Reaksyon ng aglutinasyon (mula sa lat. agglutinatio- gluing) - gluing ng corpuscles (bakterya, pulang selula ng dugo, atbp.) sa pamamagitan ng antibodies sa pagkakaroon ng electrolytes.
Reaksyon ng aglutinasyon nagpapakita ng sarili sa anyo ng mga natuklap o sediment na binubuo ng mga corpuscles (halimbawa, bakterya) na "nakadikit" ng mga antibodies (Larawan 7.37). Ang reaksyon ng agglutination ay ginagamit upang: matukoy ang pathogen na nakahiwalay sa pasyente; pagpapasiya ng mga antibodies sa serum ng dugo ng pasyente; pagpapasiya ng mga pangkat ng dugo.
kanin. 7.37 a, b. Agglutination reaksyon saIgM-antibodies (a) atIgG-antibodies (b)
1. Pagpapasiya ng pathogen na nakahiwalay sa pasyente. Tinatayang agglutination reaction sa salamin (Fig. 7.38). Ang isang suspensyon ng bakterya na nakahiwalay mula sa pasyente ay idinagdag sa isang patak ng agglutinating serum (1:20 dilution). Isang flocculent precipitate forms.
kanin. 7.38.
Isang malawak na reaksyon ng agglutination na may pathogen na nakahiwalay sa isang pasyente (Fig. 7.39). Ang isang suspensyon ng bakterya na nakahiwalay mula sa pasyente ay idinagdag sa mga dilution ng agglutinating serum.
kanin. 52
2. Pagpapasiya ng antibodies sa serum ng dugo ng pasyente
Detalyadong reaksyon ng agglutination sa serum ng dugo ng pasyente (Larawan 7.39). Ang Diagnosticum ay idinagdag sa mga dilution ng serum ng pasyente.
- Ang aglutinasyon sa O-diagnosticum (bacteria na pinatay ng init, nananatili ang O-antigen) ay nangyayari sa anyo ng pinong butil na agglutination.
- Ang aglutinasyon sa H-diagnosticum (bacteria na pinatay ng formaldehyde, pinapanatili ang flagellar H-antigen) ay malaki at nangyayari nang mas mabilis.
3. Agglutination reaction para sa pagtukoy ng mga grupo ng dugo Ang reaksyon ng agglutination upang matukoy ang mga pangkat ng dugo ay ginagamit upang itatag ang sistema ng ABO (Talahanayan b) gamit ang pagsasama-sama ng mga erythrocytes na may immune serum antibodies laban sa mga antigen ng pangkat ng dugo na A (I), B (III). Ang kontrol ay: serum na hindi naglalaman ng mga antibodies, i.e. serum AB (IV) pangkat ng dugo; antigens na nakapaloob sa mga pulang selula ng dugo ng mga pangkat A (II), B (III). Ang negatibong kontrol ay hindi naglalaman ng mga antigen, ibig sabihin, ang pangkat O (I) erythrocytes ay ginagamit.
Talahanayan 7.6. Pagpapasiya ng mga pangkat ng dugo ng ABO
| Resulta ng reaksyon |
Grupo |
|
|
pag-aari |
||
|
sinaliksik |
||
|
pulang selula ng dugo na may |
suwero (plasma) |
|
|
pamantayan |
na may pamantayan |
|
|
mga serum | ||
Ang agglutination reaction (RA) ay ang pagdirikit at pag-ulan ng mga mikrobyo o iba pang mga selula sa ilalim ng impluwensya ng mga antibodies sa pagkakaroon ng isang electrolyte. Ang nagresultang precipitate ay tinatawag na agglutinate.
Ginagamit ang RA:
1. Upang makita ang mga antibodies sa serum ng dugo ng pasyente (serodiagnosis).
2. Upang matukoy ang uri at serovar ng isang purong kultura ng mga pathogenic microorganism na nakahiwalay sa isang pasyente (serotyping).
Ang agglutination reaction ay ginagamit upang matukoy ang mga antibodies sa blood serum ng mga pasyente, halimbawa, na may typhoid fever at paratyphoid fever (Vidal reaction), brucellosis (Wright, Heddleson reaction), tularemia, leptospirosis at iba pa Nakakahawang sakit, pati na rin upang matukoy ang pathogen na nakahiwalay sa isang pasyente ( mga impeksyon sa bituka, whooping cough, atbp.). Ginagamit ang RA upang matukoy ang mga pangkat ng dugo, Rh factor, atbp.
Ang reaksyon ay nangangailangan ng mga sumusunod na sangkap:
1. Ang antigen (agglutinogen) ay dapat na corpuscular, iyon ay, ito ay isang suspensyon ng mga nabubuhay o napatay na microorganism (diagnostics m), erythrocytes o iba pang mga cell. Karaniwan, ginagamit ang pang-araw-araw na kultura ng mga microorganism na lumaki sa agar slants. Ang kultura ay hugasan ng 3 - 4 ML ng isotonic solution, inilipat sa isang sterile tube, at ang density ay tinutukoy. Ang suspensyon ay dapat na homogenous at naglalaman ng hanggang 3 bilyong microbial cell bawat 1 ml. Ang paggamit ng isang suspensyon ng mga pinatay na microbes - diagnosticums - pinapadali ang trabaho (inihanda sa produksyon).
2. Ang mga antibodies (agglutinin) ay matatagpuan sa serum ng pasyente (sa panahon ng serodiagnosis) o sa agglutinating serum (sa panahon ng serotyping). Ang agglutinating sera ay nakukuha sa pamamagitan ng pagbabakuna sa mga kuneho na may napatay na bakterya.
Agglutinating titer Ang serum ay tinatawag na pinakamataas na pagbabanto nito, kung saan ito ay tumutugon sa kaukulang antigen sa ilalim ng ilang mga eksperimentong kondisyon.
Ang agglutinating sera ay maaaring native (non-adsorbed) at adsorbed. Ang katutubong sera sa maliliit na dilution ay nakikipag-ugnayan hindi lamang sa uri ng mga mikroorganismo kung saan ang hayop ay nabakunahan upang makuha ang serum, kundi pati na rin sa mga kaugnay na uri ng mga mikroorganismo, dahil naglalaman ang mga ito ng mga antibodies ng grupo (antibodies sa mga mikroorganismo na may mga karaniwang antigen). Ang katutubong sera ay ginagamit para sa isang detalyadong reaksyon ng agglutination (para sa serodiagnosis), na isinasaalang-alang hindi lamang ang pagkakaroon ng reaksyon, kundi pati na rin ang dinamika ng pagtaas ng titer ng antibody.
Kung ang mga antibodies ng grupo ay nakuha (na-adsorbed) mula sa katutubong serum sa pamamagitan ng pakikipag-ugnayan sa mga kaugnay na bakterya na mayroong mga antigen ng grupo, ang adsorbed na sera ay nakuha. Ang adsorbed sera ay maaaring monoreceptor (o type-specific), na naglalaman ng mga antibodies sa isang antigen receptor lamang. Ang polyvalent sera ay binubuo ng pinaghalong ilang adsorbed o non-adsorbed sera. Ang adsorbed sera ay ginagamit para sa reaksyon ng pagsasama-sama ng salamin.
Kapag ang mga hayop ay nabakunahan ng motile bacteria na may H-antigen, ang H-agglutinating sera na naglalaman ng H-antibodies ay nakukuha (halimbawa, Salmonella monoreceptor H-agglutinating serum). Sa pamamagitan ng pagbabakuna ng O-antigen, nakukuha ang O-agglutinating sera na naglalaman ng O-antibodies (halimbawa, ang grupo ng Salmonella na adsorbed O-agglutinating serum, anticholera O-agglutinating serum). Sa pamamagitan ng pagbabakuna na may H- at O-antigens, nakukuha ang sera na may H- at O-antibodies.
Bukod dito, ang O-agglutinin ay gumagawa ng isang pinong butil na agglutinate, at ang H-agglutinin ay gumagawa ng isang magaspang na sediment.
3. Electrolyte - isotonic NaCl solution (0.9% sodium chloride solution na inihanda sa distilled water).
Mayroong dalawang pangunahing pamamaraan para sa pagsasagawa ng reaksyon ng agglutination: isang reaksyon sa salamin (minsan ay tinatawag na indicative o plate reaction) at isang detalyadong reaksyon (sa mga test tubes)
Pagse-set up ng agglutination reaction sa salamin. Dalawang patak ng serum at isang patak ng isotonic sodium chloride solution ay inilapat sa isang walang taba na glass slide. Ang diagnostic agglutinating serum ay kinuha sa isang dilution, na, depende sa titer nito, ay 1:10, 1:25, 1:50 o 1:100. Ang kultura ng mikroorganismo sa ilalim ng pag-aaral ay idinagdag sa isang patak ng serum at isang patak ng isotonic solution gamit ang isang loop at halo-halong lubusan. Ang isang patak ng sodium chloride na may mga microorganism ay antigen control, ang isang drop ng serum na walang microorganism ay serum control. Hindi mo maaaring ilipat ang kultura mula sa isang patak na may serum sa isang patak na may NaCl. Ang reaksyon ay nagaganap sa temperatura ng silid sa loob ng 1-3 minuto. Kung ang kontrol ng serum ay nananatiling malinaw, ang pare-parehong labo ay sinusunod sa kontrol ng antigen, at ang mga agglutinate na natuklap ay lilitaw sa patak kung saan ang kultura ay nahahalo sa serum, kung gayon ang resulta ay itinuturing na positibo. Kung mayroong pare-parehong labo sa drop na may serum at antigen, kung gayon ito ay isang negatibong resulta. Ang reaksyon ay mas malinaw na nakikita laban sa isang madilim na background.
Serum
1. kontrol ng antigen
2. kontrol ng suwero
Mga reaksyon ng immune. Application ng immune reactions sa diagnostics Nakakahawang sakit.
PLANO:
Mga uri ng mga reaksyon ng immune.
Mga kondisyon para sa pagsasagawa ng mga serological reaksyon.
Mga kinakailangan sa suwero.
Ang konsepto ng positibo at negatibong mga resulta.
PANGUNAHING NILALAMAN:
Mga uri ng mga reaksyon ng immune.
Immunological reaksyon – Ito ang pakikipag-ugnayan ng isang antigen sa isang antibody, na tinutukoy ng partikular na pakikipag-ugnayan ng mga aktibong sentro ng antibody (paratope) sa mga epitope ng antigens.
Pangkalahatang pag-uuri ng mga reaksiyong immunological:
serological reaksyon – reaksyon sa pagitan ng antigens (Ag) at antibodies (Ig)
sa vitro ;
mga reaksyon ng cellular kasama ang pakikilahok ng mga immunocompetent na selula;
mga pagsusuri sa allergy - pagtuklas ng hypersensitivity.
