Pasywne reakcje aglutynacji. Pośrednie reakcje aglutynacji. Pośrednia lub bierna reakcja hemaglutynacji (IRHA, RPHA). Odwrotne RNGA. Pasywna reakcja hamowania hemaglutynacji (PHA).
Te reakcje są nazywane pośredni (bierny), ponieważ wykorzystują Ag (lub AT) sztucznie zaadsorbowany na powierzchni różnych cząstek korpuskularnych.
Pośrednia lub bierna reakcja hemaglutynacji (RNGA, RPG) jest jedną z najbardziej wrażliwych reakcji serologicznych. Opiera się na zdolności AT do interakcji z Ag osadzonym na różnych czerwonych krwinkach, które następnie ulegają aglutynacji. Dla większej stabilności diagnostyki, czerwone krwinki są formalizowane.
Odwrotne RNGA stosowany do wykrywania Ag w surowicy krwi; W tym celu na erytrocytach mocuje się nie Ag, ale AT. Reakcje tego typu są szeroko stosowane w diagnozowaniu chorób zakaźnych, ustalaniu ciąży, wykrywaniu nadwrażliwość na leki itp.
Reakcja hamowania bierna hemaglutynacja (RTPGA) - dalszy rozwój RNGA; w pewnym sensie kontroluje jego specyfikę. w odróżnieniu RNGA, zawiera trzy komponenty; Ag, AT i Ag (AT) adsorbowane na erytrocytach. Początkowo Ag reaguje z AT (standardową surowicą odpornościową), następnie do mieszaniny dodaje się erytrocyty uczulone tym samym Ag (lub AT). Jeśli podczas interakcji Ag z AT w układzie nie pozostanie wolny AT (lub Ag), wówczas nie obserwuje się aglutynacji diagnostycznej erytrocytów.
Wykorzystuje czerwone krwinki lub neutralne materiały syntetyczne(na przykład cząsteczki lateksu), na powierzchni których sorpcyjne są antygeny (bakteryjne, wirusowe, tkankowe) lub przeciwciała. Do ich aglutynacji dochodzi po dodaniu odpowiednich surowic lub antygenów. Czerwone krwinki uczulone antygenami nazywane są antygenowymi erytrocytami diagnostycznymi i służą do wykrywania i oznaczania przeciwciał. Erytrocyty uczulone przeciwciałami. nazywane są immunoglobulinami diagnostycznymi erytrocytów i służą do wykrywania antygenów.
Reakcję pasywnej hemaglutynacji wykorzystuje się do diagnostyki chorób wywołanych przez bakterie ( dur brzuszny i dur paradurowy, czerwonka, bruceloza, dżuma, cholera itp.), pierwotniaki (malaria) i wirusy (grypa, infekcje adenowirusowe, Wirusowe zapalenie wątroby B, odra, kleszczowe zapalenie mózgu, krymska gorączka krwotoczna itp.), a także w celu oznaczenia niektórych hormonów, określenia zwiększonej wrażliwości pacjenta na leki oraz hormony, takie jak penicylina i insulina.
Pasywna reakcja hemaglutynacji (RPHA). Test hemaglutynacji biernej jest metodą czułą diagnostyka serologiczna i służy zarówno do diagnostyki wczesnej, jak i retrospektywnej oraz do określenia stanu immunopogicznego osób zaszczepionych. U chorych na tularemię przeciwciała stwierdza się zwykle pod koniec 1. lub 2. tygodnia choroby, po 1–1,5 miesiąca miano RPHA osiąga maksymalna wydajność(1:100000-1:20000, rzadko wyższe), po czym spadają i przez długi czas utrzymują się na poziomie 1:100-1:200.
U osób zaszczepionych przeciwciała są również stale wykrywane, jednak w niższych mianach, nie przekraczających 1:2000-1:5000 1-1,5 miesiąca po szczepieniu i przez kilka lat utrzymują się na niskim poziomie 1:20-1:80.
