Domov Pulpitida Diagnostická aglutinační reakce. Aglutinační reakce

Pulpitida

Diagnostická aglutinační reakce. Aglutinační reakce

Aglutinační reakce je založena na specifické interakci protilátek (aglutininů) s celými mikrobiálními nebo jinými buňkami. V důsledku této interakce se tvoří aglomerované částice, které se vysrážejí (aglutinují). Na aglutinační reakci se mohou podílet bakterie, prvoci, houby, kvasinky, rickettsie, erytrocyty a další buňky, živé i usmrcené. Reakce probíhá ve dvou fázích: první je specifická kombinace antigenu a protilátky, druhá je nespecifická, tj. tvorba viditelného aglutinátu. K vysrážení aglutinátu dochází v přítomnosti elektrolytů, jako je chlorid sodný. Mikroorganismy v aglutinátu zůstávají naživu, ale ztrácejí svou pohyblivost.

Aglutinační reakce je široce používána pro sérologickou diagnostiku infekčních onemocnění a stanovení antigenní struktury izolovaných mikrobů. Ke stanovení antigenní struktury patogenu izolovaného z těla pacienta nebo nosiče se používá specifické imunitní sérum získané imunizací zvířat (králík, osel, ovce) určitými mikroorganismy. Identifikace mikroba se provádí aglutinační reakcí na skle s adsorbovanými nebo monoreceptorovými séry nebo ve zkumavkách se specifickými aglutinačními séry. Adsorbovaná séra obsahují protilátky pouze proti antigenům specifickým pro daný mikrob a monoreceptorová séra obsahují protilátky pouze proti jednomu specifickému antigenu patogenu.

Druhová séra obsahují protilátky proti všem antigenům konkrétního mikroba.

Zda izolovaná kultura mikroorganismu patří k tento druh stanoveno aglutinací se známým sérem na titr protilátek uvedený na štítku sérové ampule. Protilátkový titr séra se považuje za jeho poslední ředění, při kterém je stále pozorována aglutinace kultury mikrobů použitých k imunizaci zvířete. Adsorbovaná a monoreceptorová séra se při skleněné aglutinační reakci obvykle používají neředěná.

Při stanovení přítomnosti protilátek v krevním séru pacienta se toto ředí izotonickým roztokem chloridu sodného, počínaje ředěním 1:50 až 1:800 nebo více. Do každého ředění se přidá suspenze živých nebo usmrcených mikrobů. Přípravky obsahující mikroby usmrcené teplem nebo formaldehydem se nazývají diagnosticum. Diagnostika získaná zahříváním kultur mikroorganismů obsahují pouze somatické antigeny. Při použití pouze formaldehydu si mikrobi zachovávají své bičíkové antigeny.

V přítomnosti protilátek v krvi pacienta se při reakci odebrané diagnostické činidlo slepí a na dvou zkumavkách se vytvoří sediment (aglutinát). V tomto případě jsou výsledky aglutinační reakce považovány za pozitivní. V kontrolní zkumavce, do které se přidává izotonický roztok chloridu sodného a diagnostika, by měla být suspenze mikrobů homogenní (negativní aglutinační reakce).

Výsledky aglutinační reakce u některých onemocnění, např. leptospirózy, jsou brány v úvahu pouze mikroskopicky v tmavém zorném poli mikroskopu (mikroaglutinace). Chcete-li provést sérologickou diagnózu onemocnění, vzít v úvahu diagnostické onemocnění. Obvykle odpovídá ředění séra 1:100 nebo 1:200.

Protilátky v krevním séru pacienta lze detekovat pomocí aglutinační reakce v případech břišního tyfu a paratyfu (Vidalova reakce), brucelózy (Wrightova reakce), tularémie atd.
Castellaniho reakce. Pro některé infekční choroby nebo imunizace mikroorganismy obsahujícími skupinové antigeny, v krevním séru se kromě protilátek specifických pro daný typ objevují i skupinové protilátky. V tomto případě budou příbuzné bakteriální druhy aglutinovány výsledným sérem.

