Dom Pulpitis Dijagnostička reakcija aglutinacije. Reakcija aglutinacije

Pulpitis

Dijagnostička reakcija aglutinacije. Reakcija aglutinacije

Reakcija aglutinacije temelji se na specifičnoj interakciji antitijela (aglutinina) s cijelim mikrobnim ili drugim stanicama. Kao rezultat ove interakcije nastaju čestice aglomerata koje se talože (aglutiniraju). U reakciji aglutinacije mogu učestvovati bakterije, protozoe, gljive, kvasac, rikecije, eritrociti i druge ćelije, kako žive tako i ubijene. Reakcija se odvija u dvije faze: prva je specifična kombinacija antigena i antitijela, druga je nespecifična, odnosno stvaranje vidljivog aglutinata. Precipitacija aglutinata se javlja u prisustvu elektrolita, kao što je natrijum hlorid. Mikroorganizmi u aglutinatu ostaju živi, ali gube svoju pokretljivost.

Reakcija aglutinacije se široko koristi za serološku dijagnostiku zaraznih bolesti i određivanje antigenske strukture izolovanih mikroba. Za određivanje antigenske strukture patogena izolovanog iz organizma pacijenta ili nosioca koristi se specifični imunološki serum koji se dobija imunizacijom životinja (zeca, magaraca, ovce) određenim mikroorganizmima. Identifikacija mikroba se provodi reakcijom aglutinacije na staklu sa adsorbiranim ili monoreceptorskim serumom ili u epruvetama sa specifičnim aglutinirajućim serumima. Adsorbirani serumi sadrže antitijela samo na antigene specifične za dati mikrob, a monoreceptorski serumi sadrže antitijela samo na jedan specifični antigen patogena.

Serumi vrsta sadrže antitijela na sve antigene određenog mikroba.

Da li izolovana kultura mikroorganizma pripada ovu vrstu određena aglutinacijom sa poznatim serumom do titra antitela naznačenog na etiketi ampule seruma. Titar antitijela seruma smatra se njegovim posljednjim razrjeđenjem, u kojem se još uvijek opaža aglutinacija kulture mikroba korištenih za imunizaciju životinje. Adsorbirani i monoreceptorski serumi se obično koriste nerazrijeđeni u reakciji staklene aglutinacije.

Prilikom određivanja prisutnosti antitijela u krvnom serumu pacijenta, razrjeđuje se izotoničnom otopinom natrijevog klorida počevši od razrjeđenja od 1:50 do 1:800 ili više. Svakom razrjeđivanju dodaje se suspenzija živih ili ubijenih mikroba. Preparati koji sadrže mikrobe ubijene toplotom ili formaldehidom nazivaju se dijagnostikumi. Dijagnostikumi dobiveni zagrijavanjem kultura mikroorganizama sadrže samo somatske antigene. Kada koriste samo formaldehid, mikrobi zadržavaju svoje flagelarne antigene.

U prisustvu antitijela u krvi pacijenta, dijagnostikum uzet u reakciji se lijepi i na dvije epruvete nastaje sediment (aglutinat). U ovom slučaju, rezultati reakcije aglutinacije smatraju se pozitivnim. U kontrolnoj epruveti, u koju se dodaju izotonični rastvor natrijum hlorida i dijagnostikum, suspenzija mikroba treba da bude homogena (negativna reakcija aglutinacije).

Rezultati reakcije aglutinacije kod nekih bolesti, kao što je leptospiroza, uzimaju se u obzir samo mikroskopski u tamnom vidnom polju mikroskopa (mikroaglutinacija). Uzmite u obzir da biste postavili serološku dijagnozu bolesti dijagnostička bolest. Obično odgovara razrjeđenju seruma od 1:100 ili 1:200.

Antitijela u krvnom serumu pacijenta mogu se otkriti reakcijom aglutinacije u slučajevima trbušnog tifusa i paratifusa (Vidalova reakcija), bruceloze (Wrightova reakcija), tularemije itd.
Kastelanijeva reakcija. Za neke zarazne bolesti ili imunizacija mikroorganizmima koji sadrže grupne antigene, u krvnom serumu, pored antitela specifičnih za datu vrstu, pojavljuju se i grupna antitela. U ovom slučaju, srodne bakterijske vrste će biti aglutinirane nastalim serumima.