Antygenem pozwalającym określić stopień zaawansowania RPHA jest tularemia erythrocyte Diagnosticum (antygenowy). Lek to sformalizowane krwinki czerwone owcze, uczulone antygenem tularemii, dostępne w postaci płynnej i suchej. Preparat płynny - 10% zawiesina czerwonych krwinek w roztworze formaldehydu o stężeniu 10%. Preparat suchy liofilizowany to suszona próżniowo 10% zawiesina czerwonych krwinek bez środka konserwującego. Przed użyciem należy go rozcieńczyć zgodnie ze wskazówkami na etykiecie. Do ustawienia reakcji w płytkach styropianowych oba leki stosuje się w stężeniu 2,5%, a przy ustawianiu reakcji w mikroobjętościach - w stężeniu 0,5%.
Technika konfiguracji RPGA. Surowice testowe rozcieńcza się roztworem fizjologicznym 1:5 (1:10) i ogrzewa w temperaturze 56 stopni C przez 30 minut. Następnie, w celu usunięcia heterogennych przeciwciał przeciwko erytrocytom owiec, surowice traktuje się 50% zawiesiną sformalizowanych erytrocytów owiec. W tym celu należy dodać czerwone krwinki w ilości 2 kropli (0,05 ml) na 1 ml surowicy i dokładnie wymieszać, wstrząsając. Surowicę pozostawia się do całkowitego osadzenia się erytrocytów lub po godzinie wiruje się w temperaturze pokojowej i po tym czasie nadaje się do badania.
Ciecz rozcieńczającą wlewa się w objętości 0,5 ml do rzędu studzienek na płytce polistyrenowej. Podczas wstępnego badania surowic zaleca się ich przetestowanie poprzez ustawienie reakcji w krótkim rzędzie płytki (6-studzienek). Jeżeli przeciwciała zostaną wykryte w krótkich seriach, surowice są ponownie badane w długich seriach rozcieńczeń (12 dołków). Po rozlaniu płynu rozcieńczającego dodać 0,5 ml surowic testowych w rozcieńczeniu 1:5 do pierwszego dołka każdego rzędu (krótkiego lub długiego). Następnie te same objętości surowicy miareczkuje się, stosując dwukrotne rozcieńczenia. W ten sposób uzyskuje się rozcieńczenia surowicy w krótkich seriach od 1:10 do 1:320, a w długich seriach od 1:10 do 1:20480. Po miareczkowaniu surowicy do każdego dołka dodaje się jedną kroplę (0,05 ml) roboczej 2,5% zawiesiny uczulonych erytrocytów. Zawartość płytek dokładnie wytrząsa się aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Płytki pozostawia się w temperaturze pokojowej na nieruchomej powierzchni stołu. Wstępną rejestrację reakcji przeprowadza się po 2-3 godzinach, ostateczne oznaczenie miana następuje po całkowitym opadnięciu czerwonych krwinek w dołkach. Do reakcji przewidziano następujące kontrole: 1) surowicę testową rozcieńczoną w stosunku 1:10 w objętości 0,5 ml + 1 kropla 2,5% zawiesiny nieuczulonych erytrocytów; 2) płyn rozcieńczający w objętości 0,5 ml + 1 kropla 2,5% zawiesiny nieuczulonych erytrocytów; 3) roztwór rozcieńczający w objętości 0,5 ml + 1 kropla 2,5% zawiesiny uczulonych erytrocytów. Wszystkie kontrole powinny dać reakcję wyraźnie negatywną.
Rachunkowość i ocena RPGA. Reakcję ocenia się wg poniższy schemat:
1) ostro pozytywna reakcja(++++) - czerwone krwinki opadają na dno otworu równą warstwą w postaci „parasolki”, która często ma zapiekane stopienie krawędzi;
2) reakcja pozytywna (+++) – krwinki czerwone pokrywają co najmniej 2/3 dna dołka;
3) reakcja słabo pozytywna (++) - aglutynian jest mały i znajduje się w samym środku dołka;
4) reakcja wątpliwa (+) - wokół osadu erytrocytów w samym środku studzienki znajdują się pojedyncze ziarna aglutynatu;
5) ujemny (-) - na dnie otworu czerwone krwinki osadzają się w postaci „guzika” lub małego pierścienia o gładkich, ostro zarysowanych krawędziach.
