Reacción de aglutinación para determinar anticuerpos anti-Rhesus ( reacción indirecta Coombs)aplicar en pacientes con hemólisis intravascular. En algunos de estos pacientes se detectan anticuerpos anti-Rhesus, que son incompletos y monovalentes. Interactúan específicamente con los eritrocitos Rh positivos, pero no provocan su aglutinación. La presencia de tales anticuerpos incompletos se determina mediante la prueba de Coombs indirecta. Para ello, se añade suero antiglobulina (anticuerpos contra inmunoglobulinas humanas) al sistema de anticuerpos anti-Rh + eritrocitos Rh positivos, lo que provoca la aglutinación de los eritrocitos. Utilizando la reacción de Coombs, se diagnostican afecciones patológicas asociadas con la lisis intravascular de eritrocitos de origen inmunológico, por ejemplo, enfermedad hemolítica del recién nacido: los eritrocitos de un feto Rh positivo se combinan con anticuerpos incompletos contra el factor Rh que circula en la sangre, que tienen pasó a través de la placenta de una madre Rh negativa.
Mecanismo. La dificultad para identificar anticuerpos incompletos (monovalentes) se debe a que estos anticuerpos, cuando se unen a los epítopos de un antígeno específico, no forman una estructura reticular y la reacción entre antígenos y anticuerpos no se detecta ni por aglutinación, precipitación, u otras pruebas. Para identificar los complejos antígeno-anticuerpo formados, es necesario utilizar sistemas de prueba adicionales. Para detectar anticuerpos incompletos, por ejemplo contra el antígeno Rh de los eritrocitos en el suero sanguíneo de una mujer embarazada, la reacción se lleva a cabo en dos etapas: 1) se añaden eritrocitos que contienen el antígeno Rh a diluciones dobles del suero problema y se mantienen a 37°C durante una hora; 2) se añade suero antiglobulina antihumana de conejo (en una dilución de trabajo pretitulada) a los eritrocitos bien lavados después de la primera etapa. Después de una incubación de 30 minutos a 37 °C, los resultados se evalúan por la presencia de hemaglutinación (reacción positiva). Es necesario controlar los ingredientes de la reacción: 1) suero de antiglobulina + glóbulos rojos que se sabe que están sensibilizados con anticuerpos específicos; 2) eritrocitos tratados con suero normal + suero antiglobulina; 3) Eritrocitos Rh negativos tratados con suero problema + suero antiglobulina.
50. Reacción de hemaglutinación pasiva. Mecanismo. Componentes. Solicitud.
Reacción de hemaglutinación indirecta (pasiva)(RNGA, RPGA) se basa en el uso de eritrocitos (o látex) con antígenos o anticuerpos adsorbidos en su superficie, cuya interacción con los correspondientes anticuerpos o antígenos del suero sanguíneo del paciente hace que los eritrocitos se peguen y caigan al fondo del Tubo de ensayo o celda en forma de sedimento festoneado.
Componentes. Para realizar RNGA se pueden utilizar eritrocitos de ovejas, caballos, conejos, pollos, ratones, humanos y otros, los cuales se almacenan para uso futuro tratándolos con formaldehído o glutaraldehído. La capacidad de adsorción de los eritrocitos aumenta cuando se tratan con soluciones de tanino o cloruro de cromo.
Los antígenos en RNGA pueden servir como antígenos polisacáridos de microorganismos, extractos de vacunas bacterianas, antígenos de virus y rickettsias, así como otras sustancias.
Los glóbulos rojos sensibilizados por la hipertensión se denominan eritrocitos diagnósticos. Para la preparación de eritrocitos diagnósticos, se utilizan con mayor frecuencia eritrocitos de oveja, que tienen una alta actividad adsorbente.
Solicitud. RNGA se utiliza para diagnosticar enfermedades infecciosas, determinar la hormona gonadotrópica en la orina al establecer el embarazo, para identificar hipersensibilidad a medicamentos, hormonas y en algunos otros casos.
