Reakcja wiązania dopełniacza (CFR) polega na tym, że specyficzny kompleks antygen-przeciwciało zawsze adsorbuje (wiąże) dopełniacz ze sobą.
Reakcja ta jest szeroko stosowana w identyfikacji antygenów oraz w serodiagnostyce infekcji, zwłaszcza chorób* wywoływanych przez krętki (reakcja Wassermanna), riketsje i wirusy.
RSC to złożona reakcja serologiczna. Obejmuje dopełniacz i dwa układy antygen-przeciwciało. Zasadniczo są to dwie reakcje serologiczne.
Układ pierwszy - główny składa się z antygenu i przeciwciała (jeden jest znany, drugi nie). Dodaje się do niego pewną ilość dopełniacza. Jeśli antygen i przeciwciało tego układu pasują, połączą się i zwiążą dopełniacz. Powstały kompleks jest drobno zdyspergowany i niewidoczny.
Tworzenie się tego kompleksu wykrywa się za pomocą drugiego układu hemolitycznego lub wskaźnikowego. W jego skład wchodzą czerwone krwinki owiec (antygen) oraz odpowiadająca im surowica hemolityczna (przeciwciało), czyli gotowy kompleks immunologiczny. W tym układzie liza czerwonych krwinek może nastąpić jedynie w obecności dopełniacza. Jeśli dopełniacz jest związany przez pierwszy układ (jeśli antygen i przeciwciało w nim odpowiadają), wówczas w drugim układzie nie będzie hemolizy - ponieważ nie ma wolnego dopełniacza. Brak hemolizy (zawartość probówki jest mętna lub na dnie znajduje się osad erytrocytów) uznaje się za dodatni wynik RSC.
Jeśli w pierwszym układzie antygen nie pasuje do przeciwciała, wówczas kompleks immunologiczny nie powstanie, a dopełniacz pozostanie wolny! Pozostając wolnym, dopełniacz bierze udział w drugim układzie, powodując hemolizę; wynik RSC jest ujemny (zawartość probówek jest przezroczysta - „krew lakieru”).
Składniki reakcji wiązania dopełniacza:
Antygen - zwykle lizat, ekstrakt, hapten; rzadziej zawieszenie.
1. Układ przeciwciało-surowica
2. Uzupełnienie - serum świnki morskie
3. Antygen – czerwone krwinki owcy
4.Przeciwciało - hemolizyna przeciwko czerwonym krwinkom owiec
5. Roztwór izotoniczny
Ze względu na fakt, że w RSC bierze udział duża liczba złożonych składników, należy je najpierw zmiareczkować i włączyć do reakcji w dokładnych ilościach i w równe objętości: 0,5 lub 0,25, rzadziej 0,2 ml. W związku z tym całe doświadczenie przeprowadza się w objętościach 2,5, 1,25 lub 1,0 ml (większe objętości dają dokładniejszy wynik). Miareczkowanie składników reakcji przeprowadza się w takiej samej objętości jak w doświadczeniu, zastępując brakujące składniki roztworem izotonicznym.
Przygotowanie składników
Surowica hemolityczna (hemolizyna). Surowicę rozcieńcza się 3 razy mniej niż jej miano (patrz s. 211). Przygotować ogólne rozcieńczenie surowicy na całe doświadczenie, którego objętość określa się poprzez pomnożenie objętości surowicy w jednej probówce (np. 0,5 ml) przez liczbę probówek nieznacznie przekraczającą liczbę w doświadczeniu.
2. Czerwone krwinki owiec. Przygotować 3% zawiesinę przemytych erytrocytów owczych (patrz str. 211) dla całej liczby probówek objętych doświadczeniem. Aby przygotować układ hemolityczny, na 30 minut przed dodaniem go do doświadczenia należy zmieszać równe objętości rozcieńczonej hemolizyny i zawiesiny czerwonych krwinek, dodając surowicę do czerwonych krwinek, dokładnie wymieszać i inkubować 30 minut w temperaturze 37˚C.
3.Suplement zazwyczaj rozcieńcza się w stosunku 1:10. Należy go miareczkować przed każdym doświadczeniem. Miano dopełniacza to jego najmniejsza ilość, po dodaniu do układu hemolitycznego całkowita hemoliza następuje w ciągu 1 godziny w temperaturze 37˚C. Schemat miareczkowania dopełniacza przedstawiono w Tabeli 21.
Uwaga! Miareczkuj komplement w tej samej objętości, co w głównym eksperymencie, zastępując brakujące składniki roztworem izotonicznym.
Rozliczanie wyników. W kontrolach nie powinno być nawet śladów hemolizy, ponieważ jeden z nich nie zawiera dopełniacza, drugi - hemolizynę. Kontrole wskazują, że składniki reakcji nie wykazują hemotoksyczności (zdolności do spontanicznej lizy czerwonych krwinek).
