Реакція аглютинації (Від лат. agglutinatio- склеювання) - склеювання корпускул (бактерій, еритроцитів та ін) антитілами в присутності електролітів.
Реакція аглютинаціїпроявляється у вигляді пластівців або осаду, що складаються з корпускул (наприклад, бактерій), «склеєних» антитілами (рис. 7.37). Реакцію аглютинації використовують для: визначення збудника, виділеного від хворого; визначення антитіл у сироватці крові хворого; визначення груп крові
Мал. 7.37 а,б. Реакція аглютинації зIgM-антитілами (а) таIgG-антитілами (б)
1. Визначення збудника, виділеного від хворого Орієнтовна реакціяаглютинації на склі (рис. 7.38) До краплі аглютинуючої сироватки (розведення 1:20) додають завись бактерій, виділених від хворого. Утворюється пластовий осад.
Мал. 7.38.
Розгорнута реакція аглютинації із збудником, виділеним від хворого (рис. 7.39). До розведень аглютинуючої сироватки додають завись бактерій, виділених від хворого.
Мал. 52
2. Визначення антитіл у сироватці крові хворого
Розгорнута реакція аглютинації із сироваткою крові хворого (рис. 7.39). До розведення сироватки хворого додають діагностикум.
- Аглютинація з О-діагностикумом (бактерії, вбиті нагріванням, що зберегли 0-антиген) відбувається у вигляді дрібнозернистої аглютинації.
- Аглютинація з Н-діагностикумом (бактерії, вбиті формаліном, що зберегли джгутиковий Н-антиген) - великобавовняна і протікає швидше.
3. Реакція аглютинації для визначення груп кровіРеакцію аглютинації для визначення груп крові застосовують для встановлення системи АВО (табл. б) за допомогою аглютинації еритроцитів антитілами імунної сироватки проти антигенів груп крові А(І), В(ІІІ). Контролем служать: сироватка, яка містить антитіл, тобто. сироватка АВ(IV) групи крові; антигени, що містяться в еритроцитах груп А (ІІ), В (ІІІ). Негативний контроль не містить антигенів, тобто використовують еритроцити групи (I).
Таблиця 7.6. Визначення груп крові АВО
| Результати реакції |
Групова |
|
|
приналежність |
||
|
досліджуваної |
||
|
еритроцитів зі |
сироватки (плазми) |
|
|
стандартними |
зі стандартними |
|
|
сироватками | ||
Розгорнута реакція аглютинації (РА). Для визначення AT у сироватці крові хворого ставлять розгорнуту реакцію аглютинації (РА). Для цього до серії розведень сироватки крові додають діагностикум - завись убитих мікроорганізмів або частинки з сорбованими Аг. Максимальне розведення, що дає аглютинаціюАг, називають титром сироватки крові.
Різновиди реакції аглютинації (РА) для виявлення AT - кров'яно-краплинна проба на туляремію (з нанесенням діагностикуму на краплю крові та появою видимих білястих аглютинатів) та реакція Хаддльсона на бруцельоз (з нанесенням на краплю сироватки крові діагностикуму, пофарбованого генціановим фіолетовим).
Орієнтовна реакція аглютинації (РА)
Для ідентифікації виділених мікроорганізмів ставлять орієнтовну РА на предметних стеклах. Для цього до краплі стандартної діагностичної антисироватки (у розведенні 1:10, 1:20) додають культуру збудника. При позитивному результатіставлять розгорнуту реакцію з розведеннями антисироватки, що збільшуються.
Реакціювважають позитивною, якщо аглютинацію спостерігають у розведеннях, близьких до титру діагностичної сироватки.
О-Аг. Соматичні О-Агтермостабільні та витримують кип'ятіння протягом 2 год. При взаємодії з AT утворюють дрібнозернисті агрегати.
Н-Аг. Н-Аг (джгутикові)термолабільні та швидко руйнуються при 100 °С, а також під дією етанолу. У реакціях з Н-антисироваткою через 2 години інкубації утворюють пухкі великі пластівці (утворені бактеріями, джгутиками, що склеїлися).
Vi-Arчеревнотифозних бактерій щодо термостабілен (витримує температуру 60-62 ° С протягом 2 год); при інкубації з Vi-антисироваткою утворюється дрібнозернистий аглютинат.
