Реакція аглютинації (РА) - це склеювання та випадання в осад мікробів або інших клітин під дією антитіл у присутності електроліту. Осад, що утворився, називають аглютинатом.
РА використовують:
1. Для виявлення антитіл у сироватці крові хворого (серодіагностика).
2. Для визначення виду та серовару виділеної від хворого чистої культури патогенних мікроорганізмів (серотипування).
Реакцію аглютинації використовують для визначення антитіл у сироватці крові хворих, наприклад, при черевному тифі та паратифах (реакція Відаля), бруцельозі (реакції Райта, Хеддлсона), туляремії, лептоспірозах та інших інфекційних хвороб, а також для визначення виділеного від хворого збудника (кишкові інфекції, кашлюк та ін). РА застосовується визначення груп крові, резус - чинника та інших.
Для реакції необхідні такі компоненти:
1. Антиген (аглютиноген) повинен бути корпускулярним, тобто це завись живих або вбитих мікроорганізмів (діагностику м), еритроцитів або інших клітин. Зазвичай використовують добову культуру мікроорганізмів, вирощену на скошеному агарі. Культуру змивають 3 - 4 мл ізотонічного розчину, переносять у стерильну пробірку, визначають густину. Завис має бути гомогенною і містити до 3 млрд. мікробних клітин в 1 мл. Застосування суспензії вбитих мікробів - діагностикумів - полегшує роботу (готуються з виробництва).
2. Антитіла (аглютиніни) знаходяться у сироватці хворого (при серодіагностиці) або в аглютинуючій сироватці (при серотипуванні). Аглютинуючі сироватки отримують шляхом імунізації кроликів убитими бактеріями.
Титром аглютинуючоюсироватки називається найбільше її розведення, в якому не реагує з відповідним антигеном в певних умовах досвіду.
Аглютинуючі сироватки можуть бути нативними (неадсорбованими) та адсорбованими. Нативні сироватки в невеликих розведеннях взаємодіють не тільки з тим видом мікроорганізмів, яким імунізували тварину для отримання сироватки, але і з спорідненими видами мікроорганізмів, тому що в них є групові антитіла (антитіла до мікроорганізмів, що мають загальні антигени). Нативні сироватки використовуються для розгорнутої реакції аглютинації (при серодіагностиці), де враховується як наявність реакції, а й динаміка наростання титру антитіл.
Якщо з нативної сироватки витягти (адсорбувати) групові антитіла шляхом взаємодії з родинними бактеріями, що мають групові антигени, виходять адсорбовані сироватки. Адсорбовані сироватки можуть бути монорецепторними (або типоспецифічними), що містять антитіла тільки до одного антигенного рецептора. Полівалентні сироватки складаються із суміші декількох адсорбованих або неадсорбованих сироваток. Адсорбовані сироватки використовують для реакції аглютинації на склі.
При імунізації тварин рухомими бактеріями з Н-антигеном отримують Н-аглютинуючі сироватки, що містять Н-антитіла (наприклад, сальмонельозна монорецепторна Н-аглютинуюча сироватка). Імунізацією О-антигеном отримують О-аглютинуючі сироватки, що містять О-антитіла, (наприклад, сальмонельозна групова адсорбована О-аглютинуюча сироватка, протихолерна О-аглютинуюча сироватка). Імунізацією Н- та О-антигенами отримують сироватки з Н- та О-антитілами.
Причому О-аглютинини дають дрібнозернистий аглютинат, а Н-аглютиніни - бавовняний осад.
3. Електроліт – ізотонічний розчин NaCl (0,9 % розчин хлориду натрію, приготовлений на дистильованій воді).
Існує два основних методи постановки реакції аглютинації: реакція на склі (іноді її називають орієнтовною або пластинчастою) та розгорнута реакція (у пробірках)
Постановка реакції аглютинації на склі. На знежирене предметне скло наносять дві краплі сироватки та краплю ізотонічного розчину хлориду натрію. Діагностична аглютинуюча сироватка береться в одному розведенні, яке в залежності від її титру становить 1:10, 1:25, 1:50 або 1:100. В одну з крапель сироватки і краплю ізотонічного розчину петлею вносять культуру мікроорганізму, що досліджується, і ретельно перемішують. Крапля хлориду натрію з мікроорганізмами – контроль антигену, крапля сироватки без мікроорганізмів – контроль сироватки. Не можна переносити культуру з краплі із сироваткою до краплі з NaCl. Реакція протікає за кімнатної температури протягом 1-3 хв. Якщо контроль сироватки залишається прозорим, у контролі антигену спостерігається рівномірне помутніння, а краплі, де культура змішана з сироваткою, з'являються пластівці аглютинату, то результат вважають позитивним. Якщо краплі з сироваткою і антигеном рівномірне помутніння, це негативний результат. Реакція виразніше видно на темному тлі.
Сироватка
1. контроль антигену
2. контроль сироватки
13.1. Реакції антиген-антитіло та їх застосування
При введенні антигену організмі утворюються антитіла. Антитіла комплементарні антигену, що викликав їхній синтез, і здатні з ним зв'язуватися. Зв'язування антигенів з антитілами складається із двох фаз. Перша фаза - специфічна, коли відбувається швидке зв'язування антигенної детермінанти з активним центром Fab-фрагменту антитіл. Слід зазначити, що зв'язування обумовлено ван-дер-ваальсовими силами, водневими та гідрофобними взаємодіями. Міцність зв'язку визначається ступенем просторової відповідності активного центру антитіла та епітопу антигену. Після специфічної фази настає повільніша - неспецифічна, яка проявляється видимим фізичним явищем (наприклад, утворенням пластівців при аглютинації та ін.).
