Reakcija fiksacije komplementa (CFR) zasniva se na činjenici da specifični kompleks antigen-antitijelo uvijek adsorbira (veže) komplement za sebe.
Ova reakcija se široko koristi u identifikaciji antigena i u serodijagnostici infekcija, posebno bolesti* uzrokovanih spirohetama (Wassermannova reakcija), rikecijama i virusima.
RSC je složena serološka reakcija. Uključuje komplement i dva sistema antigen-antitijelo. U suštini, to su dvije serološke reakcije.
Prvi sistem - glavni se sastoji od antigena i antitela (jedan je poznat, drugi nije). U to se dodaje određena količina komplementa. Ako se antigen i antitijelo ovog sistema poklapaju, oni će se povezati i vezati komplement. Dobijeni kompleks je fino raspršen i nije vidljiv.
Formiranje ovog kompleksa se otkriva pomoću drugog hemolitičkog ili indikatorskog sistema. Uključuje ovčije crvena krvna zrnca (antigen) i odgovarajući hemolitički serum (antitijelo), odnosno gotov imuni kompleks. U ovom sistemu do lize crvenih krvnih zrnaca može doći samo u prisustvu komplementa. Ako je komplement vezan prvim sistemom (ako u njemu odgovaraju antigen i antitelo), onda u drugom sistemu neće doći do hemolize - pošto nema slobodnog komplementa. Odsustvo hemolize (sadržaj epruvete je zamućen ili se na dnu nalazi sediment eritrocita) evidentira se kao pozitivan RSC rezultat.
Ako u prvom sistemu antigen ne odgovara antitelu, tada se imunološki kompleks neće formirati i komplement će ostati slobodan! Ostajući slobodan, komplement učestvuje u drugom sistemu, uzrokujući hemolizu, rezultat RSC je negativan (sadržaj epruveta je providan - „krv laka“).
Komponente reakcije fiksacije komplementa:
Antigen - obično lizat, ekstrakt, hapten; rjeđe suspenzija.
1.Antitelo-serum sistema pacijenta
2. Komplement - serum zamorci
3. Antigen – crvena krvna zrnca ovaca
4.Antitelo - hemolizin na ovčije crvena krvna zrnca
5.Izotonični rastvor
Zbog činjenice da je u RSC uključen veliki broj složenih komponenti, one se prvo moraju titrirati i uvesti u reakciju u tačnim količinama iu jednake zapremine: 0,5 ili 0,25, rjeđe 0,2 ml. U skladu s tim, cijeli eksperiment se provodi u zapreminama od 2,5, 1,25 ili 1,0 ml (veći volumeni daju precizniji rezultat). Titracija komponenti reakcije se provodi u istoj zapremini kao i eksperiment, zamjenjujući nedostajuće sastojke izotoničnom otopinom.
Priprema sastojaka
Hemolitički serum (hemolizin). Serum je razrijeđen 3 puta manje od njegovog titra (vidi str. 211). Pripremite opće razrjeđenje seruma za cijeli eksperiment, čija se zapremina određuje množenjem volumena seruma u jednoj epruveti (na primjer, 0,5 ml) s brojem epruveta, neznatno većim od broja u eksperimentu.
2. Crvena krvna zrnca ovaca. Pripremite 3% suspenziju ispranih ovčijih eritrocita (vidi str. 211) za cijeli broj epruveta u eksperimentu. Za pripremu hemolitičkog sistema, 30 minuta prije dodavanja u eksperiment, pomiješajte jednake količine razrijeđenog hemolizina i suspenzije crvenih krvnih zrnaca, dodajući serum crvenim krvnim zrncima, dobro promiješajte i inkubirajte 30 minuta na 37˚C.
3. Komplement se obično razblaži 1:10. Mora se titrirati prije svakog eksperimenta. Titar komplementa je njegova najmanja količina, kada se doda u hemolitički sistem, potpuna hemoliza se javlja u roku od 1 sata na 37˚C. Šema titracije komplementa je predstavljena u tabeli 21.
Pažnja! Titrirajte kompliment u istoj količini kao i glavni eksperiment, zamjenjujući sastojke koji nedostaju izotoničnom otopinom.
Obračun rezultata. U kontrolama ne bi smjelo biti ni tragova hemolize, jer jedna od njih ne sadrži komplement, a druga - hemolizin. Kontrole pokazuju da komponente reakcije nemaju hemotoksičnost (sposobnost spontane lize crvenih krvnih zrnaca).
