Критеріями антимікробної активності препарату є мінімальна інгібуюча концентрація(МІК) та мінімальна бактерицидна концентрація(МБК). МІК - це найменша концентрація антибіотиків, яка invitro повністю пригнічує видимий зростання бактерій. Вона виявляється у мг/л чи мкг/мл. МБК – це найменша концентрація антибіотика, що спричиняє бактерицидний ефект. Для її визначення необхідно провести висів із пробірок, в яких візуально відсутнє зростання, на щільний живильний агар, що не містить антибіотик. Цей показник має велике клінічне значення. На основі методу серійних розведень створено мікрометоди, що передбачають використання меншого обсягу живильного середовища. В даний час для проведення такого роду досліджень випускаються численні комерційні набори, що складаються з висушених стабілізованих розведень антибіотиків у живильному середовищі, які розбавляються суспензією тест-мікробу. Ці набори можуть зберігатися в звичайних умовах, внаслідок чого виключається необхідність у приготуванні розведень середовища та антибіотиків у лабораторних умовах. Перевагою тестів мікророзведень є також те, що вони включаються до автоматизованої системи.
На підставі отриманих даних (діаметра зони затримки зростання або величини МІК) мікроорганізми поділяють на чутливі, помірно-резистентні та резистентні. Для розмежування цих категорій використовують звані прикордонні концентрації антибіотиків, які є незмінними величинами. Вони переглядаються зі зміною чутливості популяції мікроорганізмів. Розробкою та переглядом критеріїв інтерпретації займаються провідні фахівці (хіміотерапевти, мікробіологи), які входять до спеціальних комітетів. Одним із них є національний комітет з клінічних лабораторних стандартів ( N ational C ommitteefor C linical L aboratory S tandards – NCCLS), організований США. В даний час стандарти NCCLS використовуються як міжнародні для оцінки результатів визначення чутливості бактерій при багатоцентрових мікробіологічних та клінічних дослідженнях.
Визначення чутливості бактерій до антибіотиків.Критерієм чутливості мікроорганізмів до антибіотиків є мінімальна інгібуюча концентрація (МІК) антибіотика, що затримує зростання збудника за стандартних умов постановки досвіду.
Для визначення лікарської стійкості використовують добову чисту культуру збудника, виділену з організму хворого, та стандартне живильне середовище (АГВ або Мюллер-Хінтон агар) для його посіву.
Визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків проводять диско-дифузійним методом або серійних розведень антибіотика в рідких або щільних середовищах.
Диско-дифузійний метод.Визначення чутливості до антибіотиків методом паперових дисків ґрунтується на дифузії антибіотика у живильне середовище. Концентрація антибіотиків у дисках підібрана таким чином, щоб діаметри зон затримки зростання стандартних тест-мікроорганізмів відповідали міжнародним стандартам. Ця концентрація відповідає середній терапевтичній дозі стандартних штамів мікроорганізмів.
Приготовлену завис мікроорганізмів засівають на поверхню спеціального середовища (АГВ або агар Мюллер-Хінтона) в чашки Петрі. Потім стерильним пінцетом на засіяну поверхню поміщають на рівній відстані один від одного, від країв та центру чашки стандартні паперові диски, просочені розчинами різних антибіотиків (також можна використовувати спеціальні пристрої та диспенсери). Засіяні чашки витримують у термостаті при температурі, оптимальної для зростання досліджуваних бактерій. Якщо бактерії чутливі до цього антибіотика, навколо диска утворюється зона затримки росту. Діаметр зони затримки зростання відповідає ступеню чутливості досліджуваного мікроорганізму до цього антибіотика. Остаточний результат оцінюється за спеціальними таблицями, в яких вказані діаметри зон затримки зростання стандартних культур, чутливих, стійких та помірно-стійких.
Метод дисків не дає надійних даних при визначенні чутливості мікроорганізмів до поліпептидних антибіотиків, що погано дифундують в агар (наприклад, поліміксину, ристоміцину). Також цей метод не дозволяє визначити мінімальну переважну концентрацію антибіотика.