Castellani navrhl metodu adsorpce skupinových protilátek z imunitních sér, založenou na jejich odstranění pomocí mikroorganismů příbuzných druhů, které mají skupinové antigeny, ale postrádají specifické. Kultura takových mikroorganismů přidaná do séra adsorbuje nespecifické skupinové protilátky a po odstranění komplexu antigen-protilátka centrifugací zůstanou v séru pouze specifické imunoglobuliny. Séra zpracovaná Castellaniho metodou lze použít v aglutinační reakci jako vysoce specifická.

Aglutinace je slepení bakterií v důsledku interakce specifických AT s nimi. K provedení RA jsou zapotřebí tři složky: 1) AG (aglutinogen); 2) AT (aglutinin); 3) roztok elektrolytu (izotonický roztok chloridu sodného). Aglutinační reakce se účastní pouze korpuskulární antigeny (bakterie, červené krvinky, latexové částice s antigenem).

Aglutinační reakce na skle. Pomocí pipety kápněte kapku na podložní sklíčko bez tuku. diagnostické sérum(ředění séra 1:10 - 1:20). Pomocí bakteriologické kličky se z povrchu šikmého agaru odebere čistá kultura zkoumaného mikroorganismu, přenese se do kapky séra a promíchá. Výsledek reakce se vezme v úvahu pouhým okem po 3-5 minutách. Pokud je reakce pozitivní, objeví se v kapce séra vzhled vloček (velkých nebo malých), které jsou po protřepání sklíčka jasně viditelné na tmavém pozadí. V případě negativní reakce zůstává kapalina rovnoměrně zakalená.

Aglutinační reakce ve zkumavkách. Do řady zkumavek se přidá 1 ml fyziologického roztoku. Do první zkumavky se přidá stejný objem testovaného krevního séra. Připraví se sériová dvojnásobná ředění séra (titrace séra), načež se do každé zkumavky přidají 2 kapky suspenze inaktivovaných bakterií (diagnosticum). Zkumavky se umístí na 2 hodiny do termostatu při 37 °C. Reakce probíhá za vzniku malých vloček, pouhým okem neviditelných, proto jsou výsledky zaznamenávány pod mírným zvětšením ve speciálním přístroji - aglutinoskopu. Intenzita aglutinace se bere v úvahu podle systému „čtyři plus“: úplná aglutinace - 4+, částečná aglutinace - 3+ nebo 2+, sporný výsledek - +. Poslední ředění, ve kterém je pozorována aglutinace 2+, se bere jako titr protilátek v testovaném séru.

Aglutinační reakce ve zkumavkách (rozsáhlá aglutinační reakce) se provádí za účelem stanovení titru protilátek proti původcům břišního tyfu a paratyfu (Vidalova reakce), brucelózy (Wrightova reakce) a tyfu (Weiglova reakce).

Aglutinace (z lat. aglutinatio - lepení) je lepení (spojování) korpuskulárních částic nesoucích antigen (celé buňky, latexové částice apod.) s molekulami specifických protilátek za přítomnosti elektrolytů, které končí tvorbou vloček nebo sedimentu. (aglutinovat) viditelné pouhým okem. Povaha sedimentu závisí na povaze antigenu: bičíkaté bakterie produkují hrubý vločkovitý sediment, bičíkovité a nekapsulární bakterie produkují jemnozrnný sediment a kapsulární bakterie produkují vláknitý sediment. Rozlišuje se přímá aglutinace, kdy se na interakci se specifickými protilátkami přímo podílejí vlastní antigeny bakteriální nebo jakékoli jiné buňky, např. erytrocytů; a nepřímé nebo pasivní, ve kterých bakteriální buňky nebo erytrocyty nebo latexové částice nejsou vlastními nosiči, ale cizími antigeny (nebo protilátkami), které jsou na nich sorbovány, aby se identifikovaly protilátky (nebo antigeny) pro ně specifické. Aglutinační reakce se týká především protilátek třídy IgG a IgM. Probíhá ve dvou fázích: zaprvé dochází ke specifické interakci aktivního centra protilátek s determinantou antigenu; tato fáze může nastat v nepřítomnosti elektrolytů a není doprovázena viditelné změny reagující systém. Pro druhý stupeň - tvorbu aglutinátu - je nutná přítomnost elektrolytů, které redukují elektrický náboj komplexy antigen + protilátka a urychlují proces jejich lepení. Tato fáze končí tvorbou aglutinátu.

