Reakcije pasivne aglutinacije. Indirektne reakcije aglutinacije. Indirektna ili pasivna reakcija hemaglutinacije (IRHA, RPHA). Obrnuti RNGA. Reakcija inhibicije pasivne hemaglutinacije (PHA).
Ove reakcije su pozvani indirektno (pasivno), budući da koriste Ag (ili AT) umjetno sorbiran na površini različitih korpuskularnih čestica.
Indirektna ili pasivna reakcija hemaglutinacije (RNGA, RPGA) je jedna od najosetljivijih seroloških reakcija. Temelji se na sposobnosti AT-a da stupi u interakciju s Ag fiksiranim na različitim crvenim krvnim zrncima, koja zatim aglutiniraju. Za veću stabilnost dijagnostikuma, crvena krvna zrnca se formaliniziraju.
Obrnuti RNGA koristi se za otkrivanje Ag u krvnom serumu; U tu svrhu, ne Ag, već AT se fiksiraju na eritrocite. Reakcije ovog tipa se široko koriste za dijagnosticiranje zaraznih bolesti, utvrđivanje trudnoće, otkrivanje preosjetljivost na lekove itd.
Reakcija kočenja pasivna hemaglutinacija (RTPGA) - dalji razvoj RNGA; u određenom smislu kontroliše njegovu specifičnost. Za razliku od RNGA, uključuje tri komponente; Ag, AT i Ag (AT) adsorbovani na eritrocitima. U početku, Ag reaguje sa AT (standardni antiserum), a zatim se u smešu dodaju eritrociti senzibilisani sa istim Ag (ili AT). Ako tokom interakcije Ag sa AT ne ostane slobodni AT (ili Ag) u sistemu, onda se ne primećuje aglutinacija dijagnostikuma eritrocita.
Koristi crvena krvna zrnca ili neutralna sintetički materijali(na primjer, čestice lateksa), na čijoj površini se sorbiraju antigeni (bakterijski, virusni, tkivni) ili antitijela. Njihova aglutinacija nastaje kada se dodaju odgovarajući serumi ili antigeni. Crvena krvna zrnca senzibilizirana antigenima nazivaju se antigenski dijagnostikum eritrocita i koriste se za otkrivanje i titriranje antitijela. Eritrociti senzibilizirani antitijelima. nazivaju se imunoglobulinski eritrocitni dijagnostici i koriste se za otkrivanje antigena.
Reakcija pasivne hemaglutinacije koristi se za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih bakterijama ( tifusne groznice i paratifus, dizenterija, bruceloza, kuga, kolera, itd.), protozoe (malarija) i virusi (gripa, adenovirusne infekcije, virusni hepatitis B, ospice, krpeljni encefalitis, Krimska hemoragična groznica i dr.), kao i za određivanje određenih hormona, identificirati povećanu osjetljivost pacijenta na lijekovi i hormone kao što su penicilin i insulin.
Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA). Test pasivne hemaglutinacije je osjetljiva metoda serološka dijagnostika a koristi se i za ranu i za retrospektivnu dijagnozu, kao i za određivanje imunološkog stanja vakcinisanih osoba. Kod pacijenata sa tularemijom, antitela se obično otkrivaju na kraju 1. ili 2. nedelje bolesti; nakon 1-1,5 meseci titar RPHA dostiže maksimalne performanse(1:100000-1:20000, rijetko više), nakon čega se smanjuju i dugo ostaju na nivou 1:100-1:200.
Kod vakcinisanih osoba antitela se takođe konstantno otkrivaju, međutim, u nižim titrima, ne prelazeći 1:2000-1:5000 1-1,5 meseci nakon vakcinacije, i ostaju nekoliko godina na niskom nivou od 1:20-1:80.
Antigen za postavljanje RPHA je tularemia erythrocyte diagnosticum (antigen). Lijek je formalinizirana ovčja crvena krvna zrnca, senzibilizirana antigenom tularemije, dostupna u tekućem i suhom obliku. Tečni preparat - 10% suspenzija crvenih krvnih zrnaca u rastvoru formaldehida 10% koncentracije. Suhi liofilizirani preparat je vakuumski osušena 10% suspenzija crvenih krvnih zrnaca bez konzervansa. Prije upotrebe razrijedi se prema uputama na etiketi. Za postavljanje reakcije u polistirenskim pločama oba lijeka se koriste u koncentraciji od 2,5%, a pri postavljanju reakcije u mikrovolumenima - u koncentraciji od 0,5%.