Castellani je predložio metodu za adsorpciju grupnih antitela iz imunih seruma, zasnovanu na njihovom uklanjanju uz pomoć mikroorganizama srodnih vrsta koje imaju grupne antigene, ali nemaju specifične. Kultura takvih mikroorganizama dodana u serum adsorbira antitijela nespecifične grupe, a nakon uklanjanja kompleksa antigen-antitijelo centrifugiranjem, u serumu ostaju samo specifični imunoglobulini. Serumi obrađeni po Castellani metodi mogu se koristiti u reakciji aglutinacije kao visoko specifični.

Aglutinacija je spajanje bakterija kao rezultat interakcije specifičnih AT s njima. Za izvođenje RA potrebne su tri komponente: 1) AG (aglutinogen); 2) AT (aglutinin); 3) rastvor elektrolita (izotonični rastvor natrijum hlorida). U reakciji aglutinacije učestvuju samo korpuskularni antigeni (bakterije, crvena krvna zrnca, čestice lateksa napunjene antigenom).

Reakcija aglutinacije na staklu. Stavite kapljicu na staklo bez masti pomoću pipete. dijagnostički serum(razblaživanje seruma 1:10 - 1:20). Bakteriološkom petljom sa površine kosog agara uzima se čista kultura ispitivanog mikroorganizma, prenosi se u kap seruma i miješa. Rezultat reakcije se uzima u obzir golim okom nakon 3-5 minuta. Ako je reakcija pozitivna, u kapi seruma primjećuje se pojava pahuljica (velikih ili malih), jasno vidljivih na tamnoj pozadini kada se stakalce protrese. U slučaju negativne reakcije, tečnost ostaje jednolično zamućena.

Reakcija aglutinacije u epruvetama. U red epruveta dodaje se 1 ml fiziološke otopine. U prvu epruvetu dodaje se jednaka zapremina krvnog seruma koji se ispituje. Pripremaju se serijska dvostruka razrjeđenja seruma (titracija seruma), nakon čega se u svaku epruvetu dodaju 2 kapi suspenzije inaktiviranih bakterija (diagnosticum). Epruvete se stavljaju u termostat na 37 °C na 2 sata. Reakcija teče formiranjem malih pahuljica, nevidljivih golim okom, pa se rezultati bilježe pod blagim povećanjem u posebnom uređaju - aglutinoskopu. Intenzitet aglutinacije se uzima u obzir po sistemu “četiri plus”: potpuna aglutinacija - 4+, parcijalna aglutinacija - 3+ ili 2+, sumnjiv rezultat - +. Posljednje razrjeđenje u kojem je uočena aglutinacija 2+ uzima se kao titar antitijela u test serumu.

Reakcija aglutinacije u epruvetama (opsežna reakcija aglutinacije) provodi se kako bi se odredio titar antitijela na uzročnike tifusa i paratifusa (Vidalova reakcija), bruceloze (Wrightova reakcija) i tifusa (Weiglova reakcija).

Aglutinacija (od lat. agglutinatio - lijepljenje) - lijepljenje (povezivanje) korpuskularnih čestica koje nose antigen (cijelih stanica, čestica lateksa i sl.) sa molekulima specifičnih antitijela u prisustvu elektrolita, što završava stvaranjem ljuskica ili sedimenta ( aglutinirati) vidljivo golim okom. Priroda sedimenta ovisi o prirodi antigena: flagelirane bakterije proizvode grubi flokulentni sediment, bičate i nekapsularne bakterije proizvode sitnozrnati sediment, a kapsularne bakterije proizvode žilavi sediment. Pravi se razlika između direktne aglutinacije, u kojoj vlastiti antigeni bakterijske ili bilo koje druge ćelije, kao što su eritrociti, direktno učestvuju u interakciji sa specifičnim antitijelima; i indirektne, ili pasivne, u kojima bakterijske ćelije ili eritrociti, ili čestice lateksa nisu nosioci svojih, već stranih antigena (ili antitijela) sorbiranih na njima kako bi se identificirala antitijela (ili antigeni) specifična za njih. Reakcija aglutinacije uglavnom uključuje antitijela koja pripadaju IgG i IgM klasama. Javlja se u dvije faze: prvo, dolazi do specifične interakcije aktivnog centra antitela sa determinantom antigena vidljive promjene reagujući sistem. Za drugu fazu - formiranje aglutinata - neophodno je prisustvo elektrolita koji smanjuju električni naboj kompleksa antigen + antitijelo i ubrzavaju proces njihovog lijepljenja. Ova faza se završava formiranjem aglutinata.

