Indirektna (pasivna) reakcija hemaglutinacije (IRHA) temelji se na činjenici da crvena krvna zrnca, ako se na njihovoj površini adsorbira rastvorljivi antigen, stiču sposobnost aglutinacije u interakciji s antitijelima na adsorbirani antigen. RNGA dijagram je prikazan na sl. 34. RNGA se široko koristi u dijagnostici brojnih infekcija.
Rice. 34. Šema reakcije pasivne hemaglutinacije (RPHA). A - dobijanje eritrocitnog dijagnostikuma: B - RPGA: 1 - eritrocit: 2 - antigen koji se proučava; 3 - dijagnostikum eritrocita; 4 - antitelo na antigen koji se proučava: 5 - aglutinirati
Postavljanje reakcije. Test serum se zagrijava 30 minuta na 56°C, razrjeđuje uzastopno u omjeru 1:10 - 1:1280 i sipa u 0,25 ml u epruvete ili jažice, gdje se 2 kapi eritrocitnog dijagnostikuma (eritrocita sa adsorbiranim antigenom na njima). ) se zatim dodaju.
Kontrole: suspenzija dijagnostikuma eritrocita sa poznatim imunološkim serumom; suspenzija dijagnostikuma sa normalnim serumom; suspenzija normalnih crvenih krvnih zrnaca sa test serumom. U prvoj kontroli trebalo bi da dođe do aglutinacije, u drugoj i trećoj ne bi trebalo da dođe.
Koristeći RIGA, možete otkriti nepoznati antigen ako se poznata antitijela adsorbiraju na crvena krvna zrnca.
Reakcija hemaglutinacije može se izvesti u zapremini od 0,025 ml (mikrometoda) korišćenjem Takachi mikrotitratora.
1. Šta pokazuje pozitivan rezultat rendgenske analize između crvenih krvnih zrnaca i materijala koji se testira na prisustvo virusa?
2. Hoće li doći do aglutinacije crvenih krvnih zrnaca ako im se doda virus i odgovarajući serum? Kako se zove reakcija koja otkriva ovaj fenomen?
Vježbajte
Uzmite u obzir i registrirajte rezultat RIGA.
Reakcija precipitacije
U reakciji precipitacije dolazi do precipitacije specifičnog imunološkog kompleksa koji se sastoji od rastvorljivog antigena (lizat, ekstrakt, hapten) i specifičnog antitijela u prisustvu elektrolita.
Mutni prsten ili talog koji nastaje kao rezultat ove reakcije naziva se precipitat. Ova reakcija se uglavnom razlikuje od reakcije aglutinacije po veličini čestica antigena.
Reakcija precipitacije se obično koristi za određivanje antigena u dijagnozi brojnih infekcija ( antraks, meningitis, itd.); u sudskoj medicini - za određivanje vrste krvi, sperme itd.; u sanitarno-higijenskim studijama - prilikom utvrđivanja falsifikovanja proizvoda; uz njegovu pomoć utvrđuje se filogenetski odnos životinja i biljaka. Za reakciju vam je potrebno:
1. Antitela (precipitini) - imuni serum sa visokim titrom antitela (ne nižim od 1:100.000). Titar precipitirajućeg seruma određen je najvećim razblaženjem antigena s kojim reaguje. Serum se obično koristi nerazrijeđen ili u razrijeđenju od 1:5 - 1:10.
2. Antigen - rastvorene supstance proteinske ili lipoidne polisaharidne prirode (puni antigeni i hapteni).
3. Izotonični rastvor.
Glavne metode za izvođenje reakcije taloženja su: prstenasta reakcija precipitacije i reakcija taloženja u agaru (gelu).
Pažnja! Sve komponente uključene u reakciju taloženja moraju biti potpuno prozirne.
Prstenasta reakcija precipitacije. Pomoću Pasteurove pipete dodajte 0,2-0,3 ml (5-6 kapi) seruma u epruvetu za precipitaciju (serum ne bi trebalo da dođe na zidove epruvete). Antigen u istoj zapremini pažljivo se nanosi na serum, sipajući ga tankom Pasteurovom pipetom duž zida epruvete. Epruveta se drži u nagnutom položaju. Kada se pravilno nanese, treba postojati jasna granica između seruma i antigena. Pažljivo, da ne biste pomešali tečnost, epruvetu stavite u stalak. Ako je reakcija pozitivna, na granici između antigena i antitela formira se zamućeni „prsten“ – talog (vidi sliku 48).
Reakcija je praćena brojnim kontrolama (tabela 18). Redoslijed dodavanja reakcionih sastojaka u epruvetu je veoma važan. Ne možete naslagati serum na antigen (u kontroli - na izotonični rastvor), pošto je relativna gustina seruma veća, on će potonuti na dno epruvete, a granica između tečnosti se neće otkriti.
Tabela 18. Šema za postavljanje prstenaste reakcije taloženja
Bilješka. + prisutnost "prstena"; - odsustvo „prstena“.
Rezultati se bilježe nakon 5-30 minuta, u nekim slučajevima i nakon sat vremena, kao i uvijek počevši od kontrola. „Prsten“ u 2. epruveti ukazuje na sposobnost imunološkog seruma da uđe specifična reakcija sa odgovarajućim antigenom. U 3-5 epruveta ne bi trebalo biti "prstenova" - nema antitijela i antigena koji odgovaraju jedni drugima. “prsten” u 1. epruveti - pozitivan rezultat reakcije - ukazuje da test antigen odgovara uzetom imunološkom serumu, odsustvo "prstena" ("prsten" samo u 2. epruveti) ukazuje na njihovu nedosljednost - negativan rezultat reakcije.