Mga reaksyon ng serological: 1) kahulugan, 2) mga yugto, 3) mga layunin ng pagbabalangkas, 4) pangkalahatang pag-uuri.
1) Kahulugan
Mga pamamaraan ng serological pananaliksik (mula sa Latin Serum - serum at logos - pagtuturo) gamit ang antigen-antibody reaction.
2) Mga yugto
2 yugto ng pakikipag-ugnayan:
ako. Tukoy (nakikita) – mabilis na nangyayari, ang mga antibodies ay nagsasama sa kanilang mga katumbas na antigens. Sa yugtong ito, nakikipag-ugnayan ang mga determinant na grupo ng antigens (AG) at mga aktibong sentro ng antibodies (AT).
Ang mga puwersang kasangkot sa pagbuo ng AG + AT complex ay:
palawit;
van der Waals
Hydrogen bonds.
wala nakikitang pagbabago wala sa yugtong ito. Ipinapakita ng electron microscopy ang AG+AT complex sa anyo ng isang sala-sala.
II. Nonspecific – nangyayari nang dahan-dahan, ang nagreresultang antigen-antibody complex ay tumutugon sa isang karagdagang nonspecific environmental factor kung saan nangyayari ang reaksyon, at ito ay nakikita ng mata – gluing, dissolution, precipitation flakes, atbp. Sa pagkakaroon ng electrolyte, bumababa ang singil , bumababa ang solubility, nabubuo ang mga nakikitang conglomerates , namumuo (agglutinate).
3) Pagtatakda ng mga layunin :
a) upang matukoy ang antigen (kilalang antibody na diagnostic serum):
serological identification (pagkilala sa species);
serotyping (pagpapasiya ng serovar) - pagpapasiya ng strain;
sa pathological na materyal (mabilis na diagnostic);
sa purong kultura:
b) upang makita ang mga antibodies (Ig) (antigen ay kilala-diagnosticum):
presensya (mga reaksyon ng husay);
dami (pagtaas ng titer - paraan ng "pinares na serum").
4) Pangkalahatang pag-uuri serological reaksyon :
a) simple (2-component: Ag+Ig):
Mga reaksyon ng agglutination ng RA (na may corpuscular antigen);
PR precipitation reactions (na may natutunaw na antigen);
b) kumplikado (3-sangkap: Ag+Ig+C);
c) gamit ang isang tag.
Mga variant ng agglutination at precipitation reactions
Reaksyon ng aglutinasyon :
Ang Agglutination reaction (RA) ay isang immune reaction ng interaksyon ng isang suspensyon ng antigens (erythrocytes, bacteria) na may antigens sa physiological solution.
Sa panahon ng agglutination, ang mga particle ng AT ay magkakadikit upang bumuo ng flocculent sediment.
Reaksyon passive hematglutination(RPGA) ay isang uri ng agglutination reaction kung saan ginagamit ang isang antibody o antigen erythrocyte diagnosticum (erythrocytes na may AT o AG na adsorbed sa ibabaw ng mga ito).
Ang mga pulang selula ng dugo ay kumikilos bilang mga passive carrier sa reaksyong ito.
Ang pagsusuri ng mga resulta ng RPGA ay isinasagawa bilang mga sumusunod:
- sa positibong reaksyon tinatakpan ng passively adhered red blood cell ang ilalim ng U- o V na butas sa pantay na layer na may scalloped na mga gilid (“payong”);
- sa negatibong reaksyon (sa kawalan ng agglutination), ang mga pulang selula ng dugo ay naipon sa gitnang recess ng butas, na bumubuo ng isang compact na "button" na may malinaw na tinukoy na mga gilid.
Ang hemagglutination inhibition test (HAI) ay ginagamit sa pagsusuri ng mga impeksyon sa viral. Ang ilang mga virus ay naglalaman ng isang protina na tinatawag na hemagglutinin sa kanilang ibabaw, na pinagdikit ang mga pulang selula ng dugo. Ang pagdaragdag ng mga tiyak na antiviral antibodies ay humaharang sa viral hemagglutinin - walang hemagglutination.
Ang indirect hemagglutination reaction (IRHA), o Coombs reaction, ay ginagamit upang matukoy ang mga hindi kumpletong antibodies. Ang pagdaragdag ng antiglobulin serum (AT laban sa Ig ng tao) ay nagpapahusay sa mga resulta ng reaksyon. Ginagamit ang RNGA upang matukoy ang Rh factor.
Upang magsagawa ng agglutination reaction (RA), tatlong sangkap ang kinakailangan:
1) antigen (agglutinogen) AG;
2) antibody(agglutinin) AT;
3)
electrolyte
(isotonic sodium chloride solution).
Ag + AT + electrolyte = aglutinate
Agglutination (mula sa Latin agglutinatio - gluing) - gluing ng corpuscles (bakterya, pulang selula ng dugo, atbp.) Sa pamamagitan ng mga antibodies sa pagkakaroon ng electrolytes - sodium chloride.
Ang RA ay nagpapakita ng sarili sa anyo ng mga natuklap o sediment na binubuo ng mga corpuscles (halimbawa, bakterya, mga pulang selula ng dugo) na "nakadikit" ng mga antibodies.
Ginagamit ang RA para sa:
Direktang reaksyon ng microbial agglutination (RA).
Sa reaksyong ito, direktang pinagsasama-sama ng mga antibodies (agglutinin) ang mga corpuscular antigens (agglutinogens).
Ang mga ito ay karaniwang kinakatawan ng isang suspensyon ng mga hindi aktibo na microorganism (microbial agglutination reaction).
Upang matukoy ang uri ng mga microorganism, gamitinkaraniwang diagnostic agglutinating suwero ( sikat na AT ).
Ang pinakakaraniwan ay lamellar (tinatayang) at pinalawak na RA.
Ang plate RA ay inilagay sa salamin. Gamitin ito bilang pinabilis na pamamaraan pagtuklas ng mga antibodies o pagkakakilanlan ng mga microorganism.
Mga Bahagi:
1. karaniwang diagnostic agglutinating sera (AT);
2. purong kulturang pinag-aaralan mula sa pasyente;
3. solusyon sa asin.
Sa purong kulturang pinag-aaralan, ang mga antigen (AG) ay nasa anyo ng mga particle (microbial cells, erythrocytes at iba pang corpuscular antigens), na pinagdikit ng mga antibodies at namuo.
Halimbawa:
pagtatanghal ng dula nagpapakilala mga reaksyon ng aglutinasyon (RA ) sa salamin para sa layunin ng pagkilala sa coliform bacteria.
Ilapat ang mga patak sa isang glass slide:
1
dysentery
;
2
-th drop: - agglutinating serum laban sa pathogenstyphoid fever
;
(1-2 diagnostic sera)
3
-th drop: - saline solution (kontrol).
Idagdag ang nasubok na purong bacterial culture sa bawat patak. Haluin.
Resulta
:
positibo
- pagkakaroon ng agglutinate flakes,
negatibo
- kawalan ng agglutinate flakes
Konklusyon:Ang mga pinag-aralan na bakterya ay mga sanhi ng ahente ng typhoid fever (natukoy ang mga antigen).
Upang matukoy ang AT sa serum ng pasyente (serological diagnosis), isang karaniwang microbialdiagnosticum , na naglalaman ng suspensyonsikat microbes o ang kanilang mga antigensAG .
Pagpapasiya ng mga pangkat ng dugo ng ABO (hemagglutination reaction (HRA)) – pinagsasama-sama ang mga pulang selula ng dugo.
Mga bahagi ng reaksyon:
1. Pagsusuri ng dugo ng AG (mga pulang selula ng dugo).
2. AT (erythrotests - zoliclones)
Set ng zoliclons:
Coliclone anti-A reagent (pink)
Coliclone anti-B reagent (asul)
Reagent Tsoliklon anti-AV (walang kulay)
3. electrolyte (solusyon sa asin)
Teknik ng pagpapasiya:
1
.
Ang isang patak (0.1 ml) ng anti-A, anti-B at anti-AB zolicone ay inilalapat sa mga balon ng tablet (para sa kontrol).
2.
Sa tabi ng bawat patak ng reagent, ang isang maliit na (0.05-0.01 ml) na patak ng dugong sinusuri ay inilapat.
Pagkatapos ang isang patak ng zoliclone ay halo-halong may isang patak ng dugo gamit ang isang indibidwal na malinis na glass rod.
3.
Ang reaksyon ng agglutination ay bubuo sa unang 3-5 segundo kapag ang plato ay malumanay na inuuga.
Ang mga resulta ng reaksyon ay isinasaalang-alang 2.5 - 3 minuto pagkatapos ng paghahalo ng mga patak. Mula kaliwa hanggang kanan sa mga balon ay anti-A, anti-B, anti-AB.
Ang isang positibong resulta ay ang hitsura ng isang butil-butil na sediment (agglutinate).
positibong RA (+)
Negatibo - walang sediment.
negatibong RA(-)
4.
Pagsusuri ng mga resulta.
O(ako) α β – walang agglutination
A(II) β – agglutination na may anti-A
B(III) α – agglutination na may anti-B
AB(IV)O – agglutination na may anti-A, na may anti-B
Schematic na representasyon ng agglutination.
Ag antigens sa erythrocytes (detectable) + antibodyAT(zoliclon) diagnostic serum
Accounting para sa agglutination sa mga tablet
Reaksyon sa pag-ulan:
Ang reaksyon ng precipitation ay isang immune reaction ng interaksyon ng antigen sa isang natutunaw na estado na may antigen sa isang physiological solution.
Sa panahon ng pag-ulan, nabuo ang isang macromolecular immune complex, na ipinakita sa pamamagitan ng paglipat ng isang transparent na colloidal solution sa isang opaque na suspensyon, o precipitate.
Ang halaga ng parehong mga reagents ay dapat na nasa mahigpit na tinukoy na mga sukat, dahil ang labis sa isa sa mga ito ay binabawasan ang resulta.
Umiiral iba't-ibang paraan pagtatanghal ng reaksyon ng pag-ulan.
1. Ang reaksyon ng pag-ulan ng singsing ay isinasagawa sa mga tubo ng pag-ulan na may maliit na diameter. Ang immune serum ay idinagdag sa test tube at ang natutunaw na antigen ay maingat na pinahiran. Pinaghalong AG at AT dahil sa thermal na paggalaw ng mga molekula, at nakikipag-ugnayan sila. Sa positibong resulta isang singsing ng opaque precipitate forms sa hangganan ng dalawang solusyon.
2. Ang Ouchterlony double immunodiffusion reaksyon ay isinasagawa sa isang agar gel, sa mga balon kung saan ang alinman sa isang solusyon sa AG o isang solusyon sa AT ay idinagdag ayon sa pamamaraan. Ang AG at AT ay nagkakalat sa gel patungo sa isa't isa at, kung ang reaksyon ay positibo, bumubuo ng mga immune complex na nakikita bilang mga linya ng pag-ulan.