Tehnika postavljanja RPGA. Test serumi se razblaže fiziološkim rastvorom 1:5 (1:10) i zagrevaju na 56 stepeni C 30 minuta. Nakon toga, da bi se uklonila heterogena antitijela na ovčje eritrocite, serumi se tretiraju 50% suspenzijom formaliniziranih eritrocita ovaca. Da biste to učinili, dodajte crvena krvna zrnca brzinom od 2 kapi (0,05 ml) na 1 ml seruma i dobro promiješajte protresanjem. Serum se ostavlja dok se eritrociti potpuno ne slegnu ili se centrifugira nakon jednog sata na sobnoj temperaturi, nakon čega je spreman za ispitivanje.
Tečnost za razblaživanje se sipa u zapremini od 0,5 ml u niz jažica na polistirenskoj ploči. Prilikom preliminarnog proučavanja seruma, preporučljivo je testirati ih postavljanjem reakcije u kratkom redu ploče (6 jažica). Ako se antitijela otkriju u kratkoj seriji, serumi se ponovo testiraju u dugoj seriji razrjeđenja (12 jažica). Nakon prolivanja tečnosti za razblaživanje, dodajte 0,5 ml test seruma u razblaženju 1:5 u prvu jažicu svakog reda (kratku ili dugačku). Zatim se iste količine seruma titriraju dvostrukim razblaženjima. Tako se u kratkim serijama dobijaju razblaženja seruma od 1:10 do 1:320, au dugim serijama od 1:10 do 1:20480. Nakon titracije seruma, u svaku jažicu se dodaje jedna kap (0,05 ml) radne 2,5% suspenzije senzibiliziranih eritrocita. Sadržaj ploča se dobro promućka dok se ne dobije homogena suspenzija. Ploče se ostavljaju na sobnoj temperaturi na stacionarnoj površini stola. Preliminarno snimanje reakcije se vrši nakon 2-3 sata, konačno određivanje titra se vrši nakon potpune sedimentacije crvenih krvnih zrnaca u jamicama. Za reakciju su obezbeđene sledeće kontrole: 1) test serum razblažen 1:10 u zapremini od 0,5 ml + 1 kap 2,5% suspenzije nesenzibilizovanih eritrocita; 2) tečnost za razblaživanje u zapremini od 0,5 ml + 1 kap 2,5% suspenzije nesenzibilizovanih eritrocita; 3) tečnost za razblaživanje u zapremini od 0,5 ml + 1 kap 2,5% suspenzije senzibilizovanih eritrocita. Sve kontrole treba da daju jasno negativnu reakciju.
Računovodstvo i procjena RPGA. Reakcija se ocjenjuje po sledeći dijagram:
1) oštro pozitivna reakcija(++++) - crvena krvna zrnca padaju na dno rupe u ravnom sloju u obliku "kišobrana", koji često ima nazubljeno otapanje rubova;
2) pozitivna reakcija (+++) - crvena krvna zrnca pokrivaju najmanje 2/3 dna bunara;
3) slabo pozitivna reakcija (++) - aglutinat je mali i nalazi se u samom centru bunara;
4) upitna reakcija (+) - oko sedimenta eritrocita u samom centru bunara nalaze se pojedinačna zrna aglutinata;
5) negativan (-) - na dnu rupe se crvena krvna zrnca smjeste u obliku "dugma" ili malog prstena s glatkim, oštro definiranim rubovima.
Titar seruma se uzima u obzir na osnovu posljednjeg razrjeđenja seruma, koje je dalo vrlo jasnu reakciju (najmanje tri plusa). Razrjeđenje od 1:100 ili više smatra se dijagnostičkim titrom, međutim, kao iu slučaju RA, potrebno je pratiti njegovo povećanje.
RPGA za tularemiju je prilično specifičan i otkriva neke unakrsne reakcije samo sa serumima protiv bruceloze. Diferencijalna dijagnoza moguće po visini titara u RPGA, koji su značajno veći kod homolognog antigena.