Імунні реакції - це взаємодія між антитілами і антигенами, причому ці реакції специфічні і мають високою чутливістю. Вони широко використовуються в медичної практики. За допомогою імунних реакцій можна вирішити такі завдання:
Визначення невідомих антитіл за відомими антигенами (антигенний діагностикум). Таке завдання стоїть, коли необхідно визначити у сироватці крові хворого антитіл до збудника (серодіагностика). Знаходження антитіл дозволяє підтвердити діагноз;
Визначення невідомих антигенів за відомими антитілами (діагностична сироватка). Це дослідження проводять за ідентифікації культури збудника, виділеної з матеріалу хворого (серотипування), а також при виявленні
антигенів мікробів та їх токсинів у крові та інших біологічних рідинах. Існує багато різновидів імунних реакцій, що відрізняються за технікою постановки та реєструється ефект. Це реакції аглютинації (РА), преципітації (РП), реакції за участю комплементу (РСК), реакції з використанням мічених компонентів (РІФ, ІФА, РІА).
13.2. Реакція аглютинації
Реакція аглютинації (РА) – це імунна реакціявзаємодії антигену з антитілами у присутності електролітів, причому антиген перебуває у корпускулярному стані (еритроцити, бактерії, частинки латексу з адсорбованими антигенами). При аглютинації відбувається склеювання корпускулярних антигенів антитілами, що проявляється утворенням пластівцевого осаду. Освіта пластівців відбувається з допомогою те, що антитіла мають два активних центру, а антигени поливалентны, тобто. мають кілька антигенних детермінантів. РА застосовують для ідентифікації збудника, виділеного з матеріалу хворого, а також для виявлення у сироватці крові хворого антитіл до збудника (наприклад, реакції Райта та Хеддлсона при бруцельозі, реакція Відаля при черевному тифі та паратифах).
Найпростіший спосіб постановки РА - реакція на склі, це орієнтовна РА, яка застосовується визначення збудника, виділеного від хворого. При постановці реакції на предметне скло наносять діагностичну аглютинуючу сироватку (в розведенні 1:10 або 1:20), потім вносять культуру від хворого. Реакція позитивна, якщо в краплі з'являється пластівцевий осад. Поруч ставлять контроль: замість сироватки наносять краплю розчину хлориду натрію.
Якщо діагностична аглютинуюча сироватка неадсорбована 1 то її розводять (до титру - розведення, до якого повинна відбуватися аглютинація), тобто. ставлять розгорнуту РА в пробірках з зростаючими1 Неадсорбована аглютинуюча сироватка може аглютинувати споріднені бактерії, що мають загальні (перехресно реагують) антигени. Тому користуються адсорбованими аглютинуючими сироватками,
розведеннями аглютинуючої сироватки, до яких додають по 2-3 краплі суспензії збудника, виділеного від хворого. Аглютинацію враховують за кількістю осаду та ступенем просвітлення рідини у пробірках. Реакцію вважають позитивною, якщо аглютинація відзначається у розведенні, близькому до титру діагностичної сироватки. Реакція супроводжується контролюми: сироватка, розведена ізотонічним розчином натрію хлориду, має бути прозорою, завись мікробів у тому ж розчині - рівномірно каламутною, без осаду.
Для визначення сироватці крові хворого антитіл до збудника використовують розгорнуту РА. При її постановці в пробірках розводять сироватку крові хворого і додають у пробірки рівну кількість суспензії діагностикуму (суспензії вбитих мікробів). Після інкубації визначають найбільше розведення сироватки, у якому сталася аглютинація, тобто. утворився осад (титр сироватки). При цьому реакція аглютинації з О-діагностикумом (бактерії, вбиті нагріванням, що зберегли термостабільний О-антиген) відбувається у вигляді дрібнозернистої аглютинації. Реакція аглютинації з Н-діагностикумом (бактерії, вбиті формаліном, що зберегли термолабільний джгутиковий Н-антиген) - великобавовняна і протікає швидше.
Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації(РНГА чи РПГА) є різновидом РА. Цей метод має високу чутливість. За допомогою РНГА можна вирішити два завдання: визначити антитіла в сироватці крові хворого, до якої додають антигенний еритроцитарний діагностикум, що є еритроцитами, на яких адсорбовані відомі антигени; визначити наявність антигенів у досліджуваному матеріалі. І тут реакцію іноді називають реакцією зворотної непрямої гемаглютинацією (РОНГА). При постановці до досліджуваного матеріалу додають антильний еритроцитарний діагностикум (еритроцити з адсорбованими на поверхні антитілами). Еритроцити у цій реакції виконують роль носіїв та пасивно залучаються до утворення імунних агрегатів. При позитивній реакції пасивно склеєні еритроцити покривають дно лунки рівним шаром з фестончастими краями (парасолька); за відсутності аглютинації еритроцити накопичуються в центральному заглибленні лунки, утворюючи компактний «гудзик» з різко окресленими краями.