Mecanismo. La prueba de hemaglutinación indirecta (IRHA) tiene una sensibilidad y especificidad significativamente mayores que la prueba de aglutinación. Se utiliza para identificar el patógeno por su estructura antigénica o para indicar e identificar productos bacterianos: toxinas en el material patológico que se está estudiando. En consecuencia, se utilizan diagnósticos estándar (comerciales) de anticuerpos contra eritrocitos, obtenidos mediante adsorción de anticuerpos específicos en la superficie de eritrocitos curtidos (tratados con taninos). Se preparan diluciones seriadas del material de prueba en los pocillos de placas de plástico. Luego se añade a cada pocillo un volumen igual de suspensión al 3% de glóbulos rojos cargados con anticuerpos. Si es necesario, la reacción se lleva a cabo en paralelo en varias filas de pocillos con eritrocitos cargados con anticuerpos de diferentes especificidades de grupo.
Después de 2 horas de incubación a 37 °C, se tienen en cuenta los resultados, evaluando apariencia sedimento de eritrocitos (sin agitar): con una reacción negativa, aparece un sedimento en forma de un disco compacto o anillo en el fondo del pozo, con una reacción positiva: un sedimento de encaje característico de eritrocitos, una película delgada con bordes irregulares .
La prueba de Coombs es análisis clínico Análisis de sangre, que se realiza para detectar si la sangre contiene ciertos anticuerpos que pueden ser peligrosos. Estos anticuerpos se adhieren a los glóbulos rojos y pueden invadir sistema inmunitario, así como causar daño de otras maneras. En terminología médica, este estudio también se denomina prueba de antiglobulina (AGT).
Tipos de muestras de Coombs
Hay dos tipos de pruebas de Coombs: directas e indirectas.
Prueba de Coombs directa, también conocido como directo (DAT), detecta autoanticuerpos que se adhieren a la superficie de los glóbulos rojos. Estos anticuerpos a veces se producen en el cuerpo debido a determinadas enfermedades o al tomar determinados medicamentos, como la procainamida, la metildopa o la quinidina.
Estos anticuerpos son peligrosos porque a veces causan anemia al destruir los glóbulos rojos.
A veces, esta prueba se solicita para diagnosticar la causa de la ictericia o la anemia.
Normalmente, la reacción de Coombs es negativa.
Positivo para:
- enfermedad hemolítica recién nacidos;
- hemólisis autoinmune;
- reacciones de transfusión hemolíticas;
- Anemia hemolítica inmunitaria inducida por fármacos.
muestra indirecta Coombs, también conocido como , se utiliza para detectar anticuerpos contra los glóbulos rojos que se encuentran en el suero sanguíneo (el suero es el líquido amarillo claro de la sangre que queda después de que se han eliminado los glóbulos rojos y el coagulante).
La prueba de Coombs indirecta se utiliza durante la transfusión de sangre para determinar si la sangre del donante coincide con la sangre del receptor. Esto se llama prueba de compatibilidad y ayuda a prevenir cualquier reacción adversa a la sangre del donante. este análisis También recomendado para mujeres embarazadas. Algunas mujeres tienen anticuerpos IgG, que pueden atravesar la placenta hacia la sangre fetal y dañar al recién nacido, provocando una enfermedad hemolítica conocida como anemia hemolítica.
Procedimiento
La sangre se extrae usando una jeringa de una vena, generalmente con parte trasera palma o en la curva del codo. Antes de esto, el lugar de la punción se desinfecta completamente y, después de realizar un análisis de sangre, se aplica una gasa o un algodón limpio.
La sangre resultante se purifica en el laboratorio y se separan los glóbulos rojos. Luego, la muestra se analiza secuencialmente utilizando varios sueros y reactivos de Coombs, que se contrastan. Si no hay aglutinación (aglomeración de glóbulos rojos), esto significa un resultado positivo.
Sin embargo, si la prueba es negativa, significa que hay anticuerpos en la sangre que actúan contra los glóbulos rojos. Esto puede indicar varias enfermedades, como anemia (tanto natural como causada por la toma de medicamentos), sífilis o infección por micoplasma. Después de recibir los resultados, el médico tratante le prescribirá el tratamiento adecuado.