Reakcija precipitacije u agaru (gelu). Posebnost reakcije je da se interakcija antigena i antitijela odvija u gustom mediju, odnosno u gelu. Nastali talog daje mutnu crtu u debljini medijuma. Odsustvo trake ukazuje na neslaganje između komponenti reakcije. Ova reakcija se široko koristi u biomedicinskim istraživanjima, posebno u proučavanju stvaranja toksina u uzročniku difterije.
Kontrolna pitanja
1. Koja je glavna razlika između reakcija aglutinacije i precipitacije?
2. Zašto se zamućeni sastojci ne mogu koristiti u reakciji taloženja?
Vježbajte
1. Postavite reakciju taloženja u prstenu i skicirajte rezultat.
2. Proučite prirodu interakcije antigena sa antitelom u reakciji taloženja u agaru, skicirajte rezultat (uzmite šolju od učitelja).
Reakcija lize (imuna citoliza)
Imunološka liza je otapanje ćelija pod uticajem antitela kada obavezno učešće dopuna. Za reakciju vam je potrebno:
1. Antigen - mikrobi, crvena krvna zrnca ili druge ćelije.
2. Antitijelo (lizin) - imuni serum, rjeđe serum pacijenata. Bakteriolitički serum sadrži antitijela uključena u lizu bakterija; hemolitički - hemolizini koji potiču lizu crvenih krvnih zrnaca; za lizu spiroheta potrebni su spirohetolizini, ćelije - itolizini itd.
3. Dopuna. Većina komplementa u serumu zamorci. Ovaj serum (mješavina nekoliko životinja) se obično koristi kao komplementar. Svježi (nativni) komplement je nestabilan i lako se uništava zagrijavanjem, protresanjem ili skladištenjem, tako da se može koristiti ne duže od dva dana nakon prijema. Da bi se očuvao komplement, dodaje mu se 2%. borna kiselina i 3% natrijum sulfata. Ovaj dodatak se može čuvati na 4°C do dvije sedmice. Najčešće se koristi suhi komplement. Prije upotrebe, otopi se u izotoničnoj otopini do prvobitne zapremine (navedene na etiketi).
4. Izotonični rastvor.
Reakcija hemolize(Tabela 19). Za reakciju vam je potrebno:
1. Antigen - 3% suspenzija ispranih ovčijih eritrocita u količini od 0,3 ml sedimenta eritrocita i 9,7 ml izotonične otopine.
2. Antitijelo - hemolitički serum (hemolizin) protiv eritrocita ovaca; obično pripremljen u proizvodnji, liofiliziran i titar je naveden na etiketi.
Titar hemolizina je najveće razrjeđenje seruma pri kojem dolazi do potpune hemolize 3% suspenzije crvenih krvnih zrnaca u prisustvu komplementa. Za reakciju hemolize hemolizin se uzima u trostrukom titru, tj. razrijeđen 3 puta manje nego prije titra. Na primjer, s titrom seruma od 1:1200, serum se razrijedi 1:400 (0,1 ml seruma * i 39,9 ml izotonične otopine). Višak hemolizina je neophodan, jer se dio može adsorbirati drugim komponentama reakcije.
* (Ne biste trebali uzimati manje od 0,1 ml seruma - točnost mjerenja će patiti.)
3. Komplement se razblaži 1:10 (0,2 ml komplementa i 1,8 ml izotonične otopine).
4. Izotonični rastvor.
Tabela 19. Shema reakcije hemolize
Obračun rezultata. Ako se reakcija pravilno izvede, u prvoj epruveti će doći do hemolize - njen sadržaj će postati providan. U kontrolama tečnost ostaje mutna: u 2. epruveti nema dovoljno komplementa za hemolizu, u 3. epruveti nema hemolizina, u 4. epruveti nema ni hemolizina ni komplementa, u 5. epruveti ima antigena ne odgovara antitelu,
Ako je potrebno, titrira se hemolitički serum prema sledeći dijagram(Tabela 20).
Prije titracije pripremiti početno razrjeđenje seruma od 1:100 (0,1 ml seruma i 9,9 ml izotonične otopine), od čega neophodna razblaženja, Na primjer:
Iz ovih razblaženja dodajte 0,5 ml seruma u epruvete za titraciju, kao što je prikazano u tabeli. 20.
Tabela 20. Šema titracije hemolitičkog seruma (hemolizin)
U primjeru datom u tabeli. 20, titar hemolitičkog seruma je 1:1200.
Kada se koristi svježi hemolitički serum, on mora biti inaktiviran kako bi se uništio komplement koji je u njemu prisutan. Da biste to učinili, zagrijava se 30 minuta na 56 ° C u vodenoj kupelji ili u inaktivatoru s termostatom. Potonji način je bolji: eliminiše mogućnost pregrijavanja surutke, odnosno njene denaturacije. Denaturirani serumi nisu pogodni za testiranje.