Реакції прямої гемаглютинації
Найпростіша з подібних реакцій - аглютинаціяеритроцитів, або гемаглютинація, що застосовується визначення груп крові в системі AB0. Для визначення аглютинації(або її відсутності) використовують стандартні антисироватки з анти-А та анти-В-аглютинінами. Реакція називається прямою, тому що досліджувані Аг – природні компоненти еритроцитів.
Загальні з прямою гемаглютинацієюмеханізми має вірусна гемаглютинація. Багато вірусів здатні спонтанно аглютинувати еритроцити птахів та ссавців, їх додавання до суспензії еритроцитів викликає утворення агрегатів із них.
Аглютинації реакція Аглютинації реакція
(РА) - спосіб виявлення та кількісного визначенняАг і Ат, заснований на їхній здатності до утворення видимих неозброєним оком агломератів. У д-ці інфекцій. хвороб або в ін. цілях застосовується для ідентифікації невідомих мікробів і клітин, для визначення присутності та кількості Ат в с-ці крові та ін рідинах. Принцип визначення заснований на специфічності взаємодії Аг та Ат і полягає у знаходженні відомого за невідомим. Існує багато варіантів РА: кількісні та якісні, пробіркові та на склі, об'ємні та крапельні, звичайні, прискорені та експрес-методи. Для постановки РА потрібні: 1) с-ка крові.У варіанті з визначенням виду (вара) бактерій використовують виробничі аглютинуючі с-ки, що виготовляються шляхом імунізації кроликів. У варіанті з визначенням виду Ат беруть с-ку крові, що отримується від ісл. людей чи тварин. С-ка має бути стерильною і не містити зважених частинок. Готують основне розведення на фіз-розчині. Воно має бути в 2 -4 рази нижче за діагностичний титр при даному захворюванні; 2) Аг.У варіанті реакції з визначенням типу Ат використовують виробничі діагностикуми; у варіанті з визначенням Аг діагностикуми готують самі у вигляді 1 -3-мільярдної суспензії на фізрозчині 18-20-годинний агарової (рідше бульйонної) к-ри ісл. мікроба, інактивованої прогріванням на водяній бані при 70°С протягом 1 години або 24-годинної інкубацією при 37°С з формаліном (кінцева концентрація 0,2%); 3) електроліт у вигляді фізрозчину.Техніка постановки об'ємної серійної пробірковоїРА визначення титру Ат в с-ке: з основного розведення с-ки готують кілька рядів робочих розведенні. Число рядів залежить від кількості взятих у досвід діагностикумів, число та фактори розведення визначаються діагностичним титром передбачуваного захворювання. У ряді щонайменше повинні бути розведення, що відповідає діагностичному титру Ат, два розведення нижче і два розведення вище за нього. напр., якщо діагностичний титр дорівнює 1:100, то при об'ємному способі постановки РА повинні бути приготовлені наступні розведення с-ки: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; при краплинному методі перше розведення (1:25) не потрібне, зате необхідне ще одне вище розведення - 1:800. наукових дослідженняхс-ку титрують до негативної реакції. Розводять її наступним чином: у всі дослідні пробірки, крім 1-ї, наливають по 0,25 мл фізрозчину при постановці реакції в обсязі 0,5 мл і 0,5 мл при постановці реакції в об'ємі 1 мл. У 1-у та 2-ю пробірки вливають по 0,25 (0,5) мл основного розведення с-ки, з 2-ї пробірки, в до-рой об'єм і розведення с-доі збільшилися в 2 рази, 0,25 (0,5) мл переносять в 3-ю, з 3-ї в 4-ю і т.д. до останньої, з якої 0,25 (0,5) мл для врівноваження обсягів виливають у всі. Кожне розведення с-ки здійснюють за допомогою окремої піпетки. Якщо в досвід беруть кілька діагностикумів, то для кожного з них готують таким самим способом свій ряд розведенні. У кожне розведення с-ки доливають діагностикум в об'ємі, що дорівнює об'єму с-ки, у результаті розведення в кожній пробірці збільшується в 2 рази. Досвіду відповідають контроль с-ки (0,25 -0,5 мл основного розведення с-ки та стільки ж фізрозчину) та контроль Аг (0,25 - 0,5 мл діагностикуму та стільки ж фізрозчину). Якщо досвід беруть кілька діагностикумів, то кожному відповідає свій контроль Аг. Штатив з пробірками добре струшують і поміщають у термостат при 37°С на 4 години, а потім залишають при кімнатній температурі до наступного дня, після