Aglutinācijas reakcija (RA) ir mikrobu vai citu šūnu adhēzija un izgulsnēšanās antivielu ietekmē elektrolīta klātbūtnē. Iegūtās nogulsnes sauc par aglutinātu.
RA tiek izmantots:
1. Noteikt antivielas pacienta asins serumā (serodiagnostika).
2. Noteikt no pacienta izolētas patogēno mikroorganismu tīrkultūras veidu un serovaru (serotipēšana).
Aglutinācijas reakciju izmanto, lai noteiktu antivielas asins serumā pacientiem, piemēram, ar vēdertīfu un paratīfu (Vidal reakcija), brucelozi (Raita, Hedlesona reakcija), tularēmiju, leptospirozi un citiem. infekcijas slimības, kā arī noteikt no pacienta izolētu patogēnu (zarnu infekcijas, garo klepu u.c.). RA izmanto, lai noteiktu asinsgrupas, Rh faktoru utt.
Reakcijai nepieciešami šādi komponenti:
1. Antigēnam (aglutinogēnam) jābūt korpuskulāram, tas ir, tā ir dzīvu vai nogalinātu mikroorganismu (diagnostikas m), eritrocītu vai citu šūnu suspensija. Parasti tiek izmantota mikroorganismu ikdienas kultūra, kas audzēta uz agara slīpām malām. Kultūru nomazgā ar 3 - 4 ml izotoniskā šķīduma, pārnes sterilā mēģenē un nosaka blīvumu. Suspensijai jābūt viendabīgai un jāsatur līdz 3 miljardiem mikrobu šūnu 1 ml. Darbu atvieglo nogalināto mikrobu suspensijas - diagnostikas - izmantošana (sagatavo ražošanā).
2. Antivielas (aglutinīni) tiek konstatētas pacienta serumā (serodiagnostikas laikā) vai aglutinējošajā serumā (serotipa noteikšanas laikā). Aglutinācijas serumus iegūst, imunizējot trušus ar nogalinātām baktērijām.
Aglutinējošais titrs serumu sauc par tā augstāko atšķaidījumu, kurā noteiktos eksperimenta apstākļos tas reaģē ar atbilstošo antigēnu.
Aglutinējošie serumi var būt dabiski (neadsorbēti) un adsorbēti. Vietējie serumi mazos atšķaidījumos mijiedarbojas ne tikai ar to mikroorganismu veidu, ar kuriem dzīvnieks tika imunizēts, lai iegūtu serumu, bet arī ar radniecīgiem mikroorganismu veidiem, jo tie satur grupas antivielas (antivielas pret mikroorganismiem, kuriem ir kopīgi antigēni). Vietējos serumus izmanto detalizētai aglutinācijas reakcijai (serodiagnostikai), kurā tiek ņemta vērā ne tikai reakcijas klātbūtne, bet arī antivielu titra pieauguma dinamika.
Ja grupas antivielas ekstrahē (adsorbē) no dabiskā seruma, mijiedarbojoties ar radniecīgām baktērijām, kurām ir grupas antigēni, tiek iegūti adsorbēti serumi. Adsorbētie serumi var būt monoreceptoru (vai tipam specifiski), saturot antivielas tikai pret vienu antigēna receptoru Polivalentie serumi sastāv no vairāku adsorbētu vai neadsorbētu serumu maisījuma. Stikla aglutinācijas reakcijai izmanto adsorbētus serumus.
Imunizējot dzīvniekus ar kustīgām baktērijām ar H-antigēnu, tiek iegūti H-aglutinējoši serumi, kas satur H-antivielas (piemēram, Salmonella monoreceptoru H-aglutinējošais serums). Imunizējot ar O-antigēnu, tiek iegūti O-aglutinējošie serumi, kas satur O-antivielas (piemēram, Salmonella grupas adsorbēts O-aglutinējošais serums, antiholēras O-aglutinējošais serums). Imunizējot ar H- un O-antigēniem, tiek iegūti serumi ar H- un O-antivielām.
Turklāt O-aglutinīni rada smalkgraudainu aglutinātu, bet H-aglutinīni veido rupji graudainus nogulsnes.
3. Elektrolīts - izotonisks NaCl šķīdums (0,9% nātrija hlorīda šķīdums, kas pagatavots destilētā ūdenī).
Ir divas galvenās metodes aglutinācijas reakcijas veikšanai: reakcija uz stikla (dažreiz saukta par indikatīvu vai plāksnes reakciju) un detalizēta reakcija (mēģenēs).
Aglutinācijas reakcijas iestatīšana uz stikla. Uz beztauku stikla priekšmetstikliņa uzklāj divus pilienus seruma un pilienu izotoniskā nātrija hlorīda šķīduma. Diagnostikas aglutinējošais serums tiek ņemts vienā atšķaidījumā, kas atkarībā no tā titra ir 1:10, 1:25, 1:50 vai 1:100. Pētītā mikroorganisma kultūru, izmantojot cilpu, pievieno vienam seruma pilienam un izotoniskā šķīduma pilienam un rūpīgi samaisa. Nātrija hlorīda piliens ar mikroorganismiem ir antigēna kontrole, seruma piliens bez mikroorganismiem ir seruma kontrole. Jūs nevarat pārnest kultūru no piliena ar serumu uz pilienu ar NaCl. Reakcija notiek istabas temperatūrā 1-3 minūtes. Ja seruma kontrole paliek skaidra, antigēna kontrolē tiek novērota vienmērīga duļķainība un pilē, kur kultūra tiek sajaukta ar serumu, parādās aglutināta pārslas, tad rezultāts tiek uzskatīts par pozitīvu. Ja pilienā ar serumu un antigēnu ir vienmērīga duļķainība, tas ir negatīvs rezultāts. Reakcija ir skaidrāk redzama uz tumša fona.
Serums
1. antigēnu kontrole
2. seruma kontrole
13.1. Antigēna-antivielu reakcijas un to pielietojums
Kad tiek ievadīts antigēns, organismā veidojas antivielas. Antivielas papildina antigēnu, kas izraisīja to sintēzi, un spēj ar to saistīties. Antigēnu saistīšanās ar antivielām sastāv no divām fāzēm. Pirmā fāze ir specifiska, kurā notiek ātra antigēna determinanta saistīšanās ar antivielu Fab fragmenta aktīvo centru. Jāatzīmē, ka saistīšanās notiek van der Vāla spēku, ūdeņraža un hidrofobās mijiedarbības dēļ. Saites stiprumu nosaka telpiskās atbilstības pakāpe starp antivielas aktīvo vietu un antigēna epitopu. Pēc konkrētās fāzes sākas lēnāka fāze - nespecifiska, kas izpaužas ar redzamu fizikālu parādību (piemēram, pārslu veidošanās aglutinācijas laikā u.c.).