W podanej tabeli W przykładzie 21 miano dopełniacza w rozcieńczeniu 1:10 wynosi 0,15 ml. W eksperymencie aktywność dopełniacza może spaść z powodu jego niespecyficznej adsorpcji przez inne składniki reakcji, dlatego w eksperymencie zwiększa się ilość dopełniacza: przyjmuje się dawkę zgodnie z mianem. To jest dawka robocza. W podanym przykładzie jest to równe 0,2 dopełnienia w rozcieńczeniu 1:10. Ponieważ wszystkie składniki biorące udział w RSC należy pobrać w równych objętościach (w naszym przykładzie jest to 0:5 ml), do roboczej dawki dopełniacza (0,2 ml 1:10) należy dodać 0,3 ml roztworu izotonicznego. Dla całego doświadczenia objętość każdego z nich (uzupełniacza i roztworu izotonicznego.
Dla całego doświadczenia objętość każdego z nich (dopełniacza i roztworu izotonicznego) mnoży się przez liczbę probówek biorących udział w RSC. Przykładowo, aby przeprowadzić doświadczenie w 50 probówkach należy pobrać 10 ml dopełniacza 1:10 (0,2 ml x 50) i 15 ml roztworu izotonicznego (0,3 ml x 50).
4. Antygen zazwyczaj otrzymuje się w postaci gotowej, z podanym miano, tj. ilość, która po rozcieńczeniu antygenu powinna zawierać się w 1 ml. na przykład przy mianie 0,4 rozcieńcza się go w 0,96 ml roztworu izotonicznego. Do doświadczenia biorę ilość antygenu równą połowie miana (0,5 ml). To jest jego dawka robocza. Obliczyć całkowite rozcieńczenie antygenu dla całego doświadczenia, mnożąc 0,5 ml przez liczbę probówek w doświadczeniu.
5. Przeciwciało – surowica pacjenta. Świeża surowica jest przed eksperymentem inaktywowana, aby zniszczyć obecny w niej dopełniacz. W tym celu ogrzewa się go przez 30 minut w temperaturze 56˚C w łaźni wodnej lub w inaktywatorze z termostatem. Preferowana jest ta druga metoda: eliminuje możliwość przegrzania serwatki, czyli jej denaturacji. Surowice zdenaturowane nie nadają się do badania. Surowicę pacjenta stosuje się zwykle w rozcieńczeniu od 1:10 do 1:160.
Tabela nr 14
| Składniki, ml | probówki | |||||||||||
| doświadczenie | kontrola | |||||||||||
| Układ hemolityczny | czerwone krwinki | |||||||||||
| Roztwór izotoniczny | 1,45 | 1,4 | 1,35 | 1,3 | 1,25 | 1,2 | 1,15 | 1,1 | 1,05 | 1,0 | 1,5 | 1,5 |
| Uzupełnienie 1:10 | 0,05 | 0,1 | 0,15 | 0,2 | 0,25 | 0,3 | 0,35 | 0,4 | 0,45 | 0,5 | ― | 0,5 |
| Układ hemolityczny | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | ― |
| 3% zawiesina czerwonych krwinek owiec | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | ― | 0,5 |
| Probówki dokładnie wytrząsa się i inkubuje w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. | ||||||||||||
| wynik | Brak hemolizy | Hemoliza | Brak hemolizy |
Surowice odpornościowe najczęściej przygotowywane są w warunkach produkcyjnych i uwalniane w formie inaktywowanej. Są rozcieńczane w stosunku 1:50 i więcej.
Wszystkie składniki są przygotowane w niewielkim nadmiarze.
| Składniki, ml | Probówki | |||||||
| Kontrola doświadczenia | ||||||||
| serum | antygen | Układ hemolityczny | Uzupełnić w dawce roboczej | |||||
| ½ | ||||||||
| Faza 1 Roztwór izotoniczny | ― | 0,5 | 0,5 | 1,5 | 1,25 | 1,0 | 0,5 | |
| Surowica testowa rozcieńczona 1:10 | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ― | |
| Antygen w dawce roboczej | 0,5 | 0,5 | ― | ― | ― | ― | ||
| Uzupełnij 1:10 w dawce roboczej | 0,5 | 0,5 | 0,5 | ― | 0,25 | 0,5 | 1,0 | |
| Probówki dokładnie wytrząsa się i inkubuje w temperaturze 37°C przez 45 minut 1 godzinę lub w temperaturze 4°C przez 18 godzin | ||||||||
| Faza 2 układu hemolitycznego | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | |
| Probówki dokładnie wytrząsa się i inkubuje w temperaturze 37˚C aż do całkowitej hemolizy w probówkach 2, 3, 6 i 7 | ||||||||
| Wynik | Pozytywny lub negatywny | ― | ― | ++++ | (+) | ― | ― | |
Tabela nr 15
Przeprowadzenie głównego eksperymentu
Przygotowując eksperyment, jest to niezwykle; Ważna jest kolejność dodawania składników. Eksperyment przeprowadza się w dwóch fazach.