Reakcije aglutinacije se izvode ili na staklenim ili glatkim kartonskim pločama, ili u sterilnim aglutinacijskim epruvetama. Reakcije aglutinacije (direktne i pasivne) na staklu se obično koriste kao ubrzana metoda otkrivanje specifičnih antitijela u serumu pacijenta (na primjer, kod bruceloze) ili za serološku identifikaciju patogena. U potonjem slučaju obično se koriste dobro pročišćeni (adsorbirani) dijagnostički serumi koji sadrže samo monoreceptorska antitijela ili njihov skup na različite antigene. Nesumnjiva prednost reakcije aglutinacije na staklu je jednostavnost njene implementacije i činjenica da traje nekoliko minuta ili čak sekundi, jer se obje komponente koriste u koncentriranom obliku. Međutim, ima samo kvalitativnu vrijednost i manje je osjetljiv od epruvete. Ekstenzivna reakcija aglutinacije u epruvetama daje preciznije rezultate, jer vam omogućava da odredite kvantitativni sadržaj antitijela u serumu (ustanovite njegov titar) i, ako je potrebno, registrujete činjenicu povećanja titra antitijela, što ima dijagnostičku vrijednost. . Za uspostavljanje reakcije dodaje se serum razrijeđen na određeni način s 0,85% otopinom NaCl i jednaku zapreminu (obično 0,5 ml) suspenzije standardnog dijagnostikuma (ili test kulture) koja sadrži 1 milijardu bakterija u 1 ml. aglutinacijske cijevi. Rezultati reakcije aglutinacije se prvo bilježe nakon 2 sata inkubacije epruveta na 37 °C i konačno nakon 20-24 sata prema dva kriterija: prisutnosti i veličini precipitata i stepenu transparentnosti tečnosti supernatanta. Ocjenjivanje se vrši po sistemu četiri ukrštanja. Reakcija je nužno praćena kontrolom seruma i antigena. U slučajevima kada se radi serološke identifikacije patogena detaljna reakcija aglutinacije u epruveti, ona ima dijagnostičku vrijednost ako se reakcija ocijeni pozitivnom kada se dijagnostički serum razrijedi najmanje do polovine svog titra.

Mora se uzeti u obzir da se pri miješanju otopina homolognih antigena i antitijela ne uočavaju uvijek vidljive manifestacije reakcije aglutinacije. Talog se formira samo pri određenim optimalnim omjerima obje komponente reakcije. Izvan ovih granica, sa značajnim viškom antigena ili antitijela, reakcija se ne opaža. Ovaj fenomen se naziva "prozonski fenomen". Uočava se i u reakciji aglutinacije i u reakciji taloženja. Pojava prozona u imunološkim reakcijama objašnjava se činjenicom da su antigeni uključeni u njih, u pravilu, polideterminantni, a molekuli IgG antitela imaju dva aktivna centra. U slučaju viška antitijela, površina svake čestice antigena je prekrivena molekulima antitijela tako da više nema slobodnih determinantnih grupa, tako da drugi, nevezani aktivni centar antitijela ne može stupiti u interakciju s drugom česticom antigena i vezati ih jedno za drugo. Formiranje vidljivog aglutinata ili precipitata je takođe potisnuto kada postoji višak antigena, kada ne ostane niti jedan slobodni aktivni centar antitijela, pa se kompleksi antigen + antitijelo + antigen više ne mogu povećati.

Opcije za ubrzane reakcije aglutinacije. Reakcija pasivna hemaglutinacija i njegove varijante

Klasična reakcija aglutinacije uključuje upotrebu korpuskularnih antigena. Međutim, mogu biti uključeni i rastvorljivi antigeni. Da bi to bilo moguće, takvi antigeni se adsorbuju na imunološki inertne čestice. Kao nosač se mogu koristiti čestice lateksa ili bentonita, ali se trenutno najčešće koriste životinjski ili ljudski eritrociti, koji poboljšavaju njihova adsorbirajuća svojstva tretiranjem otopinama tanina, formalina ili benzidina. Crvena krvna zrnca koja su adsorbirala antigen na sebe nazivaju se senzibiliziranim ovim antigenom, i imunološka reakcija u kojoj učestvuju je indirektna ili pasivna reakcija hemaglutinacije (IRHA, ili RPHA), budući da crvena krvna zrnca u njoj učestvuju pasivno.

