЬНА (ПЛАСТИНЧАТА) РЕАКЦІЯ АГГЛЮТИНАЦІЇ (РА)
Орієнтовна або пластинчаста РА ставиться на предметному склі при кімнатній температурі. Для цього пастерівською піпеткою на скло наносять окремо краплю сироватки в розведенні 1:10 1:20 і контрольну краплю ізотонічного розчину натрію хлориду. У ту і іншу бактеріологічну петлю вносять колонії або добову культуру бактерій (краплю діагностикуму) і ретельно перемішують їх. Реакції враховують за кілька хвилин візуально, іноді за допомогою лупи (х5). При позитивній РА в краплі з сироваткою відзначають появу великих і дрібних пластівців, при негативній сироватка залишається рівномірно каламутною.
РЕАКЦІЯ НЕПРЯМОЇ (ПАСИВНОЇ) ГЕМАГЛЮТИНАЦІЇ (РНГА, РПГА)
Реакція ставиться: 1) для виявлення полісахаридів, білків, екстрактів бактерій та інших високодисперсних речовин, рикетсій та вірусів, комплекси яких з аглютинінами у звичайних РА побачити не вдається, або 2) для виявлення антитіл у сироватках хворих до цих високодисперсних речовин та мілин.
Під непрямою, або пасивною, аглютинацією розуміють реакцію, в якій антитіла взаємодіють з антигенами, попередньо адсорбованими на інертних частинках (латекс, целюлоза, полістерол, оксид барію та ін. або еритроцити барана, I(0) групи крові людини).
У реакції пасивної гемаглютинації (РПГА) як носій використовують еритроцити. Навантажені антигеном еритроцити склеюються у присутності специфічних антитіл до цього антигену і випадають осад. Сенсибілізовані антигеном еритроцити використовують у РПГА як еритроцитарний діагностикум для виявлення антитіл (серодіагностика). Якщо навантажити еритроцити антитілами (еритроцитарний антільний діагностикум), можна застосовувати виявлення антигенів.
Постановка. У лунках полістиролових планшетів готують низку послідовних розведень сироватки. У передостанню лунку вносять 0,5 мл свідомо позитивної сироватки і в останню 0,5 мл фізіологічного розчину (контролі). Потім у всі лунки додають по 0,1 мл розведеного еритроцитарного діагностикуму, струшують і поміщають у термостат на 2 год.
Облік. У позитивному випадкуеритроцити осідають на дні лунки у вигляді рівного шару клітин зі складчастим або зазубреним краєм (перевернутий парасольку), в негативному осідають у вигляді гудзика або кільця.
1.2. РЕАКЦІЯ НЕЙТРАЛІЗАЦІЇ. ЛІЗИСА,
ОПСОНО ФАГОЦИТАРНА РЕАКЦІЯ, РЕАКЦІЯ ПІДВИЩЕНОЇ ЧУВЧИСНОСТІ
РЕАКЦІЯ НЕЙТРАЛІЗАЦІЇ ЕКЗОТОКСИНУ АНТИТОКСИНОМ (РН)
Реакція ґрунтується на здатності антитоксичної сироватки нейтралізувати дію екзотоксину. Вона застосовується для титрування антитоксичних сироваток та визначення екзотоксин.
При титруванні сироватки до різних розведень антитоксичної сироватки додається певна доза відповідного токсину. При повній нейтралізації антигену та відсутності невитрачених антитіл настає ініціальна флокуляція. Реакцію флокуляції можна застосовувати не тільки для титрування сироватки (наприклад, дифтерійної), але і для титрування токсину та анатоксину. Реакція нейтралізації токсину антитоксин має велике практичне значення як метод визначення активності антитоксичних лікувальних сироваток. Антигеном у цій реакції є справжній екзотоксин.
Сила антитоксичної сироватки визначається умовними одиницями АЕ.