Reakcija bakteriolize. U ovoj reakciji komplement lizira bakterije u prisustvu odgovarajućeg (homolognog) seruma. Shema reakcije je u osnovi slična shemi reakcije hemolize. Razlika je u tome što se nakon dvosatne inkubacije sve epruvete zasijavaju u Petrijeve zdjelice sa podlogom pogodnom za mikroorganizam uzet u eksperiment kako bi se utvrdilo da li je lizirano. Ako je eksperiment izveden ispravno, kulture iz 2-5 epruveta (kontrole) trebale bi pokazati obilan rast. Nedostatak rasta ili slab rast u inokulaciji iz 1. epruvete (pokus) ukazuje na smrt mikroba, odnosno da su oni homologni antitelu.
Pažnja! Reakcija bakteriolize mora se provesti u aseptičnim uvjetima.
Kontrolna pitanja
1. Šta će se dogoditi s crvenim krvnim zrncima ako se umjesto izotonične otopine natrijum hlorida koristi destilovana voda? Šta je osnova ovog fenomena?
2. Kakva će se reakcija dogoditi kada eritrociti stupe u interakciju sa homolognim imunološkim serumom u odsustvu komplementa?
Vježbajte
Postavite reakciju hemolize. Snimite i skicirajte rezultat.
Povezane informacije.
Koristi crvena krvna zrnca ili neutralna sintetički materijali(na primjer, čestice lateksa), na čijoj površini se sorbiraju antigeni (bakterijski, virusni, tkivni) ili antitijela. Njihova aglutinacija nastaje kada se dodaju odgovarajući serumi ili antigeni. Crvena krvna zrnca senzibilizirana antigenima nazivaju se antigenski dijagnostikum eritrocita i koriste se za otkrivanje i titriranje antitijela. Eritrociti senzibilizirani antitijelima. nazivaju se imunoglobulinski eritrocitni dijagnostici i koriste se za otkrivanje antigena.
Reakcija pasivne hemaglutinacije koristi se za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih bakterijama (tifus i paratifus, dizenterija, bruceloza, kuga, kolera itd.), protozoama (malarija) i virusima (gripa, adenovirusne infekcije, virusni hepatitis B, boginje, krpeljni encefalitis, krimska hemoragična groznica i dr.), kao i za određivanje određenih hormona, identifikaciju preosjetljivost pacijent da lijekovi i hormone kao što su penicilin i insulin.
Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA). Test pasivne hemaglutinacije je osjetljiva metoda serološka dijagnostika a koristi se i za ranu i za retrospektivnu dijagnozu, kao i za određivanje imunološkog stanja vakcinisanih osoba. Kod pacijenata sa tularemijom, antitela se obično otkrivaju na kraju 1. ili 2. nedelje bolesti; nakon 1-1,5 meseci titar RPHA dostiže maksimalne performanse(1:100000-1:20000, rijetko više), nakon čega se smanjuju i dugo ostaju na nivou 1:100-1:200.
Kod vakcinisanih osoba antitela se takođe konstantno otkrivaju, međutim, u nižim titrima, ne prelazeći 1:2000-1:5000 1-1,5 meseci nakon vakcinacije, i ostaju nekoliko godina na niskom nivou od 1:20-1:80.
Antigen za postavljanje RPHA je tularemia erythrocyte diagnosticum (antigen). Lijek je formalinizirana ovčja crvena krvna zrnca, senzibilizirana antigenom tularemije, dostupna u tekućem i suhom obliku. Tečni preparat - 10% suspenzija crvenih krvnih zrnaca u rastvoru formaldehida 10% koncentracije. Suhi liofilizirani preparat je vakuumski osušena 10% suspenzija crvenih krvnih zrnaca bez konzervansa. Prije upotrebe razrijedi se prema uputama na etiketi. Za postavljanje reakcije u polistirenskim pločama oba lijeka se koriste u koncentraciji od 2,5%, a pri postavljanju reakcije u mikrovolumenima - u koncentraciji od 0,5%.
Tehnika postavljanja RPGA. Test serumi se razblaže fiziološkim rastvorom 1:5 (1:10) i zagrevaju na 56 stepeni C 30 minuta. Nakon toga, da bi se uklonila heterogena antitijela na ovčje eritrocite, serumi se tretiraju 50% suspenzijom formaliniziranih eritrocita ovaca. Da biste to učinili, dodajte crvena krvna zrnca brzinom od 2 kapi (0,05 ml) na 1 ml seruma i dobro promiješajte protresanjem. Serum se ostavlja dok se eritrociti potpuno ne slegnu ili se centrifugira nakon jednog sata na sobnoj temperaturi, nakon čega je spreman za ispitivanje.
