Kryteriami działania przeciwdrobnoustrojowego leku są minimalne stężenie hamujące(MIC) i minimalne stężenie bakteriobójcze(MBK). MIC to najniższe stężenie antybiotyków, które całkowicie hamuje in vitro widoczny wzrost bakterii. Wyraża się ją w mg/l lub μg/ml. MBC to najniższe stężenie antybiotyku wywołujące działanie bakteriobójcze. Aby to określić, należy zaszczepić probówki, w których wizualnie nie widać wzrostu, na gęsty agar odżywczy niezawierający antybiotyku. Wskaźnik ten ma dużą znaczenie kliniczne. W oparciu o metodę seryjnych rozcieńczeń stworzono mikrometody polegające na zastosowaniu mniejszej objętości pożywki. Obecnie do prowadzenia tego typu badań produkowane są liczne komercyjne zestawy, składające się z suszonych, stabilizowanych rozcieńczeń antybiotyków w pożywce, które rozcieńcza się zawiesiną badanego drobnoustroju. Zestawy te można przechowywać w normalne warunki eliminując tym samym konieczność przygotowywania rozcieńczeń pożywki i antybiotyków w laboratorium. Testy mikrorozcieńczeń mają także tę zaletę, że można je włączyć do zautomatyzowanego systemu.
Na podstawie uzyskanych danych (średnica strefy zahamowania wzrostu lub wartość MIC) mikroorganizmy dzieli się na wrażliwe, średnio oporne i oporne. Do rozróżnienia tych kategorii stosuje się tzw. stężenia graniczne antybiotyków, które nie są wartościami stałymi. Są one korygowane w miarę zmiany wrażliwości populacji drobnoustrojów. Opracowaniem i weryfikacją kryteriów interpretacji zajmują się czołowi specjaliści (chemioterapeuci, mikrobiolodzy) będący członkami specjalnych komisji. Jednym z nich jest Krajowy Komitet ds. Standardów Laboratoriów Klinicznych ( N krajowy C komisarz C liniowy L laboratorium S tandards – NCCLS), organizowanego w USA. Obecnie standardy NCCLS są stosowane jako standardy międzynarodowe do oceny wyników oznaczania wrażliwości bakterii podczas wieloośrodkowych badań mikrobiologicznych i studia kliniczne.
Oznaczanie wrażliwości bakterii na antybiotyki. Kryterium wrażliwości drobnoustrojów na antybiotyki jest minimalne stężenie hamujące (MIC) antybiotyku, które w standardowych warunkach doświadczalnych opóźnia wzrost patogenu.
W celu określenia lekooporności do zaszczepienia stosuje się codziennie czystą kulturę patogenu wyizolowanego z organizmu pacjenta oraz standardową pożywkę (AGV lub agar Muellera-Hintona).
Oznaczanie wrażliwości drobnoustrojów na antybiotyki przeprowadza się metodą dyfuzji krążkowej lub metodą seryjnych rozcieńczeń antybiotyku w pożywce płynnej lub stałej.
Metoda dyfuzyjna dyskowa. Oznaczanie wrażliwości na antybiotyki metodą krążka bibułowego opiera się na dyfuzji antybiotyku do pożywki. Stężenie antybiotyków w krążkach dobiera się tak, aby średnice stref zahamowania wzrostu standardowych mikroorganizmów testowych odpowiadały międzynarodowe standardy. Stężenie to odpowiada średniej dawce terapeutycznej dla standardowych szczepów mikroorganizmów.
Przygotowaną zawiesinę mikroorganizmów posiewa się na powierzchnię specjalnego podłoża (AGV lub agar Mueller-Hinton) na płytkach Petriego. Następnie za pomocą sterylnej pęsety na zaszczepioną powierzchnię umieszcza się standardowe krążki papierowe nasączone roztworami różnych antybiotyków, w jednakowej odległości od siebie, od krawędzi i od środka kubka (można również zastosować specjalne urządzenia i dozowniki). Zaszczepione szalki trzymane są w termostacie w temperaturze optymalnej dla wzrostu badanych bakterii. Jeśli bakterie są wrażliwe na ten antybiotyk, wokół krążka utworzy się strefa zahamowania wzrostu. Średnica strefy zahamowania wzrostu odpowiada stopniowi wrażliwości badanego drobnoustroju na dany antybiotyk. Wynik końcowy ocenia się za pomocą specjalnych tabel, które wskazują średnice stref zahamowania wzrostu upraw standardowych, wrażliwych, odpornych i średnio odpornych.