U datoj tabeli U primjeru 21, titar komplementa u razrjeđenju 1:10 je 0,15 ml. U eksperimentu se aktivnost komplementa može smanjiti zbog njegove nespecifične adsorpcije drugim komponentama reakcije, pa se za eksperiment povećava količina komplementa: uzima se doza koja slijedi titar. Ovo je radna doza. U datom primjeru to je jednako 0,2 komplementa u razrjeđenju 1:10. Budući da se sve komponente uključene u RSC moraju uzeti u jednakim količinama (u našem primjeru to je 0:5 ml), potrebno je u radnu dozu komplementa (0,2 ml1:10) dodati 0,3 ml izotonične otopine. Za cijeli eksperiment, volumen svakog od njih (komplementa i izotonične otopine.
Za cijeli eksperiment, volumen svakog od njih (komplementa i izotonične otopine) se množi sa brojem epruveta koje učestvuju u RSC. Na primjer, da biste izvršili eksperiment u 50 epruveta, potrebno je uzeti 10 ml komplementa 1:10 (0,2 mlx50) i 15 ml izotonične otopine (0,3 mlx50).
4. Antigen se obično dobija gotov sa naznačenim titrom, tj. količina koju nakon razblaživanja antigena treba da sadrži 1 ml. na primjer, s titrom od 0,4, razrijedi se u 0,96 ml izotonične otopine. Za eksperiment uzimam količinu antigena jednaku polovini titra (0,5 ml). Ovo je njegova radna doza. Izračunajte ukupno razrjeđenje antigena za cijeli eksperiment množenjem 0,5 ml s brojem epruveta u eksperimentu.
5. Antitelo – serum pacijenta. Svježi serum se inaktivira prije eksperimenta kako bi se uništio komplement prisutan u njemu. Da biste to učinili, zagrijava se 30 minuta na 56˚C u vodenom kupatilu ili u inaktivatoru s termostatom. Posljednja metoda je poželjnija: eliminiše mogućnost pregrijavanja surutke, odnosno njene denaturacije. Denaturirani serumi nisu prikladni za testiranje. Pacijentov serum se obično koristi u razrjeđenju od 1:10 do 1:160.
Tabela br. 14
| Sastojci, ml | epruvete | |||||||||||
| iskustvo | kontrolu | |||||||||||
| Hemolitički sistem | crvena krvna zrnca | |||||||||||
| Izotonični rastvor | 1,45 | 1,4 | 1,35 | 1,3 | 1,25 | 1,2 | 1,15 | 1,1 | 1,05 | 1,0 | 1,5 | 1,5 |
| Dopuna 1:10 | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,35 | 0,4 | 0,45 | 0,5 | ― | 0,5 |
| Hemolitički sistem | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | ― |
| 3% suspenzija crvenih krvnih zrnaca ovaca | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | 0,5 |
| Epruvete se dobro protresu i inkubiraju na 37˚C 1 sat. | ||||||||||||
| rezultat | Nema hemolize | Hemoliza | Nema hemolize |
Imuni serumi se najčešće pripremaju u proizvodnim uslovima i puštaju inaktivirani. Razrijeđeni su 1:50 i više.
Svi sastojci se pripremaju u malom višku.
| Sastojci, ml | Epruvete | |||||||
| Kontrola iskustva | ||||||||
| serum | antigen | Hemolitički sistem | Komplement u radnoj dozi | |||||
| ½ | ||||||||
| Faza 1 Izotonični rastvor | ― | 0,5 | 0,5 | 1,5 | 1,25 | 1,0 | 0,5 | |
| Test serum razrijeđen 1:10 | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ― | |
| Antigen u radnoj dozi | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ||
| Komplement 1:10 u radnoj dozi | 0,5 | 0,5 | 0,5 | ― | 0,25 | 0,5 | 1,0 | |
| Epruvete se dobro protresu i inkubiraju na 37°C 45 minuta 1 sat ili 4°C 18 sati | ||||||||
| Faza 2 hemolitički sistem | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | |
| Epruvete se dobro protresu i inkubiraju na 37˚C do potpune hemolize u epruvetama 2, 3, 6 i 7 | ||||||||
| Rezultat | Pozitivno ili negativan | ― | ― | ++++ | (+) | ― | ― | |
Tabela br. 15
Provođenje glavnog eksperimenta
Prilikom postavljanja eksperimenta, to je izuzetno; Redoslijed dodavanja komponenti je važan. Eksperiment se izvodi u dvije faze.