RPGA se postavlja u posebne polistirenske ploče sa rupama koje imaju poluloptasto dno. Kada ga koristite za serološka dijagnostika U tim jažicama se pripremaju dvostruka razrjeđenja test seruma u fiziološkoj otopini, a zatim mu se kao dijagnostički agens dodaje suspenzija senzibiliziranih eritrocita. Rezultati se bilježe nakon 2 sata inkubacije na 37 °C korištenjem četverostrukog sistema. Uz pozitivnu reakciju, aglutinirana crvena krvna zrnca talože se na dno rupe i ravnomjerno je prekrivaju u obliku obrnutog kišobrana. At negativnu reakciju crvena krvna zrnca se također talože, tečnost postaje prozirna, sediment izgleda kao mali "disk" u središtu rupe. Titar seruma u RPHA se smatra njegovim posljednjim razrjeđenjem, koje i dalje daje izraženu hemaglutinaciju bez značajnih znakova prisustva “diska”.

RPGA se može koristiti i kao ubrzana metoda bakteriološke dijagnostike za otkrivanje direktno u ispitivanom materijalu nepoznatih bakterija, virusa, toksina, na primjer, patogena kuge, stafilokoknih enterotoksina, itd. Sa ovom verzijom RPGA, eritrociti koji su se adsorbirali poznati su po svojoj specifičnosti se koriste kao poznata komponenta reakcije antitijela - antitijela eritrocit diagnosticum. Ako testni materijal sadrži dovoljnu količinu poznatog antigena, RPGA će biti pozitivan.

Opcije za upotrebu RPHA su: reakcija neutralizacije antigena (RNAg), reakcija neutralizacije antitela (RNAb), reakcija inhibicije pasivne hemaglutinacije (PHA). Za ove reakcije koristi se dijagnostika eritrocita antigena i antitijela. Dvije jednosmjerne reakcije koje se međusobno kontroliraju mogu se koristiti istovremeno, na primjer, RPHA sa dijagnostikumom antigena i RNAg sa dijagnostikumom eritrocita antitijela.

Reakcija neutralizacije antitijela (RNAb) sastoji se od miješanja suspenzije koja sadrži željeni antigen sa specifičnim imunološkim serumom koji sadrži poznata antitijela u odgovarajućim količinama i inkubacije na 37 °C dva sata. Nakon toga se dodaje antigenski eritrocitni dijagnostikum. Smjesa se promućka i ostavi na sobnoj temperaturi. Rezultati se uzimaju u obzir nakon 3-4 sata i konačno nakon 18-24 sata.

Reakcija neutralizacije antigena (RNAg) se izvodi po istom principu. Samo u ovom slučaju se u ispitivanom materijalu otkrivaju antitijela. Specifični antigen koji se dodaje takvom test materijalu će se vezati za antitijela koja se u njemu nalaze, odnosno doći će do neutralizacije antigena antitijelima, te stoga neće doći do hemaglutinacije prilikom dodavanja eritrocitnog dijagnostikuma antitijela.

Reakcija koaglutinacije. To je jedna od opcija za pasivnu, odnosno ubrzanu reakciju aglutinacije na staklu posredovanu ćelijama koje nose antitijela. Ova reakcija se zasniva na jedinstvenom svojstvu Staphylococcus aureus, koji sadrži protein A u svom ćelijskom zidu, vezuje se za Fc fragmente IgG i IgM. U tom slučaju, aktivni centri antitijela ostaju slobodni i mogu stupiti u interakciju sa specifičnim determinantama antigena. Kap 2% suspenzije stafilokoka, senzibilizirane odgovarajućim antitijelima, nanosi se na stakalce i dodaje se kap suspenzije bakterije koja se proučava. Ako se antigen poklapa sa antitijelima, jasna aglutinacija stafilokoka napunjenih antitijelima se javlja unutar 30-60 s.

Reakcija lateks aglutinacije (LAR). Nosilac antitela u ovom dijagnostičkom sistemu su male standardne čestice lateksa. Reakcija se izvodi mikrometodom u jamicama na staklu. Glavni uslov za uspješno postavljanje PAH-a je striktno pridržavanje kvantitativnih odnosa komponenti sistema: 10 μl preparata od lateksa senzibiliziranog antitijelima dodaje se na 50 μl test materijala. Specifičnost PAH-a se kontroliše korišćenjem tri kontrolna testa sadržana u komercijalnim test sistemima: poznato pozitivna reakcija, očito negativnu reakciju i kontrolu kvaliteta suspenzije lateksa za PAH-nesenzibilizirane (ne nose antitijela) latekse sa test materijalom. U našoj zemlji se kao nosioci specifičnih antitela koriste polistirenski monodisperzni lateksi različitih prečnika čestica (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 μm). LAG se koristi za brzo otkrivanje mikroorganizama ili njihovih antigena u ispitivanom materijalu.