Метод серійних розбавлень.Даним методом визначають мінімальну концентраціюантибіотика, що інгібує зростання досліджуваної культури бактерій (МПК, МІК). Для цього спочатку готують основний розчин, який містить певну концентрацію антибіотика (мкг/мл або од/мл) у спеціальному розчиннику або буферному розчині. Далі з основного розчину готують всі наступні розведення в бульйоні (обсязі 1 мл), після чого до кожного розведення додають 0,1 мл досліджуваної бактеріальної суспензії, що містить 10 6 -10 7 бактеріальних клітин в 1 мл. В останню пробірку вносять 1 мл бульйону (без антибіотика) та 0,1 мл суспензії бактерій (контроль культури). Посіви інкубують при 37 0 С до наступного дня, після чого відзначають результати досвіду помутніння живильного середовища, порівнюючи з контролем. Остання пробірка з прозорим живильним середовищем вказує на затримку зростання досліджуваної культури бактерій, під впливом мінімальної переважної (інгібуючої) концентрації (МПК, МІК) антибіотика, що міститься в ній. Для оцінки мінімальної бактерицидної концентрації (МБК) виробляють висів на щільне живильне середовище без антибіотика з пробірок з відсутністю росту. За МБК приймають мінімальну концентрацію антибіотика, що спричиняє загибель мікроорганізму, що характеризується відсутністю зростання на чашках Петрі з живильним середовищем.
Метод серійних розведень антибіотика в агаризованому середовищі.В цьому випадку можна в одному досвіді перевірити чутливість до різних концентрацій даного антибіотика кількох культур мікроорганізмів. Різні розведення антибіотика готують у стерильному агаризованому середовищі. Для цього до неї додають необхідну кількість вихідного розчину антибіотика, ретельно перемішують і заливають у стерильні чашки Петрі. Після застигання агару дно чашки із зовнішнього боку ділять маркером на сектори. Кожну досліджувану культуру засівають штрихом за допомогою бактеріологічної петлі на певний сектор чашки з різними концентраціями антибіотика. Посів досліджуваних культур на чашки з різними концентраціями антибіотика можна зробити за допомогою аплікатора, що дозволяє засівати одночасно 12-15 культур одну чашку. Потім чашки поміщають в термостат при температурі, оптимальної для зростання та розвитку бактерій, що досліджуються. Результати враховують за наявністю або відсутністю зростання бактерій у порівнянні зі зростанням на середовищі контрольної чашки. Бактерії вважаються чутливими до антибіотика в такій його концентрації, при якій їхнє зростання повністю пригнічується.
Метод Е-тестів.Даний метод поєднує в собі переваги методу серійних розведень та методу дисків. Замість дисків використовуються смужки («лінійки») фільтрувального паперу, просочені антибіотиком, причому в основі смужки концентрація антибіотика буде мінімальною, а на «верхівці» – максимальною. Смужки поміщають на поверхню живильного агару, засіяного досліджуваною культурою. Якщо бактерії чутливі до дії даного препарату, навколо ділянок смужки, що містять його інгібуючі концентрації, виникає еліпсоподібна зона затримки росту. Числове значенняконцентрації антибіотика в основі цієї зони вказує на МПК даного антибіотика для даної культури.
До чутливимвідносяться штами мікроорганізмів, зростання яких пригнічується при концентраціях препарату, які виявляються у сироватці крові хворого при використанні звичайних доз антибіотиків.
До помірно стійкимвідносяться штами, для придушення росту яких потрібні концентрації, що утворюються в сироватці крові при введенні максимальних доз препарату.
Стійкимиє мікроорганізми, зростання яких пригнічується препаратом у концентраціях, створюваних організмі під час використання максимально допустимих доз.
Контрольні питання.