1 АЕ ботулінової сироватки - її кількість нейтралізує 1000 DLM ботулінового токсину. Реакцію нейтралізації з метою визначення видової або типової приналежності екзотоксину (при діагностиці правця, ботулізму, дифтерії та ін.) можна проводити in vitro (за Рамоном), а при визначенні токсигенності мікробних клітин у гелі (по Оухтерлоні).
Реакція лізису (РЛ)
Однією із захисних властивостей імунної сироватки є її здатність розчиняти мікроби або клітинні елементи, що надходять до організму.
Специфічні антитіла, що зумовлюють розчинення (лізис) клітин, називаються лізинами. Залежно від характеру антигену вони можуть бути бактериолизинами, цитолизинами, спирохетолизинами, гемолизинами та інших.
Лізини проявляють свою дію тільки в присутності додаткового фактора комплементу. Комплемент, як фактор неспецифічного гуморального імунітету, виявлений майже у всіх рідинах організму, крім спинномозкової рідини та рідини передньої камери ока. Досить високий і постійний вміст комплементу зазначено у сироватці крові людини і дуже багато його у сироватці крові морської свинки. В інших ссавців вміст комплементу в сироватці крові по-різному.
Комплемент – це складна системасироваткових протеїнів. Він нестійкий і руйнується за 55 градусів протягом 30 хвилин. За кімнатної температури комплемент руйнується протягом двох годин. Дуже чутливий до тривалого струшування, до дії кислот та ультрафіолетових променів. Однак, комплемент тривалий час (до шести місяців) зберігається у висушеному стані при низькій температурі. Комплемент сприяє лізису мікробних клітин та еритроцитів.
Розрізняють реакцію бактеріолізу та гемолізу.
Суть реакції бактеріолізу полягає в тому, що при з'єднанні специфічної імунної сироватки з відповідними гомологічними їй живими мікробними клітинами в присутності комплементу відбувається лізис мікробів.
Реакція гемолізу у тому, що з впливу еритроцити специфічної, імунної стосовно них сироваткою (гемолітичної) у присутності комплементу, спостерігається розчинення еритроцитів, тобто. гемоліз.
Реакція гемолізу в лабораторній практиці використовується для визначення тиру комплементу, а також для врахування результатів діагностичних реакційзв'язування комплементу. Титр комплементу - це найменша його кількість, яка обумовлює лізис еритроцитів протягом 30 хвилин у гемолітичній системі в обсязі 2,5мл. Реакція лізису, як і всі серологічні реакції, відбувається в присутності електроліту.
РЕАКЦІЇ ГІПЕРЧУВНОСТІ (АЛЕРГІЧНІ)
Певні форми антигену при повторному контакті з організмом можуть викликати реакцію, специфічну у своїй основі, але включає неспецифічні клітинні та молекулярні фактори гострої запальної відповіді. Відомі дві форми підвищеної реактивності: гіперчутливість негайного типу (ГНТ) та гіперчутливість уповільненого типу (ГЗТ). Перший тип реакції проявляється за участю антитіл, при цьому реакція розвивається не пізніше 2 годин після повторного контакту з алергеном. Другий тип реалізується за допомогою Т?клітин запалення, (Тгзт) як основних ефекторів реакції, що забезпечують накопичення в зоні запалення макрофагів, реакція проявляється через 6?8 год і пізніше.
Розвитку реакції гіперчутливості передує зустріч із антигеном і виникнення сенсибілізації, тобто. поява антитіл, активно сенсибілізованих лімфоцитів та пасивно сенсибілізованих цитофільними антитілами інших лейкоцитів (макрофагів, гранулоцитів).
Реакції гіперчутливості мають три фази розвитку: імунологічну; патохімічну; патофізіологічну.
У першій, специфічній, фазі алерген взаємодіє з антитілами та (або) сенсибілізованими клітинами. У другій фазі відбувається викид біологічно активних речовинз активованих клітин. Медіатори, що звільнилися (гістамін, серотонін, лейкотрієни, брадикінін та ін.) викликають різні периферичні ефекти, властиві відповідному типу реакції третя фаза.