Faza I. U epruvete se ulije potrebna količina izotonične otopine natrijum hlorida, zatim potrebna zapremina razrijeđenog seruma i radne doze antigena i komplementa u istoj zapremini. Eksperiment mora biti praćen kontrolom svih sastojaka koji su uključeni u njega: seruma, antigena, hemolitičkog sistema i komplementa.
Epruvete se dobro protresu i inkubiraju na 37°C 45 min-1 sat ili na 4°C („RSC na hladnom“) tokom 18 sati. Za to vrijeme, u prisustvu specifičnog kompleksa, dolazi do vezivanja komplementa. Provođenje reakcije "na hladnom" značajno povećava njenu osjetljivost i specifičnost.
Faza II. Na kraju inkubacije u sve epruvete se dodaje 1 ml hemolitičkog sistema, koji se prethodno drži u termostatu 30 minuta (senzibilizovan). Epruvete se protresu i vrate u termostat.
Računovodstveni rezultat o. Epruvete se ostavljaju u termostatu do potpune hemolize u epruvetama 2, 3, 6 i 7 (kontrola seruma, antigena i komplementa za jednu i dvije doze). Hemoliza će se prvo dogoditi u 7. epruveti, koja sadrži dvostruku količinu komplementa. Nakon što dođe do hemolize u ovoj epruveti i njen sadržaj postane potpuno providan, potrebno je posebno pažljivo pratiti preostale kontrole. Čim tečnost u 2., 3. i 6. epruveti postane providna, treba odmah ukloniti stalak sa epruvetama iz termostata. Na činjenicu da pokus nije držan u termostatu duže nego što je potrebno ukazuje i prisustvo blagog zamućenja (nepotpuna hemoliza) u 5. epruveti - sadrži samo polovinu radne doze komplementa i potpuna hemoliza ne može nastupiti ako se eksperiment ispravno postaviti.
Hemoliza u serumu i kontroli antigena (epruvete 2 i 3) ukazuje da su njihove doze pravilno odabrane i da ni serum ni sam antigen ne vezuju komplement.
U kontroli hemolitičkog sistema (epruveta 4), ako radi kako treba, ne bi trebalo da bude ni tragova hemolize – u njemu nema komplementa.
Nakon što ste sigurni da su kontrole ispravno obavljene, možete uzeti u obzir iskustvo. Odsustvo hemolize u epruvetama smatra se pozitivnim rezultatom reakcije. To ukazuje da serum sadrži antitijela specifična za uzeti antigen. Kompleks koji su formirali vezao je komplement i sprečio njegovo učešće u reakciji hemolize. Ako dođe do hemolize u epruvetama, rezultat reakcije se ocjenjuje kao negativan. IN u ovom slučaju ne postoji korespondencija između antigena i antitijela, komplement nije vezan i uključen je u reakciju hemolize.
Paralelno sa pacijentovim serumom, isti eksperiment se izvodi sa očigledno pozitivnim serumom (tj. sa serumom koji sadrži antitijela na dati antigen) i očito negativnim serumom koji ne sadrži specifična antitijela. Ako je eksperiment pravilno postavljen, u prvom slučaju bi trebalo da dođe do kašnjenja hemolize, au drugom slučaju do hemolize.
Intenzitet reakcije se izražava na sljedeći način:
Potpuno odlaganje hemolize. Crvena krvna zrnca stvaraju jednoliku zamućenost ili se talože na dno. U tom slučaju tečnost u epruveti postaje bezbojna;
Približno 25% crvenih krvnih zrnaca je lizirano. Taloga je manje, tečnost iznad je blago ružičasta. Rezultat RSC-a je također ocijenjen kao izrazito pozitivan;
Približno 50% crvenih krvnih zrnaca je lizirano. Talog je mali, tečnost je ružičasta. Pozitivan RSC rezultat;
Približno 75% crvenih krvnih zrnaca je lizirano. Blagi sediment, iznad kojeg se nalazi tečnost intenzivnog boja. Upitan RSC rezultat;
Sva crvena krvna zrnca su lizirana. Tečnost je intenzivne boje i potpuno prozirna. Negativan RSK rezultat.
Ova reakcija se koristi za otkrivanje antitijela u krvnom serumu pacijenata s bakterijskim, virusnim, protozoalnim infekcijama, kao i za identifikaciju i tipizaciju virusa izoliranih od pacijenata.