Imunomagnetska detekcija antigena. Jedna od opcija za ubrzanu reakciju aglutinacije na staklu povezana je sa upotrebom supermagnetnih polimernih čestica obloženih specifičnim antitijelima. Jedna takva čestica veže do 107-108 ćelija mikroorganizama, zbog čega se osjetljivost ovu metodu dostiže 5 CFU/ml. Imunomagnetna detekcija mikroorganizama može se koristiti u kombinaciji sa CPR.

Reakcija agregatne hemaglutinacije (AHA). Omogućava vam da brzo otkrijete u krvi pacijenata i antigene koji slobodno cirkuliraju (antigenemija) i antigene povezane s antitijelima - cirkulirajući imuni kompleksi (CIC). Za RAHA se koriste crvena krvna zrnca senzibilizirana odgovarajućim antitijelima. Dodavanje krvnog seruma pacijenta, koji sadrži antigene, senzibiliziranim eritrocitima na kojima su fiksirana antitijela dovodi do sljepljivanja (aglutinacije) eritrocita i imunoloških kompleksa.

Antiglobulin Coombs test (R. Coombs reakcija). Puna (divalentna) antitijela se određuju pomoću direktne i pasivne reakcije aglutinacije. Nepotpuna (monovalentna, blokirajuća) antitijela se ovim metodama ne otkrivaju, jer, kada se spoje s antigenom, blokiraju ga, ali ne mogu uzrokovati agregaciju antigena u velike konglomerate. Nepotpuna (blokirajuća) antitijela su ona u kojima funkcionira samo jedan aktivni centar; drugi aktivni centar ne radi iz nepoznatog razloga. Za otkrivanje nepotpunih antitijela koristi se posebna Coombsova reakcija (slika 72). Reakcija uključuje: pacijentov serum, u kojem su određena nepotpuna antitijela, korpuskularni antigen-dijagnostikum, antiglobulinski serum koji sadrži antitijela na humani globulin. Reakcija se odvija u dvije faze:

Interakcija antigena s nekompletnim antitijelima. Nema vidljivih manifestacija. Prva faza se završava ispiranjem antigena iz preostalog seruma pacijenta.

Interakcija antiglobulinskog seruma dobivenog kao rezultat imunizacije životinje ljudskim globulinom s nepotpunim antitijelima adsorbiranim na antigen. Zbog činjenice da su antiglobulinska antitela dvovalentna, ona vezuju dva monovalentna antitela odvojenih AG+ kompleksa nepotpuno antitelo, što dovodi do njihovog lijepljenja i pojave vidljivog taloga.

Aglutinacija je lijepljenje i taloženje mikroba ili drugih stanica pod utjecajem antitijela u prisustvu elektrolita (izotonični rastvor natrijum hlorida). Grupe slijepljenih bakterija (ćelija) nazivaju se aglutinati. Za reakciju aglutinacije potrebne su sljedeće komponente:

1. Antitijela (aglutinini) koja se nalaze u serumu bolesne ili imune životinje.

2. Antigen - suspenzija živih ili ubijenih mikroba, crvenih krvnih zrnaca ili drugih ćelija.

3. Izotonični (0,9%) rastvor natrijum hlorida.

Za serodijagnostiku se koristi aglutinacijski test tifusne groznice i paratifusna groznica (Vidalova reakcija), bruceloza (reakcija Wright i Heddleson), tularemija itd. Antitijelo je pacijentov serum, a antigen je poznati mikrob. Prilikom identifikacije mikroba ili drugih ćelija, njihova suspenzija se koristi kao antigen, a poznati imunološki serum se koristi kao antitijelo. Ova reakcija se široko koristi u dijagnostici crijevne infekcije, veliki kašalj itd.

Metode stadijuma RA

Približni RA na staklu

Deployed RA

(metoda volumena)

Reakcija koaglutinacije

Rasklopljeni RA na staklu (seroididentifikacija)

Reakcija aglutinacije na staklu. Dvije kapi specifičnog (adsorbiranog) seruma i kap izotonične otopine natrijum hlorida nanose se na staklo bez masti. Neadsorbirani serumi se prethodno razblažuju u omjeru 1:5 - 1:100. Kapi se moraju nanijeti na staklo tako da postoji razmak između njih. Kultura se temeljno melje petljom ili pipetom na staklo, a zatim se dodaje kapi izotonične otopine natrijum hlorida i jednoj od kapi seruma, miješajući sve dok se ne formira homogena suspenzija. Kap seruma bez kulture je kontrola seruma.