Miano surowicy uwzględnia się na podstawie ostatniego rozcieńczenia surowicy, które dało bardzo wyraźną reakcję (co najmniej trzy plusy). Za miano diagnostyczne uważa się rozcieńczenie 1:100 lub wyższe, jednak podobnie jak w przypadku RZS należy monitorować jego wzrost.
RPGA na tularemię jest dość specyficzny i wykrywa niektóre reakcje krzyżowe tylko z serum przeciw brucelozy. Diagnostyka różnicowa możliwe dzięki wysokości mian w RPGA, które są znacząco wyższe w przypadku antygenu homologicznego.
Technika ustawiania RPHA w mikroobjętościach. RPGA można wykonywać w mikroobjętościach przy użyciu mikrotitratora typu Takachi (lub mikropłytek okrągłodennych z mikropipetami), który umożliwia miareczkowanie materiału w objętościach 25 µl i 50 µl. Technika reakcji i kolejność wszystkich operacji są takie same, jak przy badaniu w płytach styropianowych. Należy jednak pamiętać, że czułość mikrometody jest zwykle o jedno rozcieńczenie (tj. 2 razy) niższa niż czułość makrometody.
Aby ustawić reakcję w mikrotitratorze, do każdego dołka dodaje się ciecz rozcieńczającą w objętości 50 µl za pomocą pipety z zakraplaczem. Następnie za pomocą titratorów z głowicą o pojemności 50 μl pobiera się surowicę testową poprzez zanurzenie w niej głowicy. Upewnij się, że ciecz wypełniła głowicę titratora. Titrator z surowicą przenosi się do pierwszego dołka i przytrzymuje pozycja pionowa, zrób kilka ruchy obrotowe podróż w obie strony. Następnie titrator przenosi się do następnego dołka i powtarza się manipulację. Miareczkowanie można przeprowadzić jednocześnie w kilku rzędach. Po miareczkowaniu całej serii titrator przemywa się wodą destylowaną (zmieniając 2 porcje) ruchami obrotowymi, wodę usuwa się z głowicy za pomocą wacika i spala płomieniem palnika.
Po miareczkowaniu dodać do dołków 25 µl płynu diagnostycznego do oznaczania erytrocytów. Stężenie diagnostyczne dla RPHA w mikroobjętościach powinno wynosić 0,5% (tj. 2,5% zawiesina czerwonych krwinek jest dodatkowo rozcieńczana 5 razy). Po dodaniu czerwonych krwinek płytki należy lekko wstrząsnąć, aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Wyniki można zarejestrować w ciągu 1-1,5 godziny, co jest znaczącą zaletą RPGA w mikromianowaniu. Ponadto technika ta wymaga małych ilości wszystkich składników reakcji i surowic testowych.
Reakcję uwzględnia się według następującego schematu:
1) „+” – hemaglutynacja całkowita, podczas której krwinki czerwone opadają na dno studzienki równą warstwą w postaci „parasolki”, zajmującej co najmniej 2/3 dna;
2) „+-” - częściowa hemaglutynacja, podczas której czerwone krwinki opadają na dno w postaci luźnego pierścienia o niewielkich rozmiarach;
3) „-” – brak hemaglutynacji, gdy czerwone krwinki opadają na dno w postaci małego guzika lub pierścienia o gładkiej krawędzi.
Specyficzność dodatniego wyniku uzyskanego w RPHA można sprawdzić za pomocą reakcji trójskładnikowej – reakcji pasywnego hamowania hemaglutynacji (PHA).