Metoda krążkowa nie dostarcza wiarygodnych danych przy określaniu wrażliwości drobnoustrojów na antybiotyki polipeptydowe, które słabo dyfundują do agaru (na przykład polimyksyna, rystomycyna). Metoda ta nie pozwala również na określenie minimalnego stężenia hamującego antybiotyku.
Metoda seryjnych rozcieńczeń. Ta metoda określa minimalne stężenie antybiotyk hamujący wzrost badanej kultury bakteryjnej (MIC, MIC). W tym celu należy najpierw przygotować roztwór podstawowy zawierający antybiotyk o określonym stężeniu (µg/ml lub jednostki/ml) w specjalnym rozpuszczalniku lub roztworze buforowym. Następnie z roztworu głównego przygotowuje się wszystkie kolejne rozcieńczenia w bulionie (w objętości 1 ml), po czym do każdego rozcieńczenia dodaje się 0,1 ml testowej zawiesiny bakteryjnej zawierającej 10 6 -10 7 komórek bakteryjnych w 1 ml. Do ostatniej probówki dodać 1 ml bulionu (bez antybiotyku) i 0,1 ml zawiesiny bakteryjnej (kontrola hodowli). Rośliny inkubuje się w temperaturze 37°C do następnego dnia, po czym wyniki doświadczenia stwierdza się na podstawie zmętnienia pożywki w porównaniu z kontrolą. Ostatnia probówka z przezroczystą pożywką wskazuje na opóźnienie wzrostu badanej kultury bakteryjnej, pod wpływem minimalnego stężenia hamującego (hamującego) (MIC, MIC) zawartego w niej antybiotyku. Aby ocenić minimalne stężenie bakteriobójcze (MBC), wysiew przeprowadza się na pożywce stałej bez antybiotyku z probówek, bez wzrostu. Za MBC przyjmuje się minimalne stężenie antybiotyku powodujące śmierć mikroorganizmu, która charakteryzuje się brakiem wzrostu na szalkach Petriego z pożywką.
Metoda seryjnego rozcieńczania antybiotyku w podłożu agarowym. W takim przypadku możliwe jest zbadanie w jednym doświadczeniu wrażliwości kilku kultur drobnoustrojów na różne stężenia danego antybiotyku. W sterylnym podłożu agarowym przygotowuje się różne rozcieńczenia antybiotyku. W tym celu należy dodać wymaganą ilość początkowego roztworu antybiotyku, dokładnie wymieszać i rozlać do sterylnych szalek Petriego. Po stwardnieniu agaru dno kubka dzieli się od zewnątrz markerem na sektory. Każdą badaną hodowlę nanosi się za pomocą pętli bakteriologicznej na określony sektor w naczyniach o różnym stężeniu antybiotyku. Wysiew badanych kultur na szalki o różnym stężeniu antybiotyku można przeprowadzić za pomocą aplikatora, który pozwala na jednoczesne zaszczepienie 12-15 kultur na szalkę. Następnie naczynia umieszcza się w termostacie o temperaturze optymalnej dla wzrostu i rozwoju badanych bakterii. Wyniki uwzględnia się na podstawie obecności lub braku wzrostu bakterii w porównaniu ze wzrostem na podłożu na płytce kontrolnej. Bakterie uważa się za wrażliwe na antybiotyk w stężeniu, przy którym ich wzrost zostaje całkowicie zahamowany.