Tečnost za razblaživanje se sipa u zapremini od 0,5 ml u niz jažica na polistirenskoj ploči. Prilikom preliminarnog proučavanja seruma, preporučljivo je testirati ih postavljanjem reakcije u kratkom redu ploče (6 jažica). Ako se antitijela otkriju u kratkoj seriji, serumi se ponovo testiraju u dugoj seriji razrjeđenja (12 jažica). Nakon prolivanja tečnosti za razblaživanje, dodajte 0,5 ml test seruma u razblaženju 1:5 u prvu jažicu svakog reda (kratku ili dugačku). Zatim se iste količine seruma titriraju dvostrukim razblaženjima. Tako se u kratkim serijama dobijaju razblaženja seruma od 1:10 do 1:320, au dugim serijama od 1:10 do 1:20480. Nakon titracije seruma, u svaku jažicu se dodaje jedna kap (0,05 ml) radne 2,5% suspenzije senzibiliziranih eritrocita. Sadržaj ploča se dobro promućka dok se ne dobije homogena suspenzija. Ploče se ostavljaju na sobnoj temperaturi na stacionarnoj površini stola. Preliminarno snimanje reakcije se vrši nakon 2-3 sata, konačno određivanje titra se vrši nakon potpune sedimentacije crvenih krvnih zrnaca u jamicama. Za reakciju su obezbeđene sledeće kontrole: 1) test serum razblažen 1:10 u zapremini od 0,5 ml + 1 kap 2,5% suspenzije nesenzibilizovanih eritrocita; 2) tečnost za razblaživanje u zapremini od 0,5 ml + 1 kap 2,5% suspenzije nesenzibilizovanih eritrocita; 3) tečnost za razblaživanje u zapremini od 0,5 ml + 1 kap 2,5% suspenzije senzibilizovanih eritrocita. Sve kontrole treba da daju jasno negativnu reakciju.
Računovodstvo i procjena RPGA. Reakcija se procjenjuje prema sljedećoj shemi:
1) oštro pozitivna reakcija(++++) - crvena krvna zrnca padaju na dno rupe u ravnom sloju u obliku "kišobrana", koji često ima nazubljeno otapanje rubova;
2) pozitivna reakcija (+++) - crvena krvna zrnca pokrivaju najmanje 2/3 dna bunara;
3) slabo pozitivna reakcija (++) - aglutinat je mali i nalazi se u samom centru bunara;
4) upitna reakcija (+) - oko sedimenta eritrocita u samom centru bunara nalaze se pojedinačna zrna aglutinata;
5) negativan (-) - na dnu rupe se crvena krvna zrnca smjeste u obliku "dugma" ili malog prstena s glatkim, oštro definiranim rubovima.
Titar seruma se uzima u obzir na osnovu posljednjeg razrjeđenja seruma, koje je dalo vrlo jasnu reakciju (najmanje tri plusa). Razrjeđenje od 1:100 ili više smatra se dijagnostičkim titrom, međutim, kao iu slučaju RA, potrebno je pratiti njegovo povećanje.
RPGA za tularemiju je prilično specifičan i otkriva neke unakrsne reakcije samo sa serumima protiv bruceloze. Diferencijalna dijagnoza moguće po visini titara u RPGA, koji su značajno veći kod homolognog antigena.
Tehnika postavljanja RPHA u mikrovolumenima. RPGA se može izvesti u mikrovolumenima pomoću mikrotitratora tipa Takachi (ili mikroploča sa okruglim dnom sa mikropipetama), koji omogućava titraciju materijala u zapreminama od 25 μl i 50 μl. Tehnika reakcije i redoslijed svih operacija isti su kao kod proučavanja u polistirenskim pločama. Treba, međutim, imati na umu da je osjetljivost mikrometode obično jedno razrjeđenje (tj. 2 puta) manja od osjetljivosti makrometode.
Za postavljanje reakcije u mikrotitratoru, tečnost za razrjeđivanje u volumenu od 50 μl se dodaje u svaku jažicu pomoću pipete s kapaljkom. Zatim se pomoću titratora sa glavom od 50 μl skuplja test serum uranjanjem glave u njega. Proverite da li je tečnost ispunila glavu titratora. Titrator sa serumom se prenosi u prvu jažicu i drži je unutra vertikalni položaj, uradite nekoliko rotacionim pokretima povratno putovanje. Zatim se titrator prenosi u sljedeću jažicu i manipulacija se ponavlja. Titracija se može vršiti istovremeno u nekoliko redova. Nakon titriranja cijele serije, titrator se ispere destiliranom vodom (promjenom 2 porcije) rotirajućim pokretima, voda se brišem uklanja iz glave i spaljuje na plamenu plamenika.
Nakon titracije, dodajte 25 μl dijagnostičke tekućine za eritrocite u jažice. Koncentracija dijagnostikuma za RPHA u mikrovolumenima treba da bude 0,5% (tj. 2,5% suspenzija crvenih krvnih zrnaca dodatno se razblaži 5 puta). Nakon dodavanja crvenih krvnih zrnaca, ploče treba lagano protresti dok se ne dobije homogena suspenzija. Rezultati se mogu snimiti u roku od 1-1,5 sati, što je značajna prednost RPGA u mikrotitru. Osim toga, ova tehnika zahtijeva male količine svih reakcionih sastojaka i test seruma.
Reakcija se uzima u obzir prema sljedećoj shemi:
1) „+“ – potpuna hemaglutinacija, u kojoj crvena krvna zrnca padaju na dno bunara u ravnom sloju u obliku „kišobrana“, koji zauzima najmanje 2/3 dna;
2) „+-“ - djelomična hemaglutinacija, u kojoj crvena krvna zrnca padaju na dno u obliku labavog prstena male veličine;
3) „-“ – odsustvo hemaglutinacije, kada crvena krvna zrnca padaju na dno u obliku malog dugmeta ili prstena sa glatkim rubom.
Specifičnost pozitivan rezultat, dobijen u RPHA, može se testirati trokomponentnom reakcijom - reakcijom inhibicije pasivne hemaglutinacije (RPHA).