Imūnās reakcijas ir mijiedarbība starp antivielām un antigēniem, un šīs reakcijas ir specifiskas un tām piemīt augsta jutība. Tie tiek plaši izmantoti medicīnas prakse. Ar imūnreakciju palīdzību var atrisināt šādas problēmas:
Nezināmu antivielu noteikšana ar zināmiem antigēniem (antigenic diagnosticum). Šis uzdevums rodas, ja pacienta asins serumā nepieciešams noteikt antivielas pret patogēnu (serodiagnostika). Antivielu atrašana ļauj apstiprināt diagnozi;
Nezināmu antigēnu noteikšana, izmantojot zināmas antivielas (diagnostikas serumu). Šis pētījums tiek veikts, identificējot no pacienta materiāla izolētu patogēnu kultūru (serotipēšana), kā arī atklājot
mikrobu antigēni un to toksīni asinīs un citi bioloģiskie šķidrumi. Ir daudz veidu imūnreakciju, kas atšķiras pēc inscenēšanas tehnikas un reģistrētā efekta. Tās ir aglutinācijas reakcijas (RA), izgulsnēšanās reakcijas (RP), reakcijas ar komplementu (RSC), reakcijas, kurās tiek izmantoti marķēti komponenti (RIF, ELISA, RIA).
13.2. Aglutinācijas reakcija
Aglutinācijas reakcija (RA) ir imūnā reakcija antigēna mijiedarbība ar antivielām elektrolītu klātbūtnē, un antigēns atrodas korpuskulārā stāvoklī (eritrocīti, baktērijas, lateksa daļiņas ar adsorbētiem antigēniem). Aglutinācijas laikā korpuskulārie antigēni tiek salīmēti kopā ar antivielām, kas izpaužas, veidojoties flokulentām nogulsnēm. Pārslu veidošanās notiek tāpēc, ka antivielām ir divi aktīvi centri, un antigēni ir polivalenti, t.i. ir vairāki antigēnu determinanti. RA izmanto, lai identificētu no pacienta materiāla izolētu patogēnu, kā arī noteiktu antivielas pret patogēnu pacienta asins serumā (piemēram, Raita un Hedlsona reakcijas brucelozei, Vidala reakcija pret vēdertīfu un paratīfu).
Vienkāršākais veids, kā diagnosticēt RA, ir reakcija uz stikla; tas ir aptuvens RA, ko izmanto, lai noteiktu no pacienta izolētu patogēnu. Kad reakcija ir konstatēta, uz stikla priekšmetstikliņa tiek uzklāts diagnostiskais aglutinējošais serums (atšķaidījumā 1:10 vai 1:20), pēc tam pievieno pacienta kultūru. Reakcija ir pozitīva, ja pilē parādās flokulējošas nogulsnes. Tuvumā tiek novietota kontrole: seruma vietā tiek uzklāts piliens nātrija hlorīda šķīduma. Ja diagnostiskais aglutinējošais serums nav adsorbēts 1, tad tas tiek atšķaidīts (līdz titram - atšķaidījumam, līdz kuram jānotiek aglutinācijai), t.i. ielieciet paplašināto RA mēģenēs, palielinoties
1 Neadsorbēts aglutinējošais serums var aglutinēt radniecīgas baktērijas, kurām ir kopīgi (savstarpēji reaģējoši) antigēni. Tāpēc viņi izmantoadsorbēti aglutinējošie serumi, no kuriem, adsorbējot radniecīgās baktērijās, ir izņemtas krusteniski reaģējošas antivielas. Šādi serumi saglabā antivielas, kas ir specifiskas tikai konkrētai baktērijai.
aglutinējošā seruma atšķaidījumi, kam pievieno 2-3 pilienus no pacienta izolētas patogēna suspensijas. Aglutināciju ņem vērā, ņemot vērā nogulšņu daudzumu un šķidruma attīrīšanas pakāpi mēģenēs. Reakciju uzskata par pozitīvu, ja aglutināciju novēro atšķaidījumā, kas ir tuvu diagnostikas seruma titram. Reakciju pavada kontroles: serumam, kas atšķaidīts ar izotonisko nātrija hlorīda šķīdumu, jābūt caurspīdīgam, mikrobu suspensijai tajā pašā šķīdumā jābūt vienmērīgi duļķainai, bez nogulsnēm.
Lai noteiktu antivielas pret patogēnu pacienta asins serumā, tiek izmantota pilna mēroga RA. Uzstādot to, pacienta asins serums tiek atšķaidīts mēģenēs un mēģenēs tiek pievienots vienāds daudzums diagnostiskās suspensijas (nogalināto mikrobu suspensijas). Pēc inkubācijas nosaka augstāko seruma atšķaidījumu, pie kura notikusi aglutinācija, t.i. ir izveidojušās nogulsnes (seruma titrs). Šajā gadījumā aglutinācijas reakcija ar O-diagnosticum (karsējot iznīcina baktērijas, saglabājot termostabilo O-antigēnu) notiek smalkgraudainas aglutinācijas veidā. Aglutinācijas reakcija ar H-diagnosticum (baktērijas, ko iznīcina formaldehīds, saglabājot termolabilu flagellar H-antigēnu) ir rupja un norit ātrāk.
Netiešā (pasīvā) hemaglutinācijas reakcija(RNGA vai RPGA) ir RA veids. Šī metode ir ļoti jutīga. Ar RNGA palīdzību var atrisināt divas problēmas: noteikt antivielas pacienta asins serumā, kam pievienota antigēna eritrocītu diagnostika, kas ir eritrocīti, uz kuriem adsorbējas zināmie antigēni; nosaka antigēnu klātbūtni testa materiālā. Šajā gadījumā reakciju dažreiz sauc par reverso netiešo hemaglutinācijas reakciju (RONHA). Procedūras laikā pētāmajam materiālam pievieno antivielu eritrocītu diagnostiku (eritrocītus, kuru virsmā ir adsorbētas antivielas). Šajā reakcijā sarkanās asins šūnas darbojas kā nesēji un ir pasīvi iesaistītas imūnagregātu veidošanā. Ar pozitīvu reakciju pasīvi pielīmētie sarkanie asinsķermenīši pārklāj cauruma dibenu vienmērīgā slānī ar izgrieztām malām (“lietussargs”); ja nav aglutinācijas, sarkanās asins šūnas uzkrājas cauruma centrālajā padziļinājumā, veidojot kompaktu “pogu” ar asi izteiktām malām.