Дайте визначення поняття "антибіотики". Основні групи антибіотиків в залежності від способу одержання: природні, напівсинтетичні, синтетичні. Назвіть прізвище вченого, який розробив теорію хіміотерапії. Які властивості є визначальними під час виборів хіміотерапевтичного препарату? Що таке хіміотерапевтичний індекс, напишіть його формулу, яким він має бути? Вкажіть перші антиспірохетозні препарати; перший антибактеріальний препараті прізвище вченого, який одержав його. Назвіть прізвища російських вчених, які вперше виявили антибактеріальні властивості зеленої плісняви. Назвіть прізвище вченого, який вивчав антибактеріальні властивості цвілевого гриба Penicillium і зробив спробу виділити пеніцилін. Вчені, які вперше отримали препарати пеніциліну. Продуценти антибіотиків – наведіть приклади. Класифікація антибіотиків за походженням, хімічного складу, За спектром дії. Механізм дії антибіотиків: мішені (точки застосування антибіотиків різних груп). Типи дії - бактерицидна та бактеріостатична; як у досвіді in vitro визначити їх? Противірусні антибіотики, механізми їхньої дії. У яких одиницях вимірюється активність антибіотиків? Умови збереження антибіотиків.
Назвіть та охарактеризуйте можливі побічні явищапри антибіотикотерапії. Дайте визначення поняття «лікарська стійкість бактерій». Види лікарської стійкості. Природна та набута (первинна та вторинна). Генетичні механізми лікарської стійкості: хромосомна та плазмідна. Фенотипові механізми лікарської стійкості - назвіть та охарактеризуйте. Раціональне застосування антибіотиків – назвіть способи. Назвіть препарати – інгібітори ферментів, що руйнують антибіотики. Опишіть методи визначення чутливості бактерій до антибіотиків.
Аналіз здатності бактерій розмножуватися і зростати на середовищах, що містять концентрацію, що зменшується лікарської речовини, дозволяє визначити мінімальну інгібуючу концентрацію антибіотика (МІК), що пригнічує роль бактерій in vitro (табл. 3(vet7)). Величина цієї дози визначає вибір лікарської речовини, здатної досягти аналогічних значень концентрації in vivo, і є основою порівняння відносної чутливості організму по відношенню до інших лікарських засобів. Вважається, що для забезпечення ефективності впливу концентрація лікарської речовини в осередку інфекції має бути щонайменше рівної значеннюмінімальної інгібуючої концентрації антибіотика. З іншого боку, концентрація лікарської речовини в плазмі зазвичай повинна бути більш високою для забезпечення адекватної концентрації в тканинах. Однак невиправдане збільшення доз протимікробних препаратів з метою досягнення мінімальної дози антибіотика, що пригнічує зростання бактерій певного виду in vitro, може призвести до накопичення препарату в організмі реципієнта в токсичних дозах.
"Критичною МІК" для конкретної лікарської речовини є найбільша досить безпечна концентрація препарату, яку можна досягти за допомогою клінічно прийнятної дози та способу застосування препарату (табл. 3(vet7)). МІК залежить від конкретного виду бактеріальної культури та конкретного виду лікарської речовини. У той же час критична МІК є специфічною для конкретного реципієнта та конкретної лікарської речовини. Таким чином, критична МІК буде однаковою для будь-якого організму (табл. 3(vet7)). Критичне значення концентрації для конкретного організму може відрізнятися залежно від виду тварини (через відмінності у чутливості або в характері розподілу) лікарського засобу) та конкретної лабораторії. Необхідно звернутися до лабораторії, що надає дані щодо методів культивування та чутливості до антибіотиків, з метою отримання критичних значень, що використовуються в ході досліджень, які там проводяться.
На підставі даних про розведення в пробірці бактерії відносять до чутливих (S) до конкретної лікарської речовини, якщо МІК значно нижчий від критичного значення цього показника. Зростання патогенних мікроорганізмів із середнім (MS) або проміжним (IS) значенням чутливості пригнічується при концентрації препарату, що наближається до критичного значення МІК. Такі бактерії можуть викликати негативні реакції організму пацієнта або не впливати на нього. МІК для резистентних (R) бактерій перевищує критичне значеннямінімальної дози. Ефективне значення концентрації в організмі пацієнта такого препарату, що впливає на певний мікроорганізм, навряд чи буде досягнуто. У таких випадках небезпека кумуляції лікарської речовини у токсичних дозах може також переважити потенційний зисквід застосування терапії. Критичне значення мінімальної дози антибіотиків нового покоління, що пригнічують зростання бактерій, у деяких випадках важче визначити у зв'язку з переходом на професійне гнучке маркування діапазонів дозування.