Реакція коаглютинаціївикористовується для визначення клітин збудника (антигенів) за допомогою антитіл, адсорбованих на Staphylococcus aureus,містить білок А. Білок А має спорідненість до Fc-фрагменту імуноглобулінів. Завдяки цьому антитіла зв'язуються зі стафілококом опосередковано через Fc-фрагмент, а Fab-фрагменти орієнтовані назовні та здатні взаємодіяти з відповідними мікробами, виділеними від хворих. При цьому утворюються пластівці.
Реакція гальмування гемаглютинації (РТГА)використовується при діагностиці вірусних інфекцій, причому тільки інфекцій, що викликаються гемаглютинуючими вірусами. Ці віруси містять на своїй поверхні білок – гемаглютинін, який відповідальний за реакцією гемаглютинації (РДА) при додаванні до вірусів еритроцитів. РТГА полягає у блокуванні антитілами вірусних антигенів, внаслідок чого віруси втрачають здатність аглютинувати еритроцити.
Реакція КумбсаРА визначення неповних антитіл. При деяких інфекційних захворюваннях, наприклад, при бруцельозі, у сироватці крові хворого циркулюють неповні антитіла до збудника. Неповні антитіланазивають блокуючими, оскільки вони мають одну антигензв'язувальну ділянку, а не дві, як повноцінні антитіла. Тому при додаванні антигенного діагностикуму неповні антитіла зв'язуються з антигенами, але не склеюють їх. Для прояву реакції додають антиглобулінову сироватку (антитіла до імуноглобулінів людини), яка призведе до аглютинації імунних комплексів (антигенний діагностикум + неповні антитіла), що утворилися у першій стадії реакції.
Непряму реакцію Кумбса застосовують у хворих при внутрішньосудинному гемолізі. У деяких хворих виявляють неповні одновалентні антирезусні антитіла. Вони специфічно взаємодіють з резусположительными еритроцитами, але з викликають їх аглютинації. Тому в систему антирезусні антитіла + резус-позитивні еритроцити додають антиглобулінову сироватку, що спричиняє аглютинацію еритроцитів. За допомогою реакції Кумбса діагностують патологічні стани, пов'язані з внутрішньосудинним лізисом еритроцитів імунного генезу, наприклад, гемолітичну хворобу новонароджених, обумовлену резус-конфліктом.
РА визначення груп кровізаснована на аглютинації еритроцитів антитілами імунної сироватки до антигенів груп крові А(II), B(III). Контролем є сироватка, яка містить антитіл, тобто. сироватка AB(IV) групи крові, та антигени еритроцитів груп А(П) та B(III). Як негативний контроль застосовують еритроцити групи 0(I), оскільки вони не мають антигенів.
Для визначення резус-фактора використовують антирезусні сироватки (не менше двох різних серій). За наявності на мембрані досліджуваних еритроцитів резус-антигена відбувається аглютинація цих клітин.
13.3. Реакція преципітації
РП - це імунна реакція взаємодії антитіл з антигенами в присутності електролітів, причому антиген знаходиться в розчинному стані. При преципітації відбувається осадження розчинних антигенів антитіл, що проявляється помутнінням у вигляді смуг преципітації. Утворення видимого преципітату спостерігається при змішуванні обох реагентів у еквівалентних співвідношеннях. Надлишок одного з них знижує кількість імунних комплексів, що осаджуються. Існують різні способи постановки реакції преципітації.
Реакція кільцепреципітаціїставиться у преципітаційних пробірках з малим діаметром. У пробірку вносять імунну сироватку і обережно нашаровують розчинний антиген. При позитивному результаті межі двох розчинів утворюється кільце молочного кольору. Реакція кільцепреципітації, за допомогою якої визначають наявність антигенів в органах та тканинах, екстракти яких кип'ятять і фільтрують, називається реакцією термопреципітації (реакція Асколі для визначення термостабільного сибіркового антигену).
Реакція подвійної імунодифузії по Оухтерлоні.Ця реакція проводиться у агаровому гелі. У шарі гелю рівномірної товщини на певній відстані один від одного вирізають лунки та заповнюють їх антигеном та імунною сироваткою відповідно. Після цього антигени та антитіла дифундують у гель, зустрічаються один з одним і утворюють імунні комплекси, які преципітують у гелі і стають видимими як лінії преци-
питації. Цю реакцію можна використовувати для визначення невідомих антигенів або антитіл, а також для перевірки подібності між різними антигенами: якщо антигени ідентичні, лінії преципітації зливаються, якщо антигени неідентичні, лінії преципітації перетинаються, якщо антигени частково ідентичні формується шпора.
Реакція радіальної імунодифузії.У розплавлений агаровий гель додають антитіла і гель наносять рівномірним шаром на скло. У гелі вирізують лунки і вносять у них стандартний обсяг різних концентрації розчинів антигену. Під час інкубації антигени радіально дифундують з лунки і, зустрівшись з антитілами, утворюють кільце преципітації. Доки в лунці зберігається надлишок антигену, відбувається поступове збільшення діаметра кільця преципітації. Цей метод використовується для визначення антигенів або антитіл у досліджуваному розчині (наприклад, для визначення концентрації імуноглобулінів різних класів у сироватці крові).
Імуноелектрофорез.Попередньо електрофоретично розділяють суміш антигенів, потім в канавку, що йде вздовж напрямку руху білків, вносять антисироватку, що преципітує.