Pažnja! Ne možete prenijeti kulturu iz seruma u kap izotonične otopine natrijum hlorida, koja služi kao kontrola antigena. Reakcija se odvija na sobnoj temperaturi 1-3 minuta. Ako kontrola seruma ostane prozirna, uočena je ujednačena zamućenost u kontroli antigena, a aglutinatne ljuspice se pojavljuju u kapi gdje je kultura pomiješana sa serumom na pozadini bistre tekućine, rezultat reakcije se smatra pozitivnim.

Diagnostic Physiological

serum + rastvor kulture + kultura

Detaljna reakcija aglutinacije (volumenska metoda). Pripremaju se serijska, najčešće dvostruka, razrjeđenja seruma. Metoda se naziva volumetrijska. Za određivanje titra antitijela u krvnom serumu uzmite 6 epruveta. U prvu epruvetu sipajte 1 ml originalnog seruma u omjeru 1:50 i dodajte 1 ml fiziološkog rastvora u svih 6 epruveta koristeći graduisanu pipetu. Prva epruveta će dati razrjeđenje seruma od 1:100 sa zapreminom od 2 ml. Prebacite 1 ml iz prve epruvete u drugu epruvetu, gde razblaženje postaje 1:200. Zato napravite seriju serijskih razblaženja seruma u prvih 5 epruveta (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Iz pete epruvete sipajte 1 ml u rastvor za dezinfekciju. Dodajte 2 kapi dijagnostikuma u svih 6 epruveta. Šesta epruveta je kontrola kulture, jer sadrži samo fiziološki rastvor i dijagnostikum.

Takva kontrola je neophodna da bi se isključila spontana aglutinacija kulture. Epruvete se protresu i stave u termostat na 37°C na 2 sata, a zatim ostave jedan dan na sobnoj temperaturi, nakon čega se bilježe rezultati reakcije aglutinacije. Prilikom izvođenja reakcije aglutinacije sa serumima djece u prvim mjesecima života, zbog funkcionalne inferiornosti stvaranja antitijela, potrebno je utvrditi niže titre antitijela, što se uzima u obzir pri razrjeđivanju seruma. Početno razrjeđenje seruma je 1:25. U prvoj epruveti dobije se razrjeđenje 1:50, zatim 1:100 itd.

At pozitivan rezultat reakcije u epruvetama, ljepljive ćelije u obliku zrnaca ili pahuljica vidljive su na pozadini bistre tekućine. Aglutinat se postepeno taloži na dno u obliku "kišobrana", a tečnost iznad sedimenta postaje bistra. Kontrola antigena je jednolično zamućena.

Na osnovu prirode sedimenta razlikuje se fino i krupnozrnasta (ljuskasta) aglutinacija. Pri radu sa O-serumom postiže se fino zrnasta aglutinacija. Krupnozrnast - kada pokretni mikrobi stupaju u interakciju sa flagelarnim H-serumima. Javlja se brže od sitnozrnog, a nastali sediment je vrlo labav i lako se lomi.

Intenzitet reakcije se izražava na sljedeći način:

Sve ćelije su se slegle, tečnost u epruveti je potpuno prozirna. Rezultat reakcije je oštro pozitivan;

Taloga je manje, tečnost se ne bistri u potpunosti. Rezultat reakcije je pozitivan;

Taloga je još manje, tečnost je zamućenija. Rezultat reakcije je sumnjiv;

Na dnu epruvete je blagi talog, tečnost je mutna. Upitan rezultat reakcije;

Nema sedimenta, tečnost je jednolično zamućena, kao u kontroli antigena. Rezultat negativne reakcije