Faza I. Do probówek wlewa się wymaganą ilość izotonicznego roztworu chlorku sodu, następnie wymaganą objętość rozcieńczonej surowicy i w tej samej objętości robocze dawki antygenu i dopełniacza. Eksperymentowi musi towarzyszyć kontrola wszystkich składników biorących w nim udział: surowicy, antygenu, układu hemolitycznego i dopełniacza.
Probówki dokładnie wytrząsa się i inkubuje w temperaturze 37°C przez 45 min-1 godzinę lub w temperaturze 4°C („RSC na zimno”) przez 18 godzin. W tym czasie następuje wiązanie dopełniacza w obecności specyficznego kompleksu. Przeprowadzenie reakcji „na zimno” znacząco zwiększa jej czułość i swoistość.
Faza II. Po zakończeniu inkubacji do wszystkich probówek dodaje się 1 ml układu hemolitycznego i wstępnie umieszcza się w termostacie na 30 minut (uczulony). Probówki są wstrząsane i ponownie umieszczane w termostacie.
Wynik księgowy ok. Probówki pozostawia się w termostacie do czasu całkowitej hemolizy w probówkach 2, 3, 6 i 7 (kontrola surowicy, antygenu i dopełniacza dla jednej i dwóch dawek). Hemoliza nastąpi najpierw w siódmej probówce, która zawiera podwójną ilość dopełniacza. Po wystąpieniu hemolizy w tej probówce i jej zawartość stanie się całkowicie przezroczysta, należy szczególnie uważnie monitorować pozostałe kontrole. Gdy tylko ciecz w probówkach 2., 3. i 6. stanie się przezroczysta, należy natychmiast wyjąć statyw z probówkami z termostatu. O tym, że doświadczenia nie przetrzymywano w termostacie dłużej, niż to konieczne, świadczy obecność niewielkiego zmętnienia (niecałkowita hemoliza) w 5 probówce - zawiera ona tylko połowę roboczej dawki dopełniacza i w przypadku przerwania doświadczenia nie może nastąpić całkowita hemoliza. ustawić poprawnie.
Hemoliza w kontroli surowicy i antygenu (probówki 2 i 3) wskazuje, że ich dawki zostały dobrane prawidłowo i że ani surowica, ani sam antygen nie wiążą dopełniacza.
W kontroli układu hemolitycznego (probówka 4), jeśli działa prawidłowo, nie powinno być nawet śladów hemolizy - nie ma w tym dopełnienia.
Kiedy już będziesz mieć pewność, że kontrole zostały przeprowadzone prawidłowo, możesz wziąć pod uwagę zdobyte doświadczenie. Brak hemolizy w probówkach uważa się za pozytywny wynik reakcji. Wskazuje, że w surowicy znajdują się przeciwciała specyficzne dla pobranego antygenu. Utworzony przez nie kompleks wiązał dopełniacz i uniemożliwiał jego udział w reakcji hemolizy. Jeżeli w probówkach nastąpi hemoliza, wynik reakcji ocenia się jako ujemny. W w tym przypadku nie ma zgodności między antygenem a przeciwciałem, dopełniacz nie jest związany i bierze udział w reakcji hemolizy.
Równolegle z surowicą pacjenta wykonuje się to samo doświadczenie z surowicą wyraźnie dodatnią (tj. z surowicą zawierającą przeciwciała przeciwko danemu antygenowi) i surowicą wyraźnie ujemną, która nie zawiera specyficznych przeciwciał. Jeśli eksperyment zostanie skonfigurowany prawidłowo, w pierwszym przypadku powinno nastąpić opóźnienie hemolizy, a w drugim przypadku nastąpi hemoliza.
Intensywność reakcji wyraża się w następujący sposób:
Całkowite opóźnienie hemolizy. Czerwone krwinki tworzą jednolite zmętnienie lub osiadają na dnie. W takim przypadku ciecz w probówce staje się bezbarwna;
Lizie ulega około 25% czerwonych krwinek. Osadu jest mniej, ciecz nad nim jest lekko różowa. Wynik RSC również ocenia się jako zdecydowanie pozytywny;
Lizie ulega około 50% czerwonych krwinek. Osad jest mały, ciecz jest różowa. Pozytywny wynik RSC;
Około 75% czerwonych krwinek ulega lizie. Niewielki osad, nad którym znajduje się intensywnie zabarwiona ciecz. Wątpliwy wynik RSC;
Wszystkie czerwone krwinki uległy lizie. Płyn jest intensywnie zabarwiony i całkowicie przezroczysty. Wynik negatywny RSC.