Реакції підвищеної чутливостічетвертого типу
Реакції цього типу зумовлені патогенними міжклітинними взаємодіями сенсибілізованих Тхелперів, цитотоксичних Тлімфоцитів (Ткілерів) та активованих клітин системи мононуклеарних фагоцитів, викликаних тривалою стимуляцією системи імунітету бактеріальними антигенами, при якій виникає відносна недостатність внутрішнього середовищабактеріальні збудники інфекційних захворювань Дані реакції підвищеної чутливості обумовлюють туберкульозні каверни легень, їх казеозний некроз та загальну інтоксикацію у пацієнтів із туберкульозом. Шкірний грануломатоз при туберкульозі та проказі у морфопатогенетичному відношенні багато в чому складається реакціями підвищеної чутливості четвертого типу.
Найбільш відомий прикладреакції підвищеної чутливості четвертого типу - це реакція Манту, що розвивається в місці внутрішньошкірного введення туберкуліну хворому, організм і система якого сенсибілізовані до антигенів мікобактерій. Внаслідок реакції утворюється щільна гіперемована папула з некрозом у центрі, яка з'являється лише через кілька годин (уповільнено) після внутрішньошкірного введення туберкуліну. Формування папули починається з виходу із судинного русла у міжклітинні простори мононуклеарних фагоцитів циркулюючої крові. Одночасно починається еміграція із судинного русла поліморфонуклеарів. Потім інфільтрація нейтрофілами спадає, і інфільтрат починає переважно складатися з лімфоцитів і мононуклеарних фагоцитів. Цим реакція Манту відрізняється від реакції Артюса, коли у місці поразки накопичуються переважно полиморфонуклеарные лейкоцити.
При реакціях підвищеної чутливості четвертого типу тривала стимуляція антигенами сенсибілізованих лімфоцитів наводить у місцях патологічні змінитканин до патологічно інтенсивного та тривалого вивільнення Т хелперами цитокінів. Інтенсивний викид цитокінів у локусах тканинних ушкоджень зумовлює гіперактивацію клітин системи мононуклеарних фагоцитів, що знаходяться там, багато з яких у гіперактивованому стані утворюють тяжи епітеліоїдних клітин, а деякі зливаються між собою з утворенням гігантських клітин. Макрофаги, на поверхні яких експоновані бактеріальні та вірусні антигени можуть знищуватися через функціонування Ткілерів (натуральних кілерів).
Реакція підвищеної чутливості четвертого типу індукується розпізнаванням чужорідного бактеріального антигену сенсибілізованими по відношенню до нього Т хелперами. Необхідна умова розпізнавання: взаємодія індукторів з антигенами, експонованими на поверхні антиген, що презентують клітин після ендоцитозу та переробки мононуклеарними фагоцитами чужорідних імуногенів. Ще одне необхідна умова¦ експонування антигенів у комплексі з молекулами I класу з головного комплексу тканинної сумісності. Після розпізнавання антигену сенсибілізовані хелпери вивільняють цитокіни і, зокрема, інтерлейкін 2, що активує натуральні кілери та мононуклеарні фагоцити. Активовані мононуклеарні фагоцити вивільняють протеолітичні ферменти та вільні кисневі радикали, що ушкоджує тканини.
Шкірно|алергічні проби| колективного імунітетунаприклад, до туляремії. За місцем введення алергену розрізняють: 1) нашкірні проби; 2) скарифікаційні; 3) внутрішньошкірні; 4) підшкірні. Клінічна реакція на алерген при шкірноалергічній пробі поділяються на місцеві, загальні та вогнищеві, а також на негайні та уповільнені.