Koaglutinācijas reakcija izmanto patogēnu šūnu (antigēnu) noteikšanai, izmantojot adsorbētas antivielas Staphylococcus aureus, kas satur proteīnu A. Proteīnam A ir afinitāte pret imūnglobulīnu Fc fragmentu. Pateicoties tam, antivielas saistās ar stafilokoku netieši caur Fc fragmentu, un Fab fragmenti ir vērsti uz āru un spēj mijiedarboties ar attiecīgajiem mikrobiem, kas izolēti no pacientiem. Šajā gadījumā veidojas pārslas.
Hemaglutinācijas inhibīcijas reakcija (HAI) izmanto diagnostikā vīrusu infekcijas, un tikai infekcijas, ko izraisa hemaglutinējošie vīrusi. Šo vīrusu virsmā ir proteīns – hemaglutinīns, kas ir atbildīgs par hemaglutinācijas reakciju (HRA), kad vīrusiem pievieno sarkanās asins šūnas. RTGA ietver vīrusu antigēnu bloķēšanu ar antivielām, kā rezultātā vīrusi zaudē spēju aglutinēt sarkanās asins šūnas.
Kumbsa reakcija - RA nepilnīgu antivielu noteikšanai. Dažās infekcijas slimībās, piemēram, brucelozes gadījumā, pacienta asins serumā cirkulē nepilnīgas antivielas pret patogēnu. Nepilnīgas antivielas tiek sauktas par bloķējošām antivielām, jo tām ir viena antigēnu saistīšanās vieta, nevis divas, kā pilnvērtīgām antivielām. Tāpēc, pievienojot antigēnu diagnostiku, nepilnīgas antivielas saistās ar antigēniem, bet nesalīmē tās kopā. Reakcijas izpausmei tiek pievienots antiglobulīna serums (antivielas pret cilvēka imūnglobulīniem), kas novedīs pie imūnkompleksu (antigēna diagnostika + nepilnīgas antivielas), kas veidojas reakcijas pirmajā posmā, aglutinācijas.
Netiešo Kumbsa reakciju lieto pacientiem ar intravaskulāru hemolīzi. Dažiem no šiem pacientiem tiek konstatētas nepilnīgas monovalentas anti-rēzus antivielas. Tie īpaši mijiedarbojas ar Rh pozitīviem eritrocītiem, bet neizraisa to aglutināciju. Tāpēc anti-Rh antivielu + Rh-pozitīvo eritrocītu sistēmai tiek pievienots antiglobulīna serums, kas izraisa eritrocītu aglutināciju. Kumbsa testu izmanto, lai diagnosticētu patoloģiski apstākļi, kas saistīta ar imūnās izcelsmes eritrocītu intravaskulāru lizu, piemēram, jaundzimušo hemolītisko slimību, ko izraisa Rh konflikts.
RA asins grupu noteikšanai pamatā ir eritrocītu aglutinācija ar imūnseruma antivielām pret asins grupas antigēniem A(II), B(III). Kontrole ir serums, kas nesatur antivielas, t.i. seruma AB(IV) asinsgrupa un A(P) un B(III) grupas eritrocītu antigēni. 0(I) grupas sarkanās asins šūnas tiek izmantotas kā negatīva kontrole, jo tām nav antigēnu.
Lai noteiktu Rh faktoru, tiek izmantoti anti-Rh serumi (vismaz divas dažādas sērijas). Ja uz pētāmo eritrocītu membrānas ir Rh antigēns, notiek šo šūnu aglutinācija.
13.3. Nokrišņu reakcija
RP ir imūnreakcija antivielu mijiedarbībai ar antigēniem elektrolītu klātbūtnē, un antigēns ir šķīstošā stāvoklī. Nokrišņu laikā šķīstošie antigēni tiek izgulsnēti ar antivielām, kas izpaužas kā duļķainība nokrišņu joslu veidā. Redzamu nogulšņu veidošanos novēro, ja abus reaģentus sajauc līdzvērtīgās attiecībās. Viena no tām pārpalikums samazina izgulsnēto imūnkompleksu skaitu. Ir dažādi veidi, kā veikt nokrišņu reakciju.
Gredzena nokrišņu reakcija ievieto neliela diametra nokrišņu caurulēs. Mēģenē pievieno imūnserumu un rūpīgi slāņo šķīstošo antigēnu. Ja rezultāts ir pozitīvs, abu risinājumu saskarnē veidojas pienains gredzens. Gredzenveida izgulsnēšanās reakciju, ko izmanto, lai noteiktu antigēnu klātbūtni orgānos un audos, kuru ekstraktus vāra un filtrē, sauc par termoprecipitācijas reakciju (Ascoli reakcija termostabila Sibīrijas mēra antigēna noteikšanai).
Ouchterlony dubultā imūndifūzijas reakcija.Šo reakciju veic agara gēlā. Vienāda biezuma gēla slānī noteiktā attālumā viena no otras tiek izgrieztas iedobes un attiecīgi piepildītas ar antigēnu un imūnserumu. Pēc tam antigēni un antivielas izkliedējas gēlā, satiekas viens ar otru un veido imūnkompleksus, kas nogulsnējas gēlā un kļūst redzami kā precīzas līnijas.
uzturs. Šo reakciju var izmantot, lai identificētu nezināmus antigēnus vai antivielas, kā arī pārbaudītu dažādu antigēnu līdzību: ja antigēni ir identiski, nokrišņu līnijas saplūst, ja antigēni nav identiski, nokrišņu līnijas krustojas, ja antigēni ir daļēji. identisks, veidojas spurs.
Radiāla imūndifūzijas reakcija. Izkausētajam agara gēlam pievieno antivielas un gēlu vienmērīgā kārtā uzklāj uz stikla. Želejā izgriež iedobes un tām pievieno standarta tilpumu dažādu koncentrāciju antigēnu šķīdumu. Inkubācijas laikā antigēni izkliedējas radiāli no akas un, satiekoties ar antivielām, veido nokrišņu gredzenu. Kamēr akā paliek antigēna pārpalikums, pakāpeniski palielinās nokrišņu gredzena diametrs. Šo metodi izmanto, lai noteiktu antigēnus vai antivielas testa šķīdumā (piemēram, lai noteiktu dažādu klašu imūnglobulīnu koncentrāciju asins serumā).
Imūnelektroforēze. Antigēnu maisījumu vispirms elektroforētiski atdala, pēc tam rievai, kas iet pa proteīna kustības virzienu, pievieno nogulsnējošu antiserumu. Antigēni un antivielas izkliedējas želejā viens pret otru; mijiedarbojoties, tie veido lokveida nokrišņu līnijas.