Reaksyon sa pag-ulan -ito ay pagbuoat pag-ulan ng natutunaw na molekular na antigen-antibody complex bilang isang ulap na tinatawag na precipitate. Ito ay nabuo sa pamamagitan ng paghahalo ng mga antigen at antibodies sa katumbas na dami.
Mga bahagi ng RA:
precipitating serum (kilalang AT-precipitin);
test serum (hindi kilalang precipitinogen antigen);
pisikal Solusyon.
Ang reaksyon ng pag-ulan ay isinasagawa alinman sa mga espesyal na makitid na tubo ng pagsubok (ring precipitation reaction), o sa mga Petri dish sa mga gel, nutrient media, atbp.
Reaksyon ng ring-pricipitation
Pahayag at pagtatala ng mga resulta ng reaksyonpag-ulan ng singsingpara sa pagtuklas ng pathogen anthrax(Reaksyon ng Ascoli).
pagtatanghal ng dula .
1. Ang materyal na pinag-aaralan (katad, lana, nadama, balahibo, tela, karne, lupa, dumi ng hayop, atbp.) ay pinakuluan sa solusyon ng asin sa loob ng 5-45 minuto. upang makakuha ng isotonic extract (extract). Na-filter.
2. Ang namuong anti-anthrax serum ay ibinubuhos sa isang test tube.
3. Maingat na i-layer ang test material (extract) dito.
Accounting .
Sa loob ng susunod na 10 minuto. Sa mga positibong kaso, lumilitaw ang isang singsing ng labo sa interface sa pagitan ng serum at katas (ring precipitation). Ang reaksyon ng Ascoli ay napakasensitibo at tiyak
Sa tulong nito, posible na mabilis na makilala ang mga materyales na nahawaan ng anthrax.
Reaksyon ng pag-ulan sa agar
Pahayag at pagtatala ng mga resultamga reaksyon ng pag-ulan sa agarupang matukoy ang toxigenicity ng corynebacteria (causative agents ng diphtheria)
pagtatanghal ng dula
Inilagay sa phosphate peptone agar sa isang Petri dish.
1. Maglagay ng strip ng sterile filter paper na binasa sa gitna ng tasa.antitoxic serum.
2. Pagkatapos ng pagpapatayo, sa layo na 1 cm mula sa gilid ng strip, ang mga plake na may diameter na 10 mm ay ibinuhos.mga piling pananim.
Sa isang tasa maaari kang maghasik ng 3 hanggang 10 pananim, isa sa mga itokontrol, dapat malamannakakalason.
Ang mga pananim ay inilalagay sa isang termostat.
Accounting
Ang pagsusuri ay isinasagawa pagkatapos ng 24-48-72 na oras.
Positibong resulta - (kulturatoxigenic) - sa ilang distansya mula sa strip ng papel ay lilitawnamuo na mga linya, « mga arrow ng tendril", na malinaw na nakikita sa ipinadalang liwanag.
Ang figure ay nagpapakita ng precipitation reaction sa agar upang matukoy ang toxigenicity ng diphtheria bacilli. Ang mga katamtamang kultura ay hindi nakabuo ng "mga arrow-tendril"; hindi ito mga toxicogenic na pathogen.
Ang mga strain ng causative agent ng diphtheria ay maaaring toxigenic (paggawa ng exotoxin) at non-toxigenic. Ang pagbuo ng isang exotoxin ay nakasalalay sa pagkakaroon ng bakterya ng isang prophage na nagdadala ng isang tox gene na naka-encode sa pagbuo ng isang exotoxin.
Sa kaso ng sakit, ang lahat ng diphtheria pathogens ay sinusuri para sa toxigenicity - paggawa ng diphtheria exotoxin gamit ang precipitation reaction sa agar
Mga kumplikadong serological reaksyon ( 3-sangkap: Ag+Ig+C):
Complement fixation reaction (CFR).
Ang reaksyon ay isinasagawa sa dalawang yugto.
Sa unang yugto, nakikipag-ugnayan ang AT sa antigen at pandagdag; sa pangalawang yugto, idinagdag ang isang tagapagpahiwatig - ang hemolytic system (isang pinaghalong erythrocytes at anti-erythrocyte serum).
Kung positibo ang resulta, sa unang yugto, ang mga antibodies ay bumubuo ng isang immune complex na may mga antigen, na nagbubuklod sa pandagdag ng pinaghalong reaksyon.
Sa kasong ito, ang mga pulang selula ng dugo ng hemolytic system na idinagdag sa ikalawang yugto ay hindi nawasak.
Kung hindi, ang unbound complement ay nagiging sanhi ng lysis ng indicator red blood cells.
Upang maisakatuparan ito, limang sangkap ang kailangan: AG, AT at complement (unang sistema), mga erythrocytes ng tupa at hemolytic serum (pangalawang sistema) (Fig. 1).
Ang reaksyon ay nangyayari sa dalawang yugto (Larawan 3).
Unang bahagi - pakikipag-ugnayan ng antigen at antibodies habang ipinag-uutos na paglahok pandagdag.
Pangalawa - pagkilala sa mga resulta ng reaksyon gamit ang isang indicator hemolytic system (mga pulang selula ng dugo ng tupa at hemolytic serum). Ang pagkasira ng mga pulang selula ng dugo sa pamamagitan ng hemolytic serum ay nangyayari lamang kung ang pandagdag ay idinagdag sa hemolytic system. Kung ang pandagdag ay dating na-adsorbed sa antigen-antibody complex, kung gayon ang hemolysis ng mga erythrocytes ay hindi mangyayari (Fig.).
Resulta ng eksperimento
tinasa (Larawan 2), na binabanggit ang pagkakaroon o kawalan ng hemolysis sa lahat ng mga tubo. Ang reaksyon ay itinuturing na positibo kapag ang hemolysis ay ganap na naantala, kapag ang likido sa test tube ay walang kulay at ang mga pulang selula ng dugo ay tumira sa ilalim, negatibo - kapag ang mga pulang selula ng dugo ay ganap na na-lysed, kapag ang likido ay matinding kulay ("barnis" na dugo ).
Ang antas ng pagkaantala ng hemolysis ay tinasa depende sa intensity ng kulay ng likido at ang laki ng red blood cell sediment sa ibaba (++++, +++, ++, +).
kanin. 4. Pahayag at resulta ng RSC.
Konklusyon:Ang mga antibodies ay nakita sa test serum.
Binibigyang-daan ka ng RSK na makakita ng mga antibodies sa anumang strain ng parehong serotype ng virus.
Halaga ng diagnostic Mayroon itong:
isang apat na beses na pagtaas sa titer ng antibody sa ipinares na sera (sa panahon ng isang epidemya ng trangkaso);
isang dalawang beses na pagtaas sa serum ng dugo ng mga pasyente na may isang katangian na klinikal na larawan.
Mga reaksyon gamit ang isang tag :
Ang mga pamamaraang ito ay lubhang sensitibo. Ang mga tina, radioactive isotopes, enzyme, atbp. ay ginagamit bilang mga label para sa mga antigen o antibodies.
RIF - reaksyon ng immunofluorescence
Ang reaksyon ng immunofluorescence ay batay sa magaan na indikasyon ng antigen-antibody complex
Naka-link na immunosorbent assay.
Isang modernong pagsubok sa laboratoryo na naghahanap ng mga tiyak na antibodies sa dugo o mga antigen sa mga partikular na sakit upang matukoy hindi lamang ang etiology, kundi pati na rin ang yugto ng sakit.
Ang mga resulta ng ELISA ay maaaring ibigay sa qualitatively at quantitatively.
Sa kasalukuyan, ang ELISA ay ginagamit sa mga sumusunod na sitwasyon:
1) maghanap ng mga tiyak na antibodies sa anumang nakakahawang sakit;
2) paghahanap para sa mga antigens ng anumang mga sakit (nakakahawa, venereological);
3) pananaliksik katayuan sa hormonal pasyente;
4) pagsusuri para sa mga marker ng tumor;
5) pagsusuri para sa pagkakaroon ng mga sakit na autoimmune.
Sa figure, solid-phase ELISA - kilalang antigens (sa kaliwa) adsorbed sa balon ng plate, (sa kanan) sa mga balon ng plate na kilala antigens
Mga kalamangan ng pamamaraang ELISA:
1) Mataas na pagtitiyak at pagiging sensitibo ng pamamaraang ELISA (higit sa 90%).
2) Ang kakayahang matukoy ang sakit at subaybayan ang dinamika ng proseso, iyon ay, paghahambing ng bilang ng mga antibodies sa iba't ibang yugto ng panahon.
3) Availability ng ELISA diagnostics sa anumang institusyong medikal.
Kamag-anak na kawalan: Ang pagtuklas ng isang immune response (antibodies), ngunit hindi ang pathogen mismo, na pinagsama sa isang tag enzyme.
ELISA test (pangkalahatang mekanismo):
Ang batayan ng enzyme immunoassay ay ang immune reaksyon ng antigen at antibody na may pagbuo ng isang immune complex: antigen-antibody, na nagreresulta sa pagbabago sa aktibidad ng enzymatic ng mga tiyak na marka sa ibabaw ng mga antibodies.
Mga bahagi ng reaksyon:
1. Kilala ang AG(AT) - sa balon ng tableta.
2. AT (AG) na pinag-aaralan.
3. AT na may enzyme, partikular sa AT(AG)-AG(AT) complex
4. chromogenic substrate na nakikipag-ugnayan sa enzyme
5. itigil ang solusyon
Pangunahing yugto ng ELISA
1. Sa ibabaw ng mga balon ng plato mayroong isang purified antigen ng isang tiyak na pathogen. Dagdag nila biyolohikal na materyal pasyente, isang tiyak na reaksyon ang nangyayari sa pagitan ng antigen na ito at ng ninanais na antibody (immunoglobulin). Isang complex ang nabuo.
2. Ang isang conjugant ay idinagdag - AT kasama ang enzyme. Ang conjugant ay tiyak sa AT-AG complex ng unang yugto. Ang enzyme ay isinaaktibo.
3. Ang substrate ay idinagdag at ang aktibong enzyme ay tumutugon dito, binabago ang walang kulay na kulay ng solusyon.
4. Ang isang stop solution ay idinagdag upang ihinto ang pakikipag-ugnayan ng enzyme-substrate.
Accounting.
Positibo resulta - pagbabago mga kulay, sa larawan - dilaw.
Pagsusuri ng immunochromatographic
Ang immunochromatographic analysis method (ICA, rapid tests) ay isang mataas na kalidad na paunang paraan ng screening na nagbibigay-daan sa iyong mabilis, sa loob ng ilang minuto, magsagawa ng pagsusuri sa ilalim ng anumang mga kundisyon, kasama. "patlang".