RSC se odnosi na složene serološke reakcije u kojima pored antigena, antitela i komplementa učestvuje i hemolitički sistem koji otkriva rezultate reakcije. RSC se odvija u dve faze: prva je interakcija antigena sa antitelom uz učešće komplementa i druga je identifikacija stepena vezivanja komplementa pomoću hemolitičkog sistema. Ovaj sistem se sastoji od crvenih krvnih zrnaca ovaca i hemolitičkog seruma dobijenog imunizacijom laboratorijskih životinja crvenim krvnim zrncima. Eritrociti se obrađuju - senzibiliziraju dodavanjem seruma na temperaturu od 37°C u trajanju od 30 minuta. Do lize senzibiliziranih eritrocita ovaca dolazi samo ako se pridruže hemolitičkom sistemu komplementa. U njegovom nedostatku, crvena krvna zrnca se ne mijenjaju. Rezultati RSC zavise od prisustva antitela u test serumu. Ako serum sadrži antitijela homologna antigenu korištenom u reakciji, tada se nastali kompleks antigen-antitijelo vezuje i vezuje komplement. Prilikom dodavanja hemolitičkog sistema, u ovom slučaju neće doći do hemolize, jer se sav komplement troši na specifičnu vezu kompleksa antigen-antitijelo.
Crvena krvna zrnca ostaju nepromijenjena, pa se odsustvo hemolize u epruveti bilježi kao pozitivan RBC. U nedostatku antitijela koja odgovaraju antigenu u serumu, specifični kompleks antigen-antitijelo se ne formira i komplement ostaje slobodan. Kada se doda hemolitički sistem, komplement se veže za njega i izaziva hemolizu crvenih krvnih zrnaca. Uništavanje crvenih krvnih stanica i njihova hemoliza karakterizira negativnu reakciju.
Za stadijum RSC potrebno je: pacijentov serum, komplement, hemolitički sistem koji se sastoji od ovčijih eritrocita i hemolitičkog seruma, kao i izotonični rastvor natrijum hlorida.
Reakcija se provodi u serološkim epruvetama. Ovčja crvena krvna zrnca se dobijaju iz defibrinirane ovčje krvi ispiranjem tri puta izotoničnom otopinom natrijevog klorida. Hemolitički serum proizvodi se gotov u ampulama, čija oznaka označava njegov titar, odnosno maksimalno razrjeđenje seruma, koji i dalje uzrokuje hemolizu kada se doda crvenim krvnim zrncima u prisustvu komplementa. Hemolitički serum se dobija imunizacijom životinja, kao što su zečevi, crvenim krvnim zrncima ovaca. Prilikom postavljanja reakcije serum se koristi u trostrukom titru. Na primjer, titar hemolitičkog seruma je 1:1200, a radno razrjeđenje je 1:400. Kao komplement se koristi svježi krvni serum zamorca (unutar 24-48 sati) ili suvi komplement u ampulama.
Prije izvođenja RSC, komplement se razblaži 1:10 i titrira da bi se ustanovio titar – najmanja količina komplementa koja nastaje hemolizom crvenih krvnih zrnaca kada se kombinuje sa hemolitičkim sistemom koji se koristi u ovoj reakciji. Uzimajući u obzir moguća antikomplementarna svojstva antigena, prilikom stadijuma reakcije dolazi do povećanja od 20-30% do utvrđenog radnog titra komplementa.
Antigen za RSC su suspenzije ubijenih bakterija, ekstrakti pripremljeni iz ovih suspenzija i pojedinačne hemijske frakcije mikroba. Glavni zahtjev za antigen je odsustvo inhibicije aktivnosti komplementa. Ne bi trebalo da ima antikomplementarna svojstva. Da bi se identifikovala ova svojstva antigena, komplement se dodatno titrira u prisustvu antigena koji se koristi u reakciji. Postoje određene šeme za postavljanje RSC-a. Rezultati reakcije se uzimaju u obzir prisustvom ili odsustvom hemolize crvenih krvnih zrnaca u hemolitičkom sistemu. RSC se koristi u dijagnostici sifilisa (Wassermannova reakcija), gonoreje (Bordet-Gengou reakcija), toksoplazmoze, rikecija i virusne bolesti.
Reakcija fiksacije komplementa (CFR) je da kada antigeni i antitijela odgovaraju jedni drugima, oni formiraju imuni kompleks za koji je komplement (C) vezan preko Fc fragmenta antitijela, tj. komplement je vezan kompleksom antigen-antitijelo. Ako se kompleks antigen-antitijelo ne formira, komplement ostaje slobodan.