чого проводять облік РА, ґрунтуючись на кількості осаду та ступеня просвітлення рідини. Визначення цих показників, залежно від характеру аглютинатів, здійснюють неозброєним оком на темному тлі, в аглютиноскопі або над увігнутою поверхнею дзеркала від мікроскопа. Облік починають з контролів: контроль с-ки має бути прозорим, Аг - рівномірно каламутним (після струшування пробірки). Якщо контролі хороші, встановлюють наявність і ступінь аглютинації у всіх досвідчених пробірках, які позначають плюсами: великий осад і повне просвітлення рідини - 4 плюси; великий осад та неповне просвітлення рідини -3 плюси; помітний осад і помітне просвітлення рідини-2 плюси. Після цього визначають титр: найбільше розведення з аглютинації інтенсивністю не менше 2 плюсів. Титр досл. с-ки порівнюють із діагностичним титром при цьому захворювання. Якщо титр досл. с-ки вдвічі нижче діагностичного, реакцію оцінюють як сумнівну; якщо титр дорівнює діагностичного -якслабопозитивну; якщо у 2-4 рази вище його-як позитивну, якщо у 8 і більше разів вище - як різко позитивну. При широкому поширенні Ату здорових людейз метою оцінки РА застосовують наростання титру Ат. Для визначення виду Аг у серійній РА число рядів має відповідати числу взятих для ідентифікації діагностичних с-до. З основного розведення діагностичної с-ки готують ряд послідовних дворазових розведенні таким же способом, як і в РА для визначення титру Ат. Фактори розведення залежать від титру аглютинуючої с-ки У досвіді необхідна присутність розведення, рівного титру с-ки, а також у 2, 4, 6, 8 разів нижче його напр., якщо титр діагностичної с-ки дорівнює 1 3200, то слід використовувати розведення 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 До розведень с-ки доливають такий же обсяг ісл Аг, в результаті розведення с-к збільшується в 2 рази До досвіду ставлять 2 контролю с-ки та Аг Якщо у досвіді бере участь кілька с-к, то до кожної з них потрібен свій контроль. Після завершення реакції штатив енергійно струшують і поміщають у термостат при 37°С. Результати враховують, як описано вище Оцінка реакції має особливості Для того щоб зробити висновок про відповідність ісл. Аг взятої в досвід с-ке, титр реакції повинен відповідати не менше половині титру стандартної діагностичної с-ки Титри 14 і нижче розглядають як групову реакцію Краплинний дпостановки РА відрізняється від об'ємного тим, що с-ку розводять в об'ємі 1 мл, Аг застосовують у вищій концентрації (10 млрд/мл) і додають його по 1 мл - 2 краплі в пробірку Розведення с-ки після внесення Аг вважають незміненим В іншому методика постановки, обліку та оцінки аналогічна об'ємному методу
(Джерело: «Словник термінів мікробіології»)
ІМУНОМІКРОБІОЛОГІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
Імунологічні методи застосовують для вирішення багатьох завдань:
1. Оцінка стану імунної системилюдини ( імунного статусу) з визначення кількісних і функціональних характеристикклітин імунної системи та їх продуктів.
2. Визначення складу та характеристик тканин людини: груп крові, резус фактора, трансплантаційних антигенів.
3. Діагностика інфекційних хвороб та резистентності до них щодо виявлення та встановлення титрів антитіл (серодіагностика), виявлення антигенів збудників в організмі, визначення клітинних реакцій на ці антигени.
4. Сероідентифікація культур бактерій та вірусів, виділених з організму людини та тварин.
5. Виявлення в організмі людини та зовнішньому середовищібудь-яких речовин, які мають антигенні або гаптенні властивості (гормони, ферменти, отрути, ліки, наркотики і т.п.).
6. Виявлення імунопатологічних станів, алергій, трансплантаційних та протипухлинних реакцій.
Процес взаємодії антигену та антитіла в серологічних реакціяхпротікає у дві фази:
1) специфічна- фаза взаємодії, у якій відбувається комплементарне з'єднання активних центрів антитіл (паратопів) та епітопів антигену. Зазвичай ця фаза триває кілька секунд чи хвилин;
2) неспецифічна- фаза прояву, що характеризується зовнішніми ознакамиутворення імунних комплексів Ця фаза може розвиватися від кількох хвилин до кількох годин.
