Reakcija aglutinacije za određivanje anti-Rhesus antitijela ( indirektna reakcija Coombs)primijeniti kod pacijenata sa intravaskularnom hemolizom. Kod nekih od ovih pacijenata detektuju se anti-Rhesus antitijela, koja su nepotpuna i monovalentna. Oni specifično stupaju u interakciju s Rh-pozitivnim eritrocitima, ali ne uzrokuju njihovu aglutinaciju. Prisustvo takvih nekompletnih antitijela utvrđuje se indirektnim Coombsovim testom. Da bi se to postiglo, antiglobulinski serum (antitijela protiv humanih imunoglobulina) dodaje se u sistem anti-Rh antitijela + Rh-pozitivni eritrociti, što uzrokuje aglutinaciju eritrocita. Koristeći Coombsovu reakciju dijagnosticiraju se patološka stanja povezana s intravaskularnom lizom eritrocita imunog porijekla, na primjer, hemolitička bolest novorođenčeta: eritrociti Rh-pozitivnog fetusa kombinuju se s nekompletnim antitijelima na Rh faktor koji cirkuliraju u krvi, a koji imaju prošla kroz placentu od Rh negativne majke.
Mehanizam. Poteškoća u identifikaciji nekompletnih (monovalentnih) antitijela nastaje zbog činjenice da ova antitijela, kada se vežu za epitope specifičnog antigena, ne formiraju rešetkastu strukturu i reakcija između antigena i antitijela nije otkrivena ni aglutinacijom, precipitacijom, ili druge testove. Za identifikaciju formiranih kompleksa antigen-antitijelo potrebno je koristiti dodatne test sisteme. Za otkrivanje nepotpunih antitijela, na primjer na Rh antigen eritrocita u krvnom serumu trudnice, reakcija se provodi u dvije faze: 1) eritrociti koji sadrže Rh antigen dodaju se u dvostruka razrjeđenja test seruma i čuvaju na 37°C sat vremena; 2) zečji anti-humani antiglobulinski serum (u prethodno titriranom radnom razblaženju) dodaje se u eritrocite koji su temeljito isprani nakon prve faze. Nakon inkubacije od 30 minuta na 37 °C, rezultati se procjenjuju prisustvom hemaglutinacije (pozitivna reakcija). Potrebno je kontrolisati sastojke reakcije: 1) antiglobulinski serum + crvena krvna zrnca za koja se zna da su senzibilizirana specifičnim antitelima; 2) eritrociti tretirani normalnim serumom + antiglobulinski serum; 3) Rh-negativni eritrociti tretirani test serumom + antiglobulinski serum.
50. Reakcija pasivne hemaglutinacije. Mehanizam. Komponente. Aplikacija.
Indirektna (pasivna) reakcija hemaglutinacije(RNGA, RPGA) temelji se na upotrebi eritrocita (ili lateksa) s antigenima ili antitijelima adsorbiranim na njihovoj površini, čija interakcija s odgovarajućim antitijelima ili antigenima krvnog seruma pacijenata uzrokuje da se eritrociti zalijepe zajedno i ispadnu na dno epruveta ili ćelija u obliku zupčastog sedimenta.
Komponente. Za izvođenje RNGA mogu se koristiti eritrociti ovaca, konja, zečeva, pilića, miševa, ljudi i drugih, koji se pohranjuju za buduću upotrebu tretiranjem formaldehidom ili glutaraldehidom. Kapacitet adsorpcije eritrocita se povećava kada se tretiraju rastvorima tanina ili hrom-hlorida.
Antigeni u RNGA mogu biti polisaharidni antigeni mikroorganizama, ekstrakti bakterijskih vakcina, antigeni virusa i rikecija, kao i druge supstance.
Crvena krvna zrnca senzibilizirana hipertenzijom nazivaju se eritrocitni dijagnostici. Za pripremu eritrocitnog dijagnostikuma najčešće se koriste ovčiji eritrociti koji imaju visoku adsorbirajuću aktivnost.
Aplikacija. RNGA se koristi za dijagnostiku infektivnih bolesti, određivanje gonadotropnog hormona u urinu pri utvrđivanju trudnoće, za identifikaciju preosjetljivosti na lijekove, hormone iu nekim drugim slučajevima.