Metoda e-testu. Metoda ta łączy w sobie zalety metody seryjnych rozcieńczeń i metody krążkowej. Zamiast krążków stosuje się paski („linijki”) bibuły filtracyjnej nasączonej antybiotykiem, przy czym u podstawy paska stężenie antybiotyku będzie minimalne, a na „górnej” – maksymalne. Paski umieszcza się na powierzchni agaru odżywczego zaszczepionego badaną kulturą. Jeżeli bakterie są wrażliwe na działanie tego leku, wokół obszarów paska zawierających jego stężenia hamujące pojawia się elipsoidalna strefa zahamowania wzrostu. Wartość numeryczna stężenie antybiotyku u podstawy tej strefy wskazuje MIC tego antybiotyku dla danej uprawy.
DO wrażliwy Należą do nich szczepy mikroorganizmów, których wzrost zostaje zahamowany przy stężeniach leku występujących w surowicy krwi pacjenta podczas stosowania normalnych dawek antybiotyków.
DO umiarkowanie stabilny Należą do nich szczepy, których zahamowanie wzrostu wymaga stężeń powstałych w surowicy krwi po podaniu maksymalnych dawek leku.
Zrównoważony to mikroorganizmy, których wzrost nie jest hamowany przez lek w stężeniach powstałych w organizmie przy stosowaniu maksymalnych dopuszczalnych dawek.
Pytania kontrolne.
Zdefiniuj pojęcie „antybiotyki”. Główne grupy antybiotyków w zależności od sposobu przygotowania: naturalne, półsyntetyczne, syntetyczne. Wymień naukowca, który opracował teorię chemioterapii. Jakie właściwości decydują o wyborze leku do chemioterapii? Jaki jest wskaźnik chemioterapii, napisz jego wzór, jaki powinien być? Wymień pierwsze leki przeciwkrętkowe; Pierwszy lek przeciwbakteryjny i nazwisko naukowca, który go otrzymał. Jak nazywają się rosyjscy naukowcy, którzy jako pierwsi odkryli antybakteryjne właściwości zielonej pleśni? Wymień naukowca, który badał właściwości antybakteryjne pleśni Penicillium i podjął próbę wyizolowania penicyliny. Naukowcy, którzy jako pierwsi otrzymali preparaty penicyliny. Producenci antybiotyków – podaj przykłady. Klasyfikacja antybiotyków ze względu na pochodzenie, skład chemiczny zgodnie ze spektrum działania. Mechanizm działania antybiotyków: cele (miejsca zastosowania antybiotyków różne grupy). Rodzaje działania - bakteriobójcze i bakteriostatyczne; jak je oznaczyć w eksperymencie in vitro? Antybiotyki przeciwwirusowe, mechanizmy ich działania. W jakich jednostkach mierzy się aktywność antybiotyków? Warunki przechowywania antybiotyków.
Możliwe nazwanie i opisanie skutki uboczne z antybiotykoterapią. Zdefiniuj pojęcie „lekooporności drobnoustrojów”. Rodzaje lekooporności. Naturalne i nabyte (pierwotne i wtórne). Genetyczne mechanizmy lekooporności: chromosomalne i plazmidowe. Fenotypowe mechanizmy lekooporności – nazwać i scharakteryzować. Racjonalne stosowanie antybiotyków – podaj metody. Wymień leki będące inhibitorami enzymów niszczących antybiotyki. Opisać metody określania wrażliwości drobnoustrojów na antybiotyki.
Analiza zdolności bakterii do namnażania i wzrostu na podłożach zawierających malejące stężenia substancja lecznicza, pozwala określić minimalne stężenie hamujące antybiotyku (MIC), hamującą rolę bakterii in vitro (Tabela 3(vet7)). Wielkość tej dawki determinuje wybór leku, który może osiągnąć podobne stężenia in vivo i jest podstawą do porównania względnej wrażliwości organizmu na inne leki. Uważa się, że aby zapewnić skuteczność, stężenie substancji leczniczej w miejscu zakażenia powinno wynosić co najmniej równa wartości minimalne stężenie hamujące antybiotyku. Z drugiej strony, stężenia leku w osoczu na ogół muszą być wyższe, aby zapewnić odpowiednie stężenie w tkance. Jednakże nieuzasadnione zwiększanie dawek leków przeciwdrobnoustrojowych w celu uzyskania dawki minimalnej antybiotyku hamującej rozwój określonego rodzaju bakterii in vitro może prowadzić do kumulacji leku w organizmie biorcy w dawkach toksycznych.