Tehnika postavljanja RTPGA. Ova reakcija se koristi za potvrdu specifičnosti pozitivnog RPGA rezultata kada je u nedoumici ili je od posebnog epidemiološkog interesa. Mehanizam reakcije je specifična inhibicija hemaglutinacije kada se u test serum doda suspenzija ubijenih bakterija tularemije. U reakciji interaguju tri komponente: test serum, specifični antigen tularemije i antigenski dijagnostikum eritrocita RTPHA se obično postavlja u red od 7-8 jažica. Preporučljivo je instalirati ponovljeni RPGA paralelno sa RTPGA. U dva reda jažica se sipa po 0,25 ml tečnosti za razblaživanje, zatim se u prve jažice oba reda doda test serum u zapremini od 0,25 ml i izvrši se titracija. Dobiju se dva identična reda razblaženja seruma. Dodajte 0,25 ml tečnosti za razblaživanje u sve jažice drugog reda, a 0,25 ml suspenzije bakterije tularemije u jažice prvog reda. Koristi se Tularemia diagnosticum (sadrži 25 milijardi bakterija tularemije u 1 ml), prethodno razrijeđen 50 puta. Ova suspenzija sadrži 500 miliona bakterija u 1 ml ili 125 miliona u zapremini od 0,25 ml. Nakon dodavanja antigena, ploča se ostavi 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega se u sve jažice oba reda doda po jedna kap (0,05 ml) dijagnostikuma eritrocita, ploča se protrese i ostavi na ravnoj površini stola. Obračun se vrši nakon 2-3 sata.
Računovodstvo i procjena RTPGA. Ako test serum sadrži specifična antitijela protiv tularemije, ona se neutraliziraju dodatkom antigena i hemaglutinacija se neće dogoditi u prvom redu jažica, ili, ako visoki titar serumu, hemaglutinacija će se uočiti u manjem (2-4) broja jažica nego u redu sa RPGA. U ovom slučaju je potvrđena specifičnost rezultata. Ako je hemaglutinacija zabilježena u oba reda, tj. Ako se rezultati RTPGA i RPGA poklapaju, to ukazuje na odsustvo antitijela tularemije u test serumu. U ovom slučaju, primarni rezultat RPGA se smatra nespecifičnim.
Tehnika postavljanja RTHG u mikrovolume. RTPGA, kao i RPGA, može se izvesti u mikrovolumenima pomoću mikrotitra tipa Takachi. Da biste to učinili, dodajte 0,25 μl tečnosti za razrjeđivanje u jažice mikroploča u dva reda od po 7-8 jažica. Zatim se pomoću titratora doda 0,25 μl test seruma i titrira u oba reda. Nakon toga se u svaku jažicu u prvom redu dodaje 25 μl antigena tularemije (čija je koncentracija 500 miliona bakterija tularemije u 1 ml), a u drugi red se dodaje 25 μl tečnosti za razblaživanje. Ploče se ostavljaju 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega se u sve jažice oba reda doda 25 μl antigenskog zritrocitnog dijagnostikuma (koncentracija 0,5%). Obračun i evaluacija rezultata se provode slično reakcijama u makrovolumenima.
Sadržaj teme "Imunomodulatori. Imunodijagnostika zaraznih bolesti.":Reakcije pasivne aglutinacije. Indirektne reakcije aglutinacije. Indirektna ili pasivna reakcija hemaglutinacije (IRHA, RPHA). Obrnuti RNGA. Reakcija inhibicije pasivne hemaglutinacije (PHA).
Ove reakcije su pozvani indirektno (pasivno), budući da koriste Ag (ili AT) umjetno sorbiran na površini različitih korpuskularnih čestica.
Indirektna ili pasivna reakcija hemaglutinacije (RNGA, RPGA) je jedna od najosetljivijih seroloških reakcija. Temelji se na sposobnosti AT-a da stupi u interakciju s Ag fiksiranim na različitim crvenim krvnim zrncima, koja zatim aglutiniraju. Za veću stabilnost dijagnostikuma, crvena krvna zrnca se formaliniziraju.
Obrnuti RNGA koristi se za otkrivanje Ag u krvnom serumu; U tu svrhu, ne Ag, već AT se fiksiraju na eritrocite. Reakcije ovog tipa se široko koriste za dijagnosticiranje zaraznih bolesti, utvrđivanje trudnoće, otkrivanje preosjetljivosti na lijekove itd.
Reakcija inhibicije pasivne hemaglutinacije (RTPGA) - dalji razvoj RNGA; u određenom smislu kontroliše njegovu specifičnost. Za razliku od RNGA, uključuje tri komponente; Ag, AT i Ag (AT) adsorbovani na eritrocitima. U početku, Ag reaguje sa AT (standardni antiserum), a zatim se u smešu dodaju eritrociti senzibilisani sa istim Ag (ili AT). Ako tokom interakcije Ag sa AT ne ostane slobodni AT (ili Ag) u sistemu, onda se ne primećuje aglutinacija dijagnostikuma eritrocita.
11621 0
Serološke reakcije se označavaju u skladu sa pojavama koje prate formiranje kompleksa antigen-antitijelo tokom interakcije komponenti različitih svojstava. Postoje reakcije aglutinacije, precipitacije i lize.