Антигени та антитіла дифундують у гель назустріч один одному; взаємодіючи вони утворюють дугоподібні лінії преципітації.Реакція флоккуляції
(за Рамоном) – різновид реакції преципітації, яка використовується для визначення активності антитоксичної сироватки або анатоксину. Реакцію проводять у пробірках. У пробірці, де анатоксин та антитоксин знаходяться в еквівалентному співвідношенні, спостерігається помутніння.
13.4. Реакція зв'язування комплементу
Антитіла, взаємодіючи з відповідним антигеном, пов'язують доданий комплемент (перша система). Індикатором зв'язування комплементу є еритроцити, сенсибілізовані гемолітичної сироваткою, тобто. антитілами до еритроцитів (2-я система). Якщо комплемент не фіксується у 1-й системі, тобто. не відбувається реакція антиген-антитіло, сенсибілізовані еритроцити повністю лізуються (негативна реакція). При зв'язуванні комплементу імунними комплексами 1-ї системи після додавання сенсибілізованих еритроцитів гемоліз від-
є (позитивна реакція). Реакція зв'язування комплементу використовується для діагностики інфекційних хвороб (гонореї, сифілісу, грипу та ін.).
Мікроби та їх токсини надають шкідливу дію на органи та тканини організму людини. Антитіла здатні зв'язуватися з цими агентами, що ушкоджують, і блокувати їх, тобто. нейтралізувати. На цій особливості антитіл засновано діагностичну реакцію нейтралізації. Її проводять шляхом введення суміші антиген-антитіло тварин або в чутливі тест-об'єкти (культуру клітин, ембріони). Наприклад, для виявлення токсинів у матеріалі хворого тваринам 1-ї групи вводять матеріал хворого. Тварини 2-ї групи вводять аналогічний матеріал, попередньо оброблений відповідною антисироваткою. Тварини 1-ї групи за наявності токсину у матеріалі гинуть. Друга група тварин виживає, що ушкоджує дію токсину не проявляється, оскільки відбувається його нейтралізація.
13.6. Реакції з використанням мічених антитіл чи антигенів
13.6.1. Реакція імунофлюоресценції (РІФ, метод Кунса)
Цей метод використовується для експрес-діагностики. З його допомогою можна виявляти мікробні антигени, так і антитіла.
Прямий метод РІФ- імунна реакція взаємодії антитіл з антигенами, причому антитіла мітять флюорохромом - речовиною, здатною при попаданні світла певної довжини хвилі випускати кванти світла також певної довжини хвилі. Особливість постановки цього методу полягає в необхідності видалення компонентів, що не прореагували, щоб виключити виявлення неспецифічного світіння. Для цього проводять відмивання від антитіл, що не прореагували. Результати оцінюють за допомогою люмінесцентного мікроскопа. Бактерії в мазку, оброблені такою сироваткою, що люмінескує, світяться на темному тлі по периферії клітини.
Непрямий метод РІФвикористовується частіше за попередній. Ця реакція проводиться у два етапи. На першому етапі антигени взаємо-
Модують з відповідними антитілами, утворюючи імунні комплекси. Усі компоненти, які не прореагували (тобто не у складі імунних комплексів), мають бути видалені відмиванням. На другому етапі комплекс антиген-антитіло, що утворився, виявляється за допомогою флюорохромованої антиглобулінової сироватки. В результаті утворюється комплекс мікроб + антимікробні кролячі антитіла + антитіла до імуноглобулінів кролика, мічені флюорохромом. Результати оцінюють за допомогою люмінесцентного мікроскопа.
13.6.2. Імуноферментний метод чи аналіз
ІФА - найпоширеніший сучасний метод, що використовується для діагностики вірусних, бактеріальних, протозойних інфекцій, зокрема для діагностики ВІЛ-інфекції, вірусних гепатитівта ін.
Модифікацій ІФА дуже багато. Широко використовується неконкурентний твердофазний варіант ІФА. Його проводять у 96-лункових полістиролових планшетах (тверда фаза). При проведенні реакції необхідно на кожному етапі відмивати компоненти, що не прореагували. При визначенні антитіл у лунки, на яких сорбовані антигени, вносять сироватку крові, що досліджується, потім антиглобулінову сироватку, мічену ферментом. Виявляють реакцію, додаючи субстрат ферменту. У присутності ферменту субстрат змінюється, причому фермент субстратний комплекс підбирають таким чином, щоб продукт, що утворюється в реакції, був кольоровим. Таким чином, при позитивній реакції спостерігається зміна кольору розчину. Для визначення антигенів твердофазний носій сенсибілізується антитілами, потім послідовно вносяться досліджуваний матеріал (антигени) та сироватка до антигенів, мічена ферментом. Для прояву реакції вносять субстрат ферменту. Зміна кольору розчину відбувається за позитивної реакції.
13.6.3. Імуноблот
Цей метод заснований на поєднанні електрофорезу та ІФА. Під час проведення імуноблотінгу (блот від англ. blot- пляма) складну суміш антигенів спочатку піддають електрофорез в поліакриламідному гелі. Отримані фракціоновані анти-
генні пептиди переносять на нітроцелюлозну мембрану. Потім блоти обробляють антитілами до специфічного антигену, міченими ферментом, тобто. проводять ІФА блоти. Імуноблоттинг використовують у діагностиці інфекцій, наприклад ВІЛ.
13.6.4. Імунна електронна мікроскопія
Метод полягає в мікроскопуванні в електронному мікроскопівірусів (рідше інших мікробів), попередньо оброблених відповідною імунною сироваткою, міченою електроннооптично-щільними препаратами, наприклад феритином - залізовмісним білком.