Оптимальна специфічна взаємодія антитіл з антигеном відбувається в ізотонічному розчині з рН, близьким до нейтрального. Реакція антиген-антитіло в системі in vitro може супроводжуватися виникненням кількох феноменів
· аглютинації,
· Преципітації,
· Лізісу.
Зовнішні проявиреакції залежать від фізико-хімічних властивостей антигену (розмір частинок, фізичний стан), класу та виду антитіл (повні та неповні), а також умов досвіду (консистенція середовища, концентрація солей, рН, температура).
Полівалентність антигенів та антитіл забезпечує виникнення видимих неозброєним оком агрегатів. Це відбувається відповідно до теорії освіти мереж, згідно з якою до комплексу, що утворився антиген-антитіло послідовно приєднуються інші молекули антитіл і антигену. В результаті формуються мережеві структури, які перетворюються на агрегати, що випадають в осад. Характер і вираженість реакції залежить від кількісного співвідношення антигенів і антитіл. Найбільш інтенсивно реакції проявляються у тому випадку, якщо реагенти перебувають у еквівалентному співвідношенні.
Необхідна умоваутворення решітки (мереж) - наявність більше трьох антигенних детермінантів на кожну молекулу антигену та по два активні центри на кожну молекулу антитіла. Молекули антигену є вузлами ґрат, а молекули антитіл - сполучними ланками. Область оптимальних співвідношень (зона еквівалентності) концентрацій антигену та антитіл, коли в надосадовій рідині після утворення осаду не виявляються ні вільні антигени, ні вільні антитіла.
Агрегати, здатні випадати в осад, утворюються при з'єднанні антигенів з антитілами. Неповні антитіла(моновалентні) не викликають утворення мережевих структур та великих агрегатів. Для виявлення таких антитіл використовують спеціальні методизасновані на використанні антиглобулінів (реакцію Кумбса)
Серологічні реакції, завдяки високій специфічності та чутливості, застосовують для виявлення та кількісного визначення антигенів та антитіл. Кількість імунореагентів у реакціях виражають титром – максимальним розведенням сироватки або антигену, при якому ще спостерігається реакція.
Серологічні реакції в мікробіологічних та імунологічних лабораторіях використовують у двох цілях:
1) для сероідентифікації мікроорганізмів, токсинів, антигену взагалі за допомогою відомого антитіла (імунної діагностичної сироватки),
2) для серодіагностики – визначення природи антитіла у сироватці крові хворого при бактеріальних, вірусних, рідше інших інфекційних захворюваннях за допомогою відомого антигену (діагностикуму).
Для визначення родової, видової та типової приналежності антигену необхідні свідомо відомі імунні діагностичні сироватки. Їх отримують шляхом багаторазового введення тваринам (частіше за кроликів) у наростаючих дозах вбитих або живих мікроорганізмів, продуктів їх розпаду, знешкоджених або нативних токсинів. Після певного циклу імунізації тварин роблять масивне кровопускання або тотальне знекровлення тварини. Кров, зібрану в стерильну посуд, спочатку поміщають у термостат за нормальної температури 37°З 4 - 6 год на прискорення згортання, потім - в льодовик на добу. Отриману прозору сироватку відсмоктують у стерильний посуд, додають консерванти, визначають титр антитіл, перевіряють на стерильність та розливають у ампули.
Використовуються неадсорбованіі адсорбованідіагностичні сироватки Неадсорбовані сироватки мають високими титрамиантитіл, але здатні давати групові (перехресні) реакції.
Адсорбовані сироватки відрізняються строгою специфічністю дії (реагують лише з гомологічним антигеном). Сироватки, що містять антитіла тільки одного певного антигену називаються монорецепторними.
Випускають також сироватки, мічені флюорохромами, ферментами, радіоізотопами, які дають змогу з високим ступенем точності виявити навіть сліди антигену.
Як антигени (діагностикуми) в серологічних реакціях застосовують суспензії живих або вбитих бактерій, продуктів їх розщеплення, токсини, віруси. У ряді випадків використовують екстракти або виділені хімічним шляхом антигени з мікроорганізмів та тканин тварин.
