Критериите за антимикробната активност на лекарството са минимална инхибираща концентрация(MIC) и минимална бактерицидна концентрация(MBK). MIC е най-ниската концентрация на антибиотици, която напълно инхибира in vitro видими бактериален растеж. Изразява се в mg/l или μg/ml. MBC е най-ниската концентрация на антибиотик, която предизвиква бактерициден ефект. За да се определи, е необходимо да се инокулират епруветки, в които визуално няма растеж върху плътен хранителен агар, който не съдържа антибиотик. Този показател има голям клинично значение. Въз основа на метода на серийно разреждане са създадени микрометоди, които включват използването на по-малък обем хранителна среда. Понастоящем за провеждане на този тип изследвания се произвеждат множество търговски комплекти, състоящи се от изсушени стабилизирани разреждания на антибиотици в хранителна среда, които се разреждат със суспензия от тестовия микроб. Тези комплекти могат да се съхраняват в нормални условия, като по този начин елиминира необходимостта от приготвяне на разреждания на средата и антибиотиците в лабораторията. Тестовете за микроразреждане също имат предимството да бъдат включени в автоматизирана система.
Въз основа на получените данни (диаметър на зоната на инхибиране на растежа или стойност на MIC) микроорганизмите се разделят на чувствителни, умерено устойчиви и устойчиви. За разграничаване на тези категории се използват така наречените гранични концентрации на антибиотици, които не са постоянни стойности. Те се преразглеждат при промяна на чувствителността на микробната популация. Разработването и преразглеждането на критериите за интерпретация се извършват от водещи специалисти (химиотерапевти, микробиолози), които са членове на специални комисии. Един от тях е Националният комитет по клинични лабораторни стандарти ( ннационален ° С ommitteefor ° Склиничен Ллаборатория Сстандарти – NCCLS), организиран в САЩ. Понастоящем стандартите на NCCLS се използват като международни стандарти за оценка на резултатите от определяне на чувствителността на бактериите по време на многоцентрови микробиологични и клинични изследвания.
Определяне на чувствителността на бактериите към антибиотици.Критерият за чувствителността на микроорганизмите към антибиотиците е минималната инхибираща концентрация (MIC) на антибиотика, която забавя растежа на патогена при стандартни експериментални условия.
За да се определи лекарствената резистентност, се използва дневна чиста култура на патогена, изолиран от тялото на пациента, и стандартна хранителна среда (AGV или агар на Мюлер-Хинтън) за инокулирането му.
Определянето на чувствителността на микроорганизмите към антибиотици се извършва с помощта на метода на дискова дифузия или метода на серийни разреждания на антибиотика в течна или твърда среда.
Дисков дифузионен метод.Определянето на чувствителността към антибиотици по метода на хартиения диск се основава на дифузията на антибиотика в хранителната среда. Концентрацията на антибиотиците в дисковете е избрана по такъв начин, че диаметрите на зоните на инхибиране на растежа на стандартните тестови микроорганизми да съответстват международни стандарти. Тази концентрация съответства на средната терапевтична доза за стандартни щамове микроорганизми.
Приготвената суспензия от микроорганизми се инокулира върху повърхността на специална среда (AGV или Mueller-Hinton агар) в петриеви панички. След това с помощта на стерилни пинсети стандартни хартиени дискове, напоени с разтвори на различни антибиотици, се поставят върху инокулираната повърхност на еднакво разстояние един от друг, от ръбовете и центъра на чашата (може да се използват и специални устройства и дозатори). Инокулираните блюда се съхраняват в термостат при температура, оптимална за растежа на изследваните бактерии. Ако бактериите са чувствителни към този антибиотик, около диска ще се образува зона на инхибиране на растежа. Диаметърът на зоната на инхибиране на растежа съответства на степента на чувствителност на изследвания микроорганизъм към даден антибиотик. Крайният резултат се оценява с помощта на специални таблици, които показват диаметрите на зоните на инхибиране на растежа на стандартни култури, чувствителни, устойчиви и умерено устойчиви.
Дисковият метод не предоставя надеждни данни при определяне на чувствителността на микроорганизмите към полипептидни антибиотици, които дифундират слабо в агар (например полимиксин, ристомицин). Също така, този метод не позволява определяне на минималната инхибираща концентрация на антибиотика.