Flokulācijas reakcija(pēc Ramona) - nokrišņu reakcijas veids, ko izmanto, lai noteiktu antitoksiskā seruma vai toksoīda aktivitāti. Reakciju veic mēģenēs. Mēģenē, kurā toksoīds un antitoksīns ir līdzvērtīgā attiecībā, tiek novērota duļķainība.
13.4. Komplementa fiksācijas reakcija
Antivielas, mijiedarbojoties ar atbilstošo antigēnu, saista pievienoto komplementu (1. sistēma). Komplementa fiksācijas indikators ir eritrocīti, kas sensibilizēti ar hemolītisko serumu, t.i. antivielas pret sarkanajām asins šūnām (2. sistēma). Ja komplements nav fiksēts 1. sistēmā, t.i. Ja antigēna-antivielu reakcija nenotiek, sensibilizētās sarkanās asins šūnas tiek pilnībā lizētas (negatīva reakcija). Kad komplementu fiksē 1. sistēmas imūnkomplekss pēc sensibilizētu eritrocītu pievienošanas, hemolīze no plkst.
nav (pozitīva reakcija). Komplementa saistīšanās reakciju izmanto, lai diagnosticētu infekcijas slimības (gonoreju, sifilisu, gripu utt.).
13.5. Neitralizācijas reakcija
Mikrobiem un to toksīniem ir kaitīga ietekme uz cilvēka ķermeņa orgāniem un audiem. Antivielas spēj saistīties ar šiem kaitīgajiem aģentiem un tos bloķēt, t.i. neitralizēt. Diagnostiskās neitralizācijas reakcijas pamatā ir šī antivielu iezīme. To veic, ievadot antigēnu-antivielu maisījumu dzīvniekiem vai jutīgos testa objektos (šūnu kultūrā, embrijos). Piemēram, lai noteiktu toksīnus pacienta materiālā, 1. grupas dzīvniekiem injicē materiālu no pacienta. 2. grupas dzīvnieki tiek injicēti ar līdzīgu materiālu, iepriekš apstrādāti ar atbilstošu antiserumu. 1. grupas dzīvnieki mirst, ja materiālā ir toksīns. Otrā dzīvnieku grupa izdzīvo, toksīna kaitīgā iedarbība neizpaužas, jo tiek neitralizēta.
13.6. Reakcijas, izmantojot marķētas antivielas vai antigēnus
13.6.1. Imunofluorescences reakcija (RIF, Kūnsa metode)
Šo metodi izmanto ekspresdiagnostikai. To var izmantot, lai noteiktu gan mikrobu antigēnus, gan antivielas.
Tiešā RIF metode- imūnreakcija no antivielu mijiedarbības ar antigēniem, un antivielas tiek marķētas ar fluorohromu - vielu, kas spēj izstarot noteikta viļņa garuma gaismas kvantus, pakļaujoties noteikta viļņa garuma gaismai. Šīs metodes īpatnība ir nepieciešamība noņemt nereaģējušos komponentus, lai izslēgtu nespecifiskas luminiscences noteikšanu. Lai to izdarītu, nomazgājiet nereaģējušās antivielas. Rezultātus novērtē, izmantojot fluorescējošu mikroskopu. Ar šādu luminiscējošu serumu apstrādātā uztriepē baktērijas mirdz uz tumša fona gar šūnas perifēriju.
Netiešā RIF metode tiek izmantots biežāk nekā iepriekšējais. Šī reakcija tiek veikta divos posmos. Pirmajā posmā antigēni savstarpēji
mijiedarbojas ar attiecīgajām antivielām, veidojot imūnkompleksus. Visas sastāvdaļas, kas nav reaģējušas (t.i., neietilpst imūnkompleksos), ir jānoņem, mazgājot. Otrajā posmā iegūtais antigēna-antivielu komplekss tiek noteikts, izmantojot fluorohromētu antiglobulīna serumu. Rezultātā veidojas mikrobu + pretmikrobu trušu antivielu + antivielu pret trušu imūnglobulīniem komplekss, kas marķēts ar fluorohromu. Rezultātus novērtē, izmantojot fluorescējošu mikroskopu.
13.6.2. Enzīmu imūnsorbcijas metode vai tests
ELISA - visizplatītākā moderna metode, ko izmanto vīrusu, baktēriju, vienšūņu infekciju diagnosticēšanai, jo īpaši HIV infekcijas diagnosticēšanai, vīrusu hepatīts un utt.
Ir daudz ELISA modifikāciju. Plaši tiek izmantots cietās fāzes nekonkurējošs ELISA tests. To veic 96 bedrīšu polistirola plāksnēs (cietā fāze). Veicot reakciju, katrā posmā ir jānomazgā nereaģējušas sastāvdaļas. Nosakot antivielas, iedobēm, uz kurām tiek sorbēti antigēni, pievieno testa asins serumu, pēc tam antiglobulīna serumu marķē ar fermentu. Reakciju veic, pievienojot substrātu fermentam. Fermenta klātbūtnē substrāts mainās, un enzīma-substrāta komplekss tiek izvēlēts tā, lai reakcijā izveidotais produkts būtu krāsots. Tādējādi ar pozitīvu reakciju tiek novērota šķīduma krāsas maiņa. Lai noteiktu antigēnus, cietās fāzes nesēju sensibilizē ar antivielām, pēc tam secīgi pievieno testējamo materiālu (antigēnus) un enzīmu iezīmēto serumu antigēniem. Lai reakcija notiktu, tiek pievienots enzīma substrāts. Ar pozitīvu reakciju notiek šķīduma krāsas izmaiņas.
13.6.3. Imunoblotēšana
Šīs metodes pamatā ir elektroforēzes un ELISA kombinācija. Veicot imūnblotēšanu (blotēšana no angļu valodas. traips- plankums) komplekss antigēnu maisījums vispirms tiek pakļauts elektroforēzei poliakrilamīda gēlā. Iegūtais frakcionētais anti-
gēnu peptīdi tiek pārnesti uz nitrocelulozes membrānu. Pēc tam blotus apstrādā ar enzīmu iezīmētām antivielām pret konkrētu antigēnu, t.i. veikt ELISA blotēšanu. Imunoblotēšanu izmanto tādu infekciju kā HIV diagnostikā.
13.6.4. Imūnā elektronu mikroskopija
Metode sastāv no mikroskopijas in elektronu mikroskops vīrusi (retāk citi mikrobi), kas iepriekš apstrādāti ar atbilstošu imūnserumu, kas marķēts ar elektronoptiski blīviem preparātiem, piemēram, feritīnu, dzelzi saturošu proteīnu.