Tehnika postavljanja RPHA u mikrovolumenima. RPGA se može izvesti u mikrovolumenima pomoću mikrotitratora tipa Takachi (ili mikroploča sa okruglim dnom sa mikropipetama), koji omogućava titraciju materijala u zapreminama od 25 μl i 50 μl. Tehnika reakcije i redoslijed svih operacija isti su kao kod proučavanja u polistirenskim pločama. Treba, međutim, imati na umu da je osjetljivost mikrometode obično jedno razrjeđenje (tj. 2 puta) manja od osjetljivosti makrometode.
Za postavljanje reakcije u mikrotitratoru, tečnost za razrjeđivanje u volumenu od 50 μl se dodaje u svaku jažicu pomoću pipete s kapaljkom. Zatim se pomoću titratora sa glavom od 50 μl skuplja test serum uranjanjem glave u njega. Proverite da li je tečnost ispunila glavu titratora. Titrator sa serumom se prenosi u prvu jažicu i drži je unutra vertikalni položaj, uradite nekoliko rotacionim pokretima povratno putovanje. Zatim se titrator prenosi u sljedeću jažicu i manipulacija se ponavlja. Titracija se može vršiti istovremeno u nekoliko redova. Nakon titriranja cijele serije, titrator se ispere destiliranom vodom (promjenom 2 porcije) rotirajućim pokretima, voda se brišem uklanja iz glave i spaljuje na plamenu plamenika.
Nakon titracije, dodajte 25 μl dijagnostičke tekućine za eritrocite u jažice. Koncentracija dijagnostikuma za RPHA u mikrovolumenima treba da bude 0,5% (tj. 2,5% suspenzija crvenih krvnih zrnaca dodatno se razblaži 5 puta). Nakon dodavanja crvenih krvnih zrnaca, ploče treba lagano protresti dok se ne dobije homogena suspenzija. Rezultati se mogu snimiti u roku od 1-1,5 sati, što je značajna prednost RPGA u mikrotitru. Osim toga, ova tehnika zahtijeva male količine svih reakcionih sastojaka i test seruma.
Reakcija se uzima u obzir prema sljedećoj shemi:
1) „+“ – potpuna hemaglutinacija, u kojoj crvena krvna zrnca padaju na dno bunara u ravnom sloju u obliku „kišobrana“, koji zauzima najmanje 2/3 dna;
2) „+-“ - djelomična hemaglutinacija, u kojoj crvena krvna zrnca padaju na dno u obliku labavog prstena male veličine;
3) „-“ – odsustvo hemaglutinacije, kada crvena krvna zrnca padaju na dno u obliku malog dugmeta ili prstena sa glatkim rubom.
Specifičnost pozitivnog rezultata dobijenog u RPHA može se testirati pomoću trokomponentne reakcije - reakcije inhibicije pasivne hemaglutinacije (PHA).
Tehnika postavljanja RTPGA. Ova reakcija se koristi za potvrdu specifičnosti pozitivnog RPGA rezultata kada je u nedoumici ili je od posebnog epidemiološkog interesa. Mehanizam reakcije je specifična inhibicija hemaglutinacije kada se u test serum doda suspenzija ubijenih bakterija tularemije. U reakciji interaguju tri komponente: test serum, specifični antigen tularemije i antigenski dijagnostikum eritrocita RTPHA se obično postavlja u red od 7-8 jažica. Preporučljivo je instalirati ponovljeni RPGA paralelno sa RTPGA. U dva reda jažica se sipa po 0,25 ml tečnosti za razblaživanje, zatim se u prve jažice oba reda doda test serum u zapremini od 0,25 ml i izvrši se titracija. Dobiju se dva identična reda razblaženja seruma. Dodajte 0,25 ml tečnosti za razblaživanje u sve jažice drugog reda, a 0,25 ml suspenzije bakterije tularemije u jažice prvog reda. Koristi se Tularemia diagnosticum (sadrži 25 milijardi bakterija tularemije u 1 ml), prethodno razrijeđen 50 puta. Ova suspenzija sadrži 500 miliona bakterija u 1 ml ili 125 miliona u zapremini od 0,25 ml. Nakon dodavanja antigena, ploča se ostavi 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega se u sve jažice oba reda doda po jedna kap (0,05 ml) dijagnostikuma eritrocita, ploča se protrese i ostavi na ravnoj površini stola. Obračun se vrši nakon 2-3 sata.