Місцеві реакції медіаторного типу ГНТ виникають через 520 хв, виражаються у вигляді еритеми і пухиря, зникають через кілька годин, оцінюються плюсовим методом за величиною еритеми, що вимірюється в мм. Місцеві реакції ГЗТ виникають через 24 48 год, тримаються довго, проявляються у вигляді інфільтрату, іноді з некрозом в центрі, оцінюються за величиною інфільтрату в мм, також за плюсовою системою. При цитотоксичному та імунокомплексному типах ГНТ гіперемія та інфільтрація відзначаються через 3?4 год, досягають максимуму на 6?8 год і затихають приблизно через добу. Іноді спостерігаються комбіновані реакції.
1.3. РЕАКЦІЯ ЗВ'ЯЗУВАННЯ КОМПЛЕМЕНТУ (РСК)
Цю реакцію застосовують при лабораторних дослідженнях для виявлення антитіл у сироватці крові при різних інфекціях, а також для ідентифікації збудника антигенної структури.
Реакція зв'язування комплементу відноситься до складних серологічних реакцій і відрізняється високою чутливістю та специфічністю.
Особливістю цієї реакції є те, що зміна антигену при його взаємодії зі специфічними антитілами відбувається лише у присутності комплементу. Комплемент адсорбується тільки на комплексі «антитіло антиген». Комплекс «антитіло антиген» утворюється тільки в тому випадку, якщо між антигеном і антитілом, що знаходиться в сироватці, є спорідненість.
Адсорбція комплементу на комплексі «антиген - антитіло» може по-різному позначитися на долі антигену в залежності від його особливостей.
Деякі з антигенів піддаються за цих умов різким морфологічним змінам, аж до розчинення (гемоліз, феномен Ісаєва Пфейфера, цитолітична дія). Інші змінюють швидкість пересування (іммобілізація трепонему). Треті гинуть без різких деструктивних змін (бактерицидна чи цитотоксична дія). Нарешті, адсорбція комплементу може і супроводжуватися змінами антигену, легко доступними для спостереження.
За механізмом РСК протікає у дві фази:
- Перша фаза - це утворення комплексу «антиген - антитіло» і адсорбція на цьому комплексі комплементу. Результат фази візуально не бачимо (взаємодія антигену та антитіл за обов'язкової участі комплементу).
- Друга фаза - це зміна антигену під впливом специфічних антитіл у присутності комплементу. Результат фази може бути візуально видимим або не видимим (виявлення результатів реакції за допомогою індикаторної гемолітичної системи (еритроцити барана і гемолітична сироватка).
Руйнування еритроцитів гемолітичною сироваткою відбувається лише у разі приєднання комплементу до гемолітичної системи. Якщо ж комплемент адсорбувався раніше на комплексі антиген антитіло, то гемоліз еритроцитів не настає.
Результат досвіду оцінюють, відзначаючи наявність чи відсутність гемолізу у всіх пробірках. Реакцію вважають позитивною при повній затримці гемолізу, коли рідина в пробірці безбарвна і еритроцити осідають на дно, негативною при повному лізисі еритроцитів, коли рідина інтенсивно забарвлена («лакова» кров). Ступінь затримки гемолізу оцінюють залежно від інтенсивності фарбування рідини та величини осаду еритроцитів на дні (++++, +++, ++, +).
У разі, коли зміни антигену залишаються недоступними для візуального спостереження, доводиться використовувати другу систему, яка виконує роль індикатора, що дозволяє оцінити стан комплементу і зробити висновок результат реакції.
Ця індикаторна система представлена компонентами реакції гемолізу, у складі якої знаходяться баранячі еритроцити та гемолітична сироватка, що містить до еритроцитів специфічні антитіла (гемолізини), але не містить комплемент. Ця індикаторна система додається в пробірки за годину після постановки основної РСК. Якщо реакція зв'язування комплементу позитивна, то утворюється комплекс антитіло антиген», що адсорбує на собі комплемент. Оскільки комплемент використовується в кількості необхідної тільки для однієї реакції, а лізис еритроцитів може статися тільки за наявності комплементу, то при його адсорбції на комплексі «антиген антитіло», лізис еритроцитів в гемолітичній (індикаторній) системі не відбудеться. Якщо реакція зв'язування комплементу негативна, комплекс «антиген антитіло» не утворюється, комплемент залишається вільним, і при додаванні гемолітичної системи настає лізис еритроцитів.