Усі імуномікробіологічні методи можна розділити на 3 групи:
1) засновані на прямій взаємодії антигену з антитілом(феномени аглютинації, преципітації, гемаглютинації, іммобілізації та ін.);
2) засновані на опосередкованій взаємодії антигену з антитілом(реакції непрямої гемаглютинації, коаглютинації, латекс-аглютинації, вугільної аггломерації, бентоніт-аглютинації, зв'язування комплементу та ін);
3) з використанням мічених антитіл або антигенів(метод флюоресціюючих антитіл, імуноферментний та радіоімунний аналізи та інші методи).
РЕАКЦІЇ АГГЛЮТИНАЦІЇ
У цих реакціях беруть участь антигени у вигляді частинок (мікробні клітини, еритроцити та інші корпускулярні антигени), які склеюються антитілами та випадають у осад.
Для постановки реакції аглютинації(РА) необхідні три компоненти: 1) антиген (аглютиноген);
2) антитіло (аглютинін)
3) електроліт (ізотонічний розчин хлориду натрію).
Орієнтовна реакція аглютинації (РА)
Орієнтовна або пластинчаста РА ставиться на предметному склі при кімнатній температурі. Для цього пастерівською піпеткою на скло наносять окремо краплю сироватки в розведенні 1:10 - 1:20 та контрольну краплю ізотонічного розчину натрію хлориду. У ту і іншу бактеріологічну петлю вносять колонії або добову культуру бактерій (краплю діагностикуму) і ретельно перемішують їх. Реакції враховують за кілька хвилин візуально, іноді за допомогою лупи (х5). При позитивній РА у краплі із сироваткою відзначають появу великих і дрібних пластівців, при негативній – сироватка залишається рівномірно каламутною.
Розгорнута реакція аглютинаціїз метою виявлення титру специфічних антитіл у хворого.
Розгорнута РА для серодиагностики ставиться у сироватці хворих. Її розводять і ізотонічному розчині натрію хлориду від 1:50 - 1:100 до 1:800 або 1: 1600. Так як у нижчих титрах сироватки можуть перебувати нормальні аглютиніни, що є у здорових людей або хворих з іншим діагнозом (діагностичний ти. Як антиген у цій реакції використовують діагностикуми - свідомо відомі суспензії, як правило, убитих бактерій.
В аглютинаційні пробірки попередньо розливають по 1 мл ізотонічного розчину хлориду натрію. У першу з них доливають 1 мл сироватки, розведеної 1:100, змішавши її, 1 мл переносять у другу, з другої - в третю і т.д. В отримані дворазові розведення сироваток (від 1:100 до 1:1600 і більше) вносять по 1-2 краплі суспензії бактерій, що містить 3 млрд. мікробних тіл в 1 мл. Пробірки струшують і поміщають у термостат при 37°З 2 години, потім витримують добу при кімнатній температурі.
Облік реакції розгорнутої аглютинації роблять, оцінюючи послідовно кожну пробірку, починаючи з контрольних, при обережному струшуванні. У контрольних пробірках аглютинації не повинно бути. Інтенсивність реакції аглютинації відзначають такими знаками: ++++ - повна аглютинація (пластівки аглютинату в абсолютній прозорій рідині); +++ - неповна аглютинація (пластівки у слабоопалесцирующей рідини); ++ - часткова аглютинація (пластівці чітко помітні, рідина злегка каламутна); + - слабка, сумнівна аглютинація - рідина дуже каламутна, пластівці в ній погано помітні; - - відсутність аглютинації (рідина рівномірно каламутна).
За титр сироватки приймають останнє її розведення, в якому інтенсивність аглютинації оцінюється не менш як два плюси (++)
Лекція №16
Словник
НЕПОСЕРЕДНИЙ -прямо наступний без чогось, без наступних ланок.
ПОПЕРЕДЖЕНО- Через інші клітини, не прямо.
ЗНИЖУВАТИ ≠ ЗБІЛЬШУВАТИ (активність клітин).
Зторгнути –не прийняти, відкинути. Організм відкинув трансплантований орган.
Реакція імунітету.
Реакції імунітету – це реакції специфічної взаємодії (зв'язування) антигену та антитіла або антигену та сенсибілізованого Т-лімфоциту.
Ці реакції протікають in vitro (у пробірці) та in vivo (у живому організмі).
У цих реакціях бере участь сироватка (serum), тому вони називаються серологічні.