„Krytyczny MIC” dla konkretnej substancji leczniczej to najwyższe racjonalnie bezpieczne stężenie leku, które można osiągnąć przy zastosowaniu klinicznie akceptowalnej dawki i drogi podania leku (Tabela 3(vet7)). Wartość MIC zależy od konkretnego rodzaju hodowli bakteryjnej i konkretnego rodzaju substancji leczniczej. Jednocześnie krytyczny MIC jest specyficzny dla konkretnego biorcy i konkretnej substancji leczniczej. Zatem krytyczny MIC będzie taki sam dla każdego organizmu (Tabela 3 (vet7)). Wartość stężenia krytycznego dla konkretnego organizmu może się różnić w zależności od gatunku zwierzęcia (ze względu na różnice w czułości lub wzorcach dystrybucji). medycyna) i konkretne laboratorium. Należy skontaktować się z laboratorium dostarczającym dane dotyczące metod hodowli i wrażliwości na antybiotyki w celu uzyskania wartości krytycznych stosowanych w ich badaniach.
Na podstawie danych dotyczących rozcieńczeń in vitro bakterie klasyfikuje się jako wrażliwe (S) na dany lek, jeśli wartość MIC jest znacznie niższa od wartości krytycznej tego wskaźnika. Wzrost mikroorganizmów chorobotwórczych o pośrednich (MS) lub pośrednich (IS) wartościach wrażliwości zostaje zahamowany, gdy stężenie leku zbliża się do krytycznej wartości MIC. Bakterie takie mogą powodować negatywne reakcje w organizmie pacjenta lub nie mieć na niego żadnego wpływu. Wartość MIC dla bakterii opornych (R) przekracza Krytyczna wartość dawka minimalna. Jest mało prawdopodobne, aby osiągnięto skuteczne stężenie w organizmie pacjenta takiego leku, który oddziałuje na określony mikroorganizm. W takich przypadkach może również przeważać niebezpieczeństwo kumulacji leku w toksycznych dawkach potencjalna korzyść od stosowania terapii. Krytyczna minimalna dawka antybiotyków przeciwbakteryjnych nowej generacji jest w niektórych przypadkach trudniejsza do ustalenia ze względu na przejście na profesjonalne, elastyczne oznakowanie zakresów dawek.
Leki należy tak dobierać, aby przy stosowaniu w schemacie zapobiegającym kumulacji leku w dawkach toksycznych możliwe było osiągnięcie maksymalnego stężenia leku w osoczu, znacznie wyższego od MIC. Wiele bakterii będzie wrażliwych na działanie konkretnego leku w stężeniach znacznie poniżej krytycznej dawki minimalnej. Różnica między wartością krytyczną a wartość własna Wartości MIC można wykorzystać do porównania względnej skuteczności różnych środków przeciwdrobnoustrojowych. Na przykład dla amikacyny wartość krytyczna wynosi 32 µg/ml, zatem E. coli z MIC wynoszącym 2 µg/ml jest stosunkowo bardziej wrażliwa na amikacynę niż E. coli z MIC wynoszącym 16 µg/ml. Obydwa gatunki należy uznać za wrażliwe (choć drugi gatunek można uznać za gatunek średnio wrażliwy), jednak wzrost bakterii pierwszego gatunku wydaje się być w większym stopniu zahamowany. Jeżeli ten sam gatunek E. coli o wartości MIC wynoszącej 2 µg/ml w porównaniu z amoksycyliną ma wartość MIC wynoszącą 16 µg/ml (przy wartości krytycznej wynoszącej 32 µg/ml), wówczas wzrost tego mikroorganizmu prawdopodobnie byłby łatwiej jest zapobiegać, stosując amikacynę zamiast amoksycyliny, ponieważ wartość MIC amikacyny jest bardziej odległa od jej krytycznej wartości MIC niż wartość MIC amoksycyliny.