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Principio de antiglobulina. Los anticuerpos antieritrocitos de tipo incompleto y las moléculas del complemento (C) ubicadas en la superficie de los eritrocitos se detectan (una prueba directa) mediante su aglutinación en contacto con suero animal que contiene anticuerpos contra la antiglobulina humana (suero antiglobulina). Gratis en suero anticuerpos incompletos se detectan (una prueba indirecta) uniéndolos a una mezcla de eritrocitos normales del grupo 0, cuyos antígenos pertenecen al conocido sistema Rh, y luego se aglutinan bajo la influencia de suero antiglobulina.
Materiales, reactivos para la prueba de antiglobulina de Coombs.: tubos de ensayo 10/100 ml; pipetas graduadas de 1, 2 ml; pipetas Pasteur; trípodes; portaobjetos de vidrio sin moler; solución de NaCl al 8,5‰; las células rojas de la sangre. Los glóbulos rojos del paciente, así como los del grupo 0, se obtendrán de sangre recién extraída utilizando un agente anticoagulante (solución de EDTA).
Los glóbulos rojos del grupo 0 deben seleccionarse de tal manera que provengan de individuos normales y contengan todos Antígenos del sistema Rh. Se pueden almacenar hasta 7 días en plasma autólogo a + 4°C. En ausencia de glóbulos rojos del grupo 0, se puede utilizar un mosaico antigénico conocido, una mezcla de glóbulos rojos del grupo 0, glóbulos rojos Rh positivos y Rh negativos.
Suero el paciente debe estar recién seleccionado.
Suero antiglobulina elaborado por el Instituto. Dr. I. Cantacuzino, está disponible en forma liofilizada en ampollas de 1 ml. Después de la disolución, almacenar el suero a -20°C.
Técnica de prueba de antiglobulina de Coombs:
A) Prueba de Coombs directa: Enjuague los glóbulos rojos del paciente 3 veces con una solución de NaCl al 8,5 ‰.
Aplicar una gota grande de diluciones de suero antiglobulina en varios portaobjetos de vidrio y, al lado, una pequeña gota del sedimento eritrocitario del paciente; mezclar las gotas con la esquina del vaso. Deje el material preparado sobre la mesa durante 5 minutos, luego examine la presencia de aglutinados. Cuando resultado positivo determinar el título aglutinante máximo.
b) Prueba de Coombs indirecta: eritrocitos del grupo 0, Rh positivo y Rh negativo, lavar 3 veces con solución de NaCl al 8,5 ‰ y exponer al suero del paciente a razón de 2 gotas de eritrocitos por 8-10 gotas de suero, luego incubar durante 60 minutos a una temperatura de 37° CON. Después de esto, lavar nuevamente los glóbulos rojos tres veces y tratarlos con suero antiglobulina, según las instrucciones para la prueba de Coombs directa.
Cuando se trata de sobre anticuerpos activos en frío sensibilizar los glóbulos rojos del grupo 0 durante 60 minutos. a una temperatura de + 4°C.
Nota 1) No realizar una prueba de Coombs directa en glóbulos rojos almacenados durante uno o varios días a + 4°C o temperatura ambiente, ya que los resultados pueden ser falsos positivos debido a la fijación incompleta de los anticuerpos activos en frío presentes en el suero normal. 2) En casos de hiperproteinemia grave, lavar los glóbulos rojos 4-5 veces y comprobar la ausencia de proteínas séricas en el último líquido de lavado utilizando ácido sulfosalicílico.
Un posible residuo de 2 μg IgG/ml en el sedimento eritrocitario puede neutralizar el suero de antiglobulina. La prueba de Coombs también se puede realizar utilizando sueros monoespecíficos anti-IgG, -IgM, -IgA -C3 y -C4 para aclarar el tipo de células ubicadas en la superficie de los glóbulos rojos, por ejemplo, en pacientes que padecen enfermedad hemolítica autoinmune. anemia.