Aglutinační reakce se provádějí buď na skleněných nebo hladkých kartonových deskách, nebo ve sterilních aglutinačních zkumavkách. Obvykle se používají aglutinační reakce (přímé a pasivní) na skle zrychlená metoda detekci specifických protilátek v séru pacienta (například s brucelózou) nebo pro sérologickou identifikaci patogenu. V druhém případě se obvykle používají dobře purifikovaná (adsorbovaná) diagnostická séra obsahující pouze monoreceptorové protilátky nebo jejich sadu na různé antigeny. Nespornou výhodou aglutinační reakce na skle je jednoduchost její realizace a skutečnost, že trvá několik minut nebo dokonce sekund, protože obě složky jsou použity v koncentrované formě. Má však pouze kvalitativní hodnotu a je méně citlivý než zkumavka. Rozsáhlá aglutinační reakce ve zkumavkách poskytuje přesnější výsledky, protože umožňuje stanovit kvantitativní obsah protilátek v séru (stanovit jeho titr) a v případě potřeby zaregistrovat skutečnost zvýšení titru protilátek, což má diagnostickou hodnotu . K nastavení reakce se přidá sérum naředěné určitým způsobem 0,85% roztokem NaCl a stejný objem (obvykle 0,5 ml) suspenze standardního diagnostika (nebo testovací kultury) obsahující 1 miliardu bakterií v 1 ml. aglutinační trubice. Výsledky aglutinační reakce se zaznamenávají nejprve po 2 hodinách inkubace zkumavek při 37 °C a nakonec po 20-24 hodinách podle dvou kritérií: přítomnost a velikost precipitátu a stupeň průhlednosti kapaliny nad usazeninou. Hodnocení se provádí systémem čtyř křížů. Reakce je nezbytně doprovázena kontrolou séra a antigenu. V případech, kdy se provádí podrobná aglutinační reakce ve zkumavce za účelem sérologické identifikace patogena, má diagnostickou hodnotu, pokud je reakce hodnocena jako pozitivní při naředění diagnostického séra alespoň na polovinu jeho titru.

Je třeba vzít v úvahu, že při míchání roztoků homologních antigenů a protilátek nejsou vždy pozorovány viditelné projevy aglutinační reakce. Sraženina se tvoří pouze při určitých optimálních poměrech obou reakčních složek. Mimo tyto limity není při významném přebytku antigenu nebo protilátek pozorována žádná reakce. Tento jev se nazývá „prozónový fenomén“. Je pozorován jak při aglutinační reakci, tak při srážecí reakci. Výskyt prozóny v imunitních reakcích se vysvětluje skutečností, že antigeny, které se na nich podílejí, jsou zpravidla polydeterminantní a molekuly IgG protilátky mají dvě aktivní centra. Při přebytku protilátek je povrch každé částice antigenu pokryt molekulami protilátky, takže nezůstávají žádné volné determinantní skupiny, takže druhé, nenavázané aktivní centrum protilátek nemůže interagovat s jinou částicí antigenu a vázat je na sebe. Tvoření viditelného aglutinátu nebo precipitátu je potlačeno i při nadbytku antigenu, kdy protilátek nezůstane jediné volné aktivní centrum, a proto se komplexy antigen + protilátka + antigen již nemohou zvětšovat.

Možnosti urychlených aglutinačních reakcí. Reakce pasivní hemaglutinace a její varianty

Klasická aglutinační reakce zahrnuje použití korpuskulárních antigenů. Mohou však být zahrnuty také rozpustné antigeny. Aby to bylo možné, jsou takové antigeny adsorbovány na imunologicky inertních částicích. Jako nosič lze použít částice latexu nebo bentonitu, v současnosti se však nejčastěji používají zvířecí nebo lidské erytrocyty, které zlepšují své adsorpční vlastnosti ošetřením roztoky taninu, formalínu nebo benzidinu. Červené krvinky, které na sebe adsorbovaly antigen, se nazývají senzibilizované tímto antigenem a imunitní reakce na které se podílejí, je nepřímá nebo pasivní hemaglutinační reakce (IRHA, nebo RPHA), protože červené krvinky se jí účastní pasivně.