Računovodstvo i procjena RTPGA. Ako test serum sadrži specifična antitijela protiv tularemije, ona se neutraliziraju dodatkom antigena i hemaglutinacija se neće dogoditi u prvom redu jažica, ili će se, s visokim titrom seruma, hemaglutinacija primijetiti u manjem (2-4) broju bunara nego u redu sa RPHA. U ovom slučaju je potvrđena specifičnost rezultata. Ako je hemaglutinacija zabilježena u oba reda, tj. Ako se rezultati RTPGA i RPGA poklapaju, to ukazuje na odsustvo antitijela tularemije u test serumu. U ovom slučaju, primarni rezultat RPGA se smatra nespecifičnim.
Tehnika postavljanja RTHG u mikrovolume. RTPGA, kao i RPGA, može se izvesti u mikrovolumenima pomoću mikrotitra tipa Takachi. Da biste to učinili, dodajte 0,25 μl tečnosti za razrjeđivanje u jažice mikroploča u dva reda od po 7-8 jažica. Zatim se pomoću titratora doda 0,25 μl test seruma i titrira u oba reda. Nakon toga se u svaku jažicu u prvom redu dodaje 25 μl antigena tularemije (čija je koncentracija 500 miliona bakterija tularemije u 1 ml), a u drugi red se dodaje 25 μl tečnosti za razblaživanje. Ploče se ostavljaju 1 sat na sobnoj temperaturi, nakon čega se u sve jažice oba reda doda 25 μl antigenskog ritrocitnog dijagnostikuma (koncentracija 0,5%). Obračun i evaluacija rezultata se provode slično reakcijama u makrovolumenima.
reakcija pasivne hemaglutinacije) metoda za detekciju i identifikaciju antigena ili antitela, zasnovana na fenomenu aglutinacije crvenih krvnih zrnaca koji se javlja u njihovom prisustvu, na čijoj površini su prethodno adsorbovani odgovarajući specifični ili antigeni.
1. Mala medicinska enciklopedija. - M.: Medicinska enciklopedija. 1991-96 2. Prvo zdravstvenu zaštitu. - M.: Velika ruska enciklopedija. 1994 3. Enciklopedijski rječnik medicinski termini. - M.: Sovjetska enciklopedija. - 1982-1984.
Pogledajte šta je "indirektna reakcija hemaglutinacije" u drugim rječnicima:
reakcija indirektne hemaglutinacije- RNGA Laboratorijski test pomoću dijagnostike eritrocita. [Englesko-ruski pojmovnik osnovnih pojmova u vakcinologiji i imunizaciji. Svjetska zdravstvena organizacija, 2009] Teme vakcinologija, imunizacija Sinonimi RNGA EN...... Vodič za tehnički prevodilac
- (RNHA; sinonim za reakciju pasivne hemaglutinacije) metoda za detekciju i identifikaciju antigena ili antitela, zasnovana na fenomenu aglutinacije eritrocita koja se javlja u njihovom prisustvu, na čijoj površini su prethodno bili adsorbovani... .. . Veliki medicinski rječnik
- (RPHA) vidi Indirektna reakcija hemaglutinacije... Veliki medicinski rječnik
Ova stranica je pojmovnik. # A... Wikipedia
Osnovne skraćenice usvojene u Veterinarskom enciklopedijskom rječniku- a., aa, artena, arteriae aa ana (jednako) Akademija medicinskih nauka SSSR Akademija medicinskih nauka SSSR Akademija nauka SSSR Akademija nauka SSSR Bac. Bacillus Bact. Bakterija BSSR Bjeloruska SSR c., vek. vek, vekovi v., v. vena, venae VASKHNIL Svesavezni orden Lenjina i ... ...