Aplique 1 gota grande de suero O(I), A(II), B(III) en un plato o portaobjetos de vidrio usando pipetas (¡diferentes!). Después de anotar el tiempo, use una varilla de vidrio limpia o una esquina limpia de un portaobjetos de vidrio para combinar gotas de suero con gotas de sangre. La determinación dura 5 minutos, agitando la placa, luego agregar 1 gota de solución salina a cada mezcla de gotas y evaluar los resultados. Es mejor si el suero viene en 2 series diferentes. Los resultados del grupo sanguíneo deben coincidir en ambos lotes de suero.
Evaluación de los resultados de isohemaglutinación:
si los 3 sueros dieron una reacción negativa, es decir, la mezcla tiene un color rosa uniforme: este es el tipo de sangre O(I);
Si reacción negativa sólo dio suero del grupo A(II), y los sueros O(I) y B(III) dieron una reacción positiva, es decir, aparecieron granos: este es el grupo sanguíneo A(II);
el suero del grupo B(II) dio una reacción negativa, y el suero del grupo O(I) y A(II) dio una reacción positiva: este es el grupo sanguíneo B(III).
isohemaglutinación. Si la reacción es positiva, en la mezcla aparecen pequeños granos rojos de glóbulos rojos adhesivos. Los granos se fusionan en granos más grandes y estos últimos en escamas. El suero está casi descolorido;
si la reacción es negativa, la mezcla permanece coloreada uniformemente durante 5 minutos color rosa y no se encuentran granos;
Cuando se trabaja con 3 sueros de los grupos O(I), A(II), B(III), son posibles 4 combinaciones de reacciones:
los 3 sueros dieron reacciones positivas- análisis de sangre del grupo AB(IV). En este caso, se realiza un estudio con suero del grupo AB(IV).
¡Nota! Las gotas de sangre analizadas deben ser de 5 a 10 veces más pequeñas que las gotas de suero.
Errores de isohemaglutinación.
No realizar aglutinación donde debería ser y presencia de aglutinación donde no debería ser. Esto puede deberse a un título sérico débil además de una aglutinación deficiente de los glóbulos rojos.
Presencia de aglutinación donde no debería haber ninguna.- Esto es pseudoaglutinación, cuando montones de glóbulos rojos forman “columnas de monedas”. Agitar el plato o agregar solución salina los destruye.
Panaglutinación, cuando el suero une todos los glóbulos rojos, incluidos los de su propio tipo de sangre. Al quinto minuto, los signos de aglutinación desaparecen.
También existe la llamada panaglutinación fría, cuando los glóbulos rojos se pegan entre sí debido a la baja temperatura del aire (por debajo de 15 ° C) en la habitación.
En todos estos casos, se lleva a cabo una reacción repetida o se utilizan glóbulos rojos estándar.
Determinación del Rh en sangre.
Para determinar el estado Rh, es decir, para detectar la presencia o ausencia de antígenos del sistema Rh en la sangre de las personas, se utilizan sueros (reactivos) anti-Rh estándar, de especificidad variable, es decir, que contienen anticuerpos contra varios antígenos de este sistema. Para determinar el antígeno Rh 0 (D), se usa con mayor frecuencia suero anti-Rhesus con la adición de una solución de gelatina al 10%, o se usa un reactivo anti-Rhesus estándar preparado de antemano con una solución de poliglucina al 33%. Para obtener resultados de investigación más precisos, así como para identificar antígenos de otros sistemas serológicos, se utiliza la prueba de Coombs (también es muy sensible para determinar la compatibilidad de la sangre transfundida). Para las investigaciones se utiliza sangre nativa o sangre preparada con algún conservante. En este caso, la sangre debe lavarse del conservante con un volumen diez veces mayor de solución isotónica de cloruro de sodio. Al determinar el estado de Rh- Rh 0 (D) se deben utilizar dos muestras de suero o reactivo anti-Rhesus de dos series diferentes y al mismo tiempo glóbulos rojos estándar obtenidos de sangre de Rh positivo (Rh +) y Rh negativo (Rh -) Los individuos deben usarse para el control. Al determinar otros isoantígenos, se deben utilizar correspondientemente glóbulos rojos de control que contengan o carezcan del antígeno contra el cual se dirigen los anticuerpos del suero estándar.