RPGA je umístěn ve speciálních polystyrénových deskách s otvory s polokulovým dnem. Při použití pro sérologické diagnostiky V těchto jamkách se připraví dvojnásobné ředění testovaného séra ve fyziologickém roztoku a poté se do něj přidá suspenze senzibilizovaných erytrocytů jako diagnostické činidlo. Výsledky se zaznamenávají po 2 hodinách inkubace při 37 °C za použití systému čtyř křížů. Při pozitivní reakci se aglutinované červené krvinky usadí na dně jamky a rovnoměrně ji pokrývají ve formě obráceného deštníku. Na negativní reakcečervené krvinky se také usazují, kapalina se stává průhlednou, sediment vypadá jako malý „kotouč“ uprostřed otvoru. Sérový titr v RPHA je považován za jeho poslední ředění, které stále poskytuje výraznou hemaglutinaci bez výrazných známek přítomnosti „disku“.

RPGA lze také použít jako zrychlenou metodu bakteriologické diagnostiky k detekci přímo v testovaném materiálu neznámé bakterie, viry, toxiny, například patogeny moru, stafylokokové enterotoxiny atd. U této verze RPGA se erytrocyty, které se adsorbovaly, známé svými specificity se používají jako známá složka reakce protilátky - protilátka erythrocyte diagnosticum. Pokud testovaný materiál obsahuje dostatečné množství známého antigenu, bude RPGA pozitivní.

Možnosti použití RPHA jsou: reakce neutralizace antigenu (RNAg), reakce neutralizace protilátky (RNAb), reakce pasivní inhibice hemaglutinace (PHA). K těmto reakcím se využívá antigenní a protilátková erytrocytární diagnostika. Současně lze použít dvě vzájemně se ovládající jednosměrné reakce, např. RPHA s antigenním diagnostikem a RNAg s protilátkovým erytrocytárním diagnostikem.

Protilátková neutralizační reakce (RNAb) spočívá v smíchání suspenze obsahující požadovaný antigen se specifickým imunitním sérem obsahujícím známé protilátky ve vhodných objemech a inkubaci při 37 °C po dobu dvou hodin. Poté se přidá antigenní erytrocytární diagnosticum. Směs se protřepe a nechá se při teplotě místnosti. Výsledky se berou v úvahu po 3-4 hodinách a nakonec po 18-24 hodinách.Pokud testovaný materiál obsahuje antigen, naváže protilátky (neutralizuje je), a proto nedojde k hemaglutinaci.

Antigenneutralizační reakce (RNAg) se provádí na stejném principu. Pouze v tomto případě jsou v testovaném materiálu detekovány protilátky. Specifický antigen přidaný k takovému testovanému materiálu se naváže na protilátky v něm obsažené, tj. dojde k neutralizaci antigenu protilátkami, a proto při přidání protilátky pro diagnostiku erytrocytů nedojde k hemaglutinaci.

Koaglutinační reakce. Je to jedna z možností pasivní, tedy zrychlené aglutinační reakce na skle zprostředkované buňkami nesoucími protilátky. Tato reakce je založena na jedinečné vlastnosti Staphylococcus aureus, který ve své buněčné stěně obsahuje protein A, se váže na Fc fragmenty IgG a IgM. V tomto případě aktivní centra protilátek zůstávají volná a mohou interagovat se specifickými determinantami antigenů. Na podložní sklíčko se nanese kapka 2% suspenze stafylokoků senzibilizovaných vhodnými protilátkami a přidá se kapka suspenze studovaných bakterií. Pokud se antigen shoduje s protilátkami, dojde během 30-60 s k jasné aglutinaci stafylokoků nabitých protilátkami.

Latexová aglutinační reakce (LAR). Nosičem protilátek v tomto diagnostickém systému jsou malé standardní latexové částice. Reakce se provádí pomocí mikrometody v jamkách na skle. Hlavní podmínkou úspěšného stagingu PAH je důsledné dodržování kvantitativních poměrů složek systému: do 50 μl testovaného materiálu se přidá 10 μl latexového přípravku senzibilizovaného protilátkami. Specifičnost PAH je kontrolována pomocí tří kontrolních testů obsažených v komerčních testovacích systémech: známé pozitivní reakce, zjevně negativní reakce a kontrola kvality latexové suspenze pro PAH-nesenzibilizované (nenesoucí protilátky) latexy s testovaným materiálem. U nás se jako nosiče specifických protilátek používají polystyrenové monodisperzní latexy s různými průměry částic (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). LAG se používá pro rychlou detekci mikroorganismů nebo jejich antigenů v testovaném materiálu.