Реакції імунітету використовуються для діагностики інфекційних захворюваньПри цьому невідомий компонент визначається за відомим компонентом, що засноване на специфічності взаємодії антигену з антитілом. Якщо відомо антитіло, то можна виявити (виявити) невідомий антиген. Якщо ж відомий антиген, то по ньому можна виявити невідомі антитіла.
Таким чином, реакції імунітету використовуються:
1) для серологічної діагностики(серодіагностики) захворювань -виявлення у сироватці крові хворих людей антитіл до певного збудника інфекційного захворювання (відомого антигену); якщо в сироватці крові хворої людини присутні антитіла до будь-якого збудника, то саме цей збудник і викликав це інфекційне захворювання;
2) для серологічної ідентифікації (сероідентифікації) мікробів -для встановлення виду збудника захворювання за допомогою імунних діагностичних сироваток (відомих антитіл); якщо антитіла пов'язують збудника, виділеного від хворої людини, цей мікроб ідентичний тому, яким імунізували тварини при отриманніімунної діагностичної сироватки .
Реакції імунітету протікають у 2 фази:
1) специфічна фаза- поєднання активного центру антитіла з детермінантною групою антигену з утворенням комплексів антиген-антитіло; ця фаза протікає швидко, але немає видимого ефекту;
2) неспецифічна фаза- Поява видимого ефектувзаємодії антигену та антитіла – випадання осаду(аглютинація) або помутніння(преципітація), що дозволяє побачитиосвіта комплексів антиген-антитілоі зробити висновок про відповідноантигену та антитіла один одному.
До реакцій імунітету відносяться реакція аглютинації (РА), реакція преципітації (РП), реакція зв'язування комплементу (РЗК).
Реакція аглютинації- це склеювання та випадання в осад мікробних або інших клітин (еритроцитів) під дією антитіл у присутності електроліту. Видимий ефект реакції (феномен аглютинації) – утворення осаду, що називається аглютинатом.
Цю реакцію використовують для серодіагностикиі сероідентифікації. РА використовують для серодіагностики (виявлення антитіл у сироватці крові хворих) черевного тифута паратифа(Реакція Відаля), бруцельозу(Реакція Райта), туляремії та лептоспірозу. РА використовують для сероідентифікації (визначення виду збудника, виділеного від хворого) при кишкових інфекціях, коклюші, холеріта ін.
Компонентиреакції:
1. А нтиген (аглютиноген) -це цілі (не зруйновані) мікробні або інші клітини ( корпускулярний, нерозчинний антиген). Аглютиногени– це завись живихабо вбитихмікробних клітин або інших клітин. Антигени можуть бути як невідомими, і відомими. Невідомий аглютиноген - це мікробна культура, виділена з організму хворого, яку необхідно визначити. Відомий антиген - діагностикум- діагностичний препарат - завись убитихмікробів відомого видуу фізіологічному розчині. Ця завись каламутна (непрозора)), т.к. мікробні клітини не розчиняються, а залишаються цілими. Відомий аглютиноген використовуватиметься для виявлення невідомих антитіл у сироватці крові хворих.
2. Антитіло (аглютинін)– перебуває у сироватці крові. Антитіла можуть бути як невідомими, так і відомими. Невідомі антитіла, які потрібно визначити, перебувають у сироватці крові хворої людини. Відомі антитіла знаходяться в імунних діагностичних сироваткахякі називаються аглютинуючими сироватками. Вони застосовуються для сероідентифікації, тобто. визначення невідомого антигену – виду мікробної культури.
3. Електроліт- 0,9% розчин хлориду натрію.
Отримання діагностикуму.
Вирощену на скошеному агарі чисту культуру збудника відомого виду (наприклад, збудника черевного тифу) змивають 3-4 мл ізотонічного розчину, поміщають у стерильну пробірку, яким-небудь способом вбивають мікроби (наприклад, кип'ятінням і визначають густоту (має бути 3 млрд. мікробних клітин) в 1 мл) Якщо мікробні клітини вбивають високою температурою, Отримують О-діагностикум (О-антиген), якщо ж її обробляють формаліном, то отримують Н-діагностикум (Н-антиген).
Приклади діагностикумів: сальмонельозний діагностикум, бруцельозний діагностикум, туляремійний діагностикум.
Отримання аглютинуючих сироваток.