13.7. Plūsmas citometrija
Asins šūnas tiek diferencētas, pamatojoties uz lāzera citofluorometriju. Lai to izdarītu, vajadzīgās šūnas tiek iekrāsotas ar fluorescējošām monoklonālām antivielām pret CD antigēniem. Asins paraugs pēc apstrādes ar iezīmētām antivielām tiek izvadīts caur plānu cauruli un caur to tiek izvadīts lāzera stars, kas ierosina fluorohromu mirdzēt. Fluorescences intensitāte korelē ar antigēnu blīvumu uz šūnas virsmas, un to var kvantitatīvi izmērīt, izmantojot fotopavairotāja cauruli. Iegūtie rezultāti tiek pārvērsti histogrammā.
Lai noteiktu, tiek izmantota plūsmas citometrija imūnsistēmas stāvoklis(limfocītu galveno populāciju saturs, intracelulāro un ārpusšūnu citokīnu saturs, NK šūnu funkcionālā aktivitāte, fagocitozes aktivitāte utt.).
IMUNOMIKROBIOLOĢISKIE PĒTĪJUMI
Daudzu problēmu risināšanai tiek izmantotas imunoloģiskās metodes:
1. Stāvokļa novērtējums imūnsistēma persona (imūnais stāvoklis), nosakot kvantitatīvo un funkcionālās īpašības imūnsistēmas šūnas un to produkti.
2. Cilvēka audu sastāva un īpašību noteikšana: asins grupas, Rh faktors, transplantācijas antigēni.
3. Infekcijas slimību diagnostika un rezistence pret tām, nosakot un nosakot antivielu titrus (serodiagnostika), identificējot patogēnu antigēnus organismā un nosakot šūnu reakcijas uz šiem antigēniem.
4. No cilvēku un dzīvnieku ķermeņa izolētu baktēriju un vīrusu kultūru seroīdu identifikācija.
5. Atklāšana cilvēka ķermenī un iekšā ārējā vide jebkuras vielas ar antigēnu vai haptēnu īpašībām (hormoni, fermenti, indes, zāles, zāles utt.).
6. Imunopatoloģisko stāvokļu, alerģiju, transplantācijas un pretvēža reakciju noteikšana.
Antigēna un antivielu mijiedarbības process seroloģiskās reakcijas notiek divās fāzēs:
1) specifisks- mijiedarbības fāze, kurā notiek antivielu (paratopu) aktīvo centru un antigēna epitopu komplementāra kombinācija. Šī fāze parasti ilgst dažas sekundes vai minūtes;
2) nespecifisks- izpausmes fāze, raksturota ārējās pazīmes imūnkompleksu veidošanās. Šī fāze var attīstīties no vairākām minūtēm līdz vairākām stundām.
Antivielu optimālā specifiskā mijiedarbība ar antigēnu notiek izotoniskā šķīdumā ar pH tuvu neitrālam. Antigēna-antivielu reakcija in vitro sistēmā var būt saistīta ar vairāku parādību rašanos
· aglutinācija,
· nokrišņi,
· līze.
Ārējās izpausmes reakcijas ir atkarīgas no antigēna fizikāli ķīmiskajām īpašībām (daļiņu izmēra, fiziskais stāvoklis), antivielu klase un veids (pilnīga un nepilnīga), kā arī eksperimenta apstākļi (vidēja konsistence, sāls koncentrācija, pH, temperatūra).
Antigēnu un antivielu polivalence nodrošina ar neapbruņotu aci redzamu agregātu veidošanos. Tas notiek saskaņā ar tīkla veidošanās teoriju, saskaņā ar kuru iegūtajam antigēna-antivielu kompleksam secīgi tiek pievienotas citas antivielas un antigēnu molekulas. Rezultātā veidojas tīkla struktūras, kas pārvēršas par agregātiem, kas izgulsnējas. Reakcijas raksturs un smagums ir atkarīgs no antigēnu un antivielu kvantitatīvās attiecības. Visintensīvākās reakcijas notiek, ja reaģenti ir līdzvērtīgās proporcijās.
Priekšnoteikums režģa veidošanās (tīkli) - vairāk nekā trīs antigēnu determinantu klātbūtne katrai antigēna molekulai un divi aktīvie centri katrai antivielu molekulai. Antigēna molekulas ir režģa mezgli, un antivielu molekulas ir savienojošās saites. Antigēnu un antivielu koncentrāciju optimālo attiecību (ekvivalences zona) apgabals, kad pēc nogulšņu veidošanās supernatantā netiek konstatēti ne brīvi antigēni, ne brīvas antivielas.
Agregāti, kas var izgulsnēties, veidojas, antigēniem apvienojoties ar pilnām antivielām. Nepilnīgas antivielas (monovalentas) neizraisa tīkla struktūru un lielu agregātu veidošanos. Lai noteiktu šādas antivielas, izmantojiet īpašas metodes pamatojoties uz antiglobulīnu lietošanu (Kumbsa reakcija).
Seroloģiskos testus to augstās specifikas un jutīguma dēļ izmanto, lai noteiktu un kvantitatīvā noteikšana antigēni un antivielas. Imūnreaģentu daudzumu reakcijās izsaka ar titru - maksimālo seruma vai antigēna atšķaidījumu, pie kura joprojām tiek novērota reakcija.
Seroloģiskās reakcijas mikrobioloģiskajās un imunoloģiskajās laboratorijās tiek izmantotas diviem mērķiem:
1) mikroorganismu, toksīnu, antigēnu seroidentifikācijai kopumā, izmantojot zināmu antivielu (imūndiagnostikas serumu),
2) serodiagnostikai - antivielu rakstura noteikšana pacienta asins serumā pret baktēriju, vīrusu un retāk citām infekcijas slimībām, izmantojot zināmu antigēnu (diagnosticum).
Lai noteiktu antigēna sugas un veidu, ir nepieciešami zināmi imūndiagnostikas serumi. Tos iegūst, atkārtoti ievadot dzīvniekiem (parasti trušiem) pieaugošās devās nogalinātus vai dzīvus mikroorganismus, to sabrukšanas produktus, neitralizētus vai vietējos toksīnus. Pēc noteikta dzīvnieku imunizācijas cikla tiek veikta masīva dzīvnieka asins nolaišana vai pilnīga asiņošana. Asinis, kas savāktas sterilā traukā, vispirms ievieto termostatā 37°C temperatūrā uz 4 - 6 stundām, lai paātrinātu recēšanu, pēc tam uz dienu ledusskapī. Iegūto caurspīdīgo serumu iesūc sterilā traukā, pievieno konservantus, nosaka antivielu titru, pārbauda sterilitāti un ielej ampulās.