Reakcija aglutinacije (RA)
Reakcija aglutinacije (RA) temelji se na korištenju korpuskularnog antigena (suspenzije bakterija, senzibiliziranih eritrocita, čestica lateksa itd.) u interakciji sa specifičnim antitijelima, kao rezultat toga nastali kompleks antigen-antitijelo precipitira. Ova reakcija se široko koristi u laboratorijskoj praksi za serološku dijagnozu. bakterijske infekcije i za identifikaciju izolovanih mikroorganizama.
RA se koristi za dijagnostiku mnogih infektivnih bolesti: bruceloze (Wright, Heddlesonova reakcija), tularemije, leptospiroze (RAL - Leptospira aglutinacija i reakcija lize), listerioze, tifusa (RAR - Rickettsia aglutination reakcija), šigeloze, yersiniosis, pseudotu itd.
Indirektna ili pasivna reakcija aglutinacije (RIGA ili RPGA).
Za insceniranje ove reakcije koriste se crvena krvna zrnca životinja (ovce, majmuni, zamorci, neke ptice) senzibilizirana antitijelima ili antigenom, što se postiže inkubacijom suspenzije crvenih krvnih stanica i otopinom antigena ili imunološkog seruma.
Dijagnostikumi dobijeni na osnovu eritrocita senzibiliziranih antigenima nazivaju se dijagnostici antigena eritrocita. Namijenjeni su za određivanje antitijela u serijskim razrjeđenjima krvnih seruma, na primjer, erythrocyte shigella diagnosticums, erythrocyte salmonella O-diagnosticums.
Shodno tome, naziva se dijagnostika zasnovana na eritrocitima senzibiliziranim specifičnim imunoglobulinima antitela(imunoglobulin) dijagnostikumi a služe za otkrivanje antigena u različitim materijalima, na primjer, eritrocitni imunoglobulin difterija diagnosticum za RIGA, koji se koristi za otkrivanje egzotoksina difterije korinebakterija u tekućem hranjivom mediju kada se u njega inokulira materijal iz nosa i orofarinksa.
Reakcija hemaglutinacije koristi se za dijagnosticiranje kako bakterijskih (tifusna groznica, paratifus, dizenterija, bruceloza, kuga, kolera itd.) tako i virusnih (gripa, adenovirusne infekcije, boginje itd.) infekcija. U smislu osjetljivosti i specifičnosti, RIGA je superiornija od RA.
Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HAI)
Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HAI) se koristi za titriranje antivirusnih antitijela u krvnom serumu, kao i za utvrđivanje vrste izoliranih virusnih kultura. RTGA se može koristiti za njihovu dijagnozu virusne infekcije, čiji patogeni imaju hemaglutinirajuća svojstva.
Princip metode je da serum koji sadrži antitijela na određenu vrstu virusa potiskuje njegovu hemaglutinirajuću aktivnost i crvena krvna zrnca ostaju neaglutinirana.
Reakcija inhibicije (odlaganja) pasivne hemaglutinacije (RPHA).
U RTPGA su uključene tri komponente: imuni serum, antigen (testni materijal) i senzibilizirani eritrociti.
Ako testni materijal sadrži antigen koji specifično reaguje sa imunim antitijelima standardni serum, zatim ih veže, a naknadnim dodavanjem eritrocita senzibiliziranih antigenom homolognim serumu, ne dolazi do hemaglutinacije.
RTPHA se koristi za detekciju mikrobnih antigena, za njihovo kvantitativno određivanje, kao i za kontrolu specifičnosti RTPGA.
Reakcija lateks aglutinacije (RLA)
Čestice lateksa se koriste kao nosioci antitijela (imunoglobulina). RLA je ekspresna metoda za dijagnosticiranje zaraznih bolesti, uzimajući u obzir potrebno vrijeme (do 10 minuta) i mogućnost detekcije antigena u maloj količini test materijala.
RLA se koristi za indikaciju antigena Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae tip b, Neisseria meningitidis u cerebrospinalnoj tečnosti, za otkrivanje streptokoka grupe A u brisevima grla, za dijagnostiku salmoneloze, jersinioze i drugih bolesti. Osetljivost metode je 1-10 ng/ml, odnosno 10³ -10⁶ bakterijskih ćelija u 1 µl.
Reakcija koaglutinacije (CoA)
Reakcija koaglutinacije (CoA) zasniva se na sposobnosti proteina A stafilokoka da veže specifične imunoglobuline. RCA – metoda ekspresne dijagnostike – služi za identifikaciju topljivih termostabilnih antigena u ljudskim sekretima i u sastavu cirkulirajućih imunoloških kompleksa (CIC). Detekcija specifičnih antigena u sastavu CEC-a zahtijeva njihovu preliminarnu precipitaciju iz krvnog seruma.
Reakcija precipitacije
U reakciji precipitacije (RP), kao rezultat interakcije antitijela sa visoko dispergiranim rastvorljivim antigenima (proteini, polisaharidi), nastaju kompleksi uz učešće komplementa - precipitata. To je osjetljiv test koji se koristi za otkrivanje i karakterizaciju raznih antigena i antitijela. Najjednostavniji primjer visokokvalitetnog RP je formiranje neprozirne precipitacijske trake u epruveti na granici slojevitosti antigena na imunološkom serumu - reakcija taloženja prstena. Široko se koriste različiti tipovi RP u polutečnom agaru ili agaroznim gelovima (metoda dvostruke imunodifuzije, metoda radijalne imunodifuzije, imunoelektroforeza).