Technika konfiguracji protokołu RTPGA. Reakcję tę wykorzystuje się do potwierdzenia specyfiki dodatniego wyniku RPGA, gdy jest on wątpliwy lub ma szczególne znaczenie epidemiologiczne. Mechanizm reakcji polega na specyficznym hamowaniu hemaglutynacji po dodaniu do surowicy testowej zawiesiny zabitych bakterii tularemii. W reakcji biorą udział trzy składniki: surowica testowa, specyficzny antygen tularemii i antygenowy erytrocyt. Diagnostyczny RTPHA umieszcza się zwykle w rzędzie 7-8 dołków. Wskazane jest zainstalowanie powtarzającego się RPGA równolegle z RTPGA. Do dwóch rzędów dołków wlewa się po 0,25 ml cieczy rozcieńczającej, następnie do pierwszych dołków obu rzędów dodaje się surowicę testową w objętości 0,25 ml i wykonuje się miareczkowanie, w wyniku czego otrzymuje się dwa identyczne rzędy rozcieńczeń surowicy. Do wszystkich dołków drugiego rzędu dodać 0,25 ml cieczy rozcieńczającej, a do dołków pierwszego rzędu 0,25 ml zawiesiny bakterii tularemii. Stosuje się Tularemia Diagnosticum (zawierający 25 miliardów bakterii tularemii w 1 ml), uprzednio rozcieńczony 50 razy. Zawiesina ta zawiera 500 milionów bakterii w 1 ml lub 125 milionów w objętości 0,25 ml. Po dodaniu antygenu płytkę pozostawia się na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, po czym do wszystkich dołków obu rzędów dodaje się po jednej kropli (0,05 ml) erytrocytu diagnostycznego, płytkę wytrząsa się i pozostawia na płaskiej powierzchni stołu. Rozliczenie odbywa się po 2-3 godzinach.
Rachunkowość i ocena RTPGA. Jeżeli w surowicy testowej znajdują się specyficzne przeciwciała tularemii, zostaną one zneutralizowane przez dodany antygen i hemaglutynacja nie nastąpi w pierwszym rzędzie dołków lub przy wysokim mianie surowicy hemaglutynacja będzie obserwowana w mniejszej (2-4) liczbie studnie niż w rzędzie z RPHA. W tym przypadku specyfika wyników została potwierdzona. Jeżeli w obu rzędach zostanie stwierdzona hemaglutynacja, tj. Jeśli wyniki RTPGA i RPGA są zbieżne, oznacza to brak przeciwciał tularemii w badanej surowicy. W tym przypadku pierwotny wynik RPGA uważa się za niespecyficzny.
Technika oceny stopnia zaawansowania RTHG w mikroobjętościach. RTPGA, podobnie jak RPGA, można przeprowadzić w mikroobjętościach przy użyciu mikromianownika typu Takachi. W tym celu należy dodać 0,25 µl płynu rozcieńczającego do dołków mikropłytek w dwóch rzędach po 7-8 dołków każdy. Następnie za pomocą titratora dodaje się 0,25 µl surowicy testowej i miareczkuje w obu rzędach. Następnie do każdej studzienki w pierwszym rzędzie dodaje się 25 µl antygenu tularemii (którego stężenie wynosi 500 milionów bakterii tularemii w 1 ml), a do drugiego rzędu dodaje się 25 µl cieczy rozcieńczającej. Płytki pozostawia się na 1 godzinę w temperaturze pokojowej, po czym do wszystkich dołków w obu rzędach dodaje się 25 µl antygenowego Zritrocytic Diagnosticum (stężenie 0,5%). Rozliczanie i ocena wyników przeprowadza się analogicznie do reakcji w makroobjętościach.
Bierna reakcja hemaglutynacji) metoda wykrywania i identyfikacji antygenów lub przeciwciał, oparta na zjawisku aglutynacji czerwonych krwinek zachodzącej w ich obecności, na powierzchni której uprzednio zaadsorbowany został odpowiedni swoistość lub antygeny.
1. Mała encyklopedia medyczna. - M.: Encyklopedia medyczna. 1991-96 2. Najpierw opieka zdrowotna. - M.: Wielka encyklopedia rosyjska. 1994 3. Słownik encyklopedyczny terminy medyczne. - M.: Encyklopedia radziecka. - 1982-1984.