Лікарські речовини необхідно вибирати таким чином, щоб при їх застосуванні відповідно до схеми, що перешкоджає накопиченню речовини в токсичних дозах, можна було досягти граничної концентрації лікарської речовини в плазмі, що істотно перевищує МІК. Багато бактерій буде чутливим до впливу певної лікарської речовини при концентраціях набагато нижче критичного значення мінімальної дози. Різницю між критичним значенням та власним значеннямМІК можна використовувати для порівняння відносної ефективності різних антимікробних препаратів. Наприклад, для амікацину критичне значення становить 32 мкг/мл, тому Е. coli зі значенням МІК 2 мкг/мл має відносно більшу чутливість до амікацину, ніж Е. coli зі значенням МІК 16 мкг/мл. Обидва види повинні вважатися чутливими (хоча другий вид можна розглядати як той, що має середню чутливість), проте зростання бактерій першого виду, мабуть, пригнічується більшою мірою. Якщо той самий вид Е. coli зі значенням МІК 2 мкг/мл по відношенню до амоксициліну має значення МІК 16 мкг/мл (при критичному значенні 32 мкг/мл), то, мабуть, зростанню цього мікроорганізму буде легше перешкодити шляхом застосування амікацину, а не амоксициліну, оскільки значення МІК амікацину далі від свого критичного значення МІК, ніж значення МІК амоксициліну.
Незважаючи на те, що відмінності між значеннями МІК для конкретного виду бактерій та конкретної лікарської речовини (16 або 32) можуть здаватися досить великими (особливо в контексті граничної концентрації лікарської речовини в плазмі), така відмінність відповідає лише одному розчину у пробірці. Це приклад небезпеки переоцінки даних про чутливості. Якщо значення МІК певного організму знаходиться досить близько до критичного значення, то через можливі розбіжності в інтерпретації даного мікроорганізму може в одній лабораторії бути присвоєний ступінь чутливості "S" або "MS", а в іншій - "R". Такі можливі розбіжності в оцінці є однією з причин, через яку слід уникати використання лікарських речовин, щодо яких певний організм має чутливість "MS" (або якщо значення МІК близько до критичного), за винятком випадків, якщо концентрація лікарської речовини в осередку інфекції може набагато перевищувати значення МІК, визначене під час аналізу in vitro. Наочним прикладом може бути використання лікарських речовин, що виводяться нирками, для лікування інфекції. сечовивідних шляхівабо використання лікарських речовин, що виводяться з жовчю, для лікування інфекції жовчних шляхів. Накопичення певних лікарських речовин лейкоцитами (фторхінолони, макроліди) може також призвести до концентрації препарату в тканинах, що значно перевищує МІК (або критичне значення МІК), незважаючи на нижчу концентрацію в плазмі.
МІК бактерій може змінюватися при наступних інфекціях, викликаних бактерією того самого виду, а також здатна змінюватися в самому процесі інфекційного захворювання. Збільшення значення МІК може просто відображати різний підхід до оцінки результатів аналізу (особливо якщо відмінності виявляються тільки при розведенні в пробірці), проте може також вважатися наслідком вироблення резистентності по відношенню до певної лікарської речовини. У таких випадках курс антимікробної терапії може бути змінений за рахунок використання додаткового препарату або переходу на новий ефективний препарат. При полімікробних інфекціях значення МІК певної лікарської речовини, ймовірно, буде різним для кожної бактерії, що інфікує. Вважається, що легше перешкодити зростанню бактерій з низьким значеннямМІК по відношенню до певної лікарської речовини, ніж зростанню мікроорганізму з більш високим значенням МІК по відношенню до тієї ж самої лікарської речовини.
(МІК) - мінімальна інгібуюча (переважна) концентрація - найменша концентрація антибіотика, яка пригнічує видиме зростання мікроорганізму, що досліджується. in vitro(в бульйонних або агарових поживних середовищах) в стандартних умовах постановки досвіду і виражається в мкг/мл (мг/л) або од/мл.
Мінімальна бактерицидна концентрація (МБК)-найменша концентрація антибіотика, що при дослідженні in vitroвикликає загибель 99,9% мікроорганізмів від вихідного рівняпротягом певного періоду часу.