Reakcja ta służy do wykrywania przeciwciał w surowicy krwi pacjentów z infekcjami bakteryjnymi, wirusowymi, pierwotniakowymi, a także do identyfikacji i typu wirusów wyizolowanych od pacjentów.
RSC odnosi się do złożonych reakcji serologicznych, w których oprócz antygenu, przeciwciała i dopełniacza uczestniczy także układ hemolityczny, ujawniając skutki reakcji. RSC przebiega dwuetapowo: pierwsza to oddziaływanie antygenu z przeciwciałem przy udziale dopełniacza, druga to określenie stopnia wiązania dopełniacza za pomocą układu hemolitycznego. System ten składa się z czerwonych krwinek owiec i surowicy hemolitycznej otrzymanej w wyniku immunizacji zwierząt laboratoryjnych czerwonymi krwinkami. Erytrocyty poddaje się obróbce – uwrażliwianiu poprzez dodanie do nich surowicy w temperaturze 37°C na 30 minut. Liza uczulonych erytrocytów owiec następuje tylko wtedy, gdy przyłączają się do hemolitycznego układu dopełniacza. W przypadku jego braku czerwone krwinki nie ulegają zmianie. Wynik RSC zależy od obecności przeciwciał w badanej surowicy. Jeśli surowica zawiera przeciwciała homologiczne do antygenu użytego w reakcji, wówczas powstały kompleks antygen-przeciwciało wiąże się i wiąże dopełniacz. W tym przypadku po dodaniu układu hemolitycznego hemoliza nie nastąpi, ponieważ całe uzupełnienie zostanie wydane na specyficzne wiązanie kompleksu antygen-przeciwciało.
Czerwone krwinki pozostają niezmienione, więc brak hemolizy w probówce jest rejestrowany jako dodatni wynik RBC. W przypadku braku przeciwciał odpowiadających antygenowi w surowicy, nie tworzy się specyficzny kompleks antygen-przeciwciało, a dopełniacz pozostaje wolny. Po dodaniu układu hemolitycznego dopełniacz przyłącza się do niego i powoduje hemolizę czerwonych krwinek. Zniszczenie czerwonych krwinek i ich hemoliza charakteryzuje się reakcją negatywną.
Do stopnia zaawansowania RSC potrzebne są: surowica pacjenta, dopełniacz, układ hemolityczny składający się z erytrocytów owczych i surowicy hemolitycznej oraz izotoniczny roztwór chlorku sodu.
Reakcję prowadzi się w probówkach serologicznych. Owcze krwinki czerwone uzyskuje się z odwłóknionej krwi owczej poprzez trzykrotne przemycie ich izotonicznym roztworem chlorku sodu. Surowica hemolityczna produkowana jest w postaci gotowej w ampułkach, na której etykiecie wskazano jej miano, czyli maksymalne rozcieńczenie surowicy, które po dodaniu do czerwonych krwinek w obecności dopełniacza nadal powoduje hemolizę. Surowicę hemolityczną otrzymuje się poprzez immunizację zwierząt, takich jak króliki, czerwonymi krwinkami owiec. Podczas ustalania reakcji surowicę stosuje się w potrójnym mianowaniu. Na przykład miano surowicy hemolitycznej wynosi 1:1200, a rozcieńczenie robocze wynosi 1:400. Jako uzupełnienie stosuje się świeżą surowicę krwi świnki morskiej (w ciągu 24-48 godzin) lub suchy dopełniacz w ampułkach.
Przed wykonaniem RSC dopełniacz rozcieńcza się w stosunku 1:10 i miareczkuje w celu ustalenia miana – najmniejszej ilości dopełniacza powstałego w wyniku hemolizy czerwonych krwinek w połączeniu z układem hemolitycznym stosowanym w tej reakcji. Biorąc pod uwagę możliwe antykomplementarne właściwości antygenu, podczas inscenizacji reakcji zwiększa się o 20-30% ustalone robocze miano dopełniacza.
Antygenem RSC są zawiesiny zabitych bakterii, przygotowane z tych zawiesin ekstrakty oraz poszczególne frakcje chemiczne drobnoustrojów. Głównym wymaganiem dla antygenu jest brak hamowania aktywności dopełniacza. Nie powinien mieć właściwości antykomplementarnych. Aby zidentyfikować te właściwości antygenu, dopełniacz miareczkuje się dodatkowo w obecności antygenu użytego w reakcji. Istnieją pewne schematy inscenizacji RSC. Wyniki reakcji uwzględnia się na podstawie obecności lub braku hemolizy czerwonych krwinek w układzie hemolitycznym. RSC stosuje się w diagnostyce kiły (reakcja Wassermanna), rzeżączki (reakcja Bordeta-Gengou), toksoplazmozy, riketsjozy i choroby wirusowe.
Reakcja wiązania dopełniacza (CFR) polega na tym, że gdy antygeny i przeciwciała odpowiadają sobie, tworzą kompleks immunologiczny, do którego dopełniacz (C) jest przyłączony poprzez fragment Fc przeciwciał, tj. dopełniacz jest wiązany przez kompleks antygen-przeciwciało. Jeśli kompleks antygen-przeciwciało nie zostanie utworzony, wówczas dopełniacz pozostaje wolny.
Specyficznemu oddziaływaniu AG i AT towarzyszy adsorpcja (wiązanie) dopełniacza. Ponieważ proces wiązania dopełniacza nie jest widoczny wizualnie, J. Bordet i O. Zhangu zaproponowali zastosowanie układu hemolitycznego (czerwone krwinki owcy + surowica hemolityczna) jako wskaźnika, który pokazuje, czy dopełniacz jest wiązany przez kompleks AG-AT. Jeżeli AG i AT odpowiadają sobie, czyli powstał kompleks immunologiczny, to dopełniacz jest wiązany przez ten kompleks i nie zachodzi hemoliza. Jeśli AT nie odpowiada AG, wówczas kompleks nie tworzy się, a dopełniacz, pozostając wolny, łączy się z drugim układem i powoduje hemolizę.
Postęp reakcji
Reakcja przebiega w dwóch fazach obejmujących dwa układy; bakteryjne i hemolityczne. Pierwsza reakcja (specyficzna) obejmuje antygen 4-+ przeciwciało + dopełniacz. Dodatni wynik reakcji, do którego dochodzi w przypadku dopasowania przeciwciał do antygenu, charakteryzuje się utworzeniem specyficznego kompleksu bakteryjnego antygen-przeciwciało z zaadsorbowanym, czyli, jak to się mówi, „związanym” dopełniaczem. Pozostając niewidocznym, kompleks nie powoduje żadnych zewnętrznych zmian w środowisku, w którym powstał. Ujemny wynik RSC występuje przy braku swoistego powinowactwa między antygenem a przeciwciałem surowicy i charakteryzuje się zachowaniem wolnego aktywnego dopełniacza. Pierwszą fazę RSC można przeprowadzić w termostacie w temperaturze 37°C (1-2 godziny) lub w lodówce w temperaturze 3-4°C (18-20 godzin). Przy przedłużonym tworzeniu kompleksu immunologicznego antygen-przeciwciało na zimno następuje pełniejsze wiązanie dopełniacza, w wyniku czego zwiększa się czułość reakcji. Prowadząc eksperymenty porównawcze, radziecki immunolog akademik. V.I. Ioffe i jego uczniowie wykazali, że w warunkach długotrwałego wiązania dopełniacza na zimno możliwe jest wychwycenie 100-500 razy mniejszych ilości antygenu i otrzymanie pozytywne wyniki
przy większych rozcieńczeniach surowicy odpornościowej niż w eksperymencie wiązania dopełniacza w temperaturze 37°C przez 1-2 godziny. Druga faza reakcji (wskaźnik) zachodzi pomiędzy odczynnikami układu hemolitycznego (mieszanina 3% zawiesiny). erytrocyty i surowica hemolityczna w równych objętościach) w temperaturze 37°C tylko w obecności dopełniacza wolnego od pierwszej fazy reakcji (reakcja ujemna). W przypadku braku wolnego aktywnego dopełniacza nie dochodzi do hemolizy czerwonych krwinek pod wpływem określonych hemolizyn (reakcja jest dodatnia).
Reakcja wiązania dopełniacza (CFR) jest złożoną reakcją serologiczną. Do jego przeprowadzenia potrzebnych jest 5 składników, a mianowicie: AG, AT i dopełniacz (pierwszy układ), erytrocyty owcze oraz surowica hemolityczna (drugi układ).
Antygenem RSC mogą być kultury różnych zabitych mikroorganizmów, ich lizaty, składniki bakterii, patologicznie zmienione i normalne narządy, lipidy tkankowe, wirusy i materiały zawierające wirusy.
Jako uzupełnienie stosuje się świeżą lub suszoną surowicę świnki morskiej.
Mechanizm reakcji
RSK przeprowadza się w dwóch fazach: I faza – inkubacja mieszaniny zawierającej trzy składniki: antygen + przeciwciało + dopełniacz; II faza (wskaźnik) - wykrywanie wolnego dopełniacza w mieszaninie poprzez dodanie do niej układu hemolitycznego składającego się z erytrocytów owiec i surowicy hemolitycznej zawierającej przeciwko nim przeciwciała. W I fazie reakcji, gdy tworzy się kompleks antygen-przeciwciało, wiąże się dopełniacz, następnie w II fazie nie dochodzi do hemolizy erytrocytów uwrażliwionych przez przeciwciała; reakcja jest pozytywna. Jeżeli antygen i przeciwciało nie pasują do siebie (w badanej próbce nie ma antygenu ani przeciwciała), dopełniacz pozostaje wolny i w II fazie połączy się z kompleksem erytrocyt – przeciwciało antyerytrocytowe, powodując hemolizę; reakcja jest negatywna.
Aplikacja
Reakcję wiązania dopełniacza można wykorzystać do:
1) identyfikacja swoistych przeciwciał w nieznanej surowicy na podstawie ich interakcji z antygenem o znanym charakterze;
2) badanie właściwości antygenu w reakcji ze znaną specyficzną surowicą. Przygotowanie składników do inscenizacji RSC.
1. Surowicę krwi pobraną do badań, w przeddzień reakcji, podgrzewa się w łaźni wodnej o temperaturze 56°C przez 30 minut w celu inaktywacji własnego dopełniacza. Inaktywowaną surowicę można przechowywać w temperaturze 3-4°C przez 5-6 dni. W dniu doświadczenia surowicę rozcieńcza się izotonicznym roztworem chlorku sodu w stosunku 1:5 (0,1 ml surowicy testowej + 0,4 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu).
2. Antygenem do produkcji CSC mogą być kultury różnych drobnoustrojów, białka bakteryjne i ekstrakty uzyskane z kultur drobnoustrojów, patologicznie zmienione i prawidłowe narządy i tkanki. Specyfika przygotowania antygenu zależy od charakteru procesu zakaźnego i cech jego patogenu.
3. Dopełniacz to mieszanina surowic uzyskanych od 3-5 zdrowych świnek morskich lub suchy dopełniacz w ampułkach.
Bezpośrednio przed użyciem surowicę świnki morskiej rozcieńcza się izotonicznym roztworem chlorku sodu w stosunku 1:10 do uzyskania roztworu podstawowego.
4. Przed wykonaniem doświadczenia surowicę hemolityczną inaktywuje się poprzez ogrzewanie w temperaturze 56°C przez 30 minut. Do przeprowadzenia głównego eksperymentu RSC, a także do miareczkowania dopełniacza i antygenu, stosuje się surowicę hemolityczną w potrójnym mianowaniu. Na przykład, jeśli miano surowicy hemolitycznej wynosi 1:1800, w reakcji stosuje się rozcieńczenie surowicy 1:600.
5. Erytrocyty otrzymuje się z odwłóknionej krwi owczej. Aby usunąć błony fibrynowe, krew jest filtrowana przez trójwarstwowy filtr z gazy. Powstały filtrat odwirowuje się, surowicę odsysa się i osusza, a erytrocyty przemywa się przez 3-4-krotne odwirowanie izotonicznym roztworem chlorku sodu. Kiedy krwinki czerwone przemywamy po raz ostatni, warstwa cieczy nasączonej powinna być całkowicie przezroczysta. Z przemytych krwinek czerwonych w izotonicznym roztworze chlorku sodu przygotowuje się 3% zawiesinę. Po przygotowaniu składników biorących udział w RSC w powyższy sposób należy przystąpić do miareczkowania surowicy hemolitycznej, dopełniacza i antygenu.
Podręcznik składa się z siedmiu części. Część pierwsza – „Mikrobiologia ogólna” – zawiera informacje dotyczące morfologii i fizjologii bakterii. Część druga poświęcona jest genetyce bakterii. Część trzecia – „Mikroflora Biosfery” – poświęcona jest mikroflorze środowisko, jej rola w obiegu substancji w przyrodzie oraz mikroflora człowieka i jej znaczenie. Część czwarta – „Doktryna infekcji” – poświęcona jest chorobotwórczym właściwościom mikroorganizmów, ich roli w proces zakaźny, a także zawiera informacje o antybiotykach i mechanizmach ich działania. Część piąta – „Doktryna odporności” – zawiera współczesne idee dotyczące odporności. Część szósta – „Wirusy i choroby przez nie wywoływane” – dostarcza informacji o podstawowych właściwościach biologicznych wirusów i chorobach, jakie powodują. Część siódma – „Prywatna mikrobiologia medyczna” – zawiera informacje o morfologii, fizjologii, właściwościach chorobotwórczych wielu patogenów choroby zakaźne, a także o nowoczesne metody ich diagnostyka, specyficzna profilaktyka i terapii.
Podręcznik przeznaczony jest dla studentów, doktorantów i nauczycieli wyższych uczelni medycznych instytucje edukacyjne, uniwersytety, mikrobiolodzy wszystkich specjalności i lekarze praktykujący.
Wydanie piąte, poprawione i rozszerzone
Książka:
| <<< Назад
|
Do przodu >>> |
Reakcja wiązania dopełniacza
Stwierdzono unikalną zdolność dopełniacza do specyficznego wiązania się z kompleksami antygen + przeciwciało o różnym charakterze szerokie zastosowanie w reakcji wiązania dopełniacza (CFR). Szczególną zaletą RSC jest to, że charakter zawartego w nim antygenu (korpuskularny lub rozpuszczalny) nie ma znaczenia, ponieważ dopełniacz wiąże się z fragmentem Fc dowolnego przeciwciała spokrewnionego z IgG i IgM, niezależnie od jego specyficzności przeciwciała. Ponadto RSA jest bardzo czuły: pozwala wykryć ilość przeciwciał 10 razy mniejszą niż np. w reakcji strącania. RSC został zaproponowany w 1901 roku przez J. Bordeta i O. Zhanga. Opiera się na dwóch właściwościach dopełniacza:
1) zdolność do wiązania kompleksu antygen + przeciwciało;
2) liza czerwonych krwinek wykorzystywanych do otrzymania surowicy hemolitycznej.
RSK odbywa się w dwóch etapach i biorą w nim udział odpowiednio dwa systemy - eksperymentalny lub diagnostyczny i wskaźnikowy. System diagnostyczny składa się z surowicy testowej (lub diagnostycznej), którą przed wykonaniem reakcji podgrzewa się w temperaturze 56°C przez 30 minut w celu inaktywacji obecnego w niej dopełniacza i antygenu. Do tego systemu dodawane jest standardowe uzupełnienie. Jego źródłem jest świeża lub suszona serwatka świnki morskiej. Mieszaninę inkubuje się w temperaturze 37°C przez jedną godzinę. Jeśli surowica testowa zawiera przeciwciała, będą one oddziaływać z dodanym antygenem, a powstałe kompleksy antygen + przeciwciało zwiążą dodany dopełniacz. Jeśli w surowicy nie ma przeciwciał, nie nastąpi utworzenie kompleksu antygen + przeciwciało, a dopełniacz pozostanie wolny. Na tym etapie reakcji zwykle nie występują widoczne objawy wiązania dopełniacza. Dlatego też, aby wyjaśnić kwestię, czy nastąpiło wiązanie dopełniacza, czy nie, dodaje się drugi układ wskaźnikowy (inaktywowana surowica hemolityczna + erytrocyty owcze), a mieszaninę wszystkich składników RSC ponownie inkubuje się w temperaturze 37°C przez 30–60 minut, po czym w którym oceniane są wyniki reakcji. Jeżeli w pierwszym etapie w systemie diagnostycznym dopełniacz zostanie związany, czyli w surowicy pacjenta znajdują się przeciwciała, a dopełniacz zostanie związany przez kompleks przeciwciało + + antygen, nie dojdzie do lizy krwinek czerwonych – RBC jest dodatni: płyn jest bezbarwny, na dnie probówki znajduje się osad czerwonych krwinek. Jeżeli w surowicy nie ma swoistych przeciwciał i w systemie diagnostycznym nie następuje wiązanie dopełniacza, tj. RSC jest ujemne, wówczas niewydany w systemie diagnostycznym dopełniacz wiąże się z kompleksem krwinki czerwone + przeciwciała układu wskaźnikowego i powoduje hemolizę pojawia się: w probówce „lakierowana krew”, osad czerwonych krwinek nr 2. Intensywność RSC ocenia się za pomocą układu czterokrzyżowego, w zależności od stopnia opóźnienia hemolizy i obecności osadu erytrocytów. Reakcji towarzyszą odpowiednie kontrole: kontrola surowicy (bez antygenu) i kontrola antygenu (bez surowicy), ponieważ niektóre surowice i niektóre antygeny mają działanie antykomplementarne. Przed wykonaniem RSC wszystkie składniki biorące w nim udział, z wyjątkiem surowicy testowej lub antygenu, poddawane są dokładnemu miareczkowaniu. Szczególnie ważne jest wprowadzenie do reakcji dokładnej dawki dopełniacza, gdyż może to prowadzić do jego braku lub nadmiaru fałszywe wyniki. Miano dopełniacza to minimalna ilość, która w obecności dawki roboczej surowicy hemolitycznej zapewnia całkowite rozpuszczenie czerwonych krwinek. Aby przygotować główne doświadczenie, należy przyjąć dawkę dopełniacza zwiększoną o 20–25% w stosunku do ustalonego miana. Miano surowicy hemolitycznej to jej maksymalne rozcieńczenie, które po zmieszaniu z równą objętością 10% roztworu dopełniacza całkowicie hemolizuje odpowiednią dawkę czerwonych krwinek w ciągu 1 godziny w temperaturze 37°C. Doświadczenie główne polega na pobraniu surowicy rozcieńczonej do 1/3 jej miana.
Reakcja wiązania dopełniacza jest jedną z tradycyjnych reakcje serologiczne, stosowany do diagnozowania wielu chorób wirusowych, a także stanowi podstawę niektórych innych metod wykrywania przeciwciała przeciwwirusowe. Chociaż reakcja neutralizacji, hamowanie hemaglutynacji, hemaglutynacja pośrednia, test immunologiczny enzymatyczny przewyższają pod względem czułości reakcję wiązania dopełniacza, jednak prostota techniki, wczesne wykrywanie przeciwciał, a także wykrywanie antygenów wirusowych, które nie mają właściwości hemaglutynujących, wyjaśniają jej szerokie zastosowanie w badaniach wirusologicznych.
Do jego produkcji nie jest wymagany tak wysoki stopień stężenia i czystości leków antygenowych, które są niezbędne w szeregu innych reakcji immunologicznych. Ponadto specyficzność grupowa antygenów wiążących dopełniacz wielu wirusów umożliwia zastosowanie reakcji wiązania dopełniacza w diagnostyce masowej: reakcja ta nie ujawnia różnic szczepowych i ma szczególną wartość przy badaniu powiązań antygenowych między wirusami.
Sama nazwa w dużej mierze oddaje istotę metody, która składa się z dwóch odrębnych reakcji. W pierwszym etapie w reakcji biorą udział antygeny i przeciwciała (jeden z tych składników jest z góry znany) oraz dopełniacz w miareczkowanej ilości. Jeśli antygen i przeciwciała pasują, ich kompleks wiąże dopełniacz, który jest wykrywany w drugim etapie za pomocą systemu wskaźnikowego (mieszaniny czerwonych krwinek owiec i surowicy odpornościowej na nie). Jeśli dopełniacz zostanie związany podczas interakcji antygenu i przeciwciał, wówczas nie następuje liza czerwonych krwinek owiec ( pozytywna reakcja wiązanie dopełniacza). W przypadku negatywnej reakcji wiązania dopełniacza, niezwiązany dopełniacz sprzyja hemolizie, na podstawie której ocenia się wyniki reakcji.
Głównymi składnikami reakcji wiązania dopełniacza są antygeny (znane lub wykrywalne), przeciwciała (znane surowice odpornościowe lub surowice testowe), dopełniacz, surowica hemolityczna i czerwone krwinki owiec; Jako rozcieńczalnik stosuje się izotoniczny roztwór chlorku sodu (pH 7,2-7,4) lub różne roztwory buforowe. Antygeny i surowice mogą być antykomplementarne, tj. zdolność do adsorbowania dopełniacza, co opóźnia hemolizę i zniekształca wynik reakcji.
Antygeny dla CSC przygotowuje się z narządów zakażonych zwierząt, płynu omoczniowego lub owodniowego zakażonych zarodków kurzych, a także płynu hodowlanego po wyhodowaniu wirusów w hodowlach komórek tkankowych. Preparaty antygenowe zawsze zawierają dużo substancji balastowych pochodzących z komórek zwierzęcych lub kultur tkankowych, które również mogą zaburzać wynik reakcji.
Powstałe antygeny wirusowe inaktywuje się, określa się dawkę roboczą oraz właściwości antykomplementarne i hemolityczne. Następnie antygen miareczkuje się w obecności dopełniacza.
Drugim głównym składnikiem inscenizacji reakcji jest dopełniacz. Termin ten oznacza złożony system białka i czynniki obecne we krwi zwierząt i ludzi. Zazwyczaj w reakcji wiązania dopełniacza stosuje się surowicę krwi świnki morskiej. Aktywność (miano) dopełniacza to jego najmniejsza ilość, w obecności której hemolizyna powoduje całkowitą hemolizę zastosowanego układu hemolitycznego.
Aby zidentyfikować przeciwciała wiążące dopełniacz przeciwko wirusom, wymagana jest inaktywacja surowicy w celu wyeliminowania dopełniacza w temperaturze 560°C przez 30 minut. Jako surowice referencyjne stosuje się zwykle surowice pochodzące od immunizowanych zwierząt. Ponadto do immunizacji stosuje się antygeny wirusowe, które są dokładnie oczyszczone z zanieczyszczeń tkankowych, ponieważ w przeciwnym razie następuje wyraźna niespecyficzna reakcja.
Obowiązkowym elementem reakcji wiązania dopełniacza jest układ hemolityczny, w skład którego wchodzą erytrocyty owiec oraz surowica hemolityczna otrzymywana w wyniku hiperimmunizacji królików erytrocytami owiec.
Do przeprowadzenia reakcji wiązania dopełniacza stosuje się następujące modyfikacje: mikrometoda reakcji wiązania dopełniacza w mikrotitratorze układu Takachi, reakcja długoterminowa wiązania dopełniacza, reakcja pośredniego wiązania dopełniacza, reakcja wiązania dopełniacza w żelu, mikrokropelka reakcja wiązania dopełniacza, reakcja wiązania dopełniacza na bazie ciała stałego.
Chociaż czułość reakcji wiązania dopełniacza jest niska, ma ona wysoką swoistość. W związku z tym jest szeroko stosowany w diagnostyce wirusowego zapalenia płuc i jelit u młodego bydła.