Zobacz, co oznacza „reakcja hemaglutynacji pośredniej” w innych słownikach:
pośrednia reakcja hemaglutynacji-RNGA Test laboratoryjny z wykorzystaniem diagnostyki erytrocytów. [Angielsko-rosyjski słownik podstawowych terminów z zakresu wakcynologii i immunizacji. Światowa Organizacja Zdrowia, 2009] Tematyka wakcynologia, szczepienia Synonimy RNGA EN... ... Przewodnik tłumacza technicznego
- (RNHA; synonim reakcji hemaglutynacji biernej) metoda wykrywania i identyfikacji antygenów lub przeciwciał, oparta na zjawisku aglutynacji erytrocytów zachodzącej w ich obecności, na powierzchni której zostały wcześniej zaadsorbowane... .. . Duży słownik medyczny
- (RPHA) patrz reakcja hemaglutynacji pośredniej... Duży słownik medyczny
Ta strona jest słownikiem. #A... Wikipedia
Podstawowe skróty przyjęte w Weterynaryjnym Słowniku Encyklopedycznym- a., aa, artena, arteriae aa ana (równie) Akademia Nauk Medycznych ZSRR Akademia Nauk Medycznych ZSRR Akademia Nauk ZSRR Akademia Nauk ZSRR Bac. Bacillus Bacillus. Bakteria BSSR Białoruska SSR ok., wieki. wiek, wieki v., w. vena, venae VASKHNIL Ogólnounijny Order Lenina i... ...
Termin ten ma inne znaczenia, patrz Plaga. Nosówka zwierząt mięsożernych (choroba Kare’a) ostra lub podostra zaraźliwa Choroba wirusowa, objawiający się gorączką, nieżytowym zapaleniem błon śluzowych, zmianami skórnymi, centralnymi ... ... Wikipedia
- (renes) sparowany narząd wydalniczy i hormonalny, który reguluje homeostazę chemiczną organizmu poprzez funkcję tworzenia moczu. ANATOMICZNY SZKIC FIZJOLOGICZNY Nerki położone są w przestrzeni zaotrzewnowej (Przestrzeń zaotrzewnowa) na... ... Encyklopedia medyczna
I (włośnica; synonim: włośnica, „opuchnięta”) robaczyca z grupy nicieni, charakteryzująca się gorączką, bólami mięśni, obrzękiem twarzy, wysypki skórne, eozynofilia we krwi, a w ciężkich przypadkach zmiany chorobowe narządy wewnętrzne i centralne... ... Encyklopedia medyczna
- (nicienie) robaczyca wywołana przez nicienie glisty klasa Nematoda. Wśród innych robaczyc N. mają najwyższa wartość w patologii człowieka większość z nich to geohelminthiasis (patrz Helminthiasis); rozwój ich jaj lub larw... ... Encyklopedia medyczna
zakaźne zapalenie najądrza- Ryż. 1. Powiększenie lewego jądra u owcy z zakaźnym zapaleniem najądrza. Ryż. 1. Powiększenie lewego jądra u owcy z zakaźnym zapaleniem najądrza. zakaźne zapalenie najądrza owiec (Epididymitis infectiosa arietum), przewlekłe zakaźne... ... Weterynaryjny słownik encyklopedyczny
Zobacz reakcję hemaglutynacji pośredniej... Duży słownik medyczny
Podana jest reakcja:
1) do wykrywania polisacharydów, białek, ekstraktów bakteryjnych i innych substancji silnie rozproszonych, riketsj i wirusów, których kompleksów z aglutyninami nie widać w konwencjonalnych RA,
2) do wykrywania przeciwciał w surowicy pacjentów przeciwko tym silnie rozproszonym substancjom i drobnym mikroorganizmom.
Przez aglutynację pośrednią, czyli pasywną, rozumie się reakcję, w której przeciwciała oddziałują z antygenami wstępnie zaadsorbowanymi na cząstkach obojętnych (lateks, celuloza, polistyren, tlenek baru itp. lub czerwone krwinki owcy, I(0) – grupa krwi ludzkiej).
W biernej reakcji hemaglutynacji (RPHA) Czerwone krwinki. Czerwone krwinki obciążone antygenem sklejają się w obecności specyficznych przeciwciał przeciwko temu antygenowi i wytrącają się. Erytrocyty uwrażliwione na antygen są stosowane w RPGA jako narzędzie diagnostyczne erytrocytów do wykrywania przeciwciał (serodiagnoza). Jeśli czerwone krwinki są obciążone przeciwciałami (diagnostyka przeciwciał erytrocytowych), można je wykorzystać do wykrycia antygenów.