Mehanizam. Test indirektne hemaglutinacije (IRHA) ima značajno veću osjetljivost i specifičnost od testa aglutinacije. Koristi se za identifikaciju patogena po njegovoj antigenskoj strukturi ili za indikaciju i identifikaciju bakterijskih produkata – toksina u patološkom materijalu koji se proučava. U skladu s tim, koristi se standardna (komercijalna) dijagnostika eritrocitnih antitijela koja se dobijaju adsorpcijom specifičnih antitijela na površini taniziranih (tretiranih taninom) eritrocita. Serijska razblaženja ispitivanog materijala pripremaju se u jamicama plastičnih ploča. Zatim se u svaku jažicu dodaje jednaka zapremina od 3% suspenzije crvenih krvnih zrnaca napunjenih antitijelima. Ako je potrebno, reakcija se izvodi paralelno u nekoliko redova jažica sa eritrocitima napunjenim antitijelima različitih grupnih specifičnosti.
Nakon 2 sata inkubacije na 37 °C, rezultati se uzimaju u obzir i evaluiraju izgled sediment eritrocita (bez mućkanja): s negativnom reakcijom sediment se pojavljuje u obliku kompaktnog diska ili prstena na dnu bunara, s pozitivnom reakcijom - karakterističan čipkasti sediment eritrocita, tanak film s neravnim rubovima .
Coombsov test je klinička analiza test krvi, koji se radi kako bi se otkrilo da li krv sadrži određena antitijela koja mogu biti nesigurna. Ova antitijela se lijepe za crvena krvna zrnca i mogu napasti imunološki sistem, kao i uzrokovati štetu na druge načine. U medicinskoj terminologiji, ova studija se naziva i antiglobulinski test (AGT).
Vrste Coombsovih uzoraka
Postoje dvije vrste Coombsovih testova - direktni i indirektni.
Direktni Coombsov test, također poznat kao direktni (DAT), otkriva auto-antitijela koja se vezuju za površinu crvenih krvnih zrnaca. Ova antitijela se ponekad stvaraju u tijelu zbog određenih bolesti ili prilikom uzimanja određenih lijekova, kao što su prokainamid, metildopa ili kinidin.
Ova antitijela su opasna jer ponekad uzrokuju anemiju uništavanjem crvenih krvnih stanica.
Ovaj test se ponekad naređuje za dijagnosticiranje uzroka žutice ili anemije.
Obično je Coombsova reakcija negativna.
Pozitivno za:
- hemolitička bolest novorođenčad;
- autoimuna hemoliza;
- hemolitičke transfuzijske reakcije;
- imunohemolitička anemija izazvana lijekovima.
Indirektni uzorak Coombs, također poznat kao , koristi se za otkrivanje antitijela na crvena krvna zrnca koja se nalaze u krvnom serumu (serum je bistra žuta tekućina krvi koja ostaje nakon što su crvena krvna zrnca i koagulant eliminirani).
Indirektni Coombsov test se koristi tokom transfuzije krvi kako bi se utvrdilo da li krv davaoca odgovara krvi primaoca. Ovo se zove test kompatibilnosti i pomaže u sprečavanju bilo kakve štetne reakcije na krv davaoca. Ova analiza preporučuje se i trudnicama. Neke žene imaju IgG antitijela, koja mogu proći kroz placentu u fetalnu krv i oštetiti novorođenče, uzrokujući hemolitičku bolest poznatu kao hemolitička anemija.
Procedura
Krv se uzima pomoću šprica iz vene, obično sa stražnja strana dlanu ili na pregibu lakta. Prije toga, mjesto uboda se temeljito dezinficira, a nakon uzimanja krvi stavlja se čista gaza ili vata.
Dobivena krv se pročišćava u laboratoriju i crvena krvna zrnca se odvajaju. Uzorak se zatim testira uzastopno upotrebom različitih seruma i Coombsovih reagensa, koji se kontrastiraju. Ako nema aglutinacije (skupljanja crvenih krvnih zrnaca), to znači pozitivan rezultat.
Međutim, ako je test negativan, to znači da u krvi postoje antitijela koja djeluju protiv crvenih krvnih stanica. Ovo može ukazivati razne bolesti, kao što je anemija (i prirodna i uzrokovana uzimanjem lijekova), sifilis ili infekcija mikoplazmama. Nakon dobijanja rezultata, ljekar će propisati odgovarajući tretman.