1.4. ДНК ЗОНДИ. ПОЛІМЕРАЗНО | ЛАНЦЮПНА РЕАКЦІЯ (ПЛР),
ІМУНО ФЕРМЕНТНИЙ МЕТОД (ІФА), МЕТОД ФЛУОРЕСЦІЙНИХ АНТИТЕЛ (МФА)
МЕТОДИ ГЕННОГО ЗОНДУВАННЯ
Інтенсивний розвиток молекулярної біології та створення досконалої методичної бази генетичних досліджень стали основою генетичної інженерії. В діагностиці виникло і бурхливо розвивається напрямок з визначення специфічних нуклеотидних послідовностей ДНК і РНК, так зване генне зондування. В основі подібних методик лежить здатність нуклеїнових кислот до гібридизації утворення дволанцюгових структур за рахунок взаємодії комплементарних нуклеотидів (АТ, ГЦ).
Для визначення послідовності ДНК (або РНК) спеціально створюється, так званий, зонд полінуклеотид з певною послідовністю підстав. До його складу вводять спеціальну мітку, що дозволяє ідентифікувати утворення комплексу.
Хоча генне зондування не можна зарахувати до методів імунохімічного аналізу, основний його принцип (взаємодія комплементарних структур) методично реалізується тими самими способами, як і індикаторні методи імунодіагностики. Крім того, методи генного зондування дозволяють заповнити інформацію про інфекційного агента без його фенотипної експресії (віруси, вбудовані в геном, «мовчі» гени).
Для проведення аналізу ДНК пробу піддають денатурації з метою отримання одноланцюгових структур, з якими і реагують молекули ДНК або РНК зонду. Для приготування зондів використовують різні ділянки ДНК (або РНК), виділені з природного джерела (наприклад, того чи іншого мікроорганізму), як правило представлені у вигляді генетичних послідовностей у складі векторних плазмід, або хімічно синтезовані олігонуклеотиди. У деяких випадках як зонд застосовують препарати геномної ДНК, гідролізованої на фрагменти, іноді препарати РНК, особливо часто рибосомальна РНК. Як мітки використовують ті ж індикатори, що і при різних видах імунохімічного аналізу: радіоактивні ізотопи, флуоресцеїни, біотоп (з подальшим проявом комплексом авідінфермент) і т.п.
Порядок проведення аналізу визначається властивостями наявного зонда
В даний час все частіше застосовуються комерційні набори, що містять усі необхідні інгредієнти.
У більшості випадків процедуру проведення аналізу можна розділити на наступні стадії: підготовка зразків (у тому числі екстракція та денатурація ДНК), фіксація проби на носії (найчастіше полімерний мембранний фільтр), передгібридизація, власне гібридизація, відмивання продуктів, що не зв'язалися, детекція. За відсутності стандартного препарату ДНК або РНК зонду попередньо проводиться його отримання та введення мітки.
Для підготовки проби може бути потрібне попереднє «підрощування» досліджуваного матеріалу для ідентифікації окремих колоній бактерій або збільшення концентрації вірусів у клітинній культурі. Проводиться та безпосередній аналіззразків сироватки крові, сечі, формених елементівкрові чи цільної крові на присутність інфекційного агента. Для звільнення нуклеїнових кислот зі складу клітинних структур проводять лізис клітин, а деяких випадках очищають препарат ДНК з допомогою фенолу.