Imunomagnetická detekce antigenů. Jedna z možností zrychlené aglutinační reakce na skle je spojena s použitím supermagnetických polymerních částic potažených specifickými protilátkami. Jedna taková částice váže až 107-108 buněk mikroorganismů, díky čemuž je citlivost tato metoda dosahuje 5 CFU/ml. Imunomagnetickou detekci mikroorganismů lze použít v kombinaci s KPR.

Agregátní hemaglutinační reakce (AHA). Umožňuje rychle detekovat v krvi pacientů jak volně cirkulující antigeny (antigenemie), tak antigeny spojené s protilátkami – cirkulující imunitní komplexy (CIC). U RAHA se používají červené krvinky senzibilizované vhodnými protilátkami. Přídavek krevního séra pacienta, které obsahuje antigeny, k senzibilizovaným erytrocytům, na kterých jsou fixovány protilátky, vede ke slepení (aglutinaci) erytrocytů a imunitních komplexů.

Antiglobulinový Coombsův test (R. Coombsova reakce). Plné (divalentní) protilátky se stanoví pomocí přímých a pasivních aglutinačních reakcí. Nekompletní (monovalentní, blokující) protilátky se těmito metodami nedetekují, protože když se spojí s antigenem, blokují jej, ale nemohou způsobit agregaci antigenu do velkých konglomerátů. Neúplné (blokující) protilátky jsou takové, ve kterých funguje pouze jedno aktivní centrum; druhé aktivní centrum z neznámého důvodu nefunguje. K detekci nekompletních protilátek se používá speciální Coombsova reakce (obr. 72). Reakce zahrnuje: sérum pacienta, ve kterém jsou stanoveny neúplné protilátky, korpuskulární antigen-diagnostika, antiglobulinové sérum obsahující protilátky proti lidskému globulinu. Reakce probíhá ve dvou fázích:

Interakce antigenu s nekompletními protilátkami. Nejsou žádné viditelné projevy. První fáze je dokončena promytím antigenu ze zbývajícího séra pacienta.

Interakce antiglobulinového séra získaného jako výsledek imunizace zvířete lidským globulinem s nekompletními protilátkami adsorbovanými na antigen. Vzhledem k tomu, že antiglobulinové protilátky jsou bivalentní, vážou dvě monovalentní protilátky samostatných AG + komplexů nekompletní protilátka, což vede k jejich slepení a vzniku viditelného sedimentu.

Aglutinace je slepení a vysrážení mikrobů nebo jiných buněk vlivem protilátek v přítomnosti elektrolytu (izotonický roztok chloridu sodného). Skupiny slepených bakterií (buněk) se nazývají aglutináty. Pro aglutinační reakci jsou zapotřebí následující složky:

1. Protilátky (aglutininy), které se nacházejí v séru nemocného nebo imunního zvířete.

2. Antigen – suspenze živých nebo usmrcených mikrobů, červených krvinek nebo jiných buněk.

3. Izotonický (0,9%) roztok chloridu sodného.

Pro sérodiagnostiku se používá aglutinační test břišní tyfus a paratyfus (Vidalova reakce), brucelóza (Wrightova a Heddlesonova reakce), tularémie atd. Protilátka je pacientovo sérum a antigen je známý mikrob. Při identifikaci mikrobů nebo jiných buněk se jako antigen používá jejich suspenze a jako protilátka známé imunitní sérum. Tato reakce je široce používána pro diagnostiku střevní infekce, černý kašel atd.

Metody stagingu RA

Přibližná RA na skle

Nasazený RA

(objemová metoda)

Koaglutinační reakce

Rozložená RA na skle (seroidentifikace)

Aglutinační reakce na skle. Na podložní sklíčko bez tuku se aplikují dvě kapky specifického (adsorbovaného) séra a kapka izotonického roztoku chloridu sodného. Neadsorbovaná séra jsou předředěna v poměru 1:5 - 1:100. Kapky musí být aplikovány na sklo tak, aby mezi nimi byla vzdálenost. Kultura se důkladně rozemele na skle pomocí kličky nebo pipety a poté se přidá ke kapce izotonického roztoku chloridu sodného a jedné z kapek séra, přičemž se každá z nich míchá, dokud se nevytvoří homogenní suspenze. Kapka séra bez kultury je kontrola séra.