Video
Antiglobulinski princip. Antieritrocitna antitijela nekompletnog tipa i molekule komplementa (C) locirane na površini eritrocita otkrivaju se – direktnim testom – njihovom aglutinacijom u kontaktu sa životinjskim serumom koji sadrži antitijela na humani antiglobulin (antiglobulinski serum). Besplatno u serumu nepotpuna antitela otkrivaju se - indirektnim testom - spajanjem na mješavinu normalnih eritrocita grupe 0, čiji svi antigeni pripadaju poznatom Rh sistemu, a zatim se aglutiniraju pod utjecajem antiglobulinskog seruma.
Materijali, reagensi za Coombsov antiglobulinski test: epruvete 10/100 ml; graduirane pipete 1,2 ml; Pasteurove pipete; tronošci; nebrušena staklena tobogana; 8,5‰ rastvor NaCl; crvena krvna zrnca. Pacijentova crvena krvna zrnca, kao i ona koja pripadaju grupi 0, dobiće se iz svježe sakupljene krvi pomoću sredstva protiv zgrušavanja (EDTA otopina).
Crvena krvna zrnca grupe 0 trebaju biti odabrana na način da potiču od normalnih pojedinaca i da sadrže sve Rh antigeni. Mogu se čuvati do 7 dana u autolognoj plazmi na +4°C. U nedostatku crvenih krvnih zrnaca grupe 0, može se koristiti poznati antigeni mozaik, mješavina crvenih krvnih zrnaca grupe 0, Rh-pozitivnih i Rh-negativnih crvenih krvnih stanica.
Serum pacijent mora biti svježe odabran.
Antiglobulinski serum u produkciji Instituta. I. Cantacuzino, dostupan je u liofilizovanom obliku u ampulama od 1 ml. Nakon rastvaranja, čuvati serum na -20°C.
Tehnika Coombsovog antiglobulinskog testa:
A) Direktni Coombsov test: Isperite crvena krvna zrnca pacijenta 3 puta sa 8,5‰ rastvorom NaCl.
Nanijeti veliku kap razrjeđenja antiglobulinskog seruma na nekoliko staklenih pločica, a pored nje malu kap sedimenta eritrocita pacijenta; pomiješajte kapi sa uglom čaše. Ostavite pripremljeni materijal na stolu 5 minuta, a zatim ispitajte da li ima aglutinata. Kada pozitivan rezultat odrediti maksimalni titar aglutinacije.
b) Indirektni Coombsov test: eritrociti grupe 0, Rh-pozitivni i Rh-negativni, isprati 3 puta sa 8,5‰ rastvorom NaCl i izložiti pacijentovom serumu brzinom od 2 kapi eritrocita na 8-10 kapi seruma, zatim inkubirati 60 minuta na temperatura od 37°S. Nakon toga ponovo tri puta operite crvena krvna zrnca i tretirajte ih antiglobulinskim serumom, prema uputama za direktni Coombs test.
Kad dođe o hladno aktivnim antitijelima senzibilizirati crvena krvna zrnca grupe 0 na 60 minuta. na temperaturi od +4°C.
Bilješka 1) Nemojte izvoditi direktan Coombsov test na crvenim krvnim zrncima pohranjenim jedan ili nekoliko dana na +4°C ili sobnoj temperaturi, jer rezultati mogu biti lažno pozitivni zbog fiksacije nepotpunih hladno aktivnih antitijela prisutnih u normalnom serumu. 2) U slučajevima teške hiperproteinemije, operite crvena krvna zrnca 4-5 puta i provjerite odsustvo serumskih proteina u posljednjoj tekućini za pranje koristeći sulfosalicilnu kiselinu.
Mogući ostatak od 2 μg IgG/ml u sedimentu eritrocita može neutraliziraju antiglobulinski serum. Coombsov test se može izvesti i korištenjem monospecifičnih anti-IgG, -IgM, -IgA -C3 i -C4 seruma kako bi se razjasnila vrsta stanica koje se nalaze na površini crvenih krvnih zrnaca, na primjer, kod pacijenata koji boluju od autoimune hemolitičke anemija.