Reakcija fiksacije komplementa (CFR)
Reakcija fiksacije komplementa (CFR) zasniva se na fenomenu hemolize uz učešće komplementa, tj. sposoban da detektuje samo antitela koja fiksiraju komplement.
RSC se široko koristi za dijagnostiku mnogih bakterijskih i virusnih infekcija, rikecija, klamidije, infektivna mononukleoza, protozoalne infekcije, helmintiaze. RSK je složen serološka reakcija, u kojem su uključena dva sistema: test sistem (krvni serum), predstavljen antigen-antitelo i sistem komplementa, i hemolitički sistem (crvena krvna zrnca ovaca + hemolitički serum). Hemolitički serum je serum krvi kunića inaktiviran toplinom imuniziran eritrocitima ovaca. Sadrži antitijela protiv crvenih krvnih zrnaca ovaca.
Pozitivan RSC rezultat - odsustvo hemolize - se opaža ako test serum sadrži antitijela homologna antigenu. U ovom slučaju nastali kompleks antigen-antitelo vezuje komplement, a u nedostatku slobodnog komplementa, dodavanje hemolitičkog sistema nije praćeno hemolizom. Ako u serumu nema antitela koja odgovaraju antigenu, ne dolazi do stvaranja kompleksa antigen-antitelo, komplement ostaje slobodan i serum izaziva hemolizu crvenih krvnih zrnaca, tj. prisustvo hemolize je negativan rezultat reakcije.
Yushchuk N.D., Vengerov Yu.Ya.
Reakcija aglutinacije - RA(od lat. agglutinatio- adhezija) je jednostavna reakcija u kojoj antitela vezuju korpuskularne antigene (bakterije, eritrocite ili druge ćelije, netopive čestice sa adsorbovanim antigenima na njima, kao i makromolekularne agregate). Javlja se u prisustvu elektrolita, na primjer, kada se doda izotonični rastvor natrijum hlorida.
Prijavite se razne opcije reakcije aglutinacije: ekstenzivne, indikativne, indirektne itd. Reakcija aglutinacije se manifestuje stvaranjem ljuskica ili sedimenta
RA se koristi za:
određivanje antitijela u krvnom serumu pacijenata, na primjer, s brucelozom (reakcije Wright, Heddelson), tifusne groznice i paratifusne groznice (Vidal reakcija) i dr zarazne bolesti;
određivanje patogena izoliranog od pacijenta;
određivanje krvnih grupa pomoću monoklonskih antitijela protiv aloantigena eritrocita.
Određivanje antitijela kod pacijenta stavitiproširena reakcija aglutinacije: dodati u razrjeđenja pacijentovog krvnog seruma diagnosticum(suspenzija ubijenih mikroba) i nakon nekoliko sati inkubacije na 37 °C, bilježi se najveće razrjeđenje seruma (titar seruma), pri čemu je došlo do aglutinacije, odnosno formiranja taloga.
Priroda i brzina aglutinacije ovise o vrsti antigena i antitijela. Primjer su posebnosti interakcije dijagnostikuma (O- i R-antigena) sa specifičnim antitijelima. Reakcija aglutinacije sa O-diagnosticum(bakterije ubijene toplotom, zadržavajući toplotno stabilne O-antigen) javlja se u obliku sitnozrnate aglutinacije. Reakcija aglutinacije sa H-diagnosticumom (bakterije ubijene formaldehidom, zadržavajući termolabilni flagelarni H-antigen) je gruba i teče brže.
Ako je potrebno utvrditi patogen izolovan od pacijenta, staviti indikativna reakcija aglutinacije, uz pomoć dijagnostičkih antitijela (aglutinirajući serum), odnosno vrši se serotipizacija patogena. Indikativna reakcija se izvodi na stakalcu. Čista kultura patogena izolovanog od pacijenta dodaje se kapi dijagnostičkog aglutinirajućeg seruma u razrjeđenju 1:10 ili 1:20. U blizini se postavlja kontrola: umjesto seruma nanosi se kap otopine natrijum hlorida. Kada se u kapi koja sadrži serum i mikrobe pojavi flokulantni sediment, a opsežna reakcija aglutinacije u epruvetama sa sve većim razrjeđenjima aglutinirajućeg seruma, u koje se dodaju 2-3 kapi suspenzije patogena. Aglutinacija se uzima u obzir količinom sedimenta i stepenom bistrine tečnosti. Reakcija se smatra pozitivnom ako se primijeti aglutinacija u razrjeđenju bliskom titru dijagnostičkog seruma. Pri tome se uzimaju u obzir kontrole: serum razrijeđen izotoničnim rastvorom natrijum hlorida treba da bude providan, suspenzija mikroba u istom rastvoru treba da bude jednolično zamućena, bez sedimenta.
Različite srodne bakterije mogu biti aglutinirane istim dijagnostičkim aglutinirajućim serumom, što otežava njihovu identifikaciju. Stoga koriste adsorbirani aglutinirajući serumi, iz kojih su ukrštena antitijela uklonjena adsorpcijom na srodne bakterije. Takvi serumi zadržavaju antitijela koja su specifična samo za datu bakteriju. Proizvodnju specijalnih monoreceptorskih dijagnostičkih aglutinirajućih seruma predložio je A. Castellani (1902).