Тваринам (частіше кроликам) 5 – 7 разів через проміжки часу парентерально вводять у дозах, що зростають, мікробні діагностикуми ( проводять гіперімунізацію)а потім у них відбирають сироватку крові, в якій містяться антитіла до тих мікробів, з яких приготовлений діагностикум. Якщо імунізацію проводять О-діагностикумом, то одержують О-аглютинуючі сироватки (містять О-антитіла), якщо Н-діагностикумом – Н-аглютинуючі сироватки.
Аглютинуючі сироватки можуть бути неадсорбованимиабо нативними та адсорбованими.
Неадсорбовані сироваткимістять групові антитіла до декількох близьких видів мікробів.
Адсорбовані сироваткимістять антитіла до одного чи кількох антигенів одного виду мікроба. Якщо сироватки містять антитіла тільки одного антигену, вони називаються монорецепторнимиабо моновалентними,якщо до кількох антигенів – груповимиадсорбованими сироватками .
Приклади аглютинуючих сироваток:сальмонельозна монорецепторна Н-аглютинуюча сироватка, сальмонельозна групова адсорбована О-аглютинуюча сироватка, протихолерна О-аглютинуюча сироватка та ін..
Титраглютинуючої сироватки – найбільше розведення сироватки, при якому ще виявляється реакція аглютинації з антигеном (титр залежить від кількості антитіл у крові: чим більше антитіл, тим вищий титр сироватки).
Методи постановки РА.
1. Орієнтовна (пластинчаста) РА- Проводиться на склі. На предметне скло наносять 2 краплі сироватки та 1 краплю ізотонічного розчину. В одну з крапель сироватки і краплю ізотонічного розчину петлею вносять мікробну культуру і перемішують. Крапля ізотонічного розчину з мікробами – контроль антигену, крапля сироватки без мікробів – контроль антитіла, крапля сироватки з мікробами – досвід.Якщо в сироватці є антитіла, що відповідають мікробним антигенам, які з нею змішуються, то антитіла та антигени специфічно зв'язуватимуться один з одним і через 1 – 3 хв у дослідній краплі з'являться пластівці аглютинату. Контроль антигену має бути каламутним, а контроль антитіла – прозорим. Облік результатів реакції проводиться за появою пластівців аглютинату . Якщо випадають пластівці – реакція позитивна, тобто. антиген відповідає антитілу і антигеном можна визначити антитіло або навпаки. Якщо залишається помутніння – негативна реакція.
2. Розгорнута реакція аглютинації –проводиться у пробірках. Спочатку готують 2-разові розведення сироватки крові хворої людини від 1:50 до 1:1600. У 6 пробірок наливають по 1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. У першу пробірку вносять 1 мл сироватки крові хворого у розведенні 1:50, перемішують і одержують розведення 1:100, потім 1 мл розведення 1:100 переносять у другу пробірку та одержують розведення 1:200 і т.д. Дві пробірки залишають для контролю антигену та сироватки. У контроль сироватки додають тільки сироватку в розведенні 1:50, контроль антигену - тільки антиген. У решту всіх пробірок додають 0,1 мл антигену - діагностикуму (Про- або Н-) і ставлять всі пробірки в термостат при 37°С на 18-20 годин. Облік результатів реакції проводять за характером, кількістю осаду, що утворився (аглютинату) і ступеня каламутності. Облік проводять лише за наступних результатів у контролю: контроль сироватки – прозорий, контроль антигену – каламутний. О-антитіла дають дрібнозернистий осад. Н-антитіла – крупнозернистий. По останній пробірці, в якій ще видно реакцію аглютинації, встановлюють діагностичний титр.
При серодіагностицізахворювань важливо непросто виявити специфічні антитіла до певного збудника, а й виявити їх кількість, тобто. встановити такий титр антитіл, доколи можна говорити про наявність захворювання, викликаного цим збудником . Цей титр називається діагностичним титром.Наприклад, для діагностики черевного тифу потрібно виявити титр антитіл – 1:400, але не менше. Ще більш точні результати дає виявлення наростання антитіл у парних сироватках.Сироватку хворого відбирають на початку захворювання та через 3 – 5 або більше днів. Якщо титр антитіл зростає не менше, ніж у 4 рази, отже, можна говорити про поточному захворюванні.
Якщо розгорнута реакція аглютинації ставиться для сероідентифікації, то використовують діагностичні аглютинірующие сироватки, розведені до титру або до половини їх титру. РА вважається позитивною, якщо аглютинація виявляється у розведенні, близькому до титру діагностичної сироватки.