Nanesite 1 veliku kap seruma O(I), A(II), B(III) na tanjir ili staklo pomoću pipeta (različitih!). Nakon što zabilježite vrijeme, koristite čistu staklenu šipku ili čisti ugao staklenog stakala da sjedinite kapi seruma s kapima krvi. Određivanje traje 5 minuta, protresite ploču, zatim dodajte 1 kap fiziološkog rastvora u svaku mešavinu kapi i procenite rezultate. Bolje je da serum dolazi u 2 različite serije. Rezultati krvne grupe moraju se podudarati u obje serije seruma.
Procjena rezultata izohemaglutinacije:
ako su sva 3 seruma dala negativnu reakciju, odnosno smjesa je jednolično obojena ružičastom - to je O(I) krvna grupa;
Ako negativnu reakciju samo serum grupe A(II) je dao, a serumi O(I) i B(III) su dali pozitivnu reakciju, odnosno pojavila su se zrna - to je A(II) krvna grupa;
serum grupe B(II) je dao negativnu reakciju, a serumi grupe O(I) i A(II) su dali pozitivnu reakciju - to je B(III) krvna grupa.
izohemaglutinacija. Ako je reakcija pozitivna, u smjesi se pojavljuju sitna crvena zrnca ljepljivih crvenih krvnih zrnaca. Zrna se spajaju u veća zrna, a ova u ljuspice. Serum je gotovo bezbojan;
ako je reakcija negativna, smjesa ostaje jednolično obojena 5 minuta roze boje i nema zrna;
Pri radu sa 3 seruma grupa O(I), A(II), B(III) moguće su 4 kombinacije reakcija:
sva 3 seruma dala pozitivne reakcije- test krvi AB(IV) grupa. U ovom slučaju, studija se provodi sa serumom AB(IV) grupe.
Bilješka! Kapljice krvi koja se testira treba da budu 5-10 puta manje od kapi seruma.
Greške izohemaglutinacije.
Neizvođenje aglutinacije tamo gdje bi trebalo biti i prisustvo aglutinacije tamo gdje ne bi trebalo biti. Ovo može biti zbog slabog titra seruma plus slabe aglutinacije crvenih krvnih zrnaca.
Prisustvo aglutinacije tamo gdje je ne bi trebalo biti- Ovo je pseudoaglutinacija, kada gomile crvenih krvnih zrnaca formiraju „stupove novčića“. Protresanje ploče ili dodavanje fiziološke otopine ih uništava.
Panaglutinacija, kada serum spaja sva crvena krvna zrnca, uključujući i one svoje krvne grupe. Do 5. minute nestaju znaci aglutinacije.
Postoji i takozvana hladna panaglutinacija, kada se crvena krvna zrnca spajaju zbog niske temperature vazduha (ispod 15°C) u prostoriji.
U svim ovim slučajevima se provodi ili ponovljena reakcija, ili korištenje standardnih crvenih krvnih zrnaca.
Određivanje Rh krvi
Za određivanje Rh statusa, odnosno za otkrivanje prisustva ili odsustva antigena Rh sistema u krvi ljudi, koriste se standardni anti-Rh serumi (reagensi), različiti po specifičnosti, odnosno koji sadrže antitela na različite antigene ovog sistema. Za određivanje Rh 0 (D) antigena najčešće se koristi antirezus serum uz dodatak 10% rastvora želatine ili se koristi standardni antirezus reagens pripremljen unapred sa 33% rastvorom poliglucina. Za dobivanje preciznijih rezultata istraživanja, kao i za identifikaciju antigena drugih seroloških sistema, koristi se Coombsov test (također je vrlo osjetljiv u određivanju kompatibilnosti transfuzirane krvi). Za istraživanje se koristi izvorna krv ili krv pripremljena s nekim konzervansom. U tom slučaju krv treba isprati od konzervansa desetostrukom zapreminom izotonične otopine natrijum hlorida. Prilikom određivanja Rh statusa- Rh 0 (D) treba koristiti dva uzorka seruma ili anti-Rhesus reagensa dvije različite serije i istovremeno standardna crvena krvna zrnca dobijena iz krvi Rh-pozitivnih (Rh+) i Rh-negativnih (Rh -) pojedince treba koristiti za kontrolu. Prilikom određivanja drugih izoantigena, potrebno je koristiti kontrolna crvena krvna zrnca koja sadrže ili nemaju antigen protiv kojih su usmjerena antitijela u standardnom serumu.