Indirektna (pasivna) reakcija hemaglutinacije(RNGA, RPGA) zasniva se na upotrebi eritrocita sa antigenima ili antitijelima adsorbiranim na njihovoj površini, čija interakcija s odgovarajućim antitijelima ili antigenima krvnog seruma uzrokuje da se eritrociti zalijepe i ispadnu na dno testa. cijev ili ćelija V u obliku zupčastog sedimenta (sl. 13.2). At negativnu reakciju crvena krvna zrnca se talože ■ u obliku “dugma”. Obično se antitela detektuju u RNGA pomoću antigenskog dijagnostikuma eritrocita, koji je eritrociti sa adsorbovanim on ih sa antigenima. Ponekad se koristi dijagnostika anti-A eritrocita na kojoj se adsorbiraju antitijela. Na primjer, botulinum toksin se može otkriti dodavanjem botulinum toksina eritrocitnog antitijela (ova reakcija se naziva reverzna reakcija indirektne hemaglutinacije- RONG). RNGA se koristi za dijagnosticiranje infektivnih bolesti i određivanje gonadotropnog hormona V urinom prilikom utvrđivanja trudnoće, za utvrđivanje preosjetljivosti na lijekove, hormone iu nekim drugim slučajevima.
COMBES REACTION
(Coombsov test) - metoda za određivanje Rh antitijela na površini crvenih krvnih zrnaca, koja izazivaju taloženje globulina u krvnom serumu. Ovaj test se koristi za dijagnozu hemolitička anemija kod dojenčadi s Rh inkompatibilnošću kod kojih dolazi do uništenja crvenih krvnih stanica.
Reakcija koaglutinacije. Ćelije patogena se određuju pomoću stafilokoka prethodno tretiranih imunološkim dijagnostičkim serumom. Stafilokoki koji sadrže proteine A, koji imaju afinitet prema Fc fragmentu imunoglobulina, nespecifično adsorbiraju antimikrobna antitijela, koja zatim stupaju u interakciju s aktivnim centrima s odgovarajućim mikrobima izoliranim od pacijenata. Kao rezultat koaglutinacije nastaju ljuspice koje se sastoje od stafilokoka, dijagnostičkih serumskih antitijela i otkrivenog mikroba.
Reakcija inhibicije hemaglutinacije(RTGA) se zasniva na blokadi, supresiji virusnih antigena antitelima imunog seruma, usled čega virusi gube sposobnost aglutinacije crvenih krvnih zrnaca (slika 13.3). RTGA se koristi za dijagnosticiranje mnogih virusnih bolesti čiji uzročnici (virusi gripe, ospice, rubeola, krpeljni encefalitis, itd.) mogu aglutinirati crvena krvna zrnca raznih životinja.
- Grupa ljekara iz Svjetske zdravstvene organizacije stigla je u Indiju da identifikuje pacijente sa dječjom paralizom i pomogne u provođenju univerzalne vakcinacije protiv dječje paralize. U jednom od ispitanih sela ljekarima je doveden 6-godišnji dječak iz višečlane porodice koji se razbolio prije 5 dana. Temperatura je naglo porasla, pojavila se jaka glavobolja, opetovano povraćanje, bolovi u rukama i nogama. Nakon pregleda: toplota, teška slabost, meningealni simptomi, na desna noga smanjena mišićni tonus, tetivni refleksi su naglo oslabljeni, stopalo visi. Prilikom punkcije kičmenog kanala došlo je do izlivanja cerebrospinalne tečnosti visok krvni pritisak, povećan je broj limfocita, bakterije nisu izolirane. Isporučeno preliminarna dijagnoza"paralitički oblik dječje paralize". Kako se dječak mogao zaraziti? Kako se provodi specifična aktivna prevencija dječje paralize? Postoji li opasnost od zaraze druge djece u ovoj porodici, šta treba učiniti?
odgovor: Dječak se mogao zaraziti fekalno-oralnim putem putem hrane, vode, ali i kapljicama iz zraka. Glavna mjera prevencije dječje paralize je imunizacija živom kulturom vakcine od 3 serotipa Sabin soja.U Rusiji se koristi vakcinacija protiv poliomijelitisa za oralnu primenu proizvodi Institut za poliomijelitis i virusni encefalitis im. M.P. Chumakova. Vakcina je trovalentni preparat atenuiranih Sabin sojeva virusa poliomijelitisa tipova 1, 2, 3, dobijenih iz primarne kulture ćelija bubrega afričkog zelenog majmuna. . Djeca uzrasta od 3 mjeseca do 6 godina podliježu rutinskoj vakcinaciji protiv dječje paralize. Vakcinacije oralnom poliomijelitis vakcinom sprovode se sa 2 ili 4 kapi vakcine oralno tri puta u 3, 4, 5 i 6 meseci sa tri revakcinacije u 18, 20 meseci i 14 godina. Bolesni dječak mora biti hospitaliziran, a sva ostala djeca iz ove porodice moraju biti vakcinisana živom poliomijelitis vakcinom.
- Sastav i upotreba trovalentne polimerne podjedinice tečne vakcine protiv gripe (influenca)
Ovo je molekularna vakcina. Sastav: površinski Ag virusa gripa tri podtipa (A/H1N1, A/H3N2, B). Primjena: za prevenciju gripe
Ispitni karton br. 23