Choć różnice pomiędzy wartościami MIC dla konkretnego gatunku bakterii i konkretnego leku (16 lub 32) mogą wydawać się dość duże (szczególnie w kontekście granicznego stężenia leku w osoczu), to taka różnica odpowiada tylko jednemu roztworowi w probówka. Jest to przykład niebezpieczeństwa przeszacowania danych wrażliwych. Jeżeli wartość MIC danego organizmu jest wystarczająco bliska wartości krytycznej, to ze względu na możliwe różnice w interpretacji, mikroorganizmowi temu można w jednym laboratorium przypisać stopień wrażliwości „S” lub „MS”, a w jednym laboratorium „R” inny, ze względu na możliwe różnice w interpretacji. Takie możliwe rozbieżności w ocenie są jednym z powodów, dla których należy unikać stosowania leków, na które dany organizm ma wrażliwość na stwardnienie rozsiane (lub wartość MIC jest bliska krytyczna), chyba że stężenie leku w miejscu zakażenia może znacznie wyższa niż wartość MIC określona w teście in vitro. Ilustrującym przykładem może być zastosowanie leków wydalanych przez nerki w celu leczenia infekcji. dróg moczowych lub stosowanie leków wydalanych z żółcią w celu leczenia infekcji dróg żółciowych. Kumulacja niektórych leków przez leukocyty (fluorochinolony, makrolidy) może również skutkować powstaniem stężeń leków w tkankach znacznie przekraczających wartość MIC (lub krytyczną wartość MIC), pomimo niższych stężeń w osoczu.
Wartość MIC bakterii może zmieniać się podczas kolejnych infekcji wywołanych bakteriami tego samego gatunku, ale może także zmieniać się w trakcie przebiegu choroby zakaźnej. Wzrost MIC może po prostu odzwierciedlać odmienne podejście do oceny testu (szczególnie jeśli różnice są wykrywane jedynie poprzez rozcieńczenie in vitro), ale może również wynikać z rozwoju oporności na konkretny lek. W takich przypadkach można zmienić przebieg terapii przeciwdrobnoustrojowej poprzez zastosowanie dodatkowego leku lub przejście na nowy, skuteczniejszy. skuteczny lek. W zakażeniach wielobakteryjnych wartość MIC konkretnego leku będzie prawdopodobnie różna dla każdej zakażającej bakterii. Uważa się, że łatwiej jest zapobiegać rozwojowi bakterii niska wartość MIC w odniesieniu do konkretnej substancji leczniczej niż wzrost mikroorganizmu o wyższej wartości MIC w stosunku do tej samej substancji leczniczej.
(MIC) - minimalne stężenie hamujące (supresyjne). - najniższe stężenie antybiotyku, które hamuje widoczny wzrost badanego drobnoustroju in vitro(w bulionie lub pożywce agarowej) w standardowych warunkach doświadczalnych i wyraża się w µg/ml (mg/l) lub jednostkach/ml.
Minimalne stężenie bakteriobójcze (MBC) - najniższe stężenie antybiotyku, jakie w badaniu in vitro powoduje śmierć 99,9% mikroorganizmów linia bazowa przez pewien okres czasu.
Wrażliwy mikroorganizm – szczep drobnoustroju, który nie posiada mechanizmów oporności na dany lek. Zatrzymuje się go na pożywce, gdy stosuje się antybiotyk w dawce terapeutycznej.
Umiarkowanie odporny drobnoustrój – szczep drobnoustroju, którego rozwój na pożywce zatrzymuje się dopiero w przypadku zastosowania największej dawki antybiotyku. Leczenie zakażeń wywołanych przez mikroorganizmy średnio oporne prowadzi się bez stosowania leków alternatywnych, stosując najwyższą (maksymalną terapeutyczną) dawkę antybiotyku.