Ovaj izraz ima druga značenja, vidi Kuga. Čuma mesojeda (Kareova bolest) akutna ili subakutna zarazna virusna bolest, manifestuje se groznicom, kataralnim upalom sluzokože, lezijama kože, centralnim ... ... Wikipedia
- (renes) upareni ekskretorni i endokrini organ koji reguliše hemijsku homeostazu organizma kroz funkciju stvaranja urina. ANATOMSKO FIZIOLOŠKA SKICA Bubrezi se nalaze u retroperitonealnom prostoru (Retroperitonealni prostor) na... ... Medicinska enciklopedija
I (trihineloza; sinonim: trihineloza, “puffy”) helmintoza iz grupe nematoda, koju karakteriše groznica, mijalgija, oticanje lica, kožni osip eozinofilija u krvi, au teškim slučajevima i lezije unutrašnje organe i centralno..... Medicinska enciklopedija
- (nematodoze) helmintiaze uzrokovane nematodama okruglih crva klasa Nematoda. Od ostalih helmintioza, N. imaju najveća vrijednost u ljudskoj patologiji, većina njih su geohelmintijaze (vidi Helmintijaze); razvoj njihovih jaja ili larvi ... ... Medicinska enciklopedija
infektivni epididimitis- Pirinač. 1. Povećanje lijevog testisa kod ovce sa infektivnim epididimitisom. Rice. 1. Povećanje lijevog testisa kod ovce sa infektivnim epididimitisom. infektivni epididimitis ovaca (Epididymitis infectiosa arietum), kronični infektivni ... ... Veterinarski enciklopedijski rječnik
Pogledajte Reakcija indirektne hemaglutinacije... Veliki medicinski rječnik
Reakcija je data:
1) za detekciju polisaharida, proteina, bakterijskih ekstrakata i drugih visoko dispergiranih supstanci, rikecija i virusa, čiji se kompleksi sa aglutininima ne mogu vidjeti u konvencionalnim RA,
2) za otkrivanje antitela u serumu pacijenata na ove visoko dispergovane supstance i male mikroorganizme.
Indirektna, ili pasivna, aglutinacija se podrazumijeva kao reakcija u kojoj antitijela stupaju u interakciju s antigenima prethodno adsorbiranim na inertnim česticama (lateks, celuloza, polistiren, barijev oksid itd. ili crvena krvna zrnca ovaca, I(0)-ljudska krvna grupa)
U reakciji pasivne hemaglutinacije (RPHA), crvena krvna zrnca. Crvena krvna zrnca napunjena antigenom se lijepe zajedno u prisustvu specifičnih antitijela na ovaj antigen i talože se. Antigen senzibilizirani eritrociti se koriste u RPGA kao eritrocitni dijagnostikum za detekciju antitijela (serodijagnostika). Ako su crvena krvna zrnca napunjena antitijelima (dijagnostikum antitijela eritrocita), mogu se koristiti za otkrivanje antigena.
Rice. 3. RPGA šema: crvena krvna zrnca (1), napunjena antigenom (3), vezana su specifičnim antitijelima (4).
Staging. Serija serijskih razblaženja seruma priprema se u jamicama polistirenskih ploča. Dodajte 0,5 ml očigledno pozitivnog seruma u pretposljednju jažicu i 0,5 ml fiziološkog rastvora (kontrole) u posljednju. Zatim se u sve jažice doda 0,1 ml razrijeđenog eritrocitnog dijagnostikuma, promućka i stavi u termostat na 2 sata.
Računovodstvo. IN pozitivan slučaj eritrociti se talože na dnu rupe u obliku ravnog sloja ćelija sa presavijenim ili nazubljenim rubom (obrnuti kišobran), u negativnom - talože se u obliku gumba ili prstena.
Fig.4. Računovodstvo za RNGA (RPGA).
Obračunavanje rezultata rendgenskog testa koji je urađen za otkrivanje botulinum toksina.
Uzročnik botulizma, Clostridium botulinum, proizvodi toksine sedam serovara (A, B, C, D, E, F, G), ali su češći serovari A, B i E. Svi toksini se razlikuju po antigenskim svojstvima i mogu mogu se razlikovati u reakcijama korištenjem seruma specifičnih za tip. U tu svrhu može se izvesti pasivna (indirektna) reakcija hemaglutinacije sa serumom pacijenta u kojoj se pretpostavlja prisustvo toksina i crvenih krvnih zrnaca napunjenih antitijelima antitoksičnih anti-botulinum seruma tipa A, B, E. Normalno. serum služi kao kontrola.
Rice. 3. Izjava i rezultat RNGA.
Računovodstvo. U pozitivnom slučaju, crvena krvna zrnca se talože na dnu rupe u obliku ravnog sloja stanica sa savijenim ili nazubljenim rubom (obrnuti kišobran); u negativnom slučaju se talože u obliku dugmeta ili prstena. .
Zaključak: Botulinski toksin tipa E otkriven je u serumu pacijenta.
Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HRT).
Rice. 8. Reakcija inhibicije hemaglutinacije (HAI) (šema).