Метод на серийно разреждане.Този метод определя минимална концентрацияантибиотик, който инхибира растежа на изследваната бактериална култура (MIC, MIC). За да направите това, първо пригответе основен разтвор, съдържащ определена концентрация на антибиотика (µg/ml или единици/ml) в специален разтворител или буферен разтвор. След това всички последващи разреждания в бульона (в обем от 1 ml) се приготвят от основния разтвор, след което към всяко разреждане се добавят 0,1 ml от тестовата бактериална суспензия, съдържаща 10 6 -10 7 бактериални клетки в 1 ml. Добавете 1 ml бульон (без антибиотик) и 0,1 ml бактериална суспензия (контролна култура) към последната епруветка. Посевите се инкубират при 37 0 С до следващия ден, след което резултатите от опита се отбелязват чрез мътност на хранителната среда, сравнена с контролата. Последната епруветка с прозрачна хранителна среда показва забавяне на растежа на изследваната бактериална култура под въздействието на минималната инхибиторна (инхибиторна) концентрация (MIC, MIC) на съдържащия се в нея антибиотик. За да се оцени минималната бактерицидна концентрация (MBC), засяването се извършва върху твърда хранителна среда без антибиотик от епруветки без растеж. За MBC се приема минималната концентрация на антибиотик, която причинява смъртта на микроорганизма, което се характеризира с липса на растеж върху петриеви панички с хранителна среда.
Метод за серийно разреждане на антибиотик в агарна среда.В този случай е възможно в един експеримент да се тества чувствителността на няколко култури микроорганизми към различни концентрации на даден антибиотик. Приготвят се различни разреждания на антибиотика в стерилна агарна среда. За да направите това, добавете необходимото количество от първоначалния антибиотичен разтвор, разбъркайте добре и изсипете в стерилни петриеви панички. След втвърдяване на агара дъното на чашата се разделя отвън на сектори с маркер. Всяка изследвана култура се нанася с помощта на бактериологична бримка върху специфичен сектор в блюда с различни концентрации на антибиотика. Засяването на изследваните култури върху съдове с различни концентрации на антибиотика може да се извърши с помощта на апликатор, който ви позволява едновременно да инокулирате 12-15 култури на съд. След това съдовете се поставят в термостат при температура, оптимална за растежа и развитието на изследваните бактерии. Резултатите се вземат под внимание от наличието или отсъствието на бактериален растеж в сравнение с растежа върху средата в контролната плака. Бактериите се считат за чувствителни към антибиотика при концентрация, при която растежът им е напълно инхибиран.
Е-тест метод.Този метод съчетава предимствата на метода на серийно разреждане и дисковия метод. Вместо дискове се използват ленти ("линийки") от филтърна хартия, импрегнирана с антибиотик, като в основата на лентата концентрацията на антибиотика ще бъде минимална, а в "горната" - максимална. Лентите се поставят върху повърхността на хранителен агар, посят с културата, която се изследва. Ако бактериите са чувствителни към действието на това лекарство, около областите на лентата, съдържащи неговите инхибиторни концентрации, се появява елипсоидална зона на инхибиране на растежа. Числова стойностконцентрацията на антибиотика в основата на тази зона показва MIC на този антибиотик за дадена култура.
ДА СЕ чувствителенТе включват щамове микроорганизми, чийто растеж се инхибира при концентрации на лекарството, открити в кръвния серум на пациента, когато се използват нормални дози антибиотици.
ДА СЕ умерено стабиленТе включват щамове, чието инхибиране на растежа изисква концентрации, създадени в кръвния серум при прилагане на максимални дози от лекарството.
Устойчивса микроорганизми, чийто растеж не се потиска от лекарството в концентрации, създадени в организма при използване на максимално допустимите дози.
Контролни въпроси.