Parcijalni toplotni aglutinini su najčešći tip antitijela koja mogu uzrokovati razvoj autoimune hemolitičke anemije. Ova antitela pripadaju IgG, ređe IgM, IgA.
COOMBS TEST
Coombsov test: uvod. Coombsov test je laboratorijska dijagnostička metoda zasnovana na reakciji hemaglutinacije.
Glavna metoda za dijagnosticiranje autoimune hemolitičke anemije je Coombsov test. Zasniva se na sposobnosti antitijela specifičnih za imunoglobuline (posebno IgG) ili komponente komplementa (posebno S3) da aglutiniraju eritrocite obložene IgG ili S3.
Vezivanje IgG i C3b za eritrocite uočeno je kod autoimune hemolitičke anemije i imunohemolitičke anemije izazvane lijekovima. Direktni Coombsov test. Direktni Coombsov test se koristi za otkrivanje antitijela ili komponenti komplementa fiksiranih na površini crvenih krvnih stanica. Izvodi se na sljedeći način:
Da bi se dobila antitijela na humane imunoglobuline (antiglobulinski serum) ili komplementar (antikomplementarni serum), životinja se imunizira ljudskim serumom, imunoglobulinima ili ljudskim komplementom. Serum dobiven od životinje se pročišćava od antitijela na druge proteine.
Pacijentova crvena krvna zrnca se ispiru fiziološkom otopinom kako bi se potpuno uklonio serum, koji neutralizira antitijela na imunoglobuline i komplement i može uzrokovati lažno negativan rezultat.
Ako su antitijela ili komponente komplementa fiksirane na površini crvenih krvnih stanica, dodavanje antiglobulina ili antikomplementnog seruma uzrokuje aglutinaciju crvenih krvnih stanica.
Direktni Coombsov test se koristi u sljedećim slučajevima:
Autoimuna hemoliza.
Hemolitička bolest novorođenčadi.
Imunološka hemolitička anemija uzrokovana lijekovima.
Hemolitičke transfuzijske reakcije. Indirektni Coombsov test. Indirektni Coombsov test otkriva antitijela na crvena krvna zrnca u serumu. Da bi se to postiglo, pacijentov serum se inkubira sa crvenim krvnim zrncima donora grupe 0, a zatim se izvodi direktan Coombsov test.
Indirektni Coombsov test se koristi u sljedećim slučajevima:
Određivanje individualne kompatibilnosti krvi davaoca i primaoca.
Detekcija aloantitijela, uključujući antitijela koja uzrokuju hemolitičke transfuzijske reakcije.
Određivanje površinskih eritrocitnih antigena u medicinskoj genetici i sudskoj medicini.
Potvrda identičnih blizanaca tokom transplantacije koštane srži.
Za provođenje biološkog testa krv se počinje transfuzirati što je brže moguće (po mogućnosti u mlazu). Nakon transfuzije 25 ml krvi, sistemska cijev se steže stezaljkom. Zatim sledi pauza od 3 minuta, tokom koje se prati stanje primaoca. Za izvođenje biološkog testa ubrizgava se tri puta po 25 ml krvi. Na kraju testa (nakon transfuzije prvih 75 ml krvi u frakcionim dozama od 25 ml u intervalima od 3 minute), sistem se podešava na potrebnu brzinu transfuzije. Prilikom transfuzije više od jedne boce krvi pacijentu, potrebno je izvaditi iglu iz vene. U tom slučaju, igla se izvadi iz epruvete bočice u kojoj je krv istekla i umetne se u sljedeću bočicu. Sistemska cijev (gumena ili plastična) je u ovom trenutku stegnuta stezaljkom. Ako tokom transfuzije krvi postane neophodno da se primaocu da intravenozno bilo koji drugi lijek, to se radi probijanjem gumene cijevi sistema. Probijanje plastične cijevi je neprihvatljivo, jer ne otpada. Nakon svake transfuzije krvi, pacijent se mora pratiti kako bi se identificirao i brzo eliminirao moguće komplikacije, uključujući alergijske reakcije. 2 sata nakon završetka transfuzije krvi treba izmjeriti tjelesnu temperaturu. Ako se povećava, mjerenje se mora ponavljati svakih sat vremena u naredna 4 sata. Jednako je važno praćenje mokrenja i sastava urina, što omogućava utvrđivanje prisutnosti toksične posttransfuzijske reakcije. Pojava oligurije i anurije nakon transfuzije krvi, prisustvo krvnih zrnaca i proteina u urinu direktan su pokazatelj razvoja posttransfuzijske hemolize.