Чутливиймікроорганізм – штам мікроорганізму, який не має механізмів резистентності до цього препарату. Його на живильному середовищі припиняється при використанні антибіотика в терапевтичній дозі.
Помірно-резистентниймікроорганізм - штам мікроорганізму, зростання якого на живильному середовищі припиняється тільки за умови використання антибіотика у вищій дозі. Лікування інфекцій, що викликаються помірно-резистентними мікроорганізмами, проводиться за відсутності альтернативних препаратів, найвищою (максимальною терапевтичною) дозою антибіотика.
Резистентний мікроорганізмштам мікроорганізму, який має механізми резистентності до препарату. Його зростання на живильному середовищі припиняється лише при використанні дуже високих концентрацій препарату, які не можна створити в організмі через їх високу токсичність. При лікуванні інфекцій, спричинених цим мікроорганізмом, клінічного ефекту від терапії немає навіть при використанні вищої дози антибіотика. При цьому можуть спостерігатися побічна діяАнтибіотика.
Показання до визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків:
1) визначення чутливості до нового антибіотика, що рекомендується до застосування;
2) періодичний моніторинг антибіотикорезистентності в окремих медичних центрахта у різних географічних регіонах з метою спостереження за поширенням антибіотикорезистентності;
3) обґрунтування адекватної антибіотикотерапії в окремих хворих у випадках:
а) виділення мікроорганізмів із первинно стерильних рідин, органів та тканин людини;
б) при виділенні мікроорганізмів з первинно нестерильних біотопів оцінці чутливості повинна передувати оцінка клінічної значущості виділеного мікроорганізму;
в) інфекцій, резистентних до препаратів емпіричної терапії;
г) унікальних інфекцій та відсутності досвіду їхньої терапії;
д) інфекцій, що вимагають пролонгованої терапії (щотижня терапії проводять детекцію антибіотикорезистеності, оскільки можлива зміна збудників).
Визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків недоцільно:
1) для представників нормальної мікрофлорилюдини, за її виділення з природних місць проживання;
2) для видів мікроорганізмів, у яких не описано резистентних форм до тих чи інших антибіотиків. Наприклад, Streptococcus pyogenes чутливі до пеніциліну, тому проводити визначення чутливості до цих препаратів у повсякденній практиці є недоцільним.
Зміст теми "Методи визначення чутливості до антимікробних засобів. Побічні ефектиантибіотикотерапії.":Методи визначення чутливості до антимікробних засобів. Мінімальна інгібуюча концентрація (МІК). Метод серійних розведень у рідких середовищах.
Критеріями активності того чи іншого препарату є мінімальна інгібуюча концентрація (МІК) - найменша концентрація препарату, що гальмує зростання тест-культури та мінімальна бактерицидна концентрація (МБК) – найменша концентрація препарату, що викликає бактерицидний ефект.
Метод серійних розведень у рідких середовищах
Метод серійних розведень у рідких середовищахдозволяє встановити мінімальну інгібуючу концентрацію (МІК) та мінімальну бактерицидну концентрацію (МБК) препарату для виділеного збудника. Дослідження можна виконувати у різних обсягах живильного середовища (1-10 мл). Використовують рідкі живильні середовища, що відповідають харчовим потребам збудника. У пробірках (зазвичай восьми) готують серію подвійних розведень препарату на живильному середовищі. Концентрацію зменшують відповідно від 128 до 0,06 мкг/мл (базова концентрація може змінюватись в залежності від активності препарату). Кінцевий обсяг середовища у кожній пробірці становить 1 мл. Контролем служить пробірка, що містить чисте живильне середовище. У кожну пробірку вносять 0,05 мл фізіологічного розчину, що містить 106/мл мікробних клітин. Пробірки інкубують 10-18 год при 37 ° С (або до появи бактеріального зростання контрольної пробірки). Після закінчення зазначеного терміну результати враховують зміни оптичної щільності середовища візуально або нефелометрично. Також можна застосовувати модифікований метод, використовуючи середовище, доповнене глюкозою та індикатором. Зростання мікроорганізмів супроводжується зміною рН середовища та, відповідно, забарвлення індикатора.