Ang mga pakinabang ng ICA ay kinabibilangan ng:
Bilis at kadalian ng paggamit;
Maliit na dami ng sample, kakulangan ng paghahanda ng sample;
Mura para sa tagagawa at mamimili;
Posibilidad ng paggawa ng mga pagsubok sa malalaking volume;
Dali ng pagbabasa at interpretasyon ng resulta;
Mataas na sensitivity at reproducibility;
Posibilidad ng quantitative determination;
Posibilidad ng paggamit ng mga portable reader na katugma sa isang computer;
Posibilidad ng multi-analysis.
Mga bahagi (inilapat sa test strip):
1. Ang conjugate na may colloidal gold label ay partikular sa nakitang antigen.
2. AT test line – partikular sa AT-AG complex
3. Ang mga abs ng control line ay tiyak sa conjugate.
Setting ng ICA:
1. Ilapat ang sample sa itinalagang panimulang lugar ng strip.
2. Pagkuha ng resulta sa anyo ng paglitaw ng mga kulay na guhit sa lugar ng mga linya ng pagsubok at kontrol.
Accounting
Positibo – kapag may mantsa ang linya ng pagsubok.
Negatibo - kung walang paglamlam ng linya ng pagsubok.
Di-wasto – kung ang linya ng kontrol ay hindi nabahiran.
Pangkalahatang mekanismo ng ICA:
1. Ang sample ay ipinakilala sa panimulang field (sample pad) at nauugnay sa conjugate (isang partikular na katawan na may kulay na label), na matatagpuan sa conjugate pad. Bilang isang resulta, ang isang kulay na kumplikado ay nabuo.
2. Ang nagreresultang kulay na immune complex ay gumagalaw sa ilalim ng pagkilos ng mga puwersa ng capillary kasama ang nitrocellulose membrane At nakikipag-ugnayanna may linya ng pagsubok sa AT.Ang resulta ay isang solong kulay na pink-pulang guhit.
3. AT (conjugate) na hindi nakatali sa nasubok na bandagumagalaw pa at umabot sa control line, nakikipag-ugnayan sa AT ng control line.Bilang resulta, lumilitaw ang pangalawang kulay na guhit.Kung ang pagsusuri ay isinasagawa nang tama, ang Control line ay dapat palaging lumitaw, anuman ang pagkakaroon ng pagsubok na antigen (antibody) sa biological fluid sample.
2. Mga kondisyon para sa pagsasagawa ng serological reactions.
1. Ang pagkakaroon ng homologous - naaayon sa bawat isa antigen at antibody.
2. Malinis at tuyong mga pinggan.
3. Isang tiyak na ratio ng mga gamot (madalas na katumbas).
4. Mandatory na presensya ng isang electrolyte (isotonic NaCl solution).
5. pH neutral o malapit sa bahagyang alkalina.
6. Temperatura +37°C o temperatura ng silid (kinakailangang positibo).
7. Ang kontrol ng antigen at kontrol ng serum (antibody) ay isinasagawa.
3 Mga kinakailangan sa suwero
Ang suwero ay dapat na ganap na transparent nang walang anumang admixture ng mga cell.
Karaniwang natatanggap nila ito sa ika-2 linggo ng pagkakasakit, kapag available na ang mga antibodies.
Ang dugo ay kinuha sa dami ng 3-5 ml sa walang laman na tiyan o 6 na oras pagkatapos kumain.
Upang makakuha ng suwero, ang dugo ay naiwan sa loob ng 1 oras sa temperatura ng silid o naka-centrifuge. Ang suwero ay sinipsip nang maingat upang hindi makuha ang mga nabuong elemento.
Ang mga immune serum ay nakuha mula sa dugo ng mga tao o hayop (karaniwan ay mga kuneho at kabayo), na nabakunahan ayon sa isang tiyak na pamamaraan na may kaukulang antigen (bakuna). Ang mga serum ay kadalasang inihahanda sa paggawa.
4. Ang konsepto ng positibo at negatibong resulta.
RA.
Sa isang positibong reaksyon, ang pasibo na nakadikit na mga pulang selula ng dugo ay sumasakop sa ilalim ng butas sa isang pantay na layer na may mga scalloped na gilid ("payong"); sa kawalan ng agglutination, ang mga pulang selula ng dugo ay naipon sa gitnang recess ng butas, na bumubuo ng isang compact na "button" na may malinaw na tinukoy na mga gilid (tingnan ang mga larawan sa itaas).
RP.
Kung positibo ang resulta, mabubuo ang parang gatas na singsing sa interface ng dalawang solusyon (tingnan ang mga larawan sa itaas).
ELISA.
Ang pagbabago sa kulay ng solusyon ay nangyayari sa isang positibong reaksyon.
RSK.
Naantala ang hemolysis - positibo ang reaksyon; kung ang complement ay libre, ang hemolysis ay sinusunod - ang reaksyon ay negatibo(tingnan ang mga larawan sa itaas).
Mga resulta ng reaksyon ng Wasserman:
a - kumpletong pagkaantala ng hemolysis (+ + ++);
b - binibigkas na pagkaantala sa hemolysis (+ ++);
c - bahagyang pagkaantala ng hemolysis (++);
d - bahagyang pagkaantala sa hemolysis (+);
d - kumpletong hemolysis (-).
Ang reaksyon ay positibo sa bahagyang, binibigkas at kumpletong pagkaantala ng hemolysis, na tinutukoy ng antas ng paglamlam ng mga nilalaman ng mga tubo mula sa light pink hanggang sa maliwanag na pula; ang mga non-hemolyzed erythrocytes ay kasunod na bumubuo ng isang pulang precipitate.
1. Pag-aralan ang materyal
Gumawa ng 3 tala sa video
sa microbiology
"Reaksyon ng Agglutination at mga uri nito (RA)"
Plano:
1. Panimula……………………………………………………………………………………..3
2. RA sa salamin…………………………………………………………………………………….4
3. Test tube RA………………………………………………………………………………………….5
4. Literatura na ginamit…………………………………………………………………………..7
1. Panimula.
Ang pakikipag-ugnayan ng microbial antigen at antibodies ay mahigpit na tiyak sa kalikasan at naglalayong sa katawan ng hayop na neutralisahin ang pathogen at ang mga lason nito. Ang pakikipag-ugnayan ng antigen at antibodies sa vitro, sa ilalim ng ilang mga kundisyon, ay sinamahan ng nakikitang mga phenomena (agglutination, precipitation, immune lysis), na nagpapahintulot sa paggamit ng mga reaksyon ng AG-AT, na tinatawag na serological (mula sa Latin serum), para sa mga praktikal na layunin. Ang mga biofactories ay gumagawa ng mga antigen at immune sera (antibodies) ng isang kilalang partikular na kalikasan (diagnostic). Gamit ang gayong sera sa mga serological na reaksyon, posible na makilala ang isang hindi kilalang mikroorganismo o, gamit ang isang kilalang antigen, upang makita sa katawan ang mga antibodies na na-synthesize bilang tugon sa pagpapakilala ng isang pathogen, at sa gayon ay gumawa ng diagnosis (serological diagnosis). Bilang karagdagan, ang mga serological na reaksyon ay maaaring gamitin upang masuri ang intensity ng immune response pagkatapos ng pagbabakuna o isang nakakahawang sakit.
Ang mga reaksyon ng aglutinasyon, tulad ng hindi direktang agglutination at Coombs, ay batay sa in vitro na interaksyon ng corpuscular antigens na may mga antibodies at ang kakayahan ng mga resultang complex na mag-precipitate. Ang mga bacterial cell o natutunaw na antigens na nakuha mula sa mga microorganism at na-sorbed sa carrier corpuscles: ang mga red blood cell, latex particle, atbp. ay ginagamit bilang corpuscular antigens.
Ang mga antigenic determinants ng corpuscular antigens ay partikular na nakikipag-ugnayan sa mga homologous antibodies (tiyak, hindi nakikitang yugto ng reaksyon), at pagkatapos ay ang mga antigen-antibody complex ay bumubuo ng malalaking conglomerates na nakikita ng mata, na namuo - isang agglutinate (di-tiyak, nakikitang yugto ng reaksyon. ). Ang mga flagellate-free form ng microbes (Brucellae) ay gumagawa ng granular agglutinants, habang ang flagellated forms (Escherichia, Salmonella) ay gumagawa ng malalaking-cotton agglutinant, na tumira sa ilalim ng test tube sa anyo ng isang baligtad na payong at madaling masira kapag inalog. Ang mga antigen at antibodies ay nakikipag-ugnayan lamang sa pagkakaroon ng isang electrolyte (0.8% sodium chloride solution). Ang kurso ng reaksyon ay naiimpluwensyahan ng konsentrasyon ng asin sa electrolyte, ang bilang ng mga microbial cell sa suspensyon, konsentrasyon sa suwero, pH, temperatura at iba pang mga kadahilanan.
Reaksyon ng aglutinasyon (ra).
Mayroong tiyak na agglutination, na batay sa pakikipag-ugnayan ng antigen Sa homologous antibody , na nakapaloob sa katawan ng hayop kung saan ipinakilala ang antigen na ito (immunoaglutination); nonspecific (kemikal), na nagmumula sa mga pagbabago sa pH ng kapaligiran, ang konsentrasyon ng mga electrolyte; spontaneous, na sinusunod kapag ang bakterya (sa R-form) ay nasuspinde sa physiological solution at kapag pinainit, na nauugnay sa isang pagbabago sa colloidal state ng bacterial cell. Antigen , Ang kasangkot sa RA ay tinatawag na agglutinogen, ang antibody ay tinatawag na agglutinin, at ang nagreresultang precipitate ay tinatawag na agglutinate. Kapag nabuo ang isang agglutinate, mahalaga ang quantitative ratio ng antigen at antibodies (ang pinakamainam na phenomenon). Sa labis o kakulangan ng mga antibodies, nangyayari ang pagkaantala.
Ang agglutination reaction (RA) ay isa sa mga unang immunological na reaksyon na ginamit sa microbiological practice. Sa unang pagkakataon (1895), ginamit ni F. Vidal ang RA upang masuri ang typhoid fever. Nang maglaon (1897), ginamit ni A. Wright ang parehong reaksyon upang masuri ang brucellosis sa mga tao. Natagpuan din ng RA ang aplikasyon sa diagnosis ng pullorosis sa mga manok, leptospirosis, nakakahawang pagpapalaglag ng mga mares, pati na rin para sa pag-type ng hindi kilalang microbial culture gamit ang isang kilalang agglutinating serum. Ang RA ay lubhang sensitibo; maaari itong magamit upang makita ang 0.01 μg ng antibody protein nitrogen sa 1 ml.
Ilang variant ng agglutination reaction ang nabuo, na naiiba sa methodological execution at layunin ng pag-aaral.
2. Ra sa salamin.
Sa variant na ito ng RA, ang mga test subject ay maaaring serum o antigen, ngunit kadalasan ang opsyong ito ay ginagamit upang makilala ang mga microorganism.