Денатурація ДНК, тобто перехід її в одноланцюгову форму, відбувається при обробці лугом. Потім зразок нуклеїнових кислот фіксують на носії нітроцелюлезної або нейлонової мембрани, зазвичай шляхом інкубації від 10 хв до 4 год при 80 ° С у вакуумі. Далі в процесі передгібридизації досягається інактивація вільних місць зв'язування для зменшення неспецифічної взаємодії зонда з мембраною. Процес гібридизації займає від 2 до 20 год, залежно від концентрації ДНК у зразку, концентрації використовуваного зонда та його розміру.
Після закінчення гібридизації і відмивання незв'язаних продуктів проводиться детекція комплексу, що утворився. Якщо до складу зонда входить радіоактивна мітка, то прояви реакції мембрану експонують з фотоплівкою (ауторадиографія). Для інших тегів використовують відповідні процедури.
Найбільш перспективним є отримання нерадіоактивних (так званих холодних) зондів. На цій основі розвивається методика гібридизації, що дозволяє встановлювати наявність патогену в препаратах зрізів, пунктатів тканини, що особливо важливо при патоморфологічному аналізі (гібридизація insitu).
Істотним етапом у розвитку методів генного зондування стало використання полімеразної реакції ампліфікації (ПЛР). Цей підхід дозволяє збільшити концентрацію певної (заздалегідь відомої) послідовності ДНК у пробі з допомогою синтезу численних копій in vitro. Для проведення реакції до досліджуваного зразка ДНК додають препарат ферменту ДНК полімерази, надлишок дезоксинуклеотидів для синтезу і, так звані, праймери два типу олігонуклеотидів величиною 20 25 основ, відповідних кінцевим ділянкам послідовності ДНК, що цікавить. Один з праймерів повинен бути копією початку ділянки зчитування кодуючого ланцюга ДНК при напрямку зчитування 53, а другий копією протилежного кінця ланцюга, що не кодує. Тоді при кожному циклі полімеразної реакції відбувається подвоєння кількості ДНК копій.
Для здійснення зв'язування праймерів необхідна денатурація ДНК (плавлення) при 94°З подальшим доведенням суміші до 40°55°С.
Для проведення реакції сконструйовані програмовані інкубатори мікропроб, що дозволяють легко чергувати зміни температури оптимальної для кожного етапу реакції.
Реакція ампліфікації дозволяє суттєво підвищити чутливість аналізу при генному зондуванні, що особливо важливо за низької концентрації інфекційного агента.
Однією з істотних переваг генного зондування з ампліфікацією є можливість дослідження субмікроскопічної кількості патологічного матеріалу.
Іншою особливістю методу, важливішою для аналізу інфекційного матеріалу, є можливість виявлення прихованих генів, що мовчать. Методи, пов'язані з використанням генного зондування безумовно, ширше впроваджуватимуться у практику діагностики інфекційних захворювань у міру їх спрощення та здешевлення.
Методи ІФА та РІФ більшою мірою носять якісний або напівкількісний характер. При дуже низьких концентраціях компонентів утворення комплексу антиген антитіло не може бути зареєстроване ні візуально, ні простими інструментальними засобами. Індикація комплексу антиген антитіло в таких випадках може бути здійснена, якщо в один із вихідних компонентів антиген або антитіло ввести мітку, яку можна легко детектувати в концентраціях, порівнянних з визначається концентрацією аналізованої речовини.
Як мітки можуть використовуватися радіоактивні ізотопи (наприклад, 125I), флюоресцентні речовини, ферменти.
Залежно від використовуваної мітки розрізняють радіоімунний (РІА), флюоресцентний імунний (ФІА), імуноферментний (ІФА) методи аналізу та ін. Останніми рокамишироке практичне застосування отримав ІФА, що пов'язано з можливістю кількісних визначень, високої чутливості, специфічності та автоматизації обліку.
Імуноферментні методи аналізу – група методів, які дозволяють виявити комплекс антиген – антитіло за допомогою субстрату, який розщеплюється ферментом з появою забарвлення.