Specifična interakcija AG i AT je praćena adsorpcijom (vezivanjem) komplementa. Budući da proces fiksacije komplementa nije vizuelno vidljiv, J. Bordet i O. Zhangu su predložili korištenje hemolitičkog sistema (ovčije crvena krvna zrnca + hemolitički serum) kao indikatora, koji pokazuje da li je komplement fiksiran AG-AT kompleksom. Ako AG i AT odgovaraju jedni drugima, tj. formiran je imuni kompleks, tada je komplement vezan ovim kompleksom i hemoliza ne dolazi. Ako AT ne odgovara AG, onda se kompleks ne formira i komplement, ostajući slobodan, kombinuje se sa drugim sistemom i izaziva hemolizu.
Napredak reakcije
Reakcija se odvija u dvije faze koje uključuju dva sistema; bakterijske i hemolitičke. Prva reakcija (specifična) uključuje antigen 4-+ antitijelo + komplement. Pozitivan rezultat reakcije, koji se javlja kada se antitijela poklapaju s antigenom, karakterizira stvaranje specifičnog bakterijskog kompleksa antigen-antitijelo s adsorbiranim, ili, kako kažu, "vezanim" komplementom. Ostajući nevidljiv, kompleks ne izaziva nikakve vanjske promjene u okruženju u kojem je nastao. Negativan RSC rezultat se javlja u odsustvu specifičnog afiniteta između antigena i serumskog antitijela i karakterizira ga očuvanje slobodnog aktivnog komplementa. Prva faza RSC se može izvesti u termostatu na 37°C (1-2 sata) ili u frižideru na 3-4°C (18-20 sati). Uz produženo formiranje imunokompleksa antigen-antitijelo na hladnoći, dolazi do potpunijeg vezivanja komplementa i kao rezultat toga se povećava osjetljivost reakcije. Prilikom provođenja uporednih eksperimenata, sovjetski imunolog akademik. V.I. Ioffe i njegovi studenti su pokazali da je u uslovima produžene fiksacije komplementa na hladnoći moguće uhvatiti 100-500 puta manje količine antigena i dobiti. pozitivni rezultati pri većim razblaženjima imunog seruma nego u eksperimentu fiksacije komplementa na temperaturi od 37°C tokom 1-2 sata. Druga faza reakcije (indikator) se javlja između reagensa hemolitičkog sistema (mešavina 3% suspenzije). eritrocita i hemolitičkog seruma u jednakim volumenima) na temperaturi od 37 °C samo u prisustvu komplementa koji je ostao slobodan iz prve faze reakcije (negativna reakcija). U nedostatku slobodnog aktivnog komplementa ne dolazi do hemolize crvenih krvnih zrnaca pod utjecajem specifičnih hemolizina (reakcija je pozitivna).
Komponente
Reakcija fiksacije komplementa (CFR) je složena serološka reakcija. Za njegovu realizaciju potrebno je 5 sastojaka i to: AG, AT i komplement (prvi sistem), ovčiji eritrociti i hemolitički serum (drugi sistem).
Antigen za RSC mogu biti kulture različitih ubijenih mikroorganizama, njihovi lizati, komponente bakterija, patološki izmijenjeni i normalnih organa, tkivni lipidi, virusi i materijali koji sadrže viruse.
Svježi ili sušeni serum zamorca se koristi kao dodatak.
Mehanizam reakcije
RSK se izvodi u dvije faze: 1. faza - inkubacija smjese koja sadrži tri komponente antigen + antitijelo + komplement; 2. faza (indikator) - otkrivanje slobodnog komplementa u smjesi dodavanjem hemolitičkog sistema koji se sastoji od ovčjih eritrocita i hemolitičkog seruma koji sadrži antitijela na njih. U 1. fazi reakcije, kada se formira kompleks antigen-antitijelo, komplement se vezuje, a zatim u 2. fazi neće doći do hemolize eritrocita senzibiliziranih antitijelima; reakcija je pozitivna. Ako se antigen i antitijelo međusobno ne poklapaju (nema antigena ili antitijela u uzorku za testiranje), komplement ostaje slobodan i u 2. fazi će se pridružiti kompleksu eritrocit - anti-eritrocitno antitijelo, uzrokujući hemolizu; reakcija je negativna.