13.7. Проточна цитометрія
Клітини крові диференціюють на основі лазерної цитофлюорометрії. Для цього шукані клітини забарвлюють флюоресцентними моноклональними антитілами до CD-антигенів. Зразок крові після обробки міченими антитілами пропускають через тонку трубку та через нього пропускають лазерний промінь, який збуджує свічення флюорохрому. Інтенсивність флюоресценції корелює із щільністю антигенів на поверхні клітин та може бути кількісно виміряна за допомогою фотопомножувача. Отримані результати перетворюються на гістограму.
Проточну цитометрію застосовують для визначення імунного статусу(Зміст основних популяцій лімфоцитів, вміст внутрішньоклітинних та позаклітинних цитокінів, функціональна активність NK-клітин, активність фагоцитозу та ін.).
ІМУНОМІКРОБІОЛОГІЧНІ ДОСЛІДЖЕННЯ
Імунологічні методи застосовують для вирішення багатьох завдань:
1. Оцінка стану імунної системилюдини (імунного статусу) щодо визначення кількісних і функціональних характеристикклітин імунної системи та їх продуктів.
2. Визначення складу та характеристик тканин людини: груп крові, резус фактора, трансплантаційних антигенів.
3. Діагностика інфекційних хвороб та резистентності до них щодо виявлення та встановлення титрів антитіл (серодіагностика), виявлення антигенів збудників в організмі, визначення клітинних реакцій на ці антигени.
4. Сероідентифікація культур бактерій та вірусів, виділених з організму людини та тварин.
5. Виявлення в організмі людини та зовнішньому середовищібудь-яких речовин, що мають антигенні або гаптенні властивості (гормони, ферменти, отрути, ліки, наркотики тощо).
6. Виявлення імунопатологічних станів, алергій, трансплантаційних та протипухлинних реакцій.
Процес взаємодії антигену та антитіла в серологічних реакціяхпротікає у дві фази:
1) специфічна- фаза взаємодії, у якій відбувається комплементарне з'єднання активних центрів антитіл (паратопів) та епітопів антигену. Зазвичай ця фаза триває кілька секунд чи хвилин;
2) неспецифічна- фаза прояву, що характеризується зовнішніми ознакамиутворення імунних комплексів Ця фаза може розвиватися від кількох хвилин до кількох годин.
Оптимальна специфічна взаємодія антитіл з антигеном відбувається в ізотонічному розчині з рН, близьким до нейтрального. Реакція антиген-антитіло у системі in vitro може супроводжуватися виникненням кількох феноменів
· аглютинації,
· Преципітації,
· Лізісу.
Зовнішні проявиреакції залежать від фізико-хімічних властивостей антигену (розмір частинок, фізичний стан), класу та виду антитіл (повні та неповні), а також умов досвіду (консистенція середовища, концентрація солей, рН, температура).
Полівалентність антигенів та антитіл забезпечує виникнення видимих неозброєним оком агрегатів. Це відбувається відповідно до теорії освіти мереж, згідно з якою до комплексу, що утворився антиген-антитіло послідовно приєднуються інші молекули антитіл і антигену. В результаті формуються мережеві структури, які перетворюються на агрегати, що випадають в осад. Характер і вираженість реакції залежить від кількісного співвідношення антигенів і антитіл. Найбільш інтенсивно реакції проявляються у тому випадку, якщо реагенти перебувають у еквівалентному співвідношенні.
Необхідна умоваутворення решітки (мереж) - наявність більше трьох антигенних детермінантів на кожну молекулу антигену та по два активні центри на кожну молекулу антитіла. Молекули антигену є вузлами ґрат, а молекули антитіл - сполучними ланками. Область оптимальних співвідношень (зона еквівалентності) концентрацій антигену та антитіл, коли в надосадовій рідині після утворення осаду не виявляються ні вільні антигени, ні вільні антитіла.
Агрегати, здатні випадати в осад, утворюються при з'єднанні антигенів з антитілами. Неповні антитіла (моновалентні) не викликають утворення мережевих структур та великих агрегатів. Для виявлення таких антитіл використовують спеціальні методизасновані на використанні антиглобулінів (реакцію Кумбса)
Серологічні реакції, завдяки високій специфічності та чутливості, застосовують для виявлення та кількісного визначенняантигенів та антитіл. Кількість імунореагентів у реакціях виражають титром – максимальним розведенням сироватки або антигену, при якому ще спостерігається реакція.
Серологічні реакції в мікробіологічних та імунологічних лабораторіях використовують у двох цілях:
1) для сероідентифікації мікроорганізмів, токсинів, антигену взагалі за допомогою відомого антитіла (імунної діагностичної сироватки),
2) для серодіагностики – визначення природи антитіла у сироватці крові хворого при бактеріальних, вірусних, рідше інших інфекційних захворюваннях за допомогою відомого антигену (діагностикуму).
Для визначення родової, видової та типової приналежності антигену необхідні відомі імунні діагностичні сироватки. Їх отримують шляхом багаторазового введення тваринам (частіше за кроликів) у наростаючих дозах вбитих або живих мікроорганізмів, продуктів їх розпаду, знешкоджених або нативних токсинів. Після певного циклу імунізації тварин роблять масивне кровопускання або тотальне знекровлення тварини. Кров, зібрану в стерильну посуд, спочатку поміщають у термостат за нормальної температури 37°З 4 - 6 год на прискорення згортання, потім - в льодовик на добу. Отриману прозору сироватку відсмоктують у стерильний посуд, додають консерванти, визначають титр антитіл, перевіряють на стерильність та розливають у ампули.