Pozornost! Kulturu ze séra nemůžete přenést do kapky izotonického roztoku chloridu sodného, který slouží jako kontrola antigenu. Reakce probíhá při teplotě místnosti po dobu 1-3 minut. Pokud kontrola séra zůstane průhledná, u antigenové kontroly je pozorován stejnoměrný zákal a v kapce, kde se kultura smíchá se sérem na pozadí čiré kapaliny, se objeví aglutinační vločky, je výsledek reakce považován za pozitivní.

Diagnostické Fyziologické

sérum + kultivační roztok + kultura

Detailní aglutinační reakce (objemová metoda). Připravují se sériová, nejčastěji dvojnásobná, ředění séra. Metoda se nazývá volumetrická. Pro stanovení titru protilátek v krevním séru vezměte 6 zkumavek. Do první zkumavky nalijte 1 ml původního ředění séra 1:50 a pomocí odměrné pipety přidejte 1 ml fyziologického roztoku do všech 6 zkumavek. První zkumavka poskytne ředění séra 1:100 o objemu 2 ml. Přeneste 1 ml z první zkumavky do druhé zkumavky, kde je ředění 1:200. Proveďte tedy sérii sériových ředění séra v prvních 5 zkumavkách (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Z páté zkumavky nalijte 1 ml do dezinfekčního roztoku. Přidejte 2 kapky diagnostica do všech 6 zkumavek. Šestá zkumavka je kultivační kontrola, protože obsahuje pouze fyziologický roztok a diagnostikum.

Taková kontrola je nezbytná k vyloučení spontánní aglutinace kultury. Zkumavky se protřepou a umístí na 2 hodiny do termostatu při teplotě 37 °C a poté se nechají jeden den při teplotě místnosti, načež se zaznamenají výsledky aglutinační reakce. Při provádění aglutinační reakce se séry dětí v prvních měsících života je z důvodu funkční méněcennosti tvorby protilátek nutné identifikovat nižší titry protilátek, což je zohledněno při ředění séra. Počáteční ředění séra je 1:25. V první zkumavce se získá ředění 1:50, poté 1:100 atd.

Na pozitivní výsledek reakce ve zkumavkách, lepkavé buňky ve formě zrnek nebo vloček jsou viditelné na pozadí čiré kapaliny. Aglutinát se postupně usadí na dně ve formě „deštníku“ a kapalina nad sedimentem se vyjasní. Antigenová kontrola je rovnoměrně zakalená.

Podle charakteru sedimentu se rozlišuje jemnozrnná a hrubozrnná (vločková) aglutinace. Při práci s O-sérami se dosáhne jemnozrnné aglutinace. Hrubozrnný - když pohybliví mikrobi interagují s bičíkovými H-séry. Vzniká rychleji než jemnozrnný a vzniklý sediment je velmi sypký a snadno se rozbije.

Intenzita reakce je vyjádřena takto:

Všechny buňky se usadily, kapalina ve zkumavce je zcela průhledná. Výsledek reakce je ostře pozitivní;

Je méně sedimentu, nedochází k úplnému vyčeření kapaliny. Výsledek reakce je pozitivní;

Usazenin je ještě méně, kapalina je kalnější. Výsledek reakce je pochybný;

Na dně zkumavky je mírný sediment, kapalina je zakalená. Pochybný výsledek reakce;

Není zde žádný sediment, kapalina je rovnoměrně zakalená, jako u kontroly antigenu. Výsledek negativní reakce