Tiek lietoti nav adsorbēts Un adsorbēts diagnostikas serumi. Neadsorbētiem serumiem ir augsti titri antivielas, bet spēj izraisīt grupu (krustu) reakcijas.
Adsorbētajiem serumiem ir raksturīga stingra darbības specifika (tie reaģē tikai ar homologu antigēnu). Tiek saukti serumi, kas satur antivielas tikai pret vienu konkrētu antigēnu monoreceptors.
Tie ražo arī serumus, kas marķēti ar fluorohromiem, fermentiem un radioizotopiem, kas ļauj ar augstu precizitātes pakāpi noteikt pat antigēna pēdas.
Dzīvu vai nogalinātu baktēriju suspensijas, to sadalīšanās produkti, toksīni un vīrusi tiek izmantoti kā antigēni (diagnostikas līdzekļi) seroloģiskās reakcijās. Dažos gadījumos tiek izmantoti ekstrakti vai ķīmiski izolēti antigēni no mikroorganismiem un dzīvnieku audiem.
Visas imūnmikrobioloģiskās metodes var iedalīt 3 grupās:
1) pamatojoties uz tieša antigēna mijiedarbība ar antivielām(aglutinācijas, izgulsnēšanās, hemaglutinācijas, imobilizācijas uc parādības);
2) pamatojoties uz mediēta antigēna mijiedarbība ar antivielu(reakcijas netiešā hemaglutinācija, koagulācija, lateksa aglutinācija, oglekļa aglomerācija, bentonīta aglutinācija, komplementa saistīšanās u.c.);
3) izmantojot marķētas antivielas vai antigēni(fluorescējošu antivielu metode, ar enzīmu saistītās imūnsorbcijas un radioimūnās metodes un citas metodes).
AGLUTINĀCIJAS REAKCIJAS
Šajās reakcijās ir iesaistīti antigēni daļiņu veidā (mikrobu šūnas, sarkanās asins šūnas un citi korpuskulārie antigēni), kuras salīmē kopā ar antivielām un nogulsnējas.
Lai veiktu aglutinācijas reakciju(RA) ir nepieciešami trīs komponenti: 1) antigēns (aglutinogēns);
2) antivielas (aglutinīns)
3) elektrolīts (izotonisks nātrija hlorīda šķīdums).
Aptuvenā aglutinācijas reakcija (RA)
Indikatīvu jeb plāksni RA novieto uz stikla priekšmetstikliņa istabas temperatūrā. Lai to izdarītu, izmantojiet Pasteur pipeti, lai atsevišķi uz stikla uzklātu seruma pilienu atšķaidījumā no 1:10 līdz 1:20 un kontroles pilienu izotoniskā nātrija hlorīda šķīduma. Abās bakterioloģiskajās cilpās ievada kolonijas vai ikdienas baktēriju kultūru (diagnostikas pilienu) un rūpīgi samaisa. Reakcijas tiek ņemtas vērā vizuāli pēc dažām minūtēm, dažreiz izmantojot palielināmo stiklu (x5). Ar pozitīvu RA tiek novērota lielu un mazu pārslu parādīšanās seruma kritumā; ar negatīvu RA serums paliek vienmērīgi duļķains.
Detalizēta aglutinācijas reakcija lai noteiktu specifisko antivielu titru pacientam.
Pilnīga RA serodiagnostikai tiek veikta pacientu serumā. To atšķaida arī izotoniskā nātrija hlorīda šķīdumā no 1:50 līdz 1:100 līdz 1:800 vai 1:1600. Tā kā zemāki seruma titri var saturēt normālus aglutinīnus, kas atrodami veseliem cilvēkiem vai pacientiem ar citu diagnozi (diagnostikas titru). Kā antigēns šajā reakcijā tiek izmantots diagnostikas līdzeklis - zināmas suspensijas, parasti no nogalinātām baktērijām.
1 ml izotoniskā nātrija hlorīda šķīduma vispirms ielej aglutinācijas mēģenēs. Pirmajam no tiem pievieno 1 ml seruma, kas atšķaidīts 1:100, un pēc tā samaisīšanas 1 ml pārnes uz otro, no otrā uz trešo utt. Iegūtajiem seruma divkāršajiem atšķaidījumiem (no 1:100 līdz 1:1600 vai vairāk) pievieno 1-2 pilienus baktēriju suspensijas, kas satur 3 miljardus mikrobu ķermeņu 1 ml. Caurules sakrata un ievieto termostatā 37°C uz 2 stundām, pēc tam 24 stundas tur istabas temperatūrā.
Detalizētā aglutinācijas reakcija tiek ņemta vērā, secīgi izvērtējot katru mēģeni, sākot ar kontroles, viegli kratot. Kontroles mēģenēs nedrīkst būt aglutinācijas. Aglutinācijas reakcijas intensitāte ir atzīmēta ar šādām pazīmēm: ++++ - pilnīga aglutinācija (aglutinācijas pārslas absolūti caurspīdīgā šķidrumā); +++ - nepilnīga aglutinācija (pārslas nedaudz opalescējošā šķidrumā); ++ - daļēja aglutinācija (pārslas ir skaidri redzamas, šķidrums ir nedaudz duļķains); + - vāja, apšaubāma aglutinācija - šķidrums ir ļoti duļķains, pārslas tajā ir grūti atšķirt; - - aglutinācijas trūkums (šķidrums ir vienmērīgi duļķains).
Seruma titru uzskata par tā pēdējo atšķaidījumu, kurā aglutinācijas intensitāte tiek novērtēta ne mazāk kā par diviem plusiem (++).