Odporny mikroorganizm - szczep drobnoustroju posiadający mechanizmy oporności na dany lek. Jego rozwój na pożywce zatrzymuje się dopiero w przypadku zastosowania bardzo wysokich stężeń leku, których nie da się wytworzyć w organizmie ze względu na ich dużą toksyczność. Podczas leczenia infekcji wywołanych tym drobnoustrojem nie ma efektu klinicznego terapii nawet przy zastosowaniu największej dawki antybiotyku. W tym przypadku można zaobserwować skutki uboczne antybiotyk.
Wskazania do oznaczania wrażliwości drobnoustrojów na antybiotyki:
1) określenie wrażliwości na nowy zalecany do stosowania antybiotyk;
2) okresowe monitorowanie oporności na antybiotyki u osobników centra medyczne oraz w różnych regionach geograficznych w celu monitorowania rozprzestrzeniania się oporności na antybiotyki;
3) uzasadnienie właściwej antybiotykoterapii u poszczególnych pacjentów w przypadku:
a) izolacja mikroorganizmów z przede wszystkim sterylnych cieczy, narządów i tkanek ludzkich;
b) przy izolacji mikroorganizmów z biotopów przede wszystkim niesterylnych ocenę wrażliwości należy poprzedzić oceną znaczenia klinicznego izolowanego drobnoustroju;
c) zakażenia lekooporne terapia empiryczna;
d) specyficzne infekcje i brak doświadczenia w ich leczeniu;
e) infekcje wymagające długotrwałego leczenia (oporność na antybiotyki wykrywa się co tydzień terapii, ponieważ możliwa jest zmiana patogenów).
Określanie wrażliwości drobnoustrojów na antybiotyki jest niewłaściwe:
1) dla przedstawicieli normalna mikroflora ludzie odizolowani od naturalnych siedlisk;
2) dla typów drobnoustrojów, u których nie opisano form opornych na niektóre antybiotyki. Na przykład Streptococcus pyogenes jest wrażliwy na penicylinę, więc badanie wrażliwości na te leki nie jest praktyczne w rutynowej praktyce.
Spis treści tematu „Metody określania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe. Skutki uboczne antybiotykoterapia.”:Metody określania wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe. Minimalne stężenie hamujące (MIC). Metoda seryjnych rozcieńczeń w mediach płynnych.
Kryteriami działania konkretnego leku są minimalne stężenie hamujące (MIKROF) - najniższe stężenie leku hamujące wzrost kultury testowej i minimalne stężenie bakteriobójcze (MBK) - najniższe stężenie leku wywołujące działanie bakteriobójcze.
Metoda seryjnych rozcieńczeń w mediach płynnych
Metoda seryjnych rozcieńczeń w mediach płynnych pozwala na instalację minimalne stężenie hamujące (MIKROF) I minimalne stężenie bakteriobójcze (MBK) lek na izolowany patogen. Badania można wykonywać w różnych objętościach pożywki (1-10 ml). Stosować płynne pożywki, które odpowiadają potrzebom żywieniowym patogenu. W probówkach (zwykle osiem) przygotowuje się serię podwójnych rozcieńczeń leku w pożywce. Stężenie zmniejsza się odpowiednio ze 128 do 0,06 µg/ml (stężenie zasady może się różnić w zależności od aktywności leku). Końcowa objętość pożywki w każdej probówce wynosi 1 ml. Kontrolę stanowi probówka zawierająca czystą pożywkę. Do każdej probówki dodaje się 0,05 ml roztworu fizjologicznego zawierającego 106/ml komórek drobnoustrojów. Probówki inkubuje się przez 10–18 godzin w temperaturze 37°C (lub do momentu pojawienia się wzrostu bakterii w probówce kontrolnej). Po upływie określonego czasu wyniki są uwzględniane na podstawie zmian gęstości optycznej ośrodka wizualnie lub nefelometrycznie. Można także zastosować metodę zmodyfikowaną, wykorzystując pożywkę uzupełnioną glukozą i wskaźnikiem. Rozwojowi mikroorganizmów towarzyszy zmiana pH pożywki i, co za tym idzie, barwa wskaźnika.