Reakcija aglutinacije Reakcija aglutinacije

(RA) - metoda identifikacije i kvantifikacija Ag i At, na osnovu njihove sposobnosti da formiraju aglomerate vidljive golim okom. Na odjelu za infektivne bolesti. bolesti ili u druge svrhe koristi se za identifikaciju nepoznatih mikroba i ćelija, za određivanje prisutnosti i količine antitijela u krvi i drugim tekućinama. Princip određivanja zasniva se na specifičnosti interakcije između Ag i Ab i sastoji se u pronalaženju poznatog od nepoznatog. Postoji mnogo opcija za RA: kvantitativne i kvalitativne, epruvete i stakla, volumetrijske i kapljične, konvencionalne, ubrzane i ekspresne metode. Za stadij RA potrebno vam je: 1) s-ka krv. U varijanti sa određivanjem vrste (var) bakterija koriste se industrijski testovi aglutinacije, proizvedeni imunizacijom zečeva. U varijanti sa određivanjem tipa Ab, iz testa se uzima uzorak krvi. ljudi ili životinje. Rastvor mora biti sterilan i bez suspendiranih čestica. Pripremite osnovno razrjeđenje u fiziološkom rastvoru. Trebao bi biti 2-4 puta manji od dijagnostičkog titra za ovu bolest; 2) Ag. U verziji reakcije sa određivanjem Ab tipa koriste se industrijski dijagnostički kompleti; u varijanti sa određivanjem Ag dijagnostikumi se sami pripremaju u obliku suspenzije od 1-3 milijarde u fiziološkom rastvoru 18-20-satnog agar (rjeđe bujon) testa. mikrob inaktiviran zagrijavanjem u vodenom kupatilu na 70°C u trajanju od 1 sata ili 24-satnom inkubacijom na 37°C sa formaldehidom (konačna koncentracija 0,2%); 3) elektrolit u obliku fiziološke otopine. Tehnika inscenacije volumetrijska serijska cijev RA za određivanje Ab titra u s-ki: nekoliko redova radnih razblaženja priprema se od glavnog razblaženja s-ki. Broj redova zavisi od broja dijagnostikuma uzetih u eksperiment. Broj i faktori razblaženja određuju se prema dijagnostičkom titru sumnjive bolesti. Serija mora sadržavati najmanje razrjeđenje koje odgovara dijagnostičkom Ab titru, dva razrjeđenja ispod i dva razrjeđenja iznad. na primjer, ako je dijagnostički titar 1:100, tada se volumetrijskom metodom stadijuma RA pripremaju sljedeća razrjeđenja: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; sa drip metodom, prvo razrjeđivanje (1:25) nije potrebno, ali je potrebno drugo veće razrjeđivanje - 1:800 B. naučno istraživanje s-ku se titrira do negativne reakcije. Razrjeđuje se na sljedeći način: 0,25 ml fiziološkog rastvora se sipa u sve epruvete, osim u prvu, kada se reakcija izvodi u zapremini od 0,5 ml, i 0,5 ml kada se reakcija izvodi u zapremini od 1. ml. Sipati 0,25 (0,5) ml glavnog razblaženja u 1. i 2. epruvetu, iz 2. epruvete, u izrezanu zapreminu i uzgoj s-k i povećana 2 puta, 0,25 (0,5) ml se prenosi u 3., sa 3. na 4. itd. do zadnjeg, od reza se u sve ulije 0,25 (0,5) ml kako bi se izbalansirale zapremine. Svako razrjeđivanje se provodi pomoću posebne pipete. Ako se u eksperiment uzme više dijagnostikuma, onda se za svaki od njih na isti način priprema vlastita serija razrjeđenja. U svako razrjeđenje epruvete dodaje se Diagnosticum u zapremini jednakoj zapremini epruvete, zbog čega se razrjeđenje u svakoj epruveti udvostručuje. Eksperiment odgovara s-ki kontroli (0,25 - 0,5 ml glavnog razblaženja s-ki i ista količina fiziološkog rastvora) i Ag kontroli (0,25 - 0,5 ml dijagnostikuma i ista količina fiziološkog rastvora). Ako se u eksperimentu koristi više dijagnostikuma, onda svaki ima svoju kontrolu antigena. Stalak sa epruvetama se dobro protrese i stavi u termostat na 37°C 4 sata, a zatim ostavi na sobnoj temperaturi do sledećeg dana, nakon čega se beleži PA na osnovu količine sedimenta i stepena pročišćenosti. tečnost. Određivanje ovih indikatora, ovisno o prirodi aglutinata, provodi se golim okom na tamnoj pozadini, u aglutinoskopu ili preko konkavne površine ogledala mikroskopa. Računovodstvo počinje kontrolama: kontrola C treba da bude providna, Ag treba da bude jednolično zamućen (nakon protresanja epruvete). Ako su kontrole dobre, utvrditi prisustvo i stepen aglutinacije u svim epruvetama, koje su označene plusovima: veliki sediment i potpuno čišćenje tečnosti - 4 plusa; veliki talog i nepotpuno čišćenje tečnosti - 3 plusa; primjetan sediment i primjetno pročišćavanje tekućine su 2 plusa. Nakon toga se određuje titar: najveće razrjeđenje s intenzitetom aglutinacije od najmanje 2 plusa. Istraživanje titra s-ki se upoređuju sa dijagnostičkim titrom za ovu bolest. Ako se ispituje titar. s-ki je 2 puta niži od dijagnostičke vrijednosti, reakcija se procjenjuje kao sumnjiva; ako je titar jednak dijagnostika - kako slabo pozitivan; ako je 2-4 puta veći, smatra se pozitivnim ako je 8 ili više puta veći, smatra se oštro pozitivnim. Sa široko rasprostranjenom distribucijom Ab zdravi ljudi Za procjenu RA koristi se povećanje Ab titra. Da bi se odredio tip Ar u serijskom RA, broj redova mora odgovarati broju uzetom za identifikaciju dijagnostičkih testova. Od glavnog razblaženja dijagnostičkog testa, priprema se serija uzastopnih dvostrukih razblaženja na isti način kao kod RA da bi se odredio Ab titar. Faktori razblaženja zavise od titra aglutinacionog testa. U eksperimentu je neophodno prisustvo razblaženja jednakog titru testa, kao i 2, 4, 6, 8 puta nižeg od njega titar dijagnostičkog testa je 1 3200, tada treba koristiti razrjeđenja 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 Ista zapremina testiranog Ag se dodaje u razrjeđenja testa, kao rezultat toga, razrjeđenje test se povećava za 2 puta, a eksperimentu se dodaju 2 kontrole u termostatu na 37°C. Rezultati se uzimaju u obzir kako je gore opisano. Ag uzet u eksperiment, titar reakcije mora odgovarati najmanje polovini titra standardnog dijagnostičkog testa Drip md Stadiranje RA se razlikuje od volumetrijskog po tome što se s-ku razblaži u zapremini od 1 ml, a koristi se Ag u višoj koncentraciji (10 milijardi/ml) i dodaje se 1 - 2 kapi u epruvetu. Razblaživanje leka nakon dodavanja Ag smatra se nepromenjenim