Aglutinācijas reakcija Aglutinācijas reakcija
(RA) ir metode Ag un Ab identificēšanai un kvantitatīvai noteikšanai, pamatojoties uz to spēju veidot ar neapbruņotu aci redzamus aglomerātus. Infekcijas slimību nodaļā. slimībām vai citiem mērķiem izmanto nezināmu mikrobu un šūnu identificēšanai, Ab klātbūtnes un daudzuma noteikšanai asinīs un citos šķidrumos. Noteikšanas princips ir balstīts uz Ag un Ab mijiedarbības specifiku, un tas sastāv no zināmā atrašanas no nezināmā. RA ir daudz iespēju: kvantitatīvā un kvalitatīvā, mēģene un stikls, tilpuma un pilienu, parastās, paātrinātās un ekspresmetodes. RA stadijai jums ir nepieciešams: 1) s-ka asinis. Variantā ar baktēriju veida (var) noteikšanu tiek izmantoti rūpnieciskie aglutinācijas testi, kas iegūti imunizējot trušus. Variantā ar Ab veida noteikšanu no testa tiek ņemts asins paraugs. cilvēkiem vai dzīvniekiem. Šķīdumam jābūt sterilam un bez suspendētām daļiņām. Sagatavo bāzes atšķaidījumu sāls šķīdumā. Tam jābūt 2-4 reizes zemākam par šīs slimības diagnostikas titru; 2) Ag. Reakcijas versijā ar Ab tipa noteikšanu tiek izmantoti rūpnieciskās diagnostikas komplekti; variantā ar Ag noteikšanu diagnostikas gatavo paši 1-3 miljardu suspensijas veidā sāls šķīdumā 18-20 stundu agara (retāk buljona) testa. mikrobs inaktivēts, karsējot ūdens vannā 70°C 1 stundu vai inkubējot 24 stundas 37°C temperatūrā ar formaldehīdu (galīgā koncentrācija 0,2%); 3) elektrolīts sāls šķīduma veidā. Iestudējuma tehnika tilpuma sērijas caurule RA, lai noteiktu Ab titru s-ki: no galvenā s-ki atšķaidījuma sagatavo vairākas darba atšķaidījumu rindas. Rindu skaits ir atkarīgs no eksperimentā ņemto diagnostiku skaita, skaitu un atšķaidīšanas koeficientus nosaka aizdomīgās slimības diagnostiskais titrs. Sērijā jāsatur vismaz atšķaidījums, kas atbilst diagnostikas Ab titram, divus atšķaidījumus zem un divus atšķaidījumus virs tā. piemēram, ja diagnostikas titrs ir 1:100, tad ar tilpuma metodi RA stadijas noteikšanai jāsagatavo šādi atšķaidījumi: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; ar pilienu metodi, pirmais atšķaidījums (1:25) nav vajadzīgs, bet nepieciešams vēl viens lielāks atšķaidījums - 1:800. zinātniskie pētījumi s-ku ir titrēts līdz negatīva reakcija. To atšķaida šādi: visās mēģenēs, izņemot 1., ielej 0,25 ml fizioloģiskā šķīduma, ja reakcija notiek 0,5 ml tilpumā, un 0,5 ml, ja reakcija notiek 1 tilpumā. ml. Ielejiet 0,25 (0,5) ml galvenā atšķaidījuma 1. un 2. mēģenē, no 2. mēģenes, izgrieztajā tilpumā un vaislas s-k un palielināts 2 reizes, 0,25 (0,5) ml tiek pārnests uz 3., no 3. uz 4. utt. uz pēdējo, no griezuma visam ielej 0,25 (0,5) ml, lai līdzsvarotu apjomus. Katru atšķaidīšanu veic, izmantojot atsevišķu pipeti. Ja eksperimentā tiek ņemti vairāki diagnostikas materiāli, tad katram no tiem tiek sagatavota sava atšķaidījumu sērija tādā pašā veidā. Katram mēģenes atšķaidījumam tiek pievienots Diagnosticum tilpumā, kas vienāds ar mēģenes tilpumu, kā rezultātā atšķaidījums katrā mēģenē tiek dubultots. Eksperiments atbilst s-ki kontrolei (0,25 - 0,5 ml s-ki galvenā atšķaidījuma un tāds pats daudzums fizioloģiskā šķīduma) un Ag kontrolei (0,25 - 0,5 ml diagnosticum un tāds pats daudzums fizioloģiskā šķīduma). Ja eksperimentā izmanto vairākas diagnostikas, tad katrai ir sava antigēna kontrole. Statīvu ar mēģenēm kārtīgi sakrata un ievieto termostatā 37°C uz 4 stundām, un pēc tam atstāj istabas temperatūrā līdz nākamajai dienai, pēc tam reģistrē PA, pamatojoties uz nosēdumu daudzumu un attīrīšanās pakāpi. šķidrums. Šo rādītāju noteikšana atkarībā no aglutinātu rakstura tiek veikta ar neapbruņotu aci uz tumša fona, aglutinoskopā vai virs mikroskopa spoguļa ieliektās virsmas. Uzskaite sākas ar vadīklām: kontrolei C jābūt caurspīdīgai, Ag jābūt vienmērīgi duļķainam (pēc mēģenes sakratīšanas). Ja kontroles ir labas, noskaidrojiet aglutinācijas esamību un pakāpi visās mēģenēs, kas apzīmētas ar plusiem: lielas nogulsnes un pilnīga šķidruma attīrīšana - 4 plusi; lielas nogulsnes un nepilnīga šķidruma notīrīšana - 3 plusi; pamanāmas nogulsnes un jūtama šķidruma attīrīšanās ir 2 plusi. Pēc tam tiek noteikts titrs: augstākais atšķaidījums ar aglutinācijas intensitāti vismaz 2 plusi. Titru izpēte s-ki tiek salīdzināti ar šīs slimības diagnostisko titru. Ja tiek pārbaudīts titrs. s-ki ir 2 reizes zemāks par diagnostisko vērtību, reakcija tiek novērtēta kā apšaubāma; ja titrs ir vienāds diagnostika - kā vāji pozitīvs; ja tas ir 2-4 reizes lielāks, tas tiek uzskatīts par pozitīvu, ja tas ir 8 vai vairāk reizes lielāks, tas tiek uzskatīts par krasi pozitīvu. Ja Ab ir plaši izplatīts veseliem cilvēkiem, RA novērtēšanai izmanto Ab titra palielināšanos. Lai noteiktu Ar veidu sērijveida RA, rindu skaitam jāatbilst identifikācijai ņemtajam numuram diagnostikas testi. No diagnostikas testa galvenā atšķaidījuma tiek sagatavota virkne secīgu divkāršu atšķaidījumu tādā pašā veidā kā RA, lai noteiktu Ab titru. Atšķaidīšanas koeficienti ir atkarīgi no aglutinācijas testa titra.Eksperimentā ir nepieciešama atšķaidījuma klātbūtne, kas vienāda ar testa titru, kā arī 2, 4, 6, 8 reizes mazāka par to. Piemēram, ja diagnostikas testa titrs ir 1 3200, tad jāizmanto atšķaidījumi 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 Testa atšķaidījumiem pievieno tādu pašu daudzumu pārbaudītā Ag, kā rezultātā tiek atšķaidīts tests palielinās 2 reizes.Eksperimentam pievieno 2 kontroles testa un Ag.Ja eksperimentā ir iesaistīti vairāki s-k,tad katram no tiem ir nepieciešama sava kontrole.Reakcijas beigās statīvu enerģiski sakrata un novieto termostatā 37 ° C. Rezultāti tiek ņemti vērā, kā aprakstīts iepriekš.Reakcijas novērtēšanai ir pazīmes.Lai izdarītu secinājumu par pētījuma atbilstību. Eksperimentā ņemts Ag, reakcijas titram jāatbilst vismaz pusei no standarta diagnostikas testa titra.Titri 1 4 un mazāk tiek uzskatīti par grupas reakciju Pilināt md RA stadija atšķiras no tilpuma ar to, ka s-ku atšķaida 1 ml tilpumā, Ag izmanto lielākā koncentrācijā (10 miljardi/ml) un pievieno 1 - 2 pilieni mēģenē Zāļu atšķaidīšana pēc Ag pievienošanas tiek uzskatīta par nemainīgu. Pretējā gadījumā iestatīšanas, reģistrēšanas un novērtēšanas metode ir līdzīga tilpuma metodei
(Avots: Mikrobioloģijas terminu vārdnīca)
Aglutinācijas reakcija.