Використовуються неадсорбованіі адсорбованідіагностичні сироватки. Неадсорбовані сироватки мають високими титрамиантитіл, але здатні давати групові (перехресні) реакції.
Адсорбовані сироватки відрізняються строгою специфічністю дії (реагують лише з гомологічним антигеном). Сироватки, що містять антитіла тільки одного певного антигену називаються монорецепторними.
Випускають також сироватки, мічені флюорохромами, ферментами, радіоізотопами, які дають змогу з високим ступенем точності виявити навіть сліди антигену.
Як антигени (діагностикуми) в серологічних реакціях застосовують суспензії живих або вбитих бактерій, продуктів їх розщеплення, токсини, віруси. У ряді випадків використовують екстракти або виділені хімічним шляхом антигени з мікроорганізмів та тканин тварин.
Усі імуномікробіологічні методи можна розділити на 3 групи:
1) засновані на прямій взаємодії антигену з антитілом(феномени аглютинації, преципітації, гемаглютинації, іммобілізації та ін.);
2) засновані на опосередкованої взаємодії антигену з антитілом(реакції непрямої гемаглютинації, коаглютинації, латекс-аглютинації, вугільної аггломерації, бентоніт-аглютинації, зв'язування комплементу та ін);
3) з використанням мічених антитіл або антигенів(метод флюоресціюючих антитіл, імуноферментний та радіоімунний аналізи та інші методи).
РЕАКЦІЇ АГГЛЮТИНАЦІЇ
У цих реакціях беруть участь антигени у вигляді частинок (мікробні клітини, еритроцити та інші корпускулярні антигени), які склеюються антитілами та випадають у осад.
Для постановки реакції аглютинації(РА) необхідні три компоненти: 1) антиген (аглютиноген);
2) антитіло (аглютинін)
3) електроліт (ізотонічний розчин хлориду натрію).
Орієнтовна реакція аглютинації (РА)
Орієнтовна або пластинчаста РА ставиться на предметному склі при кімнатній температурі. Для цього пастерівською піпеткою на скло наносять окремо краплю сироватки в розведенні 1:10 - 1:20 та контрольну краплю ізотонічного розчину натрію хлориду. У ту і іншу бактеріологічну петлю вносять колонії або добову культуру бактерій (краплю діагностикуму) і ретельно перемішують їх. Реакції враховують за кілька хвилин візуально, іноді за допомогою лупи (х5). При позитивній РА у краплі із сироваткою відзначають появу великих і дрібних пластівців, при негативній – сироватка залишається рівномірно каламутною.
Розгорнута реакція аглютинаціїз метою виявлення титру специфічних антитіл у хворого.
Розгорнута РА для серодиагностики в сироватці хворих. Її розводять і ізотонічному розчині натрію хлориду від 1:50 - 1:100 до 1:800 або 1: 1600. Так як в нижчих титрах сироватки можуть перебувати нормальні аглютинини, наявні у здорових людейабо хворих із іншим діагнозом (діагностичний титр). Як антиген у цій реакції використовують діагностикуми - свідомо відомі суспензії, як правило, убитих бактерій.
В аглютинаційні пробірки попередньо розливають по 1 мл ізотонічного розчину хлориду натрію. У першу з них доливають 1 мл сироватки, розведеної 1:100, змішавши її, 1 мл переносять у другу, з другої - в третю і т.д. В отримані дворазові розведення сироваток (від 1:100 до 1:1600 і більше) вносять по 1-2 краплі суспензії бактерій, що містить 3 млрд. мікробних тіл в 1 мл. Пробірки струшують і поміщають у термостат при 37°З 2 години, потім витримують добу при кімнатній температурі.
Облік реакції розгорнутої аглютинації роблять, оцінюючи послідовно кожну пробірку, починаючи з контрольних, при обережному струшуванні. У контрольних пробірках аглютинації не повинно бути. Інтенсивність реакції аглютинації відзначають такими знаками: ++++ - повна аглютинація (пластівки аглютинату в абсолютній прозорій рідині); +++ - неповна аглютинація (пластівки у слабоопалесцирующей рідини); ++ - часткова аглютинація (пластівці чітко помітні, рідина злегка каламутна); + - слабка, сумнівна аглютинація - рідина дуже каламутна, пластівці в ній погано помітні; - відсутність аглютинації (рідина рівномірно каламутна).