Aglutinační reakce Aglutinační reakce

(RA) - metoda identifikace a kvantifikace Ag a At, na základě jejich schopnosti tvořit aglomeráty viditelné pouhým okem. Na oddělení infekčních nemocí. onemocnění nebo pro jiné účely se používá k identifikaci neznámých mikrobů a buněk, ke stanovení přítomnosti a množství Ab v krvi a jiných tekutinách. Princip stanovení je založen na specifičnosti interakce mezi Ag a Ab a spočívá v nalezení známého od neznámého. Existuje mnoho možností pro RA: kvantitativní a kvalitativní, zkumavky a skleněné, objemové a kapkové, konvenční, zrychlené a expresní metody. Pro fázi RA potřebujete: 1) s-ka krev. Ve variantě s určením typu (var) bakterií jsou použity průmyslové aglutinační testy vyrobené imunizací králíků. Ve variantě s určením typu Ab je z testu odebrán vzorek krve. lidí nebo zvířat. Roztok musí být sterilní a bez suspendovaných částic. Připravte základní ředění ve fyziologickém roztoku. Měl by být 2-4krát nižší než diagnostický titr pro toto onemocnění; 2) Ag. Ve verzi reakce s určením typu Ab se používají průmyslové diagnostické soupravy; ve variantě se stanovením Ag se diagnostika připravují sama ve formě suspenze 1-3 miliardy ve fyziologickém roztoku 18-20hodinového agarového (méně často bujónového) testu. mikrob inaktivovaný zahříváním ve vodní lázni při 70 °C po dobu 1 hodiny nebo 24hodinovou inkubací při 37 °C s formaldehydem (konečná koncentrace 0,2 %); 3) elektrolyt ve formě solného roztoku. Inscenační technika objemová sériová trubice RA pro stanovení titru Ab v s-ki: z hlavního ředění s-ki se připraví několik řad pracovních ředění. Počet řádků závisí na počtu diagnostických vyšetření v experimentu, počet a diluční faktory jsou určeny diagnostickým titrem suspektního onemocnění. Série musí obsahovat alespoň ředění odpovídající diagnostickému titru Ab, dvě ředění pod ním a dvě ředění nad ním. je-li například diagnostický titr 1:100, pak s volumetrickou metodou stagingu RA by měly být připraveny následující ředění: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; s kapáním metoda, první ředění (1:25) není potřeba, ale je potřeba další vyšší ředění - 1:800. vědecký výzkum s-ku se titruje do negativní reakce. Ředí se následovně: 0,25 ml fyziologického roztoku se nalije do všech zkumavek kromě 1., kdy se reakce provádí v objemu 0,5 ml, a 0,5 ml, pokud se reakce provádí v objemu 1. ml. Nalijte 0,25 (0,5) ml hlavního ředění do 1. a 2. zkumavky, z 2. zkumavky, do odříznutého objemu a chovný s-k a zvýšené 2x se převede 0,25 (0,5) ml na 3., z 3. na 4. atd. do posledního se z odřezku do všeho nalije 0,25 (0,5) ml, aby se vyrovnaly objemy. Každé ředění se provádí pomocí samostatné pipety. Pokud se do experimentu vezme několik diagnostik, pak se pro každé z nich připraví jeho vlastní série ředění stejným způsobem. Diagnosticum se přidává do každého ředění zkumavky v objemu rovném objemu zkumavky, v důsledku čehož se ředění v každé zkumavce zdvojnásobí. Experiment odpovídá kontrole s-ki (0,25 - 0,5 ml hlavního ředění s-ki a stejné množství fyziologického roztoku) a kontrole Ag (0,25 - 0,5 ml diagnostika a stejné množství fyziologického roztoku). Pokud je v experimentu použito několik diagnostických prostředků, pak má každý svou vlastní antigenní kontrolu. Stojan se zkumavkami se dobře protřepe a umístí na 4 hodiny do termostatu při 37 °C a poté se nechá při pokojové teplotě do druhého dne, poté se zaznamená PA na základě množství sedimentu a stupně vyjasnění. kapalina. Stanovení těchto indikátorů v závislosti na povaze aglutinátů se provádí pouhým okem na tmavém pozadí, v aglutinoskopu nebo přes konkávní povrch zrcátka mikroskopu. Počítání začíná kontrolami: kontrola C by měla být průhledná, Ag by mělo být rovnoměrně zakalené (po protřepání zkumavky). Pokud jsou kontroly dobré, zjistěte přítomnost a stupeň aglutinace ve všech zkumavkách, které jsou označeny plusy: velký sediment a úplné vyčeření kapaliny - 4 plusy; velký sediment a neúplné čištění kapaliny - 3 plusy; znatelný sediment a znatelné čištění kapaliny jsou 2 plusy. Poté se stanoví titr: nejvyšší ředění s intenzitou aglutinace alespoň 2 plusy. Výzkum titru s-ki jsou porovnány s diagnostickým titrem pro toto onemocnění. Pokud se vyšetřuje titr. s-ki je 2x nižší než diagnostická hodnota, reakce je hodnocena jako pochybná; pokud je titr stejný diagnostika - jak slabě pozitivní; je-li 2-4krát vyšší, považuje se za kladný, je-li 8krát a vícekrát vyšší, považuje se za ostře pozitivní. S rozšířenou distribucí Ab zdravých lidí K posouzení RA se používá zvýšení titru Ab. Pro určení typu Ar v sériovém RA musí počet řádků odpovídat počtu použitému pro identifikaci diagnostické testy. Z hlavního ředění diagnostického testu se připraví série po sobě jdoucích dvojnásobných ředění stejným způsobem jako u RA pro stanovení titru Ab. Faktory ředění závisí na titru aglutinačního testu.V experimentu je nutná přítomnost ředění rovného titru testu a také 2, 4, 6, 8 krát nižšího než je. titr diagnostického testu je 1 3200, pak byste měli použít ředění 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 Stejný objem testovaného Ag se přidá do ředění testu, výsledkem je ředění test se zvýší 2krát.Do experimentu se přidají 2 kontroly testu a Ag. Pokud je v experimentu zapojeno několik s-k, pak každý z nich potřebuje svou kontrolu Po dokončení reakce se stojanem silně zatřese a umístí v termostatu při 37 ° C. Výsledky se berou v úvahu, jak je popsáno výše.. Hodnocení reakce má vlastnosti Aby bylo možné vyvodit závěr o souladu studie. Ag vzatý do experimentu musí titr reakce odpovídat alespoň polovině titru standardního diagnostického testu Titry 1 4 a nižší jsou považovány za skupinovou reakci Kapat md staging RA se od volumetrického liší tím, že s-ku se ředí v objemu 1 ml, Ag se používá ve vyšší koncentraci (10 miliard/ml) a přidává se 1 - 2 kapky do zkumavky Ředění léčiva po přidání Ag se považuje za nezměněné Jinak je způsob nastavení, zaznamenávání a vyhodnocení obdobný jako u objemové metody