Direktni Coombsov test. Ovaj test se koristi za dokazivanje prisutnosti blokirajućih antitijela fiksiranih u crvenim krvnim zrncima djeteta. Pozitivan direktni test ukazuje na senzibilizaciju i služi kao uvjerljiv znak hemolitičke bolesti novorođenčeta i prije pojave drugih kliničkih znakova. Kao izuzetak i samo u vrlo teškim slučajevima, direktan Coombsov test može biti negativan zbog već nastale, gotovo potpune hemolize senzibiliziranih crvenih krvnih stanica.
Direktni Coombsov test se izvodi na sljedeći način: 5 kapi krvi uzete iz pete djeteta stavlja se u epruvetu i dodaje se 5 ml fiziološke otopine. Dobro promiješajte i centrifugirajte 10 minuta. Bistra tečnost iznad sedimenta crvenih krvnih zrnaca se odvaja. Zatim ponovo dodajte 5 ml fiziološke otopine, promiješajte i centrifugirajte. Nakon tri puta miješanja sa fiziološkom otopinom, crvena krvna zrnca se dobro isperu. Nakon posljednjeg odvajanja supernatanta, sediment eritrocita u količini od 0,1 ml pomiješa se sa 0,9 ml fiziološkog rastvora. Nanesite 2-3 kapi ove mješavine na stakalce i dodajte jednu kap Coombs seruma. Prisustvo aglutinacije ukazuje da je reakcija pozitivna (pozitivan direktni Coombs test). Ispitivanje treba provesti na sobnoj temperaturi iznad 16° kako bi se izbjegao efekat hladnih aglutinina.
Indirektni Coombsov test služi kao dokaz prisustva slobodnih antitijela u majčinom serumu i izvodi se sa majčinim serumom.
Hemolitička bolest novorođenčeta s Rh inkompatibilnošću obično se manifestira nakon druge trudnoće. Prvo dijete se rodi zdravo, drugo sa znacima blage anemije, a tek nakon treće trudnoće rađaju se djeca sa jasni znakovi hemolitička bolest. Samo presenzibilne žene mogu roditi dijete sa simptomima hemolitičke bolesti tokom prve trudnoće. U nekim slučajevima imunizacija uzrokuje pobačaje i rađanje mrtve djece. Za početak i težinu bolesti važno je stanje posteljice i trajanje izloženosti aglutininima majke fetusu. Kada se aglutinini pojave 10-14 sedmica prije rođenja, dijete obično doživljava subkliničke oblike. Rana pojava aglutinina, 15-26 sedmica prije rođenja, uzrokuje teški oblici bolesti. U svim oblicima bolesti glavni proces je hemoliza. Posljedica reakcije antigen-antitijelo je hemoliza, oštećenje jetrenih i moždanih kapilara. U zavisnosti od toga koja lezija preovlađuje, postoje i oni raznih oblika bolesti. Opasne su i neke anafilaktičke pojave. Dovode do stvaranja supstanci sličnih histaminu, uzrokujući ozbiljna oštećenja ćelija jetre, a posebno ganglijskih ćelija bazalnih ganglija, amonovog roga, oblongata medulla pa čak i cerebralni korteks. Kada su ćelije jetre oštećene, ekstrahepatičnoj žutici se dodaje i hepatična žutica. Djeca umiru zbog teških simptoma kernikterusa. Ako prežive, simptomi lezija ostaju nervni sistem(poremećaji ekstrapiramidnog sistema sa koreoatetotičkim pokretima, osebujan plesni hod, usiljeni pokreti glave, ponekad poremećaj koordinacije voljni pokreti sa čestim padovima, pojačan ton mišići, mentalna retardacija, odnosno sa znakovima tzv. encefalopatija posticteria infantum).