Aplikacija
Reakcija fiksacije komplementa može se koristiti za:
1) identifikacija specifičnih antitela u nepoznatom serumu na osnovu njihove interakcije sa antigenom poznate prirode;
2) proučavanje svojstava antigena u reakciji sa poznatim specifičnim serumom. Priprema sastojaka za postavljanje RSC.
1. Krvni serum dobijen za istraživanje, uoči reakcije, zagrijava se u vodenom kupatilu na 56°C 30 minuta kako bi se inaktivirao vlastiti komplement. Inaktivirani serum može se čuvati na 3-4°C 5-6 dana. Na dan eksperimenta serum se razblaži izotoničnim rastvorom natrijum hlorida u omjeru 1:5 (0,1 ml test seruma + 0,4 ml izotonične otopine natrijum hlorida).
2. Antigen za proizvodnju CSC mogu biti kulture različitih mikroba, bakterijskih proteina i ekstrakata dobijenih iz mikrobnih kultura, patološki izmijenjenih i normalnih organa i tkiva. Specifičnosti pripreme antigena određene su prirodom infektivnog procesa i karakteristikama njegovog patogena.
3. Komplement je mješavina seruma dobijenih od 3-5 zdravih zamoraca, ili suvi komplement u ampulama.
Neposredno prije upotrebe, serum zamorca se razrijedi izotoničnom otopinom natrijum hlorida u omjeru 1:10 kako bi se dobio osnovni rastvor.
4. Prije izvođenja eksperimenta hemolitički serum se inaktivira zagrijavanjem na temperaturi od 56 °C u trajanju od 30 minuta. Za izvođenje glavnog eksperimenta RSC, kao i za titriranje komplementa i antigena, koristi se hemolitički serum u trostrukom titru. Na primjer, ako je titar hemolitičkog seruma 1:1800, u reakciji se koristi razrjeđenje seruma od 1:600.
5. Eritrociti se dobijaju iz defibrinirane ovčje krvi. Za uklanjanje fibrinskih filmova, krv se filtrira kroz troslojni gazni filter. Dobijeni filtrat se centrifugira, serum se odsisa i ocijedi, a eritrociti se ispiru 3-4 puta centrifugiranjem sa izotoničnim rastvorom natrijum hlorida. Kada se crvena krvna zrnca ispiru posljednji put, supernatantni sloj tekućine trebao bi biti potpuno providan. Od ispranih crvenih krvnih zrnaca u izotoničnom rastvoru natrijum hlorida priprema se 3% suspenzija. Nakon što ste pripremili sastojke uključene u RSC na gore navedeni način, preći na titraciju hemolitičkog seruma, komplementa i antigena.
Udžbenik se sastoji od sedam dijelova. Prvi dio – “Opća mikrobiologija” – sadrži informacije o morfologiji i fiziologiji bakterija. Drugi dio posvećen je genetici bakterija. Treći dio – “Mikroflora biosfere” – ispituje mikrofloru okruženje, njegovu ulogu u kruženju supstanci u prirodi, kao i ljudsku mikrofloru i njen značaj. Četvrti dio – “Učenje o infekciji” – posvećen je patogenim svojstvima mikroorganizama, njihovoj ulozi u infektivnog procesa, a sadrži i informacije o antibioticima i njihovim mehanizmima djelovanja. Peti dio – “Doktrina o imunitetu” – sadrži moderne ideje o imunitetu. Šesti dio – “Virusi i bolesti koje uzrokuju” – pruža informacije o osnovnim biološkim svojstvima virusa i bolestima koje uzrokuju. Sedmi dio - “Privatna medicinska mikrobiologija” – sadrži informacije o morfologiji, fiziologiji, patogenim svojstvima patogena mnogih zarazne bolesti, kao i o savremenim metodama njihova dijagnostika, specifična prevencija i terapiju.
Udžbenik je namijenjen studentima, diplomiranim studentima i nastavnicima viših medicinskih fakulteta obrazovne institucije, univerziteti, mikrobiolozi svih specijalnosti i praktičari.