1. Upang matukoy ang microorganism (m/o), isang patak ng isang kilalang agglutinating serum, halimbawa Salmonella serum, at isang patak ng physiological solution (control) ay inilapat nang hiwalay sa isang walang taba na glass slide. Pagkatapos, gamit ang isang bacteriological loop, ang bacterial mass ng pinag-aralan na kultura ay kinuha mula sa isang kolonya sa isang Petri dish o mula sa ibabaw ng isang slanted MPA sa isang test tube at sinuspinde nang hiwalay sa immune serum at physiological solution hanggang sa makuha ang isang homogenous na suspensyon. . Ang resulta ay isinasaalang-alang pagkatapos ng 2...4 minuto.
Accounting para sa mga resulta: dapat walang mga pagbabago sa control sample. Kung ang bacterial culture ay partikular na tumutugma sa immune serum, lumilitaw ang agglutinate flakes (positibong resulta); kung walang agglutination phenomenon, napagpasyahan na ang bacterial culture sa ilalim ng pag-aaral ay hindi tumutugma sa immune serum.
2. Isaalang-alang natin ang pagtuklas ng mga anittel sa test blood serum gamit ang halimbawa ng rose bengal test na ginamit sa serodiagnosis ng brucellosis. Ang 0.3 ml ng test animal blood serum at 0.03 ml ng brucellosis antigen (rose-Bengal-stained Brucella cells) ay inilalapat sa isang glass slide. Ang mga sangkap ay lubusan na halo-halong sa pamamagitan ng pag-alog ng baso at ang resulta ay isinasaalang-alang pagkatapos ng 4 na minuto.
Pagre-record ng mga resulta: kung positibo ang reaksyon, lilitaw ang mga pink na flakes ng agglutinate. Ang isang serological na reaksyon ng ganitong uri ay inuri bilang husay, dahil maaari itong magamit upang makita ang mga antibodies sa pathogen sa serum ng dugo ng hayop, ngunit imposibleng masuri ang kanilang dami ng nilalaman.
1.1. AGLUTINATION REACTION (RA)
AGLUTINATION REACTION (RA)
Dahil sa pagiging tiyak nito, kadalian ng pagganap at demonstrativeness, ang reaksyon ng agglutination ay naging laganap sa microbiological practice para sa pagsusuri ng maraming mga nakakahawang sakit.
Ang reaksyon ng agglutination ay batay sa pagtitiyak ng pakikipag-ugnayan ng mga antibodies (agglutinins) sa buong microbial o iba pang mga cell (agglutinogens). Bilang resulta ng pakikipag-ugnayan na ito, ang mga particle at agglomerates ay nabuo, na namuo (agglutinate) sa anyo ng mga natuklap.
Ang reaksyon ng agglutination ay maaaring kasangkot sa parehong buhay at napatay na bakterya, spirochetes, fungi, protozoa, rickettsia, pati na rin ang mga pulang selula ng dugo at iba pang mga selula. Ang reaksyon ay nangyayari sa dalawang yugto: ang una (invisible) na tiyak, ang kumbinasyon ng antigen at antibodies, ang pangalawa (nakikita) hindi tiyak, gluing ng antigens, i.e. pagbuo ng agglutinate.
Ang isang agglutinate ay nabuo kapag ang isang aktibong sentro ng isang divalent antibody ay pinagsama sa determinant na grupo ng isang antigen. Ang reaksyon ng agglutination, tulad ng anumang reaksyon ng serological, ay nangyayari sa pagkakaroon ng mga electrolyte.
Sa panlabas, ang pagpapakita ng isang positibong reaksyon ng agglutination ay may dalawang katangian. Sa flagellated microbes na mayroon lamang somatic O2 antigen, ang mga microbial cell mismo ay direktang magkakadikit. Ang agglutination na ito ay tinatawag na fine-grained. Ito ay nangyayari sa loob ng 18 22 oras. v
Ang flagellate microbes ay may dalawang antigens: somatic O2 antigen at flagellar H2 antigen. Kung ang mga selula ay pinagdikit ng flagella, mabubuo ang malalaki at maluwag na mga natuklap at ang reaksyong ito ng agglutination ay tinatawag na coarse-grained. Ito ay nangyayari sa loob ng 2 4 na oras.
Ang reaksyon ng agglutination ay maaaring isagawa kapwa para sa layunin ng qualitative at quantitative na pagpapasiya ng mga tiyak na antibodies sa serum ng dugo ng pasyente, at para sa layunin ng pagtukoy ng mga species ng nakahiwalay na pathogen. v
Ang reaksyon ng agglutination ay maaaring isagawa pareho sa isang pinalawak na bersyon, na nagbibigay-daan sa iyo upang gumana sa serum na diluted sa isang diagnostic titer, at sa isang variant indikasyon na reaksyon, na nagpapahintulot, sa prinsipyo, na makakita ng mga partikular na antibodies o matukoy ang mga species ng pathogen.
Kapag nagsasagawa ng isang detalyadong reaksyon ng agglutination, upang makita ang mga tiyak na antibodies sa serum ng dugo ng paksa, ang test serum ay kinuha sa isang pagbabanto ng 1:50 o 1:100. Ito ay dahil sa ang katunayan na ang mga normal na antibodies ay maaaring naroroon sa napakataas na konsentrasyon sa kabuuan o bahagyang diluted na serum, at pagkatapos ay ang mga resulta ng reaksyon ay maaaring hindi tumpak. Ang materyal na sinusuri sa bersyong ito ng reaksyon ay ang dugo ng pasyente.
Ang dugo ay kinukuha nang walang laman ang tiyan o hindi mas maaga kaysa sa 6 na oras pagkatapos kumain (kung hindi man ay maaaring may mga patak ng taba sa serum ng dugo, na ginagawa itong maulap at hindi angkop para sa pananaliksik). Ang serum ng dugo ng pasyente ay karaniwang nakukuha sa ikalawang linggo ng sakit, pagkolekta ng 3 × 4 ML ng dugo nang sterile mula sa cubital vein (sa oras na ito ang maximum na halaga ng mga tiyak na antibodies ay puro). Ang diagnosticum na inihanda mula sa pinatay ngunit hindi nawasak na mga microbial cell ng isang partikular na species na may partikular na antigenic na istraktura ay ginagamit bilang isang kilalang antigen.
Kapag nagsasagawa ng isang detalyadong reaksyon ng agglutination upang matukoy ang mga species at uri ng pathogen, ang antigen ay isang live na pathogen na nakahiwalay sa materyal na pinag-aaralan. Ang mga antibodies na nakapaloob sa immune diagnostic serum ay kilala. v
Immune diagnostic serum nakuha mula sa dugo ng isang nabakunahang kuneho. Ang pagkakaroon ng natukoy na titer (ang pinakamataas na pagbabanto kung saan ang mga antibodies ay nakita), ang diagnostic serum ay ibinubuhos sa mga ampoules na may pagdaragdag ng isang pang-imbak. Ang serum na ito ay ginagamit para sa pagkakakilanlan ng antigenic na istraktura ng nakahiwalay na pathogen.
MGA OPTION NG AGLUTINATION REACTION
Ang mga reaksyong ito ay nagsasangkot ng mga antigen sa anyo ng mga particle (microbial cells, red blood cell at iba pang corpuscular antigens), na pinagdikit ng mga antibodies at namuo.
Upang magsagawa ng agglutination reaction (RA), tatlong sangkap ang kinakailangan: 1) antigen (agglutinogen); 2) antibody (agglutinin) at 3) electrolyte (isotonic sodium chloride solution).
ORIENTATIVE (PLATE) AGGLUTINATION REACTION (RA)
Ang isang indicative, o plato, RA ay inilalagay sa isang glass slide sa temperatura ng silid. Upang gawin ito, gumamit ng Pasteur pipette upang hiwalay na maglagay ng isang patak ng serum sa isang dilution na 1:10 1:20 at isang control drop ng isotonic sodium chloride solution sa baso. Ang mga kolonya o isang pang-araw-araw na kultura ng bakterya (isang patak ng diagnosticum) ay ipinakilala sa parehong mga bacteriological loop at pinaghalo nang lubusan. Isinasaalang-alang ang mga reaksyon pagkatapos ng ilang minuto, minsan ay gumagamit ng magnifying glass (x5). Sa positibong RA, ang hitsura ng malalaki at maliliit na natuklap sa isang patak ng serum ay napapansin; na may negatibong , ang serum ay nananatiling pantay na maulap.
INDIRECT (PASSIVE) HEMAGLUTINATION REACTION (RNGA, RPGA)
Ginagawa ang reaksyon: 1) upang makita ang mga polysaccharides, protina, extract ng bakterya at iba pang mga nakakalat na sangkap, rickettsiae at mga virus, ang mga complex na may mga agglutinin ay hindi makikita sa conventional RA, o 2) upang makita ang mga antibodies sa sera ng mga pasyente upang ang mga lubhang nakakalat na sangkap na ito at ang pinakamaliit na mikroorganismo.
Ang hindi direkta, o passive, agglutination ay nauunawaan bilang isang reaksyon kung saan nakikipag-ugnayan ang mga antibodies sa mga antigen na na-pre-adsorbed sa mga inert na particle (latex, cellulose, polystyrene, barium oxide, atbp. o sheep red blood cells, human blood group I(0)).
Sa passive hemagglutination reaction (RPHA), ang mga pulang selula ng dugo ay ginagamit bilang isang carrier. Ang mga pulang selula ng dugo na puno ng antigen ay magkakadikit sa pagkakaroon ng mga partikular na antibodies sa antigen na ito at namuo. Ang antigen-sensitized erythrocytes ay ginagamit sa RPGA bilang isang erythrocyte diagnosticum para sa pagtuklas ng mga antibodies (serodiagnosis). Kung ang mga pulang selula ng dugo ay puno ng mga antibodies (erythrocyte antibody diagnosticum), maaari itong magamit upang makita ang mga antigen.
pagtatanghal ng dula. Ang isang serye ng mga serial dilution ng serum ay inihanda sa mga balon ng polystyrene plates. Magdagdag ng 0.5 ml ng malinaw na positibong serum sa penultimate well at 0.5 ml ng physiological solution (controls) sa huling balon. Pagkatapos ay magdagdag ng 0.1 ml ng diluted erythrocyte diagnosticum sa lahat ng mga balon, iling at ilagay sa thermostat sa loob ng 2 oras. v
Accounting. SA positibong kaso Ang mga erythrocytes ay tumira sa ilalim ng butas sa anyo ng isang pantay na layer ng mga cell na may nakatiklop o tulis-tulis na gilid (baligtad na payong); sa negatibo, sila ay tumira sa anyo ng isang pindutan o singsing.