За титр сироватки приймають останнє її розведення, в якому інтенсивність аглютинації оцінюється не менш як два плюси (++)
Аглютинації реакція Аглютинації реакція
(РА) - спосіб виявлення та кількісного визначення Аг та Ат, заснований на їх здатності до утворення видимих неозброєним оком агломератів. У д-ці інфекцій. хвороб або в ін. цілях застосовується для ідентифікації невідомих мікробів і клітин, для визначення присутності та кількості Ат в с-ці крові та ін рідинах. Принцип визначення заснований на специфічності взаємодії Аг та Ат і полягає у знаходженні відомого за невідомим. Існує багато варіантів РА: кількісні та якісні, пробіркові та на склі, об'ємні та крапельні, звичайні, прискорені та експрес-методи. Для постановки РА потрібні: 1) с-ка крові.У варіанті з визначенням виду (вара) бактерій використовують виробничі аглютинуючі с-ки, що виготовляються шляхом імунізації кроликів. У варіанті з визначенням виду Ат беруть с-ку крові, що отримується від ісл. людей чи тварин. С-ка має бути стерильною і не містити зважених частинок. Готують основне розведення на фіз-розчині. Воно має бути в 2 -4 рази нижче за діагностичний титр при даному захворюванні; 2) Аг.У варіанті реакції з визначенням типу Ат використовують виробничі діагностикуми; у варіанті з визначенням Аг діагностикуми готують самі у вигляді 1 -3-мільярдної суспензії на фізрозчині 18-20-годинний агарової (рідше бульйонної) к-ри ісл. мікроба, інактивованої прогріванням на водяній бані при 70°С протягом 1 години або 24-годинної інкубацією при 37°С з формаліном (кінцева концентрація 0,2%); 3) електроліт у вигляді фізрозчину.Техніка постановки об'ємної серійної пробірковоїРА визначення титру Ат в с-ке: з основного розведення с-ки готують кілька рядів робочих розведенні. Число рядів залежить від кількості взятих у досвід діагностикумів, число та фактори розведення визначаються діагностичним титром передбачуваного захворювання. У ряді щонайменше повинні бути розведення, що відповідає діагностичному титру Ат, два розведення нижче і два розведення вище за нього. напр., якщо діагностичний титр дорівнює 1:100, то при об'ємному способі постановки РА повинні бути приготовлені наступні розведення с-ки: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; при краплинному методі перше розведення (1:25) не потрібне, зате необхідне ще одне вище розведення - 1:800.наукових дослідженнях с-ку титрують до. Розводять її наступним чином: у всі дослідні пробірки, крім 1-ї, наливають по 0,25 мл фізрозчину при постановці реакції в обсязі 0,5 мл і 0,5 мл при постановці реакції в об'ємі 1 мл. У 1-у та 2-ю пробірки вливають по 0,25 (0,5) мл основного розведення с-ки, з 2-ї пробірки, в до-рой об'єм і розведення с-доі збільшилися в 2 рази, 0,25 (0,5) мл переносять в 3-ю, з 3-ї в 4-ю і т.д. до останньої, з якої 0,25 (0,5) мл для врівноваження обсягів виливають у всі. Кожне розведення с-ки здійснюють за допомогою окремої піпетки. Якщо в досвід беруть кілька діагностикумів, то для кожного з них готують таким самим способом свій ряд розведенні. У кожне розведення с-ки доливають діагностикум в об'ємі, що дорівнює об'єму с-ки, у результаті розведення в кожній пробірці збільшується в 2 рази. Досвіду відповідають контроль с-ки (0,25 -0,5 мл основного розведення с-ки та стільки ж фізрозчину) та контроль Аг (0,25 - 0,5 мл діагностикуму та стільки ж фізрозчину). Якщо досвід беруть кілька діагностикумів, то кожному відповідає свій контроль Аг. Штатив з пробірками добре струшують і поміщають у термостат при 37°С на 4 години, а потім залишають при кімнатній температурі до наступного дня, після чого проводять облік РА, ґрунтуючись на кількості осаду та ступеня просвітлення рідини. Визначення цих показників, залежно від характеру аглютинатів, здійснюють неозброєним оком на темному тлі, в аглютиноскопі або над увігнутою поверхнею дзеркала від мікроскопа. Облік починають з контролів: контроль с-ки має бути прозорим, Аг - рівномірно каламутним (після струшування пробірки). Якщо контролі хороші, встановлюють наявність і ступінь аглютинації у всіх досвідчених пробірках, які позначають плюсами: великий осад і повне просвітлення рідини - 4 плюси; великий осад та неповне просвітлення рідини -3 плюси; помітний осад і помітне просвітлення рідини-2 плюси. Після цього визначають титр: найбільше розведення з аглютинації інтенсивністю не менше 2 плюсів. Титр досл. с-ки порівнюють з діагностичним титром при цьому захворювання. Якщо титр досл. с-ки вдвічі нижче діагностичного, реакцію оцінюють як сумнівну; якщо титр дорівнює діагностичного -якслабопозитивну; якщо у 2-4 рази вище його-як позитивну, якщо у 8 і більше разів вище - як різко позитивну. При широкому поширенні А у здорових людей для оцінки РА застосовують наростання титру Ат. Для визначення виду Аг у серійній РА число рядів має відповідати числу взятих для ідентифікації діагностичних с-до. З основного розведення діагностичної с-ки готують ряд послідовних дворазових розведенні таким же способом, як і в РА для визначення титру Ат. Фактори розведення залежать від титру аглютинуючої с-ки У досвіді необхідна присутність розведення, рівного титру с-ки, а також у 2, 4, 6, 8 разів нижче його напр., якщо титр діагностичної с-ки дорівнює 1 3200, то слід використовувати розведення 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 До розведень с-ки доливають такий же обсяг ісл Аг, в результаті розведення с-к збільшується в 2 рази До досвіду ставлять 2 контролю с-ки та Аг Якщо у досвіді бере участь кілька с-к, то до кожної з них потрібен свій контроль. Після завершення реакції штатив енергійно струшують і поміщають у термостат при 37°С. Результати враховують, як описано вище Оцінка реакції має особливості Для того щоб зробити висновок про відповідність ісл. Аг взятої в досвід с-ке, титр реакції повинен відповідати не менше половині титру стандартної діагностичної с-ки Титри 14 і нижче розглядають як групову реакцію Краплинний дпостановки РА відрізняється від об'ємного тим, що с-ку розводять в об'ємі 1 мл, Аг застосовують у вищій концентрації (10 млрд/мл) і додають його по 1 мл - 2 краплі в пробірку Розведення с-ки після внесення Аг вважають незміненим В іншому методика постановки, обліку та оцінки аналогічна об'ємному методу
(Джерело: «Словник термінів мікробіології»)
Реакція аглютинації.