Las caloraglutininas incompletas son el tipo más común de anticuerpos que pueden provocar el desarrollo de anemia hemolítica autoinmune. Estos anticuerpos pertenecen a IgG, rara vez a IgM, IgA.
PRUEBA DE COMBS
Prueba de Coombs: introducción. La prueba de Coombs es un método de diagnóstico de laboratorio basado en la reacción de hemaglutinación.
El principal método para diagnosticar la anemia hemolítica autoinmune es la prueba de Coombs. Se basa en la capacidad de los anticuerpos específicos de las inmunoglobulinas (especialmente IgG) o de los componentes del complemento (especialmente S3) para aglutinar eritrocitos recubiertos con IgG o S3.
La unión de IgG y C3b a los eritrocitos se observa en la anemia hemolítica autoinmune y en la anemia hemolítica inmunitaria inducida por fármacos. Prueba de Coombs directa. La prueba de Coombs directa se utiliza para detectar anticuerpos o componentes del complemento fijados en la superficie de los glóbulos rojos. Se lleva a cabo de la siguiente manera:
Para obtener anticuerpos contra inmunoglobulinas humanas (suero antiglobulina) o complemento (suero anticomplementario), se inmuniza al animal con suero humano, inmunoglobulinas o complemento humano. El suero obtenido del animal se purifica de anticuerpos contra otras proteínas.
Los glóbulos rojos del paciente se lavan con solución salina para eliminar completamente el suero, que neutraliza los anticuerpos contra las inmunoglobulinas y el complemento y puede provocar un resultado falso negativo.
Si los anticuerpos o los componentes del complemento se fijan en la superficie de los glóbulos rojos, la adición de antiglobulina o suero anticomplemento provoca la aglutinación de los glóbulos rojos.
La prueba de Coombs directa se utiliza en los siguientes casos:
Hemólisis autoinmune.
Enfermedad hemolítica del recién nacido.
Anemia hemolítica inmune inducida por fármacos.
Reacciones transfusionales hemolíticas. Prueba de Coombs indirecta. La prueba de Coombs indirecta detecta anticuerpos contra los glóbulos rojos en el suero. Para ello, se incuba el suero del paciente con glóbulos rojos de un donante del grupo 0 y luego se realiza una prueba de Coombs directa.
La prueba de Coombs indirecta se utiliza en los siguientes casos:
Determinación de la compatibilidad individual de la sangre del donante y del receptor.
Detección de aloanticuerpos, incluidos anticuerpos que provocan reacciones transfusionales hemolíticas.
Determinación de antígenos eritrocitarios de superficie en genética médica y medicina forense.
Confirmación de gemelos idénticos durante el trasplante de médula ósea.
Para realizar una prueba biológica, la sangre comienza a transfundirse lo más rápido posible (preferiblemente en un chorro). Después de la transfusión de 25 ml de sangre, el tubo del sistema se sujeta con una pinza. Luego hay una pausa de 3 minutos, durante la cual se controla el estado del destinatario. Para realizar una prueba biológica se inyectan tres veces 25 ml de sangre. Al final de la prueba (después de la transfusión de los primeros 75 ml de sangre en dosis fraccionadas de 25 ml a intervalos de 3 minutos), el sistema se ajusta a la velocidad de transfusión requerida. Cuando se transfunde más de un frasco de sangre a un paciente, es necesario retirar la aguja de la vena. En este caso, la aguja se retira del tubo de ensayo del vial en el que se ha agotado la sangre y se inserta en el siguiente vial. El tubo del sistema (goma o plástico) se sujeta en este momento con una abrazadera. Si durante una transfusión de sangre es necesario administrar cualquier otro fármaco por vía intravenosa al receptor, esto se hace perforando el tubo de goma del sistema. Los pinchazos en el tubo de plástico son inaceptables, ya que no se caen. Después de cada transfusión de sangre, se debe controlar al paciente para identificar y eliminar rápidamente posibles complicaciones, incluido reacciones alérgicas. 2 horas después del final de la transfusión de sangre, se debe medir la temperatura corporal. Si aumenta, se debe repetir la medición cada hora durante las siguientes 4 horas. No menos importante es el control de la micción y la composición de la orina, lo que permite establecer la presencia de una reacción tóxica post-transfusión. La aparición de oliguria y anuria después de una transfusión de sangre, la presencia de células sanguíneas y proteínas en la orina son una indicación directa del desarrollo de hemólisis postransfusión.