Princip reakcije temelji se na sposobnosti AT da veže različite viruse i neutralizira ih, čineći nemogućim aglutiniranje crvenih krvnih stanica. Vizualno, ovaj efekat se manifestuje u „inhibiciji“ hemaglutinacije. RTGA se koristi u dijagnozi virusnih infekcija za identifikaciju specifičnih antihemaglutinina i identifikaciju različitih virusa po njihovim hemaglutininima, koji pokazuju svojstva Ag.
Tipizacija virusa se provodi u RTGA reakciji sa setom seruma specifičnih za tip. Rezultati reakcije se uzimaju u obzir odsustvom hemaglutinacije. Podtipovi virusa tipa A sa antigenima H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 i drugim mogu se diferencirati u RTGA sa setom homolognih seruma specifičnih za tip
Rice. 9. RTGA rezultati za tipizaciju virusa gripe
Legenda: - inhibicija hemaglutinacije (dugme); - hemaglutinacija (kišobran).
Zaključci: Materijal koji se proučava sadrži virus gripa tipa A sa antigenom H3N2
Reakcija indirektne (pasivne) hemaglutinacije (IRHA) zasniva se na činjenici da crvena krvna zrnca, ako se na njihovoj površini adsorbira rastvorljivi antigen, stiču sposobnost aglutinacije u interakciji s antitijelima na adsorbirani antigen. RNGA dijagram je prikazan na sl. 34. RNGA se široko koristi u dijagnostici brojnih infekcija.
Rice. 34. Šema reakcije pasivne hemaglutinacije (RPHA). A - dobijanje eritrocitnog dijagnostikuma: B - RPGA: 1 - eritrocit: 2 - antigen koji se proučava; 3 - dijagnostikum eritrocita; 4 - antitelo na antigen koji se proučava: 5 - aglutinirati
Postavljanje reakcije. Test serum se zagrijava 30 minuta na 56°C, razrjeđuje uzastopno u omjeru 1:10 - 1:1280 i sipa u 0,25 ml u epruvete ili jažice, gdje se 2 kapi eritrocitnog dijagnostikuma (eritrociti sa adsorbiranim antigenom na njima ) se zatim dodaju.
Kontrole: suspenzija dijagnostikuma eritrocita sa poznatim imunološkim serumom; suspenzija dijagnostikuma sa normalnim serumom; suspenzija normalnih crvenih krvnih zrnaca sa test serumom. U prvoj kontroli trebalo bi da dođe do aglutinacije, u drugoj i trećoj ne bi trebalo da dođe.
Koristeći RIGA, možete otkriti nepoznati antigen ako se poznata antitijela adsorbiraju na crvena krvna zrnca.
Reakcija hemaglutinacije može se izvesti u zapremini od 0,025 ml (mikrometoda) korišćenjem Takachi mikrotitratora.
1. Šta to ukazuje? pozitivan rezultat RHA između crvenih krvnih zrnaca i materijala koji se testira na prisustvo virusa?
2. Hoće li doći do aglutinacije crvenih krvnih zrnaca ako im se doda virus i odgovarajući serum? Kako se zove reakcija koja otkriva ovaj fenomen?
Vježbajte
Uzmite u obzir i registrirajte rezultat RIGA.
Reakcija precipitacije
U reakciji precipitacije dolazi do precipitacije specifičnog imunološkog kompleksa koji se sastoji od rastvorljivog antigena (lizat, ekstrakt, hapten) i specifičnog antitijela u prisustvu elektrolita.
Mutni prsten ili talog koji nastaje kao rezultat ove reakcije naziva se precipitat. Ova reakcija se uglavnom razlikuje od reakcije aglutinacije po veličini čestica antigena.
Reakcija precipitacije se obično koristi za određivanje antigena u dijagnozi brojnih infekcija ( antraks, meningitis, itd.); u sudskoj medicini - za određivanje vrste krvi, sperme itd.; u sanitarno-higijenskim studijama - prilikom utvrđivanja falsifikovanja proizvoda; uz njegovu pomoć utvrđuje se filogenetski odnos životinja i biljaka. Za reakciju vam je potrebno:
1. Antitela (precipitini) - imuni serum sa visoki titar antitijela (ne manje od 1:100000). Titar precipitirajućeg seruma određen je najvećim razblaženjem antigena s kojim reaguje. Serum se obično koristi nerazrijeđen ili u razrijeđenju od 1:5 - 1:10.