Реакція аглютинації - це склеювання та випадання в осад мікробних або інших клітин (еритроцитів) під дією антитіл у присутності електроліту. Видимий ефект реакції (феномен аглютинації) – утворення осаду, що називається аглютинатом.
Цю реакцію використовують для серодіагностикиі сероідентифікації. РА використовують для серодіагностики (виявлення антитіл у сироватці крові хворих) черевного тифута паратифа(Реакція Відаля), бруцельозу(Реакція Райта), туляремії та лептоспірозу. РА використовують для сероідентифікації (визначення виду збудника, виділеного від хворого) при кишкових інфекціях, коклюші, холеріта ін.
Компонентиреакції:
1. А нтиген (аглютиноген) -це цілі (не зруйновані) мікробні чи інші клітини ( корпускулярний, нерозчинний антиген). Аглютиногени– це завись живихабо вбитихмікробних клітин або інших клітин. Антигени можуть бути як невідомими, і відомими. Невідомий аглютиноген - це мікробна культура, виділена з організму хворого, яку необхідно визначити. Відомий антиген - діагностикум- діагностичний препарат - завись убитихмікробів відомого видуу фізіологічному розчині. Ця завись каламутна (непрозора)), т.к. мікробні клітини не розчиняються, а залишаються цілими. Відомий аглютиноген використовуватиметься для виявлення невідомих антитіл у сироватці крові хворих.
2. Антитіло (аглютинін)– знаходиться у сироватці крові. Антитіла можуть бути як невідомими, так і відомими. Невідомі антитіла, які потрібно визначити, перебувають у сироватці крові хворої людини. Відомі антитіла знаходяться в імунних діагностичних сироватках які називаються аглютинуючими сироватками. Вони застосовуються для сероідентифікації, тобто. визначення невідомого антигену – виду мікробної культури.
3. Електроліт- 0,9% розчин хлориду натрію.
Методи постановки РА.
1. Орієнтовна (пластинчаста) РА- Проводиться на склі. На предметне скло наносять 2 краплі сироватки та 1 краплю ізотонічного розчину. В одну з крапель сироватки і краплю ізотонічного розчину петлею вносять мікробну культуру і перемішують. Крапля ізотонічного розчину з мікробами – контроль антигену, крапля сироватки без мікробів – контроль антитіла, крапля сироватки з мікробами – досвід.Якщо в сироватці є антитіла, що відповідають мікробним антигенам, які з нею змішуються, то антитіла та антигени специфічно зв'язуватимуться один з одним і через 1 – 3 хв у дослідній краплі з'являться пластівці аглютинату. Контроль антигену має бути каламутним, а контроль антитіла – прозорим. Облік результатів реакції проводиться за появою пластівців аглютинату . Якщо випадають пластівці – реакція позитивна, тобто. антиген відповідає антитілу і антигеном можна визначити антитіло або навпаки. Якщо залишається помутніння – негативна реакція.
2. Розгорнута реакція аглютинації –проводиться у пробірках. Спочатку готують 2-разові розведення сироватки крові хворої людини від 1:50 до 1:1600. У 6 пробірок наливають по 1 мл ізотонічного розчину натрію хлориду. У першу пробірку вносять 1 мл сироватки крові хворого у розведенні 1:50, перемішують і одержують розведення 1:100, потім 1 мл розведення 1:100 переносять у другу пробірку та одержують розведення 1:200 і т.д. Дві пробірки залишають для контролю антигену та сироватки. У контроль сироватки додають тільки сироватку в розведенні 1:50, контроль антигену - тільки антиген. У решту всіх пробірок додають 0,1 мл антигену - діагностикуму (Про- або Н-) і ставлять всі пробірки в термостат при 37°С на 18-20 годин. Облік результатів реакції проводять за характером, кількістю осаду, що утворився (аглютинату) і ступеня каламутності. Облік проводять лише за наступних результатів у контролю: контроль сироватки – прозорий, контроль антигену – каламутний. О-антитіла дають дрібнозернистий осад. Н-антитіла – крупнозернистий. По останній пробірці, в якій ще видно реакцію аглютинації, встановлюють діагностичний титр.
При серодиагностике захворювань важливо непросто виявити специфічні антитіла до певного збудника, а й виявити їх кількість, тобто. встановити такий титр антитіл, коли можна говорити про наявність захворювання, спричиненого цим збудником. Цей титр називається діагностичним титром. Наприклад, для діагностики черевного тифу потрібно виявити титр антитіл – 1:400, але не менше. Ще більш точні результати дає виявлення наростання антитіл у парних сироватках. Сироватку хворого відбирають на початку захворювання та через 3 – 5 або більше днів. Якщо титр антитіл зростає не менше ніж у 4 рази, отже, можна говорити про поточне захворювання.