Prueba de Coombs directa. Esta prueba se utiliza para comprobar la presencia de anticuerpos bloqueantes fijados en los glóbulos rojos del niño. Una prueba directa positiva indica sensibilización y sirve como un signo convincente de enfermedad hemolítica del recién nacido incluso antes de que aparezcan otros. signos clínicos. Como excepción y sólo en casos muy graves, una prueba de Coombs directa puede resultar negativa debido a la hemólisis casi completa de los glóbulos rojos sensibilizados.
Una prueba de Coombs directa se realiza de la siguiente manera: se colocan 5 gotas de sangre extraídas del talón del niño en un tubo de ensayo y se añaden 5 ml de solución salina. Revuelva bien y centrifugue durante 10 minutos. Se separa el líquido transparente sobre el sedimento de glóbulos rojos. Luego agregue nuevamente 5 ml de solución salina, mezcle y centrifugue. Después de mezclar con solución salina tres veces, los glóbulos rojos se lavan bien. Después de la última separación del sobrenadante, se mezcla el sedimento de eritrocitos en una cantidad de 0,1 ml con 0,9 ml de solución fisiológica. Aplique 2-3 gotas de esta mezcla a un portaobjetos de vidrio y agregue una gota de suero Coombs. La presencia de aglutinación indica que la reacción es positiva (prueba de Coombs directa positiva). El estudio debe realizarse a temperatura ambiente superior a 16° para evitar el efecto de las aglutininas frías.
Prueba de Coombs indirecta sirve como evidencia de la presencia de anticuerpos libres en el suero materno y se realiza con suero materno.
La enfermedad hemolítica en un recién nacido con incompatibilidad Rh suele manifestarse después del segundo embarazo. El primer niño nace sano, el segundo con signos de anemia leve y sólo después del tercer embarazo nacen niños con señales claras enfermedad hemolítica. Sólo las mujeres presensibilizadas pueden dar a luz a un niño con síntomas de enfermedad hemolítica durante su primer embarazo. En algunos casos, la inmunización provoca abortos y nacimientos. niños muertos. Para el inicio y la gravedad de la enfermedad, son importantes el estado de la placenta y la duración de la exposición de las aglutininas maternas al feto. Cuando las aglutininas aparecen entre 10 y 14 semanas antes del nacimiento, el niño suele experimentar formas subclínicas. La aparición temprana de aglutininas, 15-26 semanas antes del nacimiento, provoca formas severas enfermedades. En todas las formas de la enfermedad, el proceso principal es la hemólisis. La consecuencia de la reacción antígeno-anticuerpo es la hemólisis, daño al hígado y a los capilares cerebrales. Dependiendo de qué lesión predomine, también hay varias formas enfermedades. Algunos fenómenos anafilácticos también son peligrosos. Conducen a la formación de sustancias similares a la histamina, que causan graves daños a las células del hígado y especialmente a las células ganglionares de los ganglios basales, el cuerno de amón, Medula oblonga e incluso la corteza cerebral. Cuando las células del hígado están dañadas, la ictericia hepática se suma a la ictericia extrahepática. Los niños mueren debido a síntomas graves de kernicterus. Si sobreviven, los síntomas de las lesiones permanecen. sistema nervioso(trastornos del sistema extrapiramidal con movimientos coreoatetósicos, un modo de andar peculiar de baile, movimientos forzados de la cabeza, a veces trastornos de coordinación movimientos voluntarios con caídas frecuentes, tono aumentado músculos, retraso mental, es decir con signos de los llamados. encefalopatía posticteria infantil).