Ryż. 3. Schemat RPGA: czerwone krwinki (1), obciążone antygenem (3), są wiązane przez specyficzne przeciwciała (4).
Inscenizacja. W dołkach płytek polistyrenowych przygotowuje się serię seryjnych rozcieńczeń surowicy. Do przedostatniego dołka dodać 0,5 ml surowicy wyraźnie dodatniej, a do ostatniego dołka 0,5 ml roztworu fizjologicznego (kontrola). Następnie do wszystkich dołków dodaje się 0,1 ml rozcieńczonego erytrocytu diagnostycznego, wytrząsa i umieszcza w termostacie na 2 godziny.
Księgowość. W pozytywny przypadek erytrocyty osiadają na dnie otworu w postaci równej warstwy komórek o złożonej lub postrzępionej krawędzi (odwrócony parasol), w negatywie - osiadają w postaci guzika lub pierścienia.
Ryc.4. Rachunkowość dla RNGA (RPGA).
Uwzględnianie wyników badania rentgenowskiego wykonanego w celu wykrycia toksyny botulinowej.
Czynnik wywołujący zatrucie jadem kiełbasianym, Clostridium botulinum, wytwarza toksyny siedmiu serotypów (A, B, C, D, E, F, G), ale częściej występują serotypy A, B i E. Wszystkie toksyny różnią się właściwościami antygenowymi i mogą różnicować w reakcjach przy użyciu surowicy specyficznej dla typu. W tym celu można przeprowadzić reakcję hemaglutynacji biernej (pośredniej) z surowicą pacjenta, w której zakłada się obecność toksyny i krwinek czerwonych obciążonych przeciwciałami antytoksycznych surowicy antybotulinowej typu A, B, E. Normalny surowica służy jako kontrola.
Ryż. 3. Oświadczenie i wynik RNGA.
Księgowość. W przypadku pozytywnym czerwone krwinki osiadają na dnie otworu w postaci równej warstwy komórek o złożonej lub postrzępionej krawędzi (odwrócony parasol), w przypadku negatywnym osiadają w postaci guzika lub pierścienia .
Wnioski: W surowicy pacjentki wykryto toksynę botulinową typu E.
Reakcja hamowania hemaglutynacji (HTZ).
Ryż. 8. Reakcja hamowania hemaglutynacji (HAI) (schemat).
Zasada reakcji opiera się na zdolności AT do wiązania różnych wirusów i neutralizowania ich, uniemożliwiając aglutynację czerwonych krwinek. Wizualnie efekt ten objawia się „hamowaniem” hemaglutynacji. RTGA stosuje się w diagnostyce infekcji wirusowych w celu identyfikacji specyficznych antyhemaglutynin i identyfikacji różnych wirusów na podstawie ich hemaglutynin, które wykazują właściwości Ag.
Typowanie wirusa przeprowadza się w reakcji RTGA z zestawem surowic specyficznych dla danego typu wirusa. Wyniki reakcji uwzględnia się przy braku hemaglutynacji. Podtypy wirusa typu A z antygenami H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 i innymi można różnicować w RTGA za pomocą zestawu homologicznych, specyficznych dla typu surowic
Ryż. 9. Wyniki RTGA typowania wirusa grypy
Legenda: - hamowanie hemaglutynacji (przycisk); - hemaglutynacja (parasol).
Wnioski: Badany materiał zawiera wirusa grypy typu A z antygenem H3N2
Pośrednia (pasywna) reakcja hemaglutynacji (IRHA) polega na tym, że krwinki czerwone, jeśli na ich powierzchni zaadsorbowany zostanie rozpuszczalny antygen, nabywają zdolność do aglutynacji w wyniku interakcji z przeciwciałami skierowanymi przeciwko zaadsorbowanemu antygenowi. Schemat RNGA pokazano na ryc. 34. RNGA jest szeroko stosowane w diagnostyce szeregu infekcji.