1.2. REAKSIYON NG NEUTRALISASYON. LYSIS,
OPSONOPHAGOCYTIC REACTION, HYPERSENSITIVITY REACTION
REAKSYON NG NEUTRALISATION NG EXOTOXIN NA MAY ANTITOXIN (RN)
Ang reaksyon ay batay sa kakayahan ng antitoxic serum na neutralisahin ang epekto ng exotoxin. Ito ay ginagamit para sa titration ng antitoxic serums at pagpapasiya ng exotoxin.
Kapag titrating ang suwero, ang isang tiyak na dosis ng kaukulang lason ay idinagdag sa iba't ibang mga dilution ng antitoxic serum. Kapag ang antigen ay ganap na neutralisado at walang mga hindi nagamit na antibodies, ang paunang flocculation ay nangyayari. Ang reaksyon ng flocculation ay maaaring gamitin hindi lamang para sa titration ng serum (halimbawa, diphtheria), kundi pati na rin para sa titration ng toxin at toxoid. Ang reaksyon ng pag-neutralize ng lason sa antitoxin ay may malaking praktikal na kahalagahan bilang isang paraan para sa pagtukoy ng aktibidad ng mga antitoxic therapeutic serum. Ang antigen sa reaksyong ito ay isang tunay na exotoxin.
Ang lakas ng antitoxic serum ay tinutukoy ng maginoo na mga yunit ng AE.
1 AE ng botulinum serum ang halaga nito ay neutralisahin ang 1000 DLM ng botulinum toxin. Ang reaksyon ng neutralisasyon upang matukoy ang mga species o uri ng exotoxin (para sa diagnosis ng tetanus, botulism, diphtheria, atbp.) ay maaaring isagawa sa vitro (ayon kay Ramon), at kapag tinutukoy ang toxigenicity ng microbial cells - sa isang gel ( ayon kay Ouchterlony).
Lysis reaction (RL)
Ang isa sa mga proteksiyon na katangian ng immune serum ay ang kakayahang matunaw ang mga microbes o mga elemento ng cellular na pumapasok sa katawan.
Ang mga partikular na antibodies na nagdudulot ng pagkatunaw ng cell (lysis) ay tinatawag na lysine. Depende sa likas na katangian ng antigen, maaari silang maging bacteriolysins, cytolysins, spirochetolysins, hemolysins, atbp.
Ang mga lysine ay nagpapakita ng kanilang epekto lamang sa pagkakaroon ng isang karagdagang salik na pandagdag. Complement bilang isang hindi tiyak na salik humoral na kaligtasan sa sakit, na matatagpuan sa halos lahat ng likido sa katawan, maliban sa cerebrospinal fluid at anterior chamber fluid. Ang isang medyo mataas at pare-pareho ang nilalaman ng pandagdag ay nabanggit sa serum ng dugo ng tao at mayroong maraming nito sa serum ng dugo guinea pig. Sa ibang mga mammal, iba ang nilalaman ng complement sa blood serum.
Complement ay isang komplikadong sistema patis ng gatas protina. Ito ay hindi matatag at bumagsak sa 55 degrees sa loob ng 30 minuto. Sa temperatura ng silid, ang pandagdag ay nawasak sa loob ng dalawang oras. Napakasensitibo sa matagal na pagyanig, mga acid at ultraviolet ray. Gayunpaman, ang pandagdag ay nakaimbak nang mahabang panahon (hanggang anim na buwan) sa isang tuyo na estado sa mababang temperatura. Itinataguyod ng Complement ang lysis ng microbial cells at red blood cells.
Ang isang pagkakaiba ay ginawa sa pagitan ng mga reaksyon ng bacteriolysis at hemolysis.
Ang kakanyahan ng reaksyon ng bacteriolysis ay kapag ang isang tiyak na immune serum ay pinagsama sa kaukulang homologous na buhay na microbial cells sa pagkakaroon ng complement, nangyayari ang microbial lysis.
Ang reaksyon ng hemolysis ay kapag ang mga erythrocyte ay nalantad sa isang tiyak na serum na immune sa kanila (hemolytic) sa pagkakaroon ng pandagdag, ang paglusaw ng mga erythrocytes ay sinusunod, i.e. hemolysis.
Ang reaksyon ng hemolysis sa pagsasanay sa laboratoryo ay ginagamit upang matukoy ang hanay ng mga pandagdag, gayundin upang maitala ang mga resulta mga reaksiyong diagnostic pandagdag pagkapirmi. Ang complement titer ay ang pinakamaliit na halaga nito, na nagiging sanhi ng lysis ng mga pulang selula ng dugo sa loob ng 30 minuto sa isang hemolytic system sa dami na 2.5 ml. Ang reaksyon ng lysis, tulad ng lahat ng mga reaksyon ng serological, ay nangyayari sa pagkakaroon ng isang electrolyte.
MGA REAKSIYON NG HYPERSENSITIVITY (Allergy)
Ang ilang partikular na anyo ng antigen, sa paulit-ulit na pakikipag-ugnayan sa katawan, ay maaaring magdulot ng isang reaksyon na tiyak sa batayan nito, ngunit kabilang ang hindi tiyak na cellular at molekular na mga kadahilanan ng isang matinding tugon sa pamamaga. Mayroong dalawang kilalang anyo ng hypersensitivity: immediate-type hypersensitivity (IHT) at delayed-type hypersensitivity (DTH). Ang unang uri ng reaksyon ay nangyayari sa pakikilahok ng mga antibodies, at ang reaksyon ay bubuo nang hindi lalampas sa 2 oras pagkatapos ng paulit-ulit na pakikipag-ugnay sa allergen. Ang pangalawang uri ay natanto sa tulong ng mga nagpapaalab na mga selulang T (Tgc) bilang pangunahing mga epekto ng reaksyon, na tinitiyak ang akumulasyon ng mga macrophage sa lugar ng pamamaga; ang reaksyon ay nagpapakita mismo pagkatapos ng 6-8 na oras at mas bago.
Ang pag-unlad ng isang hypersensitivity reaksyon ay nauuna sa isang pakikipagtagpo sa isang antigen at ang paglitaw ng sensitization, i.e. ang hitsura ng mga antibodies, aktibong sensitized lymphocytes at passively sensitized cytophilic antibodies ng iba pang mga leukocytes (macrophages, granulocytes).
Ang mga reaksyon ng hypersensitivity ay may tatlong yugto ng pag-unlad: immunological; pathochemical; pathophysiological.
Sa una, tiyak na yugto, ang allergen ay nakikipag-ugnayan sa mga antibodies at (o) sensitized na mga selula. Sa ikalawang yugto, nangyayari ang biological release aktibong sangkap mula sa mga aktibong selula. Ang mga inilabas na tagapamagitan (histamine, serotonin, leukotrienes, bradykinin, atbp.) ay nagdudulot ng iba't ibang mga peripheral effect na katangian ng kaukulang uri ng reaksyon sa ikatlong yugto.
Mga reaksyon hypersensitivity ikaapat na uri
Ang ganitong uri ng mga reaksyon ay sanhi ng pathogenic intercellular na pakikipag-ugnayan ng sensitized T-helper cells, cytotoxic T-lymphocytes (T-killer cells) at activated cells ng mononuclear phagocyte system, sanhi ng matagal na pagpapasigla ng immune system ng bacterial antigens, na nagiging sanhi ng isang kamag-anak na kakulangan ng immune system ng katawan upang alisin mula sa panloob na kapaligiran bacterial pathogens ng mga nakakahawang sakit. Ang mga reaksiyong hypersensitivity na ito ay nagdudulot ng tuberculous na mga cavity ng baga, ang kanilang caseous necrosis at pangkalahatang pagkalasing sa mga pasyenteng may tuberculosis. Ang cutaneous granulomatosis sa tuberculosis at leprosy sa mga terminong morphopathogenetic ay higit sa lahat ay binubuo ng mga reaksyon ng hypersensitivity ng ika-apat na uri.
Karamihan sikat na halimbawa hypersensitivity reaksyon ng ika-apat na uri ito ay isang Mantoux reaksyon na bubuo sa lugar ng intradermal iniksyon ng tuberculin sa isang pasyente na ang katawan at sistema ay sensitized sa mycobacterial antigens. Bilang resulta ng reaksyon, nabuo ang isang siksik na hyperemic papule na may nekrosis sa gitna, na lumilitaw lamang ng ilang oras (mabagal) pagkatapos ng intradermal injection ng tuberculin. Ang pagbuo ng isang papule ay nagsisimula sa paglabas ng mga mononuclear phagocytes ng nagpapalipat-lipat na dugo mula sa vascular bed patungo sa mga intercellular space. Kasabay nito, nagsisimula ang paglipat ng mga polymorphonuclear cell mula sa vascular bed. Pagkatapos ang paglusot ng mga neutrophil ay humupa, at ang infiltrate ay nagsisimulang binubuo pangunahin ng mga lymphocytes at mononuclear phagocytes. Ito ay naiiba sa reaksyon ng Mantoux mula sa reaksyon ng Arthus, kung saan nakararami ang polymorphonuclear leukocytes na naipon sa lugar ng sugat.
Sa type 4 hypersensitivity reactions, ang pangmatagalang pagpapasigla ng sensitized lymphocytes na may antigens ay humahantong sa mga pagbabago sa pathological tissues sa pathologically intense at prolonged release ng cytokines ng T helper cells. Ang matinding paglabas ng mga cytokine sa loci ng pinsala sa tissue ay nagdudulot ng hyperactivation ng mga selula ng mononuclear phagocyte system na matatagpuan doon, na marami sa mga ito, sa isang hyperactivated na estado, ay bumubuo ng mga hibla ng mga epithelioid cells, at ang ilan ay nagsasama sa isa't isa upang bumuo ng mga higanteng selula. Ang mga macrophage, sa ibabaw kung saan nakalantad ang mga bacterial at viral antigens, ay maaaring sirain sa pamamagitan ng paggana ng Tkillers (natural killers).
Ang ikaapat na uri ng hypersensitivity reaction ay naudyok sa pamamagitan ng pagkilala sa isang dayuhang bacterial antigen ng T helper cells na na-sensitize dito. Ang isang kinakailangang kondisyon para sa pagkilala ay ang pakikipag-ugnayan ng mga inducers na may mga antigen na nakalantad sa ibabaw ng mga antigen-presenting cells pagkatapos ng endocytosis at pagproseso ng mga dayuhang immunogens ng mononuclear phagocytes. Isa pa kinakailangang kondisyon pagkakalantad ng mga antigen kasama ng mga molekula ng klase I mula sa pangunahing histocompatibility complex. Pagkatapos ng pagkilala sa antigen, ang mga sensitized na helper cell ay naglalabas ng mga cytokine at, lalo na, interleukin2, na nagpapagana ng mga natural killer cell at mononuclear phagocytes. Ang activated mononuclear phagocytes ay naglalabas ng mga proteolytic enzymes at free oxygen radicals, na pumipinsala sa tissue.
Mga pagsusuri sa skin allergy para maitaguyod ang pagiging sensitibo ng katawan sa mga allergens, matukoy ang antas ng impeksyon nito, halimbawa, tuberculosis, brucellosis, herd immunity, halimbawa, sa tularemia. Batay sa lugar ng pangangasiwa ng allergen, mayroong: 1) mga pagsusuri sa balat; 2) scarification; 3) intradermal; 4) subcutaneous. Ang klinikal na reaksyon sa isang allergen sa panahon ng pagsusuri sa allergy sa balat ay nahahati sa lokal, pangkalahatan at focal, pati na rin ang agaran at naantala.
Ang mga lokal na reaksyon ng uri ng tagapamagitan na GNT ay nangyayari pagkatapos ng 520 minuto, ay ipinahayag sa anyo ng erythema at isang paltos, nawawala pagkatapos ng ilang oras, at tinatasa ng plus method sa pamamagitan ng laki ng erythema, na sinusukat sa mm. Ang mga lokal na reaksyon ng HRT ay nangyayari sa loob ng 24-48 na oras, tumatagal ng mahabang panahon, lumilitaw sa anyo ng isang infiltrate, kung minsan ay may nekrosis sa gitna, at tinatasa ng laki ng infiltrate sa mm, gamit din ang plus system. Sa mga cytotoxic at immunocomplex na uri ng HNT, ang hyperemia at infiltration ay sinusunod pagkatapos ng 3-4 na oras, umabot sa maximum sa 6-8 na oras at humupa pagkatapos ng halos isang araw. Minsan ang pinagsamang mga reaksyon ay sinusunod.
1.3. COMPLEMENT FIXATION REACTION (FFR)
Ang reaksyong ito ay ginagamit sa mga pag-aaral sa laboratoryo upang makita ang mga antibodies sa serum ng dugo para sa iba't ibang mga impeksiyon, pati na rin upang makilala ang pathogen sa pamamagitan ng antigenic na istraktura nito.
Ang reaksyon ng pag-aayos ng pandagdag ay isang kumplikadong reaksyon ng serological at lubos na sensitibo at tiyak.
Ang isang tampok ng reaksyong ito ay ang pagbabago sa antigen sa panahon ng pakikipag-ugnayan nito sa mga tiyak na antibodies ay nangyayari lamang sa pagkakaroon ng pandagdag. Ang complement ay na-adsorbed lamang sa "antibody antigen" complex. Ang "antibody antigen" complex ay nabuo lamang kung mayroong isang affinity sa pagitan ng antigen at ng antibody sa serum.
Ang adsorption ng complement sa "antigen antibody" complex ay maaaring magkaroon ng iba't ibang epekto sa kapalaran ng antigen depende sa mga katangian nito.
Ang ilan sa mga antigens ay sumasailalim sa matalim na pagbabago sa morphological sa ilalim ng mga kundisyong ito, kabilang ang paglusaw (hemolysis, Isaev-Pfeiffer phenomenon, cytolytic action). Binabago ng iba ang bilis ng paggalaw (treponema immobilization). Ang iba pa ay namamatay nang walang biglaang mapanirang pagbabago (bactericidal o cytotoxic effect). Sa wakas, ang complement adsorption ay maaaring hindi sinamahan ng mga pagbabago sa antigen na madaling maobserbahan.
Ayon sa mekanismo ng RSC, nangyayari ito sa dalawang yugto:
- Ang unang yugto ay ang pagbuo ng "antigen antibody" complex at adsorption sa complement complex na ito. Ang resulta ng yugto ay hindi nakikita ng biswal (pakikipag-ugnayan ng antigen at antibodies na may sapilitan na pakikilahok ng pandagdag).
- Ang ikalawang yugto ay isang pagbabago sa antigen sa ilalim ng impluwensya ng mga tiyak na antibodies sa pagkakaroon ng pandagdag. Ang resulta ng yugto ay maaaring makita nang biswal o hindi nakikita (pagtuklas ng mga resulta ng reaksyon gamit ang isang tagapagpahiwatig na hemolytic system (mga pulang selula ng dugo ng tupa at hemolytic serum).
Ang pagkasira ng mga pulang selula ng dugo sa pamamagitan ng hemolytic serum ay nangyayari lamang kung ang pandagdag ay idinagdag sa hemolytic system. Kung ang pandagdag ay dating na-adsorbed sa antigen-antibody complex, kung gayon ang hemolysis ng mga erythrocytes ay hindi mangyayari.
Ang resulta ng eksperimento ay tinasa sa pamamagitan ng pagpuna sa pagkakaroon o kawalan ng hemolysis sa lahat ng mga tubo ng pagsubok. Ang reaksyon ay itinuturing na positibo kapag ang hemolysis ay ganap na naantala, kapag ang likido sa test tube ay walang kulay at ang mga pulang selula ng dugo ay tumira sa ilalim, negatibo kapag ang mga pulang selula ng dugo ay ganap na na-lysed, kapag ang likido ay matinding kulay ("barnis" dugo). Ang antas ng pagkaantala ng hemolysis ay tinasa depende sa intensity ng kulay ng likido at ang laki ng red blood cell sediment sa ibaba (++++, +++, ++, +).
Sa kaso kung ang mga pagbabago sa antigen ay nananatiling hindi naa-access para sa visual na pagmamasid, kinakailangan na gumamit ng pangalawang sistema, na nagsisilbing tagapagpahiwatig, na nagpapahintulot sa isa na masuri ang estado ng pandagdag at gumawa ng konklusyon tungkol sa resulta ng reaksyon.
Ang sistema ng tagapagpahiwatig na ito ay kinakatawan ng mga bahagi ng reaksyon ng hemolysis, na kinabibilangan ng mga erythrocytes ng tupa at hemolytic serum, na naglalaman ng mga tiyak na antibodies sa mga erythrocytes (hemolysins), ngunit hindi naglalaman ng pandagdag. Ang indicator system na ito ay idinagdag sa mga test tube isang oras pagkatapos mailagay ang pangunahing RSC. Kung ang reaksyon ng pag-aayos ng pandagdag ay positibo, kung gayon ang isang antibody antigen complex ay nabuo, na nag-adsorb ng pandagdag sa sarili nito. Dahil ang complement ay ginagamit sa dami na kinakailangan para sa isang reaksyon lamang, at ang lysis ng mga erythrocytes ay maaari lamang mangyari sa pagkakaroon ng complement, kung gayon kapag ito ay na-adsorbed sa "antigen antibody" complex, ang lysis ng mga erythrocytes sa hemolytic (indicator) system ay magkakaroon. hindi mangyari. Kung negatibo ang reaksyon ng pag-aayos ng pandagdag, hindi nabuo ang kumplikadong "antigen antibody", nananatiling libre ang pandagdag, at kapag idinagdag ang hemolytic system, nangyayari ang erythrocyte lysis.
1.4. DNA PROBES. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR),
IMMUNO ENZYME METHOD (ELISA), FLUORESCING ANTIBODY METHOD (FFA)
PARAAN NG PAG-PROBING NG GENE
Ang masinsinang pag-unlad ng molecular biology at ang paglikha ng isang perpektong methodological base para sa genetic research ay naging batayan ng genetic engineering. Sa larangan ng diagnostics, lumitaw ang isang direksyon at mabilis na umuunlad upang matukoy ang mga partikular na nucleotide sequence ng DNA at RNA, ang tinatawag na gene probing. Ang ganitong mga pamamaraan ay batay sa kakayahan ng mga nucleic acid na mag-hybrid at bumuo ng mga double-stranded na istruktura dahil sa interaksyon ng mga pantulong na nucleotides (AT, GC).
Upang matukoy ang nais na pagkakasunud-sunod ng DNA (o RNA), ang isang tinatawag na polynucleotide probe na may isang tiyak na base sequence ay espesyal na nilikha. Ang isang espesyal na label ay ipinakilala sa komposisyon nito, na ginagawang posible upang makilala ang pagbuo ng kumplikado.
Bagama't hindi maiuuri ang gene probing bilang isang paraan ng immunochemical analysis, ang pangunahing prinsipyo nito (ang interaksyon ng mga komplementaryong istruktura) ay pamamaraang ipinapatupad sa parehong paraan tulad ng mga indicator na pamamaraan ng immunodiagnostics. Bilang karagdagan, ginagawang posible ng mga pamamaraan ng pagsusuri ng gene na maglagay muli ng impormasyon tungkol sa isang nakakahawang ahente sa kawalan ng phenotypic expression nito (mga virus na naka-embed sa genome, "silent" na mga gene).
Upang magsagawa ng pagsusuri sa DNA, ang sample ay na-denatured upang makakuha ng mga single-stranded na istruktura kung saan ang DNA o RNA probe molecule ay tumutugon. Upang maghanda ng mga probe, alinman sa iba't ibang mga seksyon ng DNA (o RNA) na nakahiwalay sa isang natural na pinagmulan (halimbawa, isang partikular na mikroorganismo), kadalasang ipinakita sa anyo ng mga genetic sequence sa mga vector plasmids, o ginagamit ang mga chemically synthesized na oligonucleotides. Sa ilang mga kaso, ang mga genomic na paghahanda ng DNA na na-hydrolyzed sa mga fragment ay ginagamit bilang isang probe, kung minsan ay mga paghahanda ng RNA, at lalo na madalas na ribosomal RNA. Ang parehong mga tagapagpahiwatig ay ginagamit bilang isang label tulad ng sa iba't ibang uri ng immunochemical analysis: radioactive isotopes, fluoresceins, biotope (na may karagdagang pag-unlad ng avidin-enzyme complex), atbp.
Ang pagkakasunud-sunod ng pagsusuri ay tinutukoy ng mga katangian ng magagamit na probe
Sa kasalukuyan, ang mga komersyal na kit na naglalaman ng lahat ng kinakailangang sangkap ay lalong ginagamit.
Sa karamihan ng mga kaso, ang pamamaraan ng pagsusuri ay maaaring nahahati sa mga sumusunod na yugto: paghahanda ng sample (kabilang ang pagkuha ng DNA at denaturation), pag-aayos ng sample sa isang carrier (kadalasan ay isang polymer membrane filter), prehybridization, hybridization mismo, paghuhugas ng hindi nakatali na mga produkto, pagtuklas. . Sa kawalan ng isang karaniwang paghahanda ng DNA o RNAprobe, ito ay unang nakuha at may label.
Upang maghanda ng sample, maaaring kailanganin na paunang "palaguin" ang materyal na pansubok upang matukoy ang mga indibidwal na kolonya ng bakterya o mapataas ang konsentrasyon ng mga virus sa isang kultura ng cell. Isinasagawa din direktang pagsusuri mga sample ng serum ng dugo, ihi, hugis elemento dugo o buong dugo para sa pagkakaroon ng isang nakakahawang ahente. Upang palabasin ang mga nucleic acid mula sa mga istruktura ng cellular, ang cell lysis ay isinasagawa, at sa ilang mga kaso ang paghahanda ng DNA ay dinadalisay gamit ang phenol.