Aglutinācijas reakcija ir mikrobu vai citu šūnu (eritrocītu) līmēšana un izgulsnēšanās antivielu ietekmē elektrolīta klātbūtnē. Reakcijas (aglutinācijas parādības) redzamā ietekme ir nogulšņu veidošanās, ko sauc par aglutinātu.
Šo reakciju izmanto serodiagnoze Un seridentifikācija. RA lieto serodiagnostikai (antivielu noteikšanai pacientu asins serumā) vēdertīfs un paratīfs(Vidāla reakcija), bruceloze(Raita reakcija) tularēmija un leptospiroze. RA izmanto seridentifikācijai (nosakot no pacienta izolētā patogēna veidu), kad zarnu infekcijas, garo klepu, holēru un utt.
Sastāvdaļasreakcijas:
1. A tigēns (aglutinogēns) - tās ir veselas (nav iznīcinātas) mikrobu vai citas šūnas ( korpuskulārs, nešķīstošs antigēns). Aglutinogēni- šī ir apturēšana dzīvs vai nogalināts mikrobu šūnas vai citas šūnas. Antigēni var būt nezināmi vai zināmi. Nezināms aglutinogēns ir no pacienta ķermeņa izolēta mikrobu kultūra, kas ir jānosaka. Zināmais antigēns - diagnostika- diagnostikas zāles - mirušo apturēšana mikrobi zināmas sugas sāls šķīdumā. Šī apturēšana duļķains (necaurspīdīgs), jo mikrobu šūnas nešķīst, bet paliek neskartas. Lai noteiktu nezināmas antivielas pacientu asins serumā, tiks izmantots zināms aglutinogēns.
2. Antivielas (aglutinīns)- atrodams asins serumā. Antivielas var būt arī nezināmas vai zināmas. Nezināmas antivielas, kas jānosaka, atrodas asins serumā slims cilvēks. Zināmas antivielas ir atrodamas imūns diagnostikas serumi kuras sauc aglutinējošie serumi. Tos izmanto sero-identifikācijai, t.i. lai noteiktu nezināmu antigēnu – mikrobu kultūras veidu.
3. Elektrolīts– 0,9% nātrija hlorīda šķīdums.
Metodes RA inscenēšanai.
1. Aptuvenais (lamelārais) RA– veikta uz stikla. Uz stikla priekšmetstikliņa uzklājiet 2 pilienus seruma un 1 pilienu izotoniskā šķīduma. Mikrobu kultūru ievada vienā no seruma pilieniem un izotoniskā šķīduma pilienu cilpā un sajauc. Izotoniskā šķīduma piliens ar mikrobiem – antigēnu kontrole, piliens serumi bez dīgļiem – antivielu kontrole, piliens serumi ar mikrobiem – pieredze. Ja serums satur antivielas, kas atbilst mikrobu antigēniem, kas ar to sajaucas, tad antivielas un antigēni specifiski saistīsies viens ar otru un pēc 1–3 minūtēm testa pilē parādīsies aglutināta pārslas. Antigēna kontrolei jābūt duļķainai, un antivielu kontrolei jābūt skaidrai. Reakcijas rezultāti tiek reģistrēti, pamatojoties uz aglutināta pārslu parādīšanos . Ja pārslas izkrīt, reakcija ir pozitīva, t.i. Antigēns atbilst antivielai, un antigēnu var izmantot, lai noteiktu antivielu vai otrādi. Ja saglabājas duļķainība, reakcija ir negatīva.
2. Detalizēta aglutinācijas reakcija - veic mēģenēs. Vispirms sagatavojiet slima cilvēka asins seruma divkāršus atšķaidījumus no 1:50 līdz 1:1600. 1 ml izotoniskā nātrija hlorīda šķīduma ielej 6 mēģenēs. Pirmajā mēģenē pievieno 1 ml pacienta asins seruma atšķaidījumā 1:50, samaisa un iegūst atšķaidījumu 1:100, pēc tam 1 ml atšķaidījuma 1:100 pārnes otrajā mēģenē. un iegūst atšķaidījumu 1:200 utt. Antigēna un seruma kontrolei tiek turētas divas mēģenes. Seruma kontrolei pievieno tikai serumu atšķaidījumā 1:50, antigēna kontrolei - tikai antigēnu. Pievienojiet 0,1 ml antigēna - diagnosticum (O- vai H-) visām pārējām mēģenēm un novietojiet visas mēģenes termostatā 37°C uz 18-20 stundām. Reakcijas rezultātus reģistrē atkarībā no veidošanās veida, nogulšņu (aglutināta) daudzuma un duļķainības pakāpes. Uzskaite tiek veikta tikai ar šādiem rezultātiem kontrolēs: seruma kontrole - caurspīdīga, antigēna kontrole - duļķaina. O-antivielas rada smalki graudainas nogulsnes. H-antivielas – rupji graudaini. Pamatojoties uz pēdējo mēģeni, kurā joprojām ir redzama aglutinācijas reakcija, tā tiek noteikta diagnostikas titrs.
Veicot slimību serodiagnostiku, ir svarīgi ne tikai noteikt specifiskas antivielas pret konkrētu patogēnu, bet arī noteikt to daudzumu, t.i. noteikt tādu antivielu titru, lai varētu runāt par šī patogēna izraisītas slimības klātbūtni. Šo titru sauc par diagnostikas titru. Piemēram, lai diagnosticētu vēdertīfu, jums ir jānosaka antivielu titrs 1:400, bet ne mazāks. Vēl precīzākus rezultātus iegūst, konstatējot antivielu pieaugumu sapārotajos serumos.Slimnieka serumu savāc slimības sākumā un pēc 3–5 un vairāk dienām. Ja antivielu titrs palielinās vismaz 4 reizes, mēs varam runāt par pašreizējo slimību.