Ryż. 34. Schemat biernej reakcji hemaglutynacji (RPHA). A - uzyskanie diagnostyki erytrocytów: B - RPGA: 1 - erytrocyt: 2 - badany antygen; 3 - diagnostyka erytrocytów; 4 - przeciwciało przeciwko badanemu antygenowi: 5 - aglutynacja
Ustawianie reakcji. Surowicę testową podgrzewa się przez 30 minut w temperaturze 56°C, rozcieńcza kolejno w stosunku 1:10 - 1:1280 i wlewa do probówek lub studzienek po 0,25 ml, do których wprowadza się 2 krople erytrocytów diagnostycznych (erytrocyty z zaadsorbowanym na nich antygenem) ) są następnie dodawane.
Kontrole: zawiesina diagnostyki erytrocytów ze znaną surowicą immunologiczną; zawieszenie diagnostyki w normalnej surowicy; zawiesina prawidłowych czerwonych krwinek w surowicy testowej. W pierwszej kontroli powinna nastąpić aglutynacja, w drugiej i trzeciej nie powinna wystąpić.
Za pomocą RIGA można wykryć nieznany antygen, jeśli znane przeciwciała zostaną zaadsorbowane na czerwonych krwinkach.
Reakcję hemaglutynacji można przeprowadzić w objętości 0,025 ml (mikrometoda) przy użyciu mikrotitratora Takachi.
1. Co to oznacza? wynik pozytywny RHA pomiędzy czerwonymi krwinkami a materiałem badanym na obecność wirusa?
2. Czy nastąpi aglutynacja czerwonych krwinek, jeśli doda się do nich wirusa i odpowiadającą mu surowicę? Jak nazywa się reakcja, która ujawnia to zjawisko?
Ćwiczenia
Weź pod uwagę i zarejestruj wynik RYGA.
Reakcja wytrącania
W reakcji strącania wytrąca się specyficzny kompleks immunologiczny, składający się z rozpuszczalnego antygenu (lizat, ekstrakt, hapten) i swoistego przeciwciała w obecności elektrolitów.
Mętny pierścień lub osad powstały w wyniku tej reakcji nazywany jest osadem. Reakcja ta różni się od reakcji aglutynacji głównie wielkością cząstek antygenu.
Reakcja strącania jest zwykle stosowana do oznaczania antygenu w diagnostyce szeregu infekcji ( wąglik zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych itp.); w medycynie sądowej – w celu określenia gatunku krwi, nasienia itp.; w badaniach sanitarno-higienicznych – przy stwierdzeniu fałszerstwa produktów; za jego pomocą określa się pokrewieństwo filogenetyczne zwierząt i roślin. Do reakcji potrzebujesz:
1. Przeciwciała (precypityny) - surowica odpornościowa z wysokie miano przeciwciała (nie mniej niż 1:100000). Miano wytrącającej się surowicy określa się na podstawie największego rozcieńczenia antygenu, z którym reaguje. Serum stosuje się najczęściej w postaci nierozcieńczonej lub w rozcieńczeniu 1:5 – 1:10.
2. Antygen - rozpuszczone substancje o charakterze polisacharydów białkowych lub lipidowych (pełne antygeny i hapteny).
3. Roztwór izotoniczny.
Głównymi metodami prowadzenia reakcji wytrącania są: reakcja wytrącania pierścieniowego i reakcja wytrącania na agarze (żelu).
Uwaga! Wszystkie składniki biorące udział w reakcji wytrącania muszą być całkowicie przezroczyste.
Reakcja wytrącania pierścienia. Za pomocą pipety Pasteura dodać 0,2-0,3 ml (5-6 kropli) surowicy do probówki do strącania (surowica nie powinna dostać się na ścianki probówki). Antygen w tej samej objętości ostrożnie nakłada się warstwami na surowicę, wylewając ją cienką pipetą Pasteura wzdłuż ścianki probówki. Probówkę trzyma się w pozycji pochylonej. Po prawidłowym nałożeniu warstw powinna istnieć wyraźna granica między surowicą a antygenem. Ostrożnie, aby nie wymieszać płynu, probówkę należy umieścić w stojaku. Jeśli reakcja jest pozytywna, na styku antygenu i przeciwciała tworzy się mętny „pierścień” - osad (patrz ryc. 48).