(Izvor: Rječnik mikrobioloških pojmova)

Reakcija aglutinacije (od lat. agglutinatio- lijepljenje) - lijepljenje tjelešca (bakterija, crvenih krvnih zrnaca, itd.) antitijelima u prisustvu elektrolita.

Reakcija aglutinacije manifestira se u obliku pahuljica ili sedimenta koji se sastoji od tjelešca (na primjer, bakterija) "zalijepljenih zajedno" antitijelima (slika 7.37). Reakcija aglutinacije se koristi za: određivanje patogena izolovanog od pacijenta; određivanje antitijela u krvnom serumu pacijenta; određivanje krvnih grupa.

Rice. 7.37 a, b. Reakcija aglutinacije saIgM-antitijela (a) iIgG-antitela (b)

1. Određivanje patogena izolovanog od pacijenta Približna reakcija aglutinacija na staklu (slika 7.38). Kapljici aglutinirajućeg seruma (razrjeđenje 1:20) dodaje se suspenzija bakterija izoliranih od pacijenta. Formira se flokulantni talog.

Rice. 7.38.

Ekstenzivna reakcija aglutinacije sa patogenom izolovanim od pacijenta (slika 7.39). Razrijeđenjima aglutinirajućeg seruma dodaje se suspenzija bakterija izoliranih od pacijenta.

Rice. 52

2. Određivanje antitijela u krvnom serumu pacijenta
Detaljna reakcija aglutinacije sa pacijentovim krvnim serumom (slika 7.39). Dijagnostikum se dodaje razblaženjima pacijentovog seruma.
- Aglutinacija sa O-diagnosticumom (bakterije ubijene toplotom, zadržavajući O-antigen) se javlja u obliku sitnozrnate aglutinacije.
- Aglutinacija sa H-dijagnostikumom (bakterije ubijene formalinom, zadržavajući flagelarni H-antigen) je velika i dešava se brže.
3. Reakcija aglutinacije za određivanje krvnih grupa Reakcija aglutinacije za određivanje krvnih grupa koristi se za uspostavljanje ABO sistema (Tabela b) pomoću aglutinacije eritrocita sa antitijelima imunog seruma protiv antigena krvne grupe A (I), B (III). Kontrola je: serum koji ne sadrži antitela, tj. serum AB (IV) krvna grupa; antigeni sadržani u crvenim krvnim zrncima grupa A (II), B (III). Negativna kontrola ne sadrži antigene, odnosno koriste se eritrociti grupe O (I).

Tabela 7.6. Određivanje ABO krvnih grupa