Дефинирайте понятието „антибиотици“. Основните групи антибиотици, в зависимост от метода на приготвяне: естествени, полусинтетични, синтетични. Назовете учения, разработил теорията за химиотерапията. Какви свойства са определящи при избора на химиотерапевтично лекарство? Какъв е индексът на химиотерапията, напишете формулата му, каква трябва да бъде? Посочете първите антиспирохетни лекарства; първи антибактериално лекарствои името на учения, който го е получил. Какви са имената на руските учени, които първи откриха антибактериалните свойства на зелената плесен? Назовете учения, който е изследвал антибактериалните свойства на плесента Penicillium и е направил опит да изолира пеницилин. Учените, които първи са получили пеницилинови препарати. Производители на антибиотици - дайте примери. Класификация на антибиотиците по произход, химичен състав, според спектъра на действие. Механизъм на действие на антибиотиците: цели (точки на приложение на антибиотиците различни групи). Видове действие - бактерицидно и бактериостатично; как да ги определим при ин витро експеримент? Антивирусни антибиотици, механизми на тяхното действие. В какви единици се измерва активността на антибиотиците? Условия за съхранение на антибиотици.
Назовете и опишете възможно странични ефектис антибиотична терапия. Дефинирайте понятието „лекарствена резистентност на микробите“. Видове лекарствена резистентност. Естествени и придобити (първични и вторични). Генетични механизми на лекарствена резистентност: хромозомни и плазмидни. Фенотипни механизми на лекарствена резистентност - наименувайте и характеризирайте. Рационално използване на антибиотици - назоваване на методите. Назовете лекарства, които са инхибитори на ензими, които унищожават антибиотиците. Опишете методите за определяне на чувствителността на микробите към антибиотици.
Анализ на способността на бактериите да се размножават и да растат върху среда, съдържаща намаляващи концентрации лекарствено вещество, ви позволява да определите минималната инхибиторна концентрация на антибиотика (MIC), инхибиторната роля на бактериите in vitro (Таблица 3(vet7)). Големината на тази доза определя избора на лекарство, което може да постигне подобни концентрации in vivo, и е основата за сравняване на относителната чувствителност на тялото към други лекарства. Смята се, че за да се осигури ефективност, концентрацията на лекарственото вещество в мястото на инфекцията трябва да бъде най-малко равно на стойносттаминимална инхибираща концентрация на антибиотика. От друга страна, плазмените концентрации на лекарството обикновено трябва да бъдат по-високи, за да се осигурят адекватни тъканни концентрации. Въпреки това, неоправдано увеличаване на дозите на антимикробните лекарства, за да се постигне минимална доза антибиотик, която инхибира растежа на определен вид бактерии in vitro, може да доведе до натрупване на лекарството в тялото на реципиента в токсични дози.
„Критичният MIC“ за определено лекарствено вещество е най-високата сравнително безопасна концентрация на лекарството, която може да бъде постигната при използване на клинично приемлива доза и начин на приложение на лекарството (Таблица 3(vet7)). MIC зависи от конкретния тип бактериална култура и конкретния вид лекарствено вещество. В същото време критичната MIC е специфична за конкретен реципиент и конкретно лекарствено вещество. Така критичната MIC ще бъде една и съща за всеки организъм (Таблица 3(vet7)). Стойността на критичната концентрация за конкретен организъм може да се различава в зависимост от животинския вид (поради разлики в чувствителността или моделите на разпределение). лекарство) и специфична лаборатория. Трябва да се свържете с лабораторията, предоставяща данни за методите на културата и чувствителността към антибиотици, за да получите критичните стойности, използвани в техните изследвания.
Въз основа на данните за in vitro разреждане, бактериите се класифицират като чувствителни (S) към определено лекарство, ако MIC е значително под критичната стойност за този показател. Растежът на патогенни микроорганизми с междинни (MS) или междинни (IS) стойности на чувствителност се инхибира, когато концентрацията на лекарството се доближи до критичната стойност на MIC. Такива бактерии могат да причинят негативни реакции в тялото на пациента или да нямат ефект върху него. MIC за резистентни (R) бактерии надвишава критична стойностминимална доза. Ефективната концентрация в тялото на пациента на такова лекарство, което засяга специфичен микроорганизъм, е малко вероятно да бъде постигната. В такива случаи опасността от натрупване на лекарството в токсични дози също може да надделее потенциални ползиот използването на терапия. Критичната минимална доза на антибактериалните антибиотици от ново поколение в някои случаи е по-трудна за определяне поради прехода към професионално гъвкаво етикетиране на диапазоните на дозиране.