Reakcji towarzyszy szereg kontroli (Tabela 18). Bardzo ważna jest kolejność dodawania składników reakcji do probówki. Nie można nakładać surowicy na antygen (w kontroli - na roztwór izotoniczny), ponieważ gęstość względna surowicy jest większa, wówczas opadnie ona na dno probówki, a granica między płynami nie zostanie ujawniona.
Tabela 18. Schemat przygotowania reakcji wytrącania pierścienia
Notatka. + obecność „pierścienia”; - brak „pierścienia”.
Wyniki rejestruje się po 5-30 minutach, w niektórych przypadkach po godzinie, jak zawsze, zaczynając od kontroli. „Pierścień” w drugiej probówce wskazuje zdolność surowicy odpornościowej do wniknięcia konkretna reakcja z odpowiednim antygenem. W 3-5 probówkach nie powinno być „pierścieni” - nie ma odpowiadających sobie przeciwciał i antygenów. „Pierścień” w I probówce – wynik reakcji dodatni – oznacza, że antygen testowy odpowiada pobranej surowicy odpornościowej, brak „pierścienia” („pierścień” tylko w II probówce) wskazuje na ich niezgodność – wynik negatywny wynik reakcji.
Reakcja wytrącania na agarze (żel). Osobliwością tej reakcji jest to, że interakcja antygenu i przeciwciała zachodzi w gęstym ośrodku, tj. W żelu. Powstały osad daje mętną smugę na grubości podłoża. Brak pasma wskazuje na rozbieżność pomiędzy składnikami reakcji. Reakcja ta jest szeroko stosowana w badaniach biomedycznych, w szczególności w badaniu powstawania toksyn w czynniku wywołującym błonicę.
Pytania kontrolne
1. Jaka jest główna różnica pomiędzy reakcjami aglutynacji i strącania?
2. Dlaczego w reakcji wytrącania nie można używać składników mętnych?
Ćwiczenia
1. Ustaw reakcję wytrącania pierścienia i naszkicuj wynik.
2. Zbadaj charakter oddziaływania antygenu z przeciwciałem w reakcji strącania na agarze, naszkicuj wynik (odbierz kubek od nauczyciela).
Reakcja lizy (cytoliza immunologiczna)
Liza immunologiczna polega na rozpuszczeniu komórek pod wpływem przeciwciał obowiązkowy udział komplement. Do reakcji potrzebujesz:
1. Antygen – drobnoustroje, czerwone krwinki lub inne komórki.
2. Przeciwciało (lizyna) – surowica immunologiczna, rzadziej surowica pacjenta. Surowica bakteriolityczna zawiera przeciwciała biorące udział w lizie bakterii; hemolityczny - hemolizyny, które promują lizę czerwonych krwinek; do lizy krętków potrzebne są spirochetolizyny, komórki - itolizyny itp.
3. Uzupełnij. Najwięcej uzupełnień w surowicy świnki morskie. To serum (mieszanka kilku zwierząt) jest zwykle stosowane jako uzupełnienie. Świeży (natywny) dopełniacz jest niestabilny i łatwo ulega zniszczeniu w wyniku ogrzewania, wstrząsania czy przechowywania, dlatego można go zużyć nie dłużej niż dwa dni od otrzymania. Aby zachować dopełniacz, dodaje się do niego 2%. kwas borowy i 3% siarczan sodu. Dodatek ten można przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie dwa tygodnie. Najczęściej stosuje się suchy dopełniacz. Przed użyciem rozpuszcza się w roztworze izotonicznym do pierwotnej objętości (wskazanej na etykiecie).
4. Roztwór izotoniczny.
Reakcja hemolizy(Tabela 19). Do reakcji potrzebujesz:
1. Antygen - 3% zawiesina przemytych erytrocytów owczych w ilości 0,3 ml osadu erytrocytów i 9,7 ml roztworu izotonicznego.
2. Przeciwciało - surowica hemolityczna (hemolizyna) przeciwko erytrocytom owczym; zwykle przygotowywany w produkcji, liofilizowany i miano wskazane na etykiecie.
Miano hemolizyny to najwyższe rozcieńczenie surowicy, przy którym następuje całkowita hemoliza 3% zawiesiny czerwonