Pośrednia (pasywna) reakcja hemaglutynacji (IRHA) polega na tym, że krwinki czerwone, jeśli na ich powierzchni zaadsorbowany zostanie rozpuszczalny antygen, nabywają zdolność do aglutynacji w wyniku interakcji z przeciwciałami skierowanymi przeciwko zaadsorbowanemu antygenowi. Schemat RNGA pokazano na ryc. 34. RNGA jest szeroko stosowane w diagnostyce szeregu infekcji.
Ryż. 34. Schemat biernej reakcji hemaglutynacji (RPHA). A - uzyskanie diagnostyki erytrocytów: B - RPGA: 1 - erytrocyt: 2 - badany antygen; 3 - diagnostyka erytrocytów; 4 - przeciwciało przeciwko badanemu antygenowi: 5 - aglutynacja
Ustawianie reakcji. Surowicę testową podgrzewa się przez 30 minut w temperaturze 56°C, rozcieńcza kolejno w stosunku 1:10 - 1:1280 i wlewa do probówek lub studzienek po 0,25 ml, do których wprowadza się 2 krople erytrocytów diagnostycznych (erytrocyty z zaadsorbowanym na nich antygenem) ) są następnie dodawane.
Kontrole: zawiesina diagnostyki erytrocytów ze znaną surowicą immunologiczną; zawieszenie diagnostyki w normalnej surowicy; zawiesina prawidłowych czerwonych krwinek w surowicy testowej. W pierwszej kontroli powinna nastąpić aglutynacja, w drugiej i trzeciej nie powinna wystąpić.
Za pomocą RIGA można wykryć nieznany antygen, jeśli znane przeciwciała zostaną zaadsorbowane na czerwonych krwinkach.
Reakcję hemaglutynacji można przeprowadzić w objętości 0,025 ml (mikrometoda) przy użyciu mikrotitratora Takachi.
1. Co wskazuje dodatni wynik analizy rentgenowskiej pomiędzy krwinkami czerwonymi a materiałem badanym na obecność wirusa?
2. Czy nastąpi aglutynacja czerwonych krwinek, jeśli doda się do nich wirusa i odpowiadającą mu surowicę? Jak nazywa się reakcja, która ujawnia to zjawisko?
Ćwiczenia
Weź pod uwagę i zarejestruj wynik RYGA.
Reakcja wytrącania
W reakcji strącania wytrąca się specyficzny kompleks immunologiczny, składający się z rozpuszczalnego antygenu (lizat, ekstrakt, hapten) i swoistego przeciwciała w obecności elektrolitów.
Mętny pierścień lub osad powstały w wyniku tej reakcji nazywany jest osadem. Reakcja ta różni się od reakcji aglutynacji głównie wielkością cząstek antygenu.
Reakcja strącania jest zwykle stosowana do oznaczania antygenu w diagnostyce szeregu infekcji ( wąglik zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych itp.); w medycynie sądowej – w celu określenia gatunku krwi, nasienia itp.; w badaniach sanitarno-higienicznych – przy stwierdzeniu fałszerstwa produktów; za jego pomocą określa się pokrewieństwo filogenetyczne zwierząt i roślin. Do reakcji potrzebujesz:
1. Przeciwciała (precypityny) – surowica odpornościowa o wysokim mianie przeciwciał (nie niższym niż 1:100 000). Miano wytrącającej się surowicy określa się na podstawie największego rozcieńczenia antygenu, z którym reaguje. Serum stosuje się najczęściej w postaci nierozcieńczonej lub w rozcieńczeniu 1:5 – 1:10.
2. Antygen - rozpuszczone substancje o charakterze polisacharydów białkowych lub lipidowych (pełne antygeny i hapteny).
3. Roztwór izotoniczny.
Głównymi metodami prowadzenia reakcji wytrącania są: reakcja wytrącania pierścieniowego i reakcja wytrącania na agarze (żelu).
Uwaga! Wszystkie składniki biorące udział w reakcji wytrącania muszą być całkowicie przezroczyste.
Reakcja wytrącania pierścienia. Za pomocą pipety Pasteura dodać 0,2-0,3 ml (5-6 kropli) surowicy do probówki do strącania (surowica nie powinna dostać się na ścianki probówki). Antygen w tej samej objętości ostrożnie nakłada się warstwami na surowicę, wylewając ją cienką pipetą Pasteura wzdłuż ścianki probówki. Probówkę trzyma się w pozycji pochylonej. Po prawidłowym nałożeniu warstw powinna istnieć wyraźna granica między surowicą a antygenem. Ostrożnie, aby nie wymieszać płynu, probówkę należy umieścić w stojaku. Jeśli reakcja jest pozytywna, na styku antygenu i przeciwciała tworzy się mętny „pierścień” - osad (patrz ryc. 48).
Reakcji towarzyszy szereg kontroli (Tabela 18). Bardzo ważna jest kolejność dodawania składników reakcji do probówki. Nie można nakładać surowicy na antygen (w kontroli - na roztwór izotoniczny), ponieważ gęstość względna surowicy jest większa, wówczas opadnie ona na dno probówki, a granica między płynami nie zostanie ujawniona.
Tabela 18. Schemat przygotowania reakcji wytrącania pierścienia
Notatka. + obecność „pierścienia”; - brak „pierścienia”.
Wyniki rejestruje się po 5-30 minutach, w niektórych przypadkach po godzinie, jak zawsze, zaczynając od kontroli. „Pierścień” w drugiej probówce wskazuje zdolność surowicy odpornościowej do wniknięcia konkretna reakcja z odpowiednim antygenem. W 3-5 probówkach nie powinno być „pierścieni” - nie ma odpowiadających sobie przeciwciał i antygenów. „Pierścień” w I probówce – wynik reakcji dodatni – oznacza, że antygen testowy odpowiada pobranej surowicy odpornościowej, brak „pierścienia” („pierścień” tylko w II probówce) wskazuje na ich niezgodność – wynik negatywny wynik reakcji.
Reakcja wytrącania na agarze (żel). Osobliwością tej reakcji jest to, że interakcja antygenu i przeciwciała zachodzi w gęstym ośrodku, tj. W żelu. Powstały osad daje mętną smugę na grubości podłoża. Brak pasma wskazuje na rozbieżność pomiędzy składnikami reakcji. Reakcja ta jest szeroko stosowana w badaniach biomedycznych, w szczególności w badaniu powstawania toksyn w czynniku wywołującym błonicę.
Pytania kontrolne
1. Jaka jest główna różnica pomiędzy reakcjami aglutynacji i strącania?
2. Dlaczego w reakcji wytrącania nie można używać składników mętnych?
Ćwiczenia
1. Ustaw reakcję wytrącania pierścienia i naszkicuj wynik.
2. Zbadaj charakter oddziaływania antygenu z przeciwciałem w reakcji strącania na agarze, naszkicuj wynik (odbierz kubek od nauczyciela).
Reakcja lizy (cytoliza immunologiczna)
Liza immunologiczna polega na rozpuszczeniu komórek pod wpływem przeciwciał obowiązkowy udział komplement. Do reakcji potrzebujesz:
1. Antygen – drobnoustroje, czerwone krwinki lub inne komórki.
2. Przeciwciało (lizyna) – surowica immunologiczna, rzadziej surowica pacjenta. Surowica bakteriolityczna zawiera przeciwciała biorące udział w lizie bakterii; hemolityczny - hemolizyny, które promują lizę czerwonych krwinek; do lizy krętków potrzebne są spirochetolizyny, komórki - itolizyny itp.
3. Uzupełnij. Najwięcej uzupełnień w surowicy świnki morskie. To serum (mieszanka kilku zwierząt) jest zwykle stosowane jako uzupełnienie. Świeży (natywny) dopełniacz jest niestabilny i łatwo ulega zniszczeniu w wyniku ogrzewania, wstrząsania czy przechowywania, dlatego można go zużyć nie dłużej niż dwa dni od otrzymania. Aby zachować dopełniacz, dodaje się do niego 2%. kwas borowy i 3% siarczan sodu. Dodatek ten można przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie dwa tygodnie. Najczęściej stosuje się suchy dopełniacz. Przed użyciem rozpuszcza się w roztworze izotonicznym do pierwotnej objętości (wskazanej na etykiecie).
4. Roztwór izotoniczny.
Reakcja hemolizy(Tabela 19). Do reakcji potrzebujesz:
1. Antygen - 3% zawiesina przemytych erytrocytów owczych w ilości 0,3 ml osadu erytrocytów i 9,7 ml roztworu izotonicznego.
2. Przeciwciało - surowica hemolityczna (hemolizyna) przeciwko erytrocytom owczym; zwykle przygotowywany w produkcji, liofilizowany i miano wskazane na etykiecie.
Miano hemolizyny to najwyższe rozcieńczenie surowicy, przy którym następuje całkowita hemoliza 3% zawiesiny czerwonych krwinek w obecności dopełniacza. Do reakcji hemolizy hemolizynę pobiera się w potrójnym mianowaniu, tj. rozcieńcza się 3 razy mniej niż przed mianem. Na przykład przy mianie surowicy wynoszącym 1:1200 surowicę rozcieńcza się 1:400 (0,1 ml surowicy * i 39,9 ml roztworu izotonicznego). Nadmiar hemolizyny jest konieczny, ponieważ część z niej może zostać zaadsorbowana przez inne składniki reakcji.
* (Nie należy przyjmować mniej niż 0,1 ml surowicy - ucierpi na tym dokładność pomiaru.)
3. Dopełniacz rozcieńcza się w stosunku 1:10 (0,2 ml dopełniacza i 1,8 ml roztworu izotonicznego).
4. Roztwór izotoniczny.
Tabela 19. Schemat reakcji hemolizy
Rozliczanie wyników. Jeśli reakcja zostanie przeprowadzona prawidłowo, w pierwszej probówce nastąpi hemoliza - jej zawartość stanie się przezroczysta. W kontrolach płyn pozostaje mętny: w 2. probówce nie ma wystarczającej ilości dopełniacza, aby nastąpiła hemoliza, w 3. probówce nie ma hemolizyny, w 4. probówce nie ma ani hemolizyny ani dopełniacza, w piątej probówce antygen nie występuje nie pasuje do przeciwciała,
Jeśli to konieczne, miareczkuje się surowicę hemolityczną według poniższy schemat(Tabela 20).
Przed miareczkowaniem przygotować początkowe rozcieńczenie surowicy 1:100 (0,1 ml surowicy i 9,9 ml roztworu izotonicznego), z którego niezbędne rozcieńczenia, Na przykład:
Z tych rozcieńczeń dodać 0,5 ml surowicy do probówek do miareczkowania, jak pokazano w tabeli. 20.
Tabela 20. Schemat miareczkowania surowicy hemolitycznej (hemolizyny)
W przykładzie podanym w tabeli. 20, miano surowicy hemolitycznej wynosi 1:1200.
Stosując świeżą surowicę hemolityczną należy ją inaktywować, aby zniszczyć obecny w niej dopełniacz. W tym celu ogrzewa się go przez 30 minut w temperaturze 56°C w łaźni wodnej lub w inaktywatorze z termostatem. Ta druga metoda jest lepsza: eliminuje możliwość przegrzania serwatki, czyli jej denaturacji. Surowice zdenaturowane nie nadają się do badania.
Reakcja bakteriolizy. W tej reakcji dopełniacz powoduje lizę bakterii w obecności odpowiedniej (homologicznej) surowicy. Schemat reakcji jest zasadniczo podobny do schematu reakcji hemolizy. Różnica polega na tym, że po dwugodzinnej inkubacji wszystkie probówki wysiewa się na szalki Petriego z pożywką korzystną dla mikroorganizmu przyjętego do doświadczenia, aby sprawdzić, czy uległa ona lizie. Jeżeli doświadczenie zostanie przeprowadzone prawidłowo, hodowle z 2-5 probówek (kontroli) powinny wykazywać obfity wzrost. Brak wzrostu lub słaby wzrost w inokulacji z pierwszej probówki (eksperyment) wskazuje na śmierć drobnoustrojów, czyli na to, że są one homologiczne z przeciwciałem.
Uwaga! Reakcję bakteriolizy należy przeprowadzić w warunkach aseptycznych.
Pytania kontrolne
1. Co stanie się z czerwonymi krwinkami, jeśli zamiast izotonicznego roztworu chlorku sodu zostanie użyta woda destylowana? Jaka jest podstawa tego zjawiska?
2. Jaka reakcja nastąpi w przypadku interakcji erytrocytów z homologiczną surowicą odpornościową przy braku dopełniacza?
Ćwiczenia
Ustawić reakcję hemolizy. Zapisz i naszkicuj wynik.
Powiązana informacja.
Wykorzystuje czerwone krwinki lub neutralne materiały syntetyczne(na przykład cząsteczki lateksu), na powierzchni których sorpcyjne są antygeny (bakteryjne, wirusowe, tkankowe) lub przeciwciała. Do ich aglutynacji dochodzi po dodaniu odpowiednich surowic lub antygenów. Czerwone krwinki uczulone antygenami nazywane są antygenowymi erytrocytami diagnostycznymi i służą do wykrywania i oznaczania przeciwciał. Erytrocyty uczulone przeciwciałami. nazywane są immunoglobulinami diagnostycznymi erytrocytów i służą do wykrywania antygenów.
Reakcję biernej hemaglutynacji wykorzystuje się do diagnostyki chorób wywołanych przez bakterie (dur brzuszny i dur brzuszny, czerwonka, bruceloza, dżuma, cholera itp.), pierwotniaki (malaria) i wirusy (grypa, infekcje adenowirusowe, Wirusowe zapalenie wątroby B, odra, kleszczowe zapalenie mózgu, krymska gorączka krwotoczna itp.), a także do oznaczania niektórych hormonów, identyfikacji nadwrażliwość cierpliwy do leki oraz hormony, takie jak penicylina i insulina.
Pasywna reakcja hemaglutynacji (RPHA). Test hemaglutynacji biernej jest metodą czułą diagnostyka serologiczna i służy zarówno do diagnostyki wczesnej, jak i retrospektywnej oraz do określenia stanu immunopogicznego osób zaszczepionych. U chorych na tularemię przeciwciała stwierdza się zwykle pod koniec 1. lub 2. tygodnia choroby, po 1–1,5 miesiąca miano RPHA osiąga maksymalna wydajność(1:100000-1:20000, rzadko wyższe), po czym spadają i przez długi czas utrzymują się na poziomie 1:100-1:200.
U osób zaszczepionych przeciwciała są również stale wykrywane, jednak w niższych mianach, nie przekraczających 1:2000-1:5000 1-1,5 miesiąca po szczepieniu i przez kilka lat utrzymują się na niskim poziomie 1:20-1:80.
Antygenem pozwalającym określić stopień zaawansowania RPHA jest tularemia erythrocyte Diagnosticum (antygenowy). Lek to sformalizowane krwinki czerwone owcze, uczulone antygenem tularemii, dostępne w postaci płynnej i suchej. Preparat płynny - 10% zawiesina czerwonych krwinek w roztworze formaldehydu o stężeniu 10%. Preparat suchy liofilizowany to suszona próżniowo 10% zawiesina czerwonych krwinek bez środka konserwującego. Przed użyciem należy go rozcieńczyć zgodnie ze wskazówkami na etykiecie. Do ustawienia reakcji w płytkach styropianowych oba leki stosuje się w stężeniu 2,5%, a przy ustawianiu reakcji w mikroobjętościach - w stężeniu 0,5%.
Technika konfiguracji RPGA. Surowice testowe rozcieńcza się roztworem fizjologicznym 1:5 (1:10) i ogrzewa w temperaturze 56 stopni C przez 30 minut. Następnie, w celu usunięcia heterogennych przeciwciał przeciwko erytrocytom owiec, surowice traktuje się 50% zawiesiną sformalizowanych erytrocytów owiec. W tym celu należy dodać czerwone krwinki w ilości 2 kropli (0,05 ml) na 1 ml surowicy i dokładnie wymieszać, wstrząsając. Surowicę pozostawia się do całkowitego osadzenia się erytrocytów lub po godzinie wiruje się w temperaturze pokojowej i po tym czasie nadaje się do badania.
Ciecz rozcieńczającą wlewa się w objętości 0,5 ml do rzędu studzienek na płytce polistyrenowej. Podczas wstępnego badania surowic zaleca się ich przetestowanie poprzez ustawienie reakcji w krótkim rzędzie płytki (6-studzienek). Jeżeli przeciwciała zostaną wykryte w krótkich seriach, surowice są ponownie badane w długich seriach rozcieńczeń (12 dołków). Po rozlaniu płynu rozcieńczającego dodać 0,5 ml surowic testowych w rozcieńczeniu 1:5 do pierwszego dołka każdego rzędu (krótkiego lub długiego). Następnie te same objętości surowicy miareczkuje się, stosując dwukrotne rozcieńczenia. W ten sposób uzyskuje się rozcieńczenia surowicy w krótkich seriach od 1:10 do 1:320, a w długich seriach od 1:10 do 1:20480. Po miareczkowaniu surowicy do każdego dołka dodaje się jedną kroplę (0,05 ml) roboczej 2,5% zawiesiny uczulonych erytrocytów. Zawartość płytek dokładnie wytrząsa się aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Płytki pozostawia się w temperaturze pokojowej na nieruchomej powierzchni stołu. Wstępną rejestrację reakcji przeprowadza się po 2-3 godzinach, ostateczne oznaczenie miana następuje po całkowitym opadnięciu czerwonych krwinek w dołkach. Do reakcji przewidziano następujące kontrole: 1) surowicę testową rozcieńczoną w stosunku 1:10 w objętości 0,5 ml + 1 kropla 2,5% zawiesiny nieuczulonych erytrocytów; 2) płyn rozcieńczający w objętości 0,5 ml + 1 kropla 2,5% zawiesiny nieuczulonych erytrocytów; 3) roztwór rozcieńczający w objętości 0,5 ml + 1 kropla 2,5% zawiesiny uczulonych erytrocytów. Wszystkie kontrole powinny dać reakcję wyraźnie negatywną.
Rachunkowość i ocena RPGA. Reakcję ocenia się według następującego schematu:
1) ostro pozytywna reakcja(++++) - czerwone krwinki opadają na dno dziury równą warstwą w postaci „parasola”, który często ma zapiekane stopienie krawędzi;
2) reakcja pozytywna (+++) – krwinki czerwone pokrywają co najmniej 2/3 dna dołka;
3) reakcja słabo pozytywna (++) - aglutynian jest mały i znajduje się w samym środku dołka;
4) reakcja wątpliwa (+) - wokół osadu erytrocytów w samym środku studzienki znajdują się pojedyncze ziarna aglutynatu;
5) ujemny (-) - na dnie otworu czerwone krwinki osadzają się w postaci „guzika” lub małego pierścienia o gładkich, ostro zarysowanych krawędziach.
Miano surowicy uwzględnia się na podstawie ostatniego rozcieńczenia surowicy, które dało bardzo wyraźną reakcję (co najmniej trzy plusy). Za miano diagnostyczne uważa się rozcieńczenie 1:100 lub wyższe, jednak podobnie jak w przypadku RZS należy monitorować jego wzrost.
RPGA na tularemię jest dość specyficzny i wykrywa niektóre reakcje krzyżowe tylko z serum przeciw brucelozy. Diagnostyka różnicowa możliwe dzięki wysokości mian w RPGA, które są znacząco wyższe w przypadku antygenu homologicznego.
Technika ustawiania RPHA w mikroobjętościach. RPGA można wykonywać w mikroobjętościach przy użyciu mikrotitratora typu Takachi (lub mikropłytek okrągłodennych z mikropipetami), który umożliwia miareczkowanie materiału w objętościach 25 µl i 50 µl. Technika reakcji i kolejność wszystkich operacji są takie same, jak przy badaniu w płytach styropianowych. Należy jednak pamiętać, że czułość mikrometody jest zwykle o jedno rozcieńczenie (tj. 2 razy) niższa niż czułość makrometody.
Aby ustawić reakcję w mikrotitratorze, do każdego dołka dodaje się ciecz rozcieńczającą w objętości 50 µl za pomocą pipety z zakraplaczem. Następnie za pomocą titratorów z głowicą o pojemności 50 μl pobiera się surowicę testową poprzez zanurzenie w niej głowicy. Upewnij się, że ciecz wypełniła głowicę titratora. Titrator z surowicą przenosi się do pierwszego dołka i przytrzymuje pozycja pionowa, zrób kilka ruchy obrotowe podróż w obie strony. Następnie titrator przenosi się do następnego dołka i powtarza się manipulację. Miareczkowanie można przeprowadzić jednocześnie w kilku rzędach. Po miareczkowaniu całej serii titrator przemywa się wodą destylowaną (zmieniając 2 porcje) ruchami obrotowymi, wodę usuwa się z głowicy za pomocą wacika i spala płomieniem palnika.
Po miareczkowaniu dodać do dołków 25 µl płynu diagnostycznego do oznaczania erytrocytów. Stężenie diagnostyczne dla RPHA w mikroobjętościach powinno wynosić 0,5% (tj. 2,5% zawiesina czerwonych krwinek jest dodatkowo rozcieńczana 5 razy). Po dodaniu czerwonych krwinek płytki należy lekko wstrząsnąć, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Wyniki można zarejestrować w ciągu 1-1,5 godziny, co jest znaczącą zaletą RPGA w mikromianowaniu. Ponadto technika ta wymaga małych ilości wszystkich składników reakcji i surowic testowych.
Reakcję uwzględnia się według następującego schematu:
1) „+” – hemaglutynacja całkowita, podczas której krwinki czerwone opadają na dno studzienki równą warstwą w postaci „parasolki”, zajmującej co najmniej 2/3 dna;
2) „+-” - częściowa hemaglutynacja, podczas której czerwone krwinki opadają na dno w postaci luźnego pierścienia o niewielkich rozmiarach;
3) „-” – brak hemaglutynacji, gdy czerwone krwinki opadają na dno w postaci małego guzika lub pierścienia o gładkiej krawędzi.
Specyficzność wynik pozytywny otrzymany w RPHA można badać za pomocą reakcji trójskładnikowej – reakcji hamowania biernej hemaglutynacji (RPHA).
Technika konfiguracji protokołu RTPGA. Reakcję tę wykorzystuje się do potwierdzenia specyfiki dodatniego wyniku RPGA, gdy jest on wątpliwy lub ma szczególne znaczenie epidemiologiczne. Mechanizm reakcji polega na specyficznym hamowaniu hemaglutynacji po dodaniu do surowicy testowej zawiesiny zabitych bakterii tularemii. W reakcji biorą udział trzy składniki: surowica testowa, specyficzny antygen tularemii i antygenowy erytrocyt. Diagnostyczny RTPHA umieszcza się zwykle w rzędzie 7-8 dołków. Wskazane jest zainstalowanie powtarzającego się RPGA równolegle z RTPGA. Do dwóch rzędów dołków wlewa się po 0,25 ml cieczy rozcieńczającej, następnie do pierwszych dołków obu rzędów dodaje się surowicę testową w objętości 0,25 ml i wykonuje się miareczkowanie, w wyniku czego otrzymuje się dwa identyczne rzędy rozcieńczeń surowicy. Do wszystkich dołków drugiego rzędu dodać 0,25 ml cieczy rozcieńczającej, a do dołków pierwszego rzędu 0,25 ml zawiesiny bakterii tularemii. Stosuje się Tularemia Diagnosticum (zawierający 25 miliardów bakterii tularemii w 1 ml), uprzednio rozcieńczony 50 razy. Zawiesina ta zawiera 500 milionów bakterii w 1 ml lub 125 milionów w objętości 0,25 ml. Po dodaniu antygenu płytkę pozostawia się na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, po czym do wszystkich dołków obu rzędów dodaje się po jednej kropli (0,05 ml) erytrocytu diagnostycznego, płytkę wytrząsa się i pozostawia na płaskiej powierzchni stołu. Rozliczenie odbywa się po 2-3 godzinach.
Rachunkowość i ocena RTPGA. Jeżeli surowica testowa zawiera specyficzne przeciwciała tularemii, zostaną one zneutralizowane przez dodany antygen i w pierwszym rzędzie dołków nie nastąpi hemaglutynacja lub, jeżeli wysokie miano surowicy, hemaglutynacja będzie obserwowana w mniejszej (2-4) liczbie dołków niż w rzędzie z RPGA. W tym przypadku specyfika wyników została potwierdzona. Jeżeli w obu rzędach zostanie stwierdzona hemaglutynacja, tj. Jeśli wyniki RTPGA i RPGA są zbieżne, oznacza to brak przeciwciał tularemii w badanej surowicy. W tym przypadku pierwotny wynik RPGA uważa się za niespecyficzny.
Technika oceny stopnia zaawansowania RTHG w mikroobjętościach. RTPGA, podobnie jak RPGA, można przeprowadzić w mikroobjętościach przy użyciu mikromianownika typu Takachi. W tym celu należy dodać 0,25 µl płynu rozcieńczającego do dołków mikropłytek w dwóch rzędach po 7-8 dołków każdy. Następnie za pomocą titratora dodaje się 0,25 µl surowicy testowej i miareczkuje w obu rzędach. Następnie do każdej studzienki w pierwszym rzędzie dodaje się 25 µl antygenu tularemii (którego stężenie wynosi 500 milionów bakterii tularemii w 1 ml), a do drugiego rzędu dodaje się 25 µl cieczy rozcieńczającej. Płytki pozostawia się na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, po czym do wszystkich dołków w obu rzędach dodaje się 25 µl antygenowego Zritrocytic Diagnosticum (stężenie 0,5%). Rozliczanie i ocena wyników przeprowadza się analogicznie do reakcji w makroobjętościach.
Spis treści tematu "Immunomodulatory. Immunodiagnostyka chorób zakaźnych.":Pasywne reakcje aglutynacji. Pośrednie reakcje aglutynacji. Pośrednia lub bierna reakcja hemaglutynacji (IRHA, RPHA). Odwrotne RNGA. Pasywna reakcja hamowania hemaglutynacji (PHA).
Te reakcje są nazywane pośredni (bierny), ponieważ wykorzystują Ag (lub AT) sztucznie zaadsorbowany na powierzchni różnych cząstek korpuskularnych.
Pośrednia lub bierna reakcja hemaglutynacji (RNGA, RPG) jest jedną z najbardziej wrażliwych reakcji serologicznych. Opiera się na zdolności AT do interakcji z Ag osadzonym na różnych czerwonych krwinkach, które następnie ulegają aglutynacji. Dla większej stabilności diagnostyki, czerwone krwinki są formalizowane.
Odwrotne RNGA stosowany do wykrywania Ag w surowicy krwi; W tym celu na erytrocytach mocuje się nie Ag, ale AT. Reakcje tego typu są szeroko stosowane w diagnostyce chorób zakaźnych, ustalaniu ciąży, wykrywaniu nadwrażliwości na leki itp.
Bierna reakcja hamowania hemaglutynacji (RTPGA) - dalszy rozwój RNGA; w pewnym sensie kontroluje jego specyfikę. w odróżnieniu RNGA, zawiera trzy komponenty; Ag, AT i Ag (AT) adsorbowane na erytrocytach. Początkowo Ag reaguje z AT (standardową surowicą odpornościową), następnie do mieszaniny dodaje się erytrocyty uczulone tym samym Ag (lub AT). Jeśli podczas interakcji Ag z AT w układzie nie pozostanie wolny AT (lub Ag), wówczas nie obserwuje się aglutynacji diagnostycznej erytrocytów.
11621 0
Reakcje serologiczne wyznacza się zgodnie ze zjawiskami towarzyszącymi tworzeniu się kompleksu antygen-przeciwciało podczas oddziaływania składników o różnych właściwościach. Zachodzą reakcje aglutynacji, wytrącania i lizy.
Reakcja aglutynacji (RA)
Reakcja aglutynacji (RA) polega na wykorzystaniu antygenu korpuskularnego (zawiesiny bakterii, uczulonych erytrocytów, cząstek lateksu itp.) oddziałującego ze specyficznymi przeciwciałami, w wyniku czego wytrąca się powstały kompleks antygen-przeciwciało. Reakcja ta jest szeroko stosowana w praktyce laboratoryjnej w diagnostyce serologicznej. infekcje bakteryjne oraz do identyfikacji izolowanych mikroorganizmów.
RZS służy do diagnostyki wielu chorób zakaźnych: brucelozy (reakcja Wrighta, Heddlesona), tularemii, leptospirozy (RAL – reakcja aglutynacji i lizy Leptospira), listeriozy, tyfusu (RAR – reakcja aglutynacji riketsje), szigellozy, jersiniozy, rzekomej gruźlicy itp.
Reakcja aglutynacji pośredniej lub pasywnej (RIGA lub RPGA).
Do etapu tej reakcji wykorzystuje się czerwone krwinki zwierząt (owiec, małp, świnek morskich, niektórych ptaków) uwrażliwione przeciwciałami lub antygenem, co osiąga się poprzez inkubację zawiesiny czerwonych krwinek z roztworem antygenu lub surowicy odpornościowej.
Diagnostyki uzyskane na podstawie erytrocytów uwrażliwionych antygenami nazywane są diagnostyka antygenów erytrocytów. Przeznaczone są do oznaczania przeciwciał w seryjnych rozcieńczeniach surowic krwi np. erytrocytów shigella Diagnosticums, erythrocyte Salmonella O-diagnosticums.
W związku z tym nazywa się diagnostykę opartą na erytrocytach uwrażliwionych specyficznymi immunoglobulinami przeciwciała(immunoglobulina) diagnostyka i służą do wykrywania antygenów w różnych materiałach, na przykład immunoglobulinie erytrocytowej diphtheria Diagnosticum dla RIGA, stosowanej do wykrywania egzotoksyny błoniczej maczugowców w płynnej pożywce, gdy zaszczepia się do niej materiał z nosa i części ustnej gardła.
Reakcję hemaglutynacji wykorzystuje się do diagnostyki zarówno infekcji bakteryjnych (dur brzuszny, dur brzuszny, czerwonka, bruceloza, dżuma, cholera itp.), jak i wirusowych (grypa, infekcje adenowirusowe, odra itp.). Pod względem czułości i swoistości RIGA przewyższa RA.
Reakcja hamowania hemaglutynacji (HAI)
Reakcja hamowania hemaglutynacji (HAI) służy do oznaczania przeciwciał przeciwwirusowych w surowicy krwi, a także do określenia rodzaju wyizolowanych kultur wirusowych. Do ich diagnozowania można zastosować RTGA infekcje wirusowe, których patogeny mają właściwości hemaglutynujące.
Zasada metody polega na tym, że surowica zawierająca przeciwciała przeciwko określonemu typowi wirusa hamuje jego aktywność hemaglutynującą, a czerwone krwinki pozostają niezaglutynowane.
Reakcja pasywnego hamowania (opóźnienia) hemaglutynacji (RPHA).
W RTPGA zaangażowane są trzy składniki: surowica odpornościowa, antygen (materiał testowy) i uczulone erytrocyty.
Jeśli materiał testowy zawiera antygen, który specyficznie reaguje z przeciwciałami immunologicznymi standardowe serum, następnie je wiąże, a po dodaniu erytrocytów uczulonych antygenem homologicznym do surowicy, hemaglutynacja nie występuje.
RTPHA służy do wykrywania antygenów drobnoustrojów, do ich ilościowego oznaczania, a także do kontroli specyficzności RTPGA.
Reakcja aglutynacji lateksu (RLA)
Cząsteczki lateksu służą jako nośnik przeciwciał (immunoglobulin). RLA to ekspresowa metoda diagnozowania chorób zakaźnych, uwzględniająca wymagany czas (do 10 minut) i możliwość wykrycia antygenu w małej objętości materiału testowego.
RLA służy do oznaczania antygenów Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae typu b, Neisseria meningitidis w płynie mózgowo-rdzeniowym, do wykrywania paciorkowców grupy A w wymazach z gardła, do diagnozowania salmonellozy, jersiniozy i innych chorób. Czułość metody wynosi 1-10 ng/ml, czyli 10³ -10⁶ komórek bakteryjnych w 1 µl.
Reakcja koaglutynacji (CoA)
Reakcja koaglutynacji (CoA) opiera się na zdolności białka A gronkowców do przyłączania specyficznych immunoglobulin. RCA – metoda ekspresowej diagnostyki – służy do identyfikacji rozpuszczalnych antygenów termostabilnych w wydzielinach człowieka oraz w składzie krążących kompleksów immunologicznych (CIC). Wykrycie specyficznych antygenów w składzie CEC wymaga ich wstępnego wytrącenia z surowicy krwi.
Reakcja wytrącania
W reakcji strącania (RP), w wyniku oddziaływania przeciwciał z silnie zdyspergowanymi rozpuszczalnymi antygenami (białkami, polisacharydami), powstają kompleksy z udziałem dopełniacza – wytrącają się. Jest to czuły test stosowany do wykrywania i charakteryzowania różnych antygenów i przeciwciał. Najprostszym przykładem wysokiej jakości RP jest utworzenie w probówce nieprzezroczystego pasma wytrącania na granicy warstwy antygenu w surowicy odpornościowej – reakcja wytrącania pierścienia. Szeroko stosowane są różne typy RP w półpłynnym agarze lub żelach agarozowych (metoda podwójnej immunodyfuzji, metoda immunodyfuzji radialnej, immunoelektroforeza).
Reakcja wiązania dopełniacza (CFR)
Reakcja wiązania dopełniacza (CFR) opiera się na zjawisku hemolizy z udziałem dopełniacza, tj. zdolne do wykrywania jedynie przeciwciał wiążących dopełniacz.
RSC jest szeroko stosowany w diagnostyce wielu infekcji bakteryjnych i wirusowych, infekcji riketsjami, chlamydiami, mononukleoza zakaźna, infekcje pierwotniakowe, robaki. RSK jest złożony reakcja serologiczna, w którym biorą udział dwa układy: układ testowy (surowica krwi), reprezentowany przez układ antygen-przeciwciało i dopełniacz, oraz układ hemolityczny (czerwone krwinki owiec + surowica hemolityczna). Surowica hemolityczna to inaktywowana termicznie surowica krwi króliczej immunizowana erytrocytami owczymi. Zawiera przeciwciała przeciwko czerwonym krwinkom owiec.
Dodatni wynik RSC – brak hemolizy – obserwuje się, jeśli w badanej surowicy znajdują się przeciwciała homologiczne do antygenu. W tym przypadku powstały kompleks antygen-przeciwciało wiąże dopełniacz, a przy braku wolnego dopełniacza dodaniu układu hemolitycznego nie towarzyszy hemoliza. Jeśli w surowicy nie ma przeciwciał odpowiadających antygenowi, nie dochodzi do tworzenia kompleksu antygen-przeciwciało, dopełniacz pozostaje wolny, a surowica powoduje hemolizę czerwonych krwinek, czyli tzw. obecność hemolizy jest negatywnym wynikiem reakcji.
Yushchuk N.D., Vengerov Yu.Ya.
Reakcja aglutynacji - RA(od łac. aglutynacja- adhezja) to prosta reakcja, podczas której przeciwciała wiążą antygeny korpuskularne (bakterie, erytrocyty lub inne komórki, nierozpuszczalne cząstki z zaadsorbowanymi na nich antygenami, a także agregaty wielkocząsteczkowe). Występuje w obecności elektrolitów, np. po dodaniu izotonicznego roztworu chlorku sodu.
Stosować różne opcje reakcje aglutynacji: rozległe, orientacyjne, pośrednie itp. Reakcja aglutynacji objawia się powstawaniem płatków lub osadu
RA służy do:
oznaczanie przeciwciał w surowicy krwi pacjentów np. chorych na brucelozę (reakcje Wrighta, Heddelsona), dur brzuszny i dur paradurowy (reakcja Vidala) i inne choroba zakaźna;
oznaczenie patogenu wyizolowanego od pacjenta;
oznaczanie grup krwi za pomocą przeciwciał monoklonalnych przeciwko alloantygenom erytrocytów.
Aby oznaczyć przeciwciała u pacjenta umieścićrozszerzony reakcja aglutynacji: dodać do rozcieńczeń surowicy krwi pacjenta diagnostyka(zawiesina zabitych drobnoustrojów) i po kilkugodzinnej inkubacji w temperaturze 37°C notuje się najwyższe rozcieńczenie surowicy (miano surowicy), przy którym nastąpiła aglutynacja, czyli wytrącił się osad.
Charakter i szybkość aglutynacji zależą od rodzaju antygenu i przeciwciał. Przykładem jest osobliwość interakcji diagnostycznych (antygenów O i R) ze specyficznymi przeciwciałami. Reakcja aglutynacji z O-diagnostyka(bakterie zabite przez ciepło, zachowujące stabilność cieplną antygen O) zachodzi w postaci drobnoziarnistej aglutynacji. Reakcja aglutynacji z H-diagnosticum (bakterie zabite przez formaldehyd, zatrzymujące termolabilny antygen wici H) jest szorstka i przebiega szybciej.
Jeżeli konieczne jest określenie patogenu wyizolowanego od pacjenta, należy umieścić orientacyjna reakcja aglutynacji, za pomocą przeciwciał diagnostycznych (surowicy aglutynującej), czyli przeprowadza się serotypowanie patogenu. Reakcję orientacyjną przeprowadza się na szkiełku podstawowym. Czystą hodowlę patogenu wyizolowanego od pacjenta dodaje się do kropli diagnostycznej surowicy aglutynującej w rozcieńczeniu 1:10 lub 1:20. W pobliżu umieszcza się kontrolę: zamiast surowicy dodaje się kroplę roztworu chlorku sodu. Kiedy w kropli zawierającej surowicę i drobnoustroje pojawi się kłaczkowaty osad, a rozległa reakcja aglutynacji w probówkach ze wzrastającymi rozcieńczeniami surowicy aglutynującej, do których dodaje się 2-3 krople zawiesiny patogenu. O aglutynacji decyduje ilość osadu i stopień przejrzystości cieczy. Reakcję uznaje się za pozytywną, jeżeli w rozcieńczeniu zbliżonym do miana surowicy diagnostycznej obserwuje się aglutynację. Jednocześnie uwzględnia się kontrole: surowica rozcieńczona izotonicznym roztworem chlorku sodu powinna być przezroczysta, zawiesina drobnoustrojów w tym samym roztworze powinna być jednolicie mętna, bez osadu.
Różne spokrewnione bakterie mogą aglutynować z tą samą diagnostyczną surowicą aglutynującą, co utrudnia ich identyfikację. Dlatego używają zaadsorbowane surowice aglutynujące, z których usunięto reagujące krzyżowo przeciwciała poprzez adsorpcję na pokrewnych bakteriach. Surowice takie zachowują przeciwciała specyficzne tylko dla danej bakterii. Produkcję specjalnych monoreceptorowych surowic aglutynujących do diagnostyki zaproponował A. Castellani (1902).
Pośrednia (bierna) reakcja hemaglutynacji(RNGA, RPGA) polega na wykorzystaniu erytrocytów z zaadsorbowanymi na ich powierzchni antygenami lub przeciwciałami, których oddziaływanie z odpowiednimi przeciwciałami lub antygenami surowicy krwi powoduje, że erytrocyty sklejają się i opadają na dno testu rurka lub komórka V w postaci zapiekanego osadu (ryc. 13.2). Na reakcja negatywna czerwone krwinki osadzają się ■ w formie „przycisku”. Zazwyczaj przeciwciała wykrywa się w RNGA za pomocą antygenowego testu na erytrocyty, czyli erytrocytów z zaadsorbowanym NA je antygenami. Czasami wykorzystuje się diagnostykę anty-A erytrocytów, na których adsorbowane są przeciwciała. Na przykład toksynę botulinową można wykryć dodając do niej przeciwciało botulinowe przeciwko erytrocytom (reakcja ta nazywa się odwrotna pośrednia reakcja hemaglutynacji- RONG). RNGA służy do diagnozowania chorób zakaźnych i oznaczania hormonu gonadotropowego V moczu przy ustalaniu ciąży, w celu wykrycia nadwrażliwości na leki, hormony oraz w niektórych innych przypadkach.
REAKCJA COMBESA
(test Coombsa) – metoda oznaczania przeciwciał Rh na powierzchni czerwonych krwinek, które powodują wytrącanie się globulin w surowicy krwi. Test ten służy do diagnozy niedokrwistość hemolityczna u niemowląt z niezgodnością Rh, u których dochodzi do zniszczenia czerwonych krwinek.
Reakcja koaglutynacji. Komórki patogenu określa się przy użyciu gronkowców poddanych wstępnej obróbce immunologiczną surowicą diagnostyczną. Gronkowce zawierające białko A, posiadające powinowactwo do fragmentu Fc immunoglobulin, nieswoiście adsorbują przeciwciała przeciwdrobnoustrojowe, które następnie oddziałują z centrami aktywnymi z odpowiednimi drobnoustrojami wyizolowanymi od pacjentów. W wyniku koaglutynacji powstają płatki składające się z gronkowców, przeciwciał surowicy diagnostycznej i wykrytego drobnoustroju.
Reakcja hamowania hemaglutynacji(RTGA) polega na blokowaniu, supresji antygenów wirusowych przez przeciwciała surowicy odpornościowej, w wyniku czego wirusy tracą zdolność do aglutynacji czerwonych krwinek (ryc. 13.3). RTGA służy do diagnozowania wielu chorób wirusowych, których czynniki sprawcze (wirusy grypy, odry, różyczki, kleszczowe zapalenie mózgu itp.) mogą aglutynować czerwone krwinki różnych zwierząt.
- Do Indii przybyła grupa lekarzy z WHO, aby zidentyfikować pacjentów chorych na polio i pomóc w przeprowadzeniu powszechnych szczepień przeciwko polio. W jednej z badanych wsi do lekarzy z dużej rodziny przywieziono 6-letniego chłopca, który 5 dni temu zachorował. Temperatura nagle wzrosła, pojawił się silny ból głowy, powtarzające się wymioty, ból rąk i nóg. Po kontroli: ciepło, silne osłabienie, objawy oponowe, na prawa noga zredukowany napięcie mięśniowe, odruchy ścięgniste są znacznie osłabione, stopa zwisa. Podczas nakłucia kanału kręgowego wypłynął pod niego płyn mózgowo-rdzeniowy wysokie ciśnienie krwi, liczba limfocytów wzrasta, bakterie nie są izolowane. Dostarczony wstępna diagnoza„paraliżującą postacią polio”. W jaki sposób chłopiec mógł się zarazić? W jaki sposób prowadzona jest konkretna aktywna profilaktyka polio? Czy istnieje niebezpieczeństwo zarażenia innych dzieci w tej rodzinie, co należy zrobić?
Odpowiedź: Chłopiec mógł zarazić się drogą fekalno-oralną poprzez żywność, wodę, a także drogą kropelkową. Główną metodą zapobiegania polio jest szczepienie szczepionką zawierającą żywe kultury 3 serotypów szczepów Sabin.W Rosji jest ona stosowana szczepienie przeciwko polio do podawania doustnego, wyprodukowany przez Instytut Poliomyelitis i Wirusowego Zapalenia Mózgu im. POSEŁ. Chumakowa. Szczepionka jest trójwalentnym preparatem atenuowanych szczepów Sabin wirusa polio typu 1, 2, 3, uzyskanych z pierwotnej hodowli komórek nerkowych afrykańskiej małpy zielonej. . Dzieci w wieku od 3 miesięcy do 6 lat podlegają rutynowym szczepieniom przeciwko polio. Szczepienia doustną szczepionką przeciwko polio przeprowadza się za pomocą 2 lub 4 kropli szczepionki doustnie, trzykrotnie w 3, 4, 5 i 6 miesiącu życia, z trzema szczepieniami przypominającymi w wieku 18, 20 miesięcy i 14 lat. Chory chłopiec musi zostać hospitalizowany, a wszystkie pozostałe dzieci w tej rodzinie muszą zostać zaszczepione żywą szczepionką przeciwko polio.
- Skład i zastosowanie trójwalentnej płynnej szczepionki przeciw grypie z podjednostkami polimerowymi (grypa)
To jest szczepionka molekularna. Skład: Ag powierzchniowy wirusa grypy trzech podtypów (A/H1N1, A/H3N2, B). Zastosowanie: w profilaktyce grypy
Karta egzaminacyjna nr 23