2. Antigen - rastvorene supstance proteinske ili lipoidne polisaharidne prirode (puni antigeni i hapteni).
3. Izotonični rastvor.
Glavne metode za izvođenje reakcije taloženja su: prstenasta reakcija precipitacije i reakcija taloženja u agaru (gelu).
Pažnja! Sve komponente uključene u reakciju taloženja moraju biti potpuno prozirne.
Prstenasta reakcija precipitacije. Pomoću Pasteurove pipete dodajte 0,2-0,3 ml (5-6 kapi) seruma u epruvetu za precipitaciju (serum ne bi trebalo da dođe na zidove epruvete). Antigen u istoj zapremini pažljivo se nanosi na serum, sipajući ga tankom Pasteurovom pipetom duž zida epruvete. Epruveta se drži u nagnutom položaju. Kada se pravilno nanese, treba postojati jasna granica između seruma i antigena. Pažljivo, da ne biste pomešali tečnost, epruvetu stavite u stalak. Ako je reakcija pozitivna, na granici između antigena i antitela formira se zamućeni „prsten“ – talog (vidi sliku 48).
Reakcija je praćena brojnim kontrolama (tabela 18). Redoslijed dodavanja reakcionih sastojaka u epruvetu je veoma važan. Ne možete naslagati serum na antigen (u kontroli - na izotonični rastvor), pošto je relativna gustina seruma veća, on će potonuti na dno epruvete, a granica između tečnosti se neće otkriti.
Tabela 18. Šema za postavljanje prstenaste reakcije taloženja
Bilješka. + prisutnost "prstena"; - odsustvo „prstena“.
Rezultati se bilježe nakon 5-30 minuta, u nekim slučajevima i nakon sat vremena, kao i uvijek počevši od kontrola. „Prsten“ u 2. epruveti ukazuje na sposobnost imunološkog seruma da uđe specifična reakcija sa odgovarajućim antigenom. U 3-5 epruveta ne bi trebalo biti "prstenova" - nema antitijela i antigena koji odgovaraju jedni drugima. “prsten” u 1. epruveti - pozitivan rezultat reakcije - ukazuje da test antigen odgovara uzetom imunološkom serumu, odsustvo "prstena" ("prsten" samo u 2. epruveti) ukazuje na njihovu nedosljednost - negativan rezultat reakcije.
Reakcija precipitacije u agaru (gelu). Posebnost reakcije je da se interakcija antigena i antitijela odvija u gustom mediju, odnosno u gelu. Nastali talog daje mutnu crtu u debljini medijuma. Odsustvo trake ukazuje na neslaganje između komponenti reakcije. Ova reakcija se široko koristi u biomedicinskim istraživanjima, posebno u proučavanju stvaranja toksina u uzročniku difterije.
Kontrolna pitanja
1. Koja je glavna razlika između reakcija aglutinacije i precipitacije?
2. Zašto se zamućeni sastojci ne mogu koristiti u reakciji taloženja?
Vježbajte
1. Postavite reakciju taloženja u prstenu i skicirajte rezultat.
2. Proučite prirodu interakcije antigena sa antitelom u reakciji taloženja u agaru, skicirajte rezultat (uzmite šolju od učitelja).
Reakcija lize (imuna citoliza)
Imunološka liza je otapanje ćelija pod uticajem antitela kada obavezno učešće dopuna. Za reakciju vam je potrebno:
1. Antigen - mikrobi, crvena krvna zrnca ili druge ćelije.
2. Antitijelo (lizin) - imuni serum, rjeđe serum pacijenata. Bakteriolitički serum sadrži antitijela uključena u lizu bakterija; hemolitički - hemolizini koji potiču lizu crvenih krvnih zrnaca; za lizu spiroheta potrebni su spirohetolizini, ćelije - itolizini itd.
3. Dopuna. Većina komplementa u serumu zamorci. Ovaj serum (mješavina nekoliko životinja) se obično koristi kao komplementar. Svježi (nativni) komplement je nestabilan i lako se uništava zagrijavanjem, protresanjem ili skladištenjem, tako da se može koristiti ne duže od dva dana nakon prijema. Da bi se očuvao komplement, dodaje mu se 2%. borna kiselina i 3% natrijum sulfata. Ovaj dodatak se može čuvati na 4°C do dvije sedmice. Najčešće se koristi suhi komplement. Prije upotrebe, otopi se u izotoničnoj otopini do prvobitne zapremine (navedene na etiketi).