Ang denaturation ng DNA, ibig sabihin, ang paglipat nito sa isang single-stranded form, ay nangyayari kapag ginagamot sa alkali. Ang sample ng nucleic acid ay pagkatapos ay naayos sa isang suporta, isang nitrocellulose o nylon membrane, kadalasan sa pamamagitan ng pagpapapisa ng itlog sa loob ng 10 minuto hanggang 4 na oras sa 80°C sa isang vacuum. Dagdag pa, sa proseso ng prehybridization, ang hindi aktibo ng mga libreng nagbubuklod na site ay nakamit upang mabawasan ang hindi tiyak na pakikipag-ugnayan ng probe sa lamad. Ang proseso ng hybridization ay tumatagal mula 2 hanggang 20 oras, depende sa konsentrasyon ng DNA sa sample, ang konsentrasyon ng probe na ginamit at ang laki nito.
Matapos makumpleto ang hybridization at ang mga hindi nakatali na produkto ay hugasan, ang nabuong complex ay nakita. Kung ang probe ay naglalaman ng radioactive label, pagkatapos ay upang ipakita ang reaksyon, ang lamad ay nakalantad sa photographic film (autoradiography). Para sa iba pang mga label, ang mga kaukulang pamamaraan ay ginagamit.
Ang pinaka-promising ay ang makakuha ng non-radioactive (tinatawag na malamig) na mga probes. Sa parehong batayan, ang isang diskarte sa hybridization ay binuo, na ginagawang posible upang maitaguyod ang pagkakaroon ng isang pathogen sa paghahanda ng seksyon at tissue punctures, na kung saan ay lalong mahalaga sa pathomorphological analysis (in situ hybridization).
Ang isang makabuluhang hakbang sa pagbuo ng mga pamamaraan ng pagsisiyasat ng gene ay ang paggamit ng polymerase amplification reaction (PCR). Ginagawang posible ng diskarteng ito na mapataas ang konsentrasyon ng isang tiyak (nauna nang kilala) na pagkakasunud-sunod ng DNA sa isang sample sa pamamagitan ng pag-synthesize ng maraming kopya sa vitro. Upang maisagawa ang reaksyon, isang paghahanda ng DNA polymerase enzyme, isang labis na deoxynucleotides para sa synthesis at ang tinatawag na mga primer ay idinagdag sa sample ng DNA sa ilalim ng pag-aaral - dalawang uri ng oligonucleotides na may sukat na 2025 na mga base na naaayon sa mga seksyon ng terminal ng Pagkakasunod-sunod ng interes ng DNA. Ang isa sa mga panimulang aklat ay dapat na isang kopya ng simula ng rehiyon ng pagbabasa ng coding DNA strand sa direksyon ng pagbabasa 53, at ang pangalawa ay dapat na isang kopya ng kabaligtaran na dulo ng non-coding strand. Pagkatapos, sa bawat cycle ng polymerase reaction, doble ang bilang ng mga kopya ng DNA.
Para makamit ang primer binding, kailangan ang DNA denaturation (melting) sa 94°C, na sinusundan ng pagdadala ng mixture sa 40-55°C.
Upang maisagawa ang reaksyon, ang mga programmable microsample incubator ay idinisenyo upang madaling magpalit ng mga pagbabago sa pinakamainam na temperatura para sa bawat yugto ng reaksyon.
Ang reaksyon ng amplification ay maaaring makabuluhang tumaas ang sensitivity ng pagsusuri sa panahon ng gene probing, na lalong mahalaga sa mababang konsentrasyon ng nakakahawang ahente.
Ang isa sa mga makabuluhang bentahe ng gene probing na may amplification ay ang kakayahang pag-aralan ang mga submicroscopic na halaga ng pathological na materyal.
Ang isa pang tampok ng pamamaraan, na mas mahalaga para sa pagsusuri ng mga nakakahawang materyal, ay ang kakayahang makilala ang mga nakatagong (tahimik) na mga gene. Ang mga pamamaraan na nauugnay sa paggamit ng gene probing ay tiyak na mas malawak na ipapasok sa pagsasanay ng pag-diagnose ng mga nakakahawang sakit habang nagiging mas simple at mura ang mga ito.
Ang mga pamamaraan ng ELISA at RIF ay higit sa lahat ay husay o semi-quantitative sa kalikasan. Sa napakababang konsentrasyon ng mga bahagi, ang pagbuo ng antigen antibody complex ay hindi maaaring makita alinman sa biswal o sa simpleng instrumental na paraan. Ang indikasyon ng antigen antibody complex sa mga ganitong kaso ay maaaring isagawa kung ang isang label ay ipinakilala sa isa sa mga paunang sangkap na antigen o antibody , na madaling matukoy sa mga konsentrasyon na maihahambing sa natukoy na konsentrasyon ng analyte.
Maaaring gamitin ang mga radioactive isotopes (halimbawa, 125I), fluorescent substance, at enzymes bilang mga label.
Depende sa ginamit na etiketa, mayroong radioimmune (RIA), fluorescent immune (FIA), enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) na pamamaraan ng pagsusuri, atbp. mga nakaraang taon Ang ELISA ay nakatanggap ng malawakang praktikal na paggamit, na dahil sa posibilidad dami ng mga pagpapasiya, mataas na sensitivity, pagtitiyak at automation ng accounting.
Ang mga pamamaraan ng immunoassay ng enzyme ay isang pangkat ng mga pamamaraan na nagbibigay-daan sa pagtuklas ng antigen-antibody complex gamit ang isang substrate na na-cleaved ng isang enzyme at gumagawa ng isang kulay.
Ang kakanyahan ng pamamaraan ay upang pagsamahin ang mga bahagi ng reaksyon ng antigen antibody sa isang nasusukat na label ng enzyme. Ang antigen o antibody na tumutugon ay may label na isang enzyme. Batay sa pagbabago ng substrate sa ilalim ng pagkilos ng enzyme, maaaring hatulan ng isa ang dami ng nakikipag-ugnayan na bahagi ng reaksyon ng antigen antibody. Enzyme sa sa kasong ito nagsisilbing pananda immune reaksyon at nagbibigay-daan sa iyo na obserbahan ito sa visual o instrumental.
Ang mga enzyme ay napaka-maginhawang mga tag dahil ang kanilang mga catalytic properties ay nagpapahintulot sa kanila na kumilos bilang mga amplifier, dahil ang isang molekula ng enzyme ay maaaring magsulong ng pagbuo ng higit sa 1 × 105 molecule ng catalytic reaction product kada minuto. Kinakailangang pumili ng isang enzyme na nagpapanatili ng catalytic na aktibidad nito sa loob ng mahabang panahon, hindi mawawala ito kapag nagbubuklod sa isang antigen o antibody, at may mataas na pagtitiyak na may paggalang sa substrate.
Ang mga pangunahing pamamaraan para sa paggawa ng enzyme-labeled antibodies o antigens at conjugates ay: kemikal, immunological at genetic engineering. Ang mga enzyme na kadalasang ginagamit para sa ELISA ay malunggay peroxidase, alkaline phosphatase, galactosidase, atbp.
Upang makita ang aktibidad ng enzyme sa antigen-antibody complex para sa layunin ng visual at instrumental na pag-record ng reaksyon, ginagamit ang mga chromogenic substrates, ang mga solusyon kung saan, sa una ay walang kulay, sa panahon ng reaksyon ng enzymatic ay nakakakuha ng kulay, ang intensity nito ay proporsyonal sa dami. ng enzyme. Kaya, upang makita ang aktibidad ng malunggay peroxidase sa solid-phase ELISA, 5-aminosalicylic acid, na gumagawa ng isang matinding kayumanggi na kulay, at ortho-phenylenediamine, na gumagawa ng isang orange-dilaw na kulay, ay ginagamit bilang isang substrate. Upang makita ang aktibidad ng alkaline phosphatase at β-galatosidase, ginagamit ang mga nitrophenylphosphate at nitrophenylgalactosides, ayon sa pagkakabanggit.
Ang resulta ng reaksyon sa pagbuo ng isang kulay na produkto ay natutukoy sa biswal o gamit ang isang spectrophotometer na sumusukat sa pagsipsip ng liwanag na may isang tiyak na haba ng daluyong.
Mayroong maraming mga pagpipilian para sa pagsasagawa ng ELISA. Mayroong homogenous at heterogenous na mga pagpipilian.
Ayon sa paraan ng paggawa, ang mapagkumpitensya at hindi mapagkumpitensyang mga pamamaraan ng ELISA ay nakikilala. Kung sa unang yugto lamang ang nasuri na tambalan at ang kaukulang mga sentro ng pagbubuklod nito (antigen at mga tiyak na antibodies) ay naroroon sa system, kung gayon ang pamamaraan ay hindi mapagkumpitensya. Kung sa unang yugto ang nasuri na tambalan (antigen) at ang analogue nito (antigen na may label na enzyme) ay naroroon, na nakikipagkumpitensya sa isa't isa para sa pagbubuklod sa mga tiyak na sentro ng pagbubuklod (antibodies) na kulang, kung gayon ang pamamaraan ay mapagkumpitensya. Sa kasong ito, mas maraming test antigen ang nilalaman ng solusyon, mas mababa ang bilang ng mga nakagapos na may label na antigens.
PARAAN NG FLUORESCING ANTIBODIES (MFA) o IMMUNOFLUORESCENCE REACTION (RIF)
Ang paraan ng immunofluorescence ay ang paraan ng pagpili para sa mabilis na pagtuklas at pagkakakilanlan ng isang hindi kilalang mikroorganismo sa materyal na pagsubok.
Ag + AT + electrolyte = kumplikadong kumikinang sa mga sinag ng UV
Microbe serum na may label na fluorochrome
Ang pangulay na kadalasang ginagamit ay fluorescein isothiocyanate FITC
Kapag pinag-aaralan ang pamamaraang ito, ginagamit ang isang fluorescent microscope.
Isinasagawa ang RIF
30 μl ng FITC-labeled antibody solution ay inilapat sa smear.
Ilagay ang baso sa isang basang silid at panatilihin ito sa temperatura ng silid sa loob ng 20-25 minuto, o sa isang thermostat sa 37°C sa loob ng 15 minuto.
Hugasan ang baso sa isang tumatakbong makina tubig sa gripo 2 minuto, banlawan ng distilled water at tuyo sa hangin.
Ang isang patak ng mounting liquid ay inilalapat sa pinatuyong pahid, ang pahid ay natatakpan ng isang coverslip at naka-microscope gamit ang isang fluorescent microscope o isang fluorescent na attachment sa isang conventional optical microscope.