5. izdanje, revidirano i prošireno
knjiga:
| <<< Назад
|
Naprijed >>> |
Reakcija fiksacije komplementa
Pronađena je jedinstvena sposobnost komplementa da se specifično veže za komplekse antigen + antitijelo različite prirode široka primena u reakciji fiksacije komplementa (CFR). Posebna prednost RSC-a je u tome što priroda antigena uključenog u njega (korpuskularnog ili rastvorljivog) nije bitna, budući da se komplement vezuje za Fc fragment bilo kog antitela povezanog sa IgG i IgM, bez obzira na njegovu specifičnost antitela. Osim toga, RSA je vrlo osjetljiv: omogućava vam da otkrijete količinu antitijela 10 puta manju nego, na primjer, u reakciji precipitacije. RSC su 1901. predložili J. Bordet i O. Zhang. Zasniva se na dva svojstva komplementa:
1) sposobnost vezivanja za kompleks antigen + antitelo;
2) liza crvenih krvnih zrnaca koja se koriste za dobijanje hemolitičkog seruma.
RSK se izvodi u dvije faze, a u njega su uključena dva sistema – eksperimentalni, odnosno dijagnostički i indikatorski. Dijagnostički sistem se sastoji od testnog (ili dijagnostičkog) seruma, koji se zagrijava na 56 °C 30 minuta prije nego što se izvrši reakcija za inaktivaciju komplementa i antigena koji su prisutni u njemu. Ovom sistemu se dodaje standardni dodatak. Njegov izvor je svježa ili sušena surutka zamorca. Smjesa je inkubirana na 37 °C jedan sat. Ako test serum sadrži antitijela, ona će stupiti u interakciju s dodanim antigenom, a rezultirajući kompleksi antigen + antitijelo će vezati dodani komplement. Ako u serumu nema antitijela, neće doći do stvaranja kompleksa antigen + antitijelo, a komplement će ostati slobodan. Obično nema vidljivih manifestacija fiksacije komplementa u ovoj fazi reakcije. Stoga, da bi se razjasnilo pitanje da li je došlo do fiksacije komplementa ili ne, dodaje se drugi indikatorski sistem (inaktivirani hemolitički serum + ovčiji eritrociti) i mješavina svih RSC komponenti se ponovo inkubira na 37 °C 30 - 60 minuta, nakon kojima se ocjenjuju rezultati reakcije. Ako je komplement vezan u prvoj fazi, u dijagnostičkom sistemu, odnosno postoje antitela u serumu pacijenta, a komplement je vezan kompleksom antitela + + antigena, neće doći do lize eritrocita - eritrociti su pozitivni: tečnost je bezbojan, na dnu epruvete se nalazi sediment eritrocita. Ako u serumu nema specifičnih antitela i ne dođe do vezivanja komplementa u dijagnostičkom sistemu, tj. RSC je negativan, onda se komplement nepotrošen u dijagnostičkom sistemu vezuje za kompleks crvenih krvnih zrnaca + antitela indikatorskog sistema i hemolize. javlja se: u epruveti „lakirana krv“, sediment crvenih krvnih zrnaca br. Intenzitet RSC se procjenjuje korištenjem četverostrukog sistema u zavisnosti od stepena kašnjenja hemolize i prisustva sedimenta eritrocita. Reakcija je praćena odgovarajućim kontrolama: kontrola seruma (bez antigena) i kontrola antigena (bez seruma), budući da neki serumi i neki antigeni imaju antikomplementarno djelovanje. Prije izvođenja RSC, sve komponente koje su uključene u njega, osim test seruma ili antigena, podliježu pažljivoj titraciji. Posebno je važno u reakciju uvesti tačnu dozu komplementa, jer njegov nedostatak ili višak može dovesti do lažni rezultati. Titar komplementa je minimalna količina koja, u prisustvu radne doze hemolitičkog seruma, osigurava potpuno otapanje crvenih krvnih zrnaca. Za postavljanje glavnog eksperimenta uzmite dozu komplementa povećanu za 20-25% u odnosu na utvrđeni titar. Titar hemolitičkog seruma je njegovo maksimalno razrjeđenje, koje, kada se pomiješa sa jednakom zapreminom 10% otopine komplementa, potpuno hemolizira odgovarajuću dozu crvenih krvnih stanica u roku od 1 sata na temperaturi od 37 °C. Glavni eksperiment uključuje uzimanje seruma razrijeđenog do 1/3 njegovog titra.
Reakcija fiksacije komplementa je jedna od tradicionalnih serološke reakcije, koji se koristi za dijagnosticiranje mnogih virusnih bolesti, a također čini osnovu za neke druge metode otkrivanja antivirusna antitela. Iako reakcija neutralizacije, inhibicija hemaglutinacije, indirektna hemaglutinacija, vezani imunosorbentni test superiorniji od reakcije fiksacije komplementa po osjetljivosti, međutim, jednostavnost tehnike, rano otkrivanje antitijela, kao i detekcija virusnih antigena koji nemaju hemaglutinirajuća svojstva objašnjavaju njegovu široku upotrebu u virološkim studijama.