4. Izotonični rastvor.
Reakcija hemolize(Tabela 19). Za reakciju vam je potrebno:
1. Antigen - 3% suspenzija ispranih ovčijih eritrocita u količini od 0,3 ml sedimenta eritrocita i 9,7 ml izotonične otopine.
2. Antitijelo - hemolitički serum (hemolizin) protiv eritrocita ovaca; obično pripremljen u proizvodnji, liofiliziran i titar je naveden na etiketi.
Titar hemolizina je najveće razrjeđenje seruma pri kojem dolazi do potpune hemolize 3% suspenzije crvenih krvnih zrnaca u prisustvu komplementa. Za reakciju hemolize hemolizin se uzima u trostrukom titru, tj. razrijeđen 3 puta manje nego prije titra. Na primjer, s titrom seruma od 1:1200, serum se razrijedi 1:400 (0,1 ml seruma * i 39,9 ml izotonične otopine). Višak hemolizina je neophodan, jer se dio može adsorbirati drugim komponentama reakcije.
* (Ne biste trebali uzimati manje od 0,1 ml seruma - točnost mjerenja će patiti.)
3. Komplement se razblaži 1:10 (0,2 ml komplementa i 1,8 ml izotonične otopine).
4. Izotonični rastvor.
Tabela 19. Shema reakcije hemolize
Obračun rezultata. Ako se reakcija pravilno izvede, u prvoj epruveti će doći do hemolize - njen sadržaj će postati providan. U kontrolama tečnost ostaje mutna: u 2. epruveti nema dovoljno komplementa za hemolizu, u 3. epruveti nema hemolizina, u 4. epruveti nema ni hemolizina ni komplementa, u 5. epruveti ima antigena ne odgovara antitelu,
Ako je potrebno, hemolitički serum se titrira prema sljedećoj shemi (tabela 20).
Prije titracije pripremiti početno razrjeđenje seruma od 1:100 (0,1 ml seruma i 9,9 ml izotonične otopine), od čega neophodna razblaženja, Na primjer:
Iz ovih razblaženja dodajte 0,5 ml seruma u epruvete za titraciju, kao što je prikazano u tabeli. 20.
Tabela 20. Šema titracije hemolitičkog seruma (hemolizin)
U primjeru datom u tabeli. 20, titar hemolitičkog seruma je 1:1200.
Kada se koristi svježi hemolitički serum, on mora biti inaktiviran kako bi se uništio komplement koji je u njemu prisutan. Da biste to učinili, zagrijava se 30 minuta na 56 ° C u vodenoj kupelji ili u inaktivatoru s termostatom. Potonji način je bolji: eliminiše mogućnost pregrijavanja surutke, odnosno njene denaturacije. Denaturirani serumi nisu pogodni za testiranje.
Reakcija bakteriolize. U ovoj reakciji komplement lizira bakterije u prisustvu odgovarajućeg (homolognog) seruma. Shema reakcije je u osnovi slična shemi reakcije hemolize. Razlika je u tome što se nakon dvosatne inkubacije sve epruvete zasijevaju u Petrijeve zdjelice sa podlogom pogodnom za mikroorganizam uzet u eksperiment kako bi se utvrdilo da li je lizirano. Ako je eksperiment izveden ispravno, kulture iz 2-5 epruveta (kontrole) trebale bi pokazati obilan rast. Nedostatak rasta ili slab rast u inokulaciji iz 1. epruvete (pokus) ukazuje na smrt mikroba, odnosno da su oni homologni antitelu.
Pažnja! Reakcija bakteriolize mora se provesti u aseptičnim uvjetima.
Kontrolna pitanja
1. Šta će se dogoditi s crvenim krvnim zrncima ako se umjesto izotonične otopine natrijum hlorida koristi destilovana voda? Šta je osnova ovog fenomena?
2. Kakva će se reakcija dogoditi kada eritrociti stupe u interakciju sa homolognim imunološkim serumom u odsustvu komplementa?
Vježbajte
Postavite reakciju hemolize. Snimite i skicirajte rezultat.
Povezane informacije.