(Zdroj: Slovník pojmů mikrobiologie)

Aglutinační reakce (z lat. aglutinatio- lepení) - lepení tělísek (bakterií, červených krvinek atd.) protilátkami za přítomnosti elektrolytů.

Aglutinační reakce se projevuje ve formě vloček nebo sedimentu složených z tělísek (např. bakterií) „slepených“ protilátkami (obr. 7.37). Aglutinační reakce se používá k: stanovení patogenu izolovaného z pacienta; stanovení protilátek v krevním séru pacienta; stanovení krevních skupin.

Rýže. 7,37 a, b. Aglutinační reakce sIgM-protilátky (a) aIgG- protilátky (b)

1. Stanovení patogenu izolovaného od pacienta Přibližná reakce aglutinace na skle (obr. 7.38). Suspenze bakterií izolovaných z pacienta se přidá ke kapce aglutinačního séra (ředění 1:20). Vytvoří se vločkovitá sraženina.

Rýže. 7.38.

Rozsáhlá aglutinační reakce s patogenem izolovaným z pacienta (obr. 7.39). Suspenze bakterií izolovaných z pacienta se přidá k ředěním aglutinačního séra.

Rýže. 52

2. Stanovení protilátek v krevním séru pacienta
Detailní aglutinační reakce s krevním sérem pacienta (obr. 7.39). Diagnosticum se přidává k ředěním pacientova séra.
- Aglutinace s O-diagnosticum (bakterie usmrcená teplem, zadržující O-antigen) probíhá ve formě jemnozrnné aglutinace.
- Aglutinace pomocí H-diagnosticum (bakterie usmrcené formaldehydem, zadržující bičíkový H-antigen) je velká a probíhá rychleji.
3. Aglutinační reakce pro stanovení krevních skupin Aglutinační reakce ke stanovení krevních skupin slouží k založení ABO systému (tab. b) pomocí aglutinace erytrocytů imunitními sérovými protilátkami proti antigenům krevních skupin A (I), B (III). Kontrolou je: sérum, které neobsahuje protilátky, tzn. krevní skupina AB (IV) v séru; antigeny obsažené v červených krvinkách skupin A (II), B (III). Negativní kontrola neobsahuje antigeny, tj. jsou použity erytrocyty skupiny O (I).

Tabulka 7.6. Stanovení krevních skupin ABO