Za njegovu proizvodnju nije potreban tako visok stupanj koncentracije i čistoće antigenskih lijekova koji su neophodni za niz drugih imunoloških reakcija. Osim toga, grupna specifičnost antigena za fiksiranje komplementa mnogih virusa omogućuje korištenje reakcije fiksacije komplementa u masovnoj dijagnostici: ova reakcija ne otkriva razlike sojeva i od posebne je vrijednosti kada se proučavaju antigenski odnosi između virusa.
Sam naziv u velikoj mjeri odražava suštinu metode, koja se sastoji od dvije odvojene reakcije. U prvoj fazi reakcija uključuje antigene i antitela (jedna od ovih komponenti je unapred poznata), kao i komplement u titriranoj količini. Ako se antigen i antitijela poklapaju, njihov kompleks veže komplement, što se u drugoj fazi otkriva pomoću indikatorskog sistema (mješavina crvenih krvnih zrnaca ovaca i antiseruma za njih). Ako je komplement vezan za vrijeme interakcije antigena i antitijela, tada ne dolazi do lize crvenih krvnih zrnaca ovaca ( pozitivna reakcija fiksacija komplementa). U slučaju negativne reakcije fiksacije komplementa, nefiksni komplement potiče hemolizu, koja se koristi za procjenu rezultata reakcije.
Glavne komponente reakcije fiksacije komplementa su antigeni (poznati ili detektabilni), antitela (poznati antiserumi ili test serumi), komplement, hemolitički serum i crvena krvna zrnca ovaca; Kao razblaživač koriste se izotonični rastvor natrijum hlorida (pH 7,2-7,4) ili različiti puferski rastvori. Antigeni i serumi mogu biti antikomplementarni, tj. sposobnost adsorbiranja komplementa, što odgađa hemolizu i iskrivljuje rezultat reakcije.
Antigeni za CSC se pripremaju iz organa zaraženih životinja, alantoične ili amnionske tečnosti inficiranih pilećih embriona, kao i tečnosti kulture nakon kultivacije virusa u kulturama ćelija tkiva. Antigeni preparati uvijek sadrže mnogo balastnih tvari iz životinjskih stanica ili kultura tkiva, što također može iskriviti rezultate reakcije.
Nastali virusni antigeni se inaktiviraju, utvrđuje se radna doza, kao i antikomplementarna i hemolitička svojstva. Antigen se zatim titrira u prisustvu komplementa.
Druga glavna komponenta u insceniranju reakcije je komplement. Ovaj izraz znači složen sistem proteini i faktori prisutni u krvi životinja i ljudi. Obično se krvni serum zamorca koristi u reakciji fiksacije komplementa. Aktivnost (titar) komplementa je njegova najmanja količina, u čijoj prisutnosti hemolizin izaziva potpunu hemolizu korišćenog hemolitičkog sistema.
Da bi se identificirala antitijela na viruse koja fiksiraju komplement, serum je potrebno inaktivirati da bi se eliminirao komplement na 560C u trajanju od 30 minuta. Serumi imuniziranih životinja obično se koriste kao referentni serumi. Štoviše, za imunizaciju se koriste virusni antigeni koji su temeljito pročišćeni od nečistoća tkiva, jer u suprotnom dolazi do izražene nespecifične reakcije.
Obavezna komponenta reakcije fiksacije komplementa je hemolitički sistem koji uključuje eritrocite ovaca i hemolitički serum dobijen hiperimunizacijom zečeva eritrocitima ovaca.
Za izvođenje reakcije fiksacije komplementa koriste se sljedeće modifikacije: mikrometoda reakcije fiksacije komplementa u mikrotitratoru sistema Takachi, reakcija dugotrajne fiksacije komplementa, reakcija indirektne fiksacije komplementa, reakcija fiksacije komplementa u gelu, mikrokapljica reakcija fiksacije komplementa, reakcija fiksacije komplementa na čvrstoj bazi.
Iako je osjetljivost reakcije fiksacije komplementa niska, ona ima visoku specifičnost. S tim u vezi, široko se koristi za dijagnozu virusnog pneumoenteritisa kod mladih goveda.