Лекарствата трябва да бъдат избрани по такъв начин, че когато се прилагат в режим, който предотвратява натрупването на лекарството в токсични дози, е възможно да се постигне максимална концентрация на лекарството в плазмата, която е значително по-висока от MIC. Много бактерии ще бъдат чувствителни към ефектите на определено лекарство при концентрации доста под критичната минимална доза. Разликата между критичната стойност и собствена стойност MIC могат да се използват за сравняване на относителната ефективност на различни антимикробни средства. Например за амикацин критичната стойност е 32 μg/ml, така че E. coli с MIC от 2 μg/ml е относително по-чувствителен към амикацин от E. coli с MIC от 16 μg/ml. И двата вида трябва да се считат за чувствителни (въпреки че вторият вид може да се счита за междинно чувствителен), но растежът на бактериите от първия вид изглежда се инхибира в по-голяма степен. Ако същият вид E. coli със стойност на MIC от 2 μg/ml спрямо амоксицилин има стойност на MIC от 16 μg/ml (с критична стойност от 32 μg/ml), тогава растежът на този микроорганизъм вероятно ще бъде по-лесно се предотвратява чрез употребата на амикацин, отколкото на амоксицилин, тъй като стойността на MIC на амикацин е по-далеч от неговата критична стойност на MIC, отколкото стойността на MIC на амоксицилин.
Въпреки че разликите между стойностите на MIC за определен бактериален вид и определено лекарство (16 или 32) може да изглеждат доста големи (особено в контекста на границата на плазмената концентрация на лекарството), такава разлика съответства само на един разтвор в епруветка. Това е пример за опасността от надценяване на данните за чувствителността. Ако стойността на MIC на конкретен организъм е достатъчно близка до критичната стойност, тогава, поради възможни разлики в интерпретацията, на този микроорганизъм може да бъде определена степен на чувствителност „S“ или „MS“ в една лаборатория и „R“ в друго, поради възможни различия в тълкуването. Такива възможни несъответствия в оценката са една от причините, поради която трябва да се избягва употребата на лекарства, към които даден организъм има чувствителност към MS (или ако стойността на MIC е близка до критичната), освен ако концентрацията на лекарството в мястото на инфекцията може да бъде много по-висока. по-висока от стойността на MIC, определена при in vitro анализа. Илюстративен пример би бил използването на лекарства, екскретирани през бъбреците, за лечение на инфекция. пикочните пътищаили използване на лекарства, екскретирани чрез жлъчката, за лечение на инфекция жлъчните пътища. Натрупването на някои лекарства от левкоцитите (флуорохинолони, макролиди) може също да доведе до концентрации на лекарството в тъканите, значително надвишаващи MIC (или критичната стойност на MIC), въпреки по-ниските плазмени концентрации.
MIC на бактериите може да се промени по време на последващи инфекции, причинени от бактерии от същия вид, и може също да се промени по време на хода на инфекциозното заболяване. Увеличаването на MIC може просто да отразява различен подход към оценката на анализа (особено ако разликите се откриват само чрез in vitro разреждане), но може също да се дължи на развитието на резистентност към определено лекарство. В такива случаи курсът на антимикробната терапия може да бъде променен чрез използване на допълнително лекарство или преминаване към ново, по-ефективно. ефективно лекарство. При полимикробни инфекции стойността на MIC на определено лекарство вероятно ще бъде различна за всяка инфектираща бактерия. Смята се, че е по-лесно да се предотврати развитието на бактерии с ниска стойност MIC по отношение на определено лекарствено вещество, отколкото растежа на микроорганизъм с по-висока стойност на MIC по отношение на същото лекарствено вещество.
(MIC) - минимална инхибираща (потискаща) концентрация - най-ниската концентрация на антибиотик, която инхибира видимия растеж на изследвания микроорганизъм инвитро(в бульон или агар хранителна среда) при стандартни експериментални условия и се изразява в µg/ml (mg/l) или единици/ml.
Минимална бактерицидна концентрация (MBC) -най-ниската концентрация на антибиотик, която в изследването инвитропричинява смъртта на 99,9% от микроорганизмите от базова линияпрез определен период от време.
Чувствителенмикроорганизъм - щам на микроорганизъм, който няма механизми на резистентност към дадено лекарство. Спира се на хранителна среда, когато се използва антибиотик в терапевтична доза.
Средно устойчивмикроорганизъм - щам на микроорганизъм, чийто растеж върху хранителна среда спира само когато антибиотикът се използва в най-високата доза. Лечението на инфекции, причинени от умерено резистентни микроорганизми, се провежда при липса на алтернативни лекарства, с най-високата (максимална терапевтична) доза антибиотик.
Устойчив микроорганизъм -щам на микроорганизъм, който има механизми на резистентност към дадено лекарство. Неговият растеж върху хранителна среда спира само когато се използват много високи концентрации на лекарството, които не могат да бъдат създадени в тялото поради високата им токсичност. При лечение на инфекции, причинени от този микроорганизъм, няма клиничен ефект от терапията дори при използване на най-високата доза антибиотик. В този случай може да се наблюдава странични ефектиантибиотик.
Показания за определяне на чувствителността на микроорганизмите към антибиотици:
1) определяне на чувствителността към нов антибиотик, препоръчан за употреба;
2) периодичен мониторинг на антибиотичната резистентност при индивида медицински центровеи в различни географски региони за наблюдение на разпространението на резистентност към антибиотици;
3) обосновка на адекватна антибиотична терапия при отделни пациенти в случаите на:
а) изолиране на микроорганизми от предимно стерилни течности, органи и човешки тъкани;
б) когато се изолират микроорганизми от предимно нестерилни биотопи, оценката на чувствителността трябва да бъде предшествана от оценка на клиничното значение на изолирания микроорганизъм;
в) резистентни към лекарства инфекции емпирична терапия;
г) уникални инфекции и липса на опит в лечението им;
д) инфекции, изискващи продължителна терапия (антибиотична резистентност се открива всяка седмица от лечението, тъй като е възможна промяна на патогените).
Определянето на чувствителността на микроорганизмите към антибиотици е неподходящо:
1) за представители нормална микрофлорахора, когато са изолирани от естествени местообитания;
2) за видове микроорганизми, при които не са описани резистентни форми към определени антибиотици. Например Streptococcus pyogenes е чувствителен към пеницилин, така че тестването на чувствителността към тези лекарства не е практично в рутинната практика.
Съдържание на темата „Методи за определяне на чувствителността към антимикробни средства. Странични ефектиантибиотична терапия.":Методи за определяне на чувствителността към антимикробни средства. Минимална инхибираща концентрация (MIC). Метод на серийни разреждания в течна среда.
Критериите за активността на определено лекарство са минимална инхибираща концентрация (MIC) - най-ниската концентрация на лекарството, която инхибира растежа на тестовата култура и минимална бактерицидна концентрация (MBK) - най-ниската концентрация на лекарството, което предизвиква бактерициден ефект.
Метод на серийни разреждания в течна среда
Метод на серийни разреждания в течна средави позволява да инсталирате минимална инхибираща концентрация (MIC) И минимална бактерицидна концентрация (MBK) лекарство за изолирания патоген. Изследванията могат да се извършват в различни обеми хранителна среда (1-10 ml). Използвайте течни хранителни среди, които отговарят на хранителните нужди на патогена. В епруветки (обикновено осем) се приготвят серия от двойни разреждания на лекарството в хранителна среда. Концентрацията се намалява съответно от 128 до 0,06 μg/ml (основната концентрация може да варира в зависимост от активността на лекарството). Крайният обем на средата във всяка епруветка е 1 ml. За контрола служи епруветка, съдържаща чиста хранителна среда. Във всяка епруветка се добавят 0,05 ml физиологичен разтвор, съдържащ 106/ml микробни клетки. Епруветките се инкубират за 10-18 часа при 37 °C (или докато се появи бактериален растеж в контролната епруветка). След посочения период резултатите се отчитат чрез промени в оптичната плътност на средата визуално или нефелометрично. Може да се използва и модифициран метод, като се използва среда, допълнена с глюкоза и индикатор. Растежът на микроорганизмите е придружен от промяна на рН на средата и съответно цвета на индикатора.