Суть методу полягає в поєднанні компонентів реакції антиген антитіло з вимірюваною ферментною міткою. Антиген або антитіло, що вступають у реакцію, мітяться ферментом. По перетворенню субстрату під дією ферменту можна судити про кількість компоненту реакції антиген, що вступив у взаємодію, антитіло. Фермент у даному випадкуслужить маркером імунної реакціїі дозволяє спостерігати її візуально чи інструментально.
Ферменти є дуже зручними мітками, оскільки їх каталітичні властивості дозволяють їм діяти як підсилювачі, оскільки одна молекула ферменту може сприяти утворенню більше 1?105 молекул продукту каталітичної реакції за хвилину. Необхідно підібрати такий фермент, який довго зберігає свою каталітичну активність, не втрачає її при зв'язуванні з антигеном або антитілом, і має високу специфічність по відношенню до субстрату.
Основні способи отримання антитіл або антигенів, мічених ферментом, кон'югатів: хімічні, імунологічні та генно-інженерні. Для постановки ІФА найчастіше використовуються ферменти: пероксидаза хрону, лужна фосфатаза, галактозидаза та ін.
Для виявлення активності ферменту в комплексі антиген антитіло з метою візуального та інструментального обліку реакції використовують хромогенні субстрати, розчини яких, спочатку безбарвні, в процесі ферментативної реакції набувають забарвлення, інтенсивність якого пропорційна кількості ферменту. Так, для виявлення активності пероксидази хрону в твердофазному ІФА як субстрат використовують 5аміносаліцилову кислоту, що дає інтенсивне коричневе фарбування, ортофенілендіамін, що утворює оранжево-жовте фарбування. Для виявлення активності лужної фосфатази та ¦галатозидази використовують нітрофенілфосфати та нітрофенілгалактозиди відповідно.
Результат реакції при утворенні забарвленого продукту визначають візуально або за допомогою спектрофотометра, що вимірює поглинання світла певною довжиною хвилі.
Відомо багато варіантів постановки ІФА. Розрізняють гомогенний та гетерогенний варіанти.
За методикою постановки розрізняють конкурентний та неконкурентний методи ІФА. Якщо на першій стадії в системі присутні тільки аналізована сполука і відповідні центри зв'язування (антиген і специфічні антитіла), то метод є неконкурентним. Якщо на першій стадії присутні аналізована сполука (антиген) та її аналог (мічений ферментом антиген), які конкурують між собою за зв'язування з наявними в нестачі центрами специфічного зв'язування (антитілами), то метод є конкурентним. У цьому випадку чим більше досліджуваного антигену містить розчин, тим менше кількість мічених антигенів, що зв'язуються.
МЕТОД ФЛЮОРЕСЦІЙНИХ АНТИТЕЛ (МФА) або РЕАКЦІЇ ІМУНОФЛЮОРЕСЦЕНЦІЇ (РІФ)
Імунофлюоресцентний метод є методом вибору для швидкого виявлення та ідентифікації невідомого мікроорганізму в досліджуваному матеріалі.
Аг + АТ + електроліт = комплекс, що світиться в УФ, променях
Мікроб сироватка, мічена флюорохромом
Часто використовують барвник ізотіоціонат флюоресціїна ФІТЦ
Під час дослідження цим методом використовують люмінесцентний мікроскоп.
Постановка РІФ
На мазок наносять 30 мкл розчину ФІТЦ помічених антитіл.
Поміщають скло у вологу камеру і витримують при кімнатній температурі протягом 2025 хв, або в термостаті при 37°С протягом 15 хв.
Промивають скло у проточній водопровідній воді 2 хв, обполіскують дистильованою водою та висушують на повітрі.
На висушений мазок наносять краплю рідини, що монтує, мазок накривають покривним склом і мікроскопують з використанням люмінесцентного мікроскопа або люмінесцентної насадки до звичайного оптичного мікроскопа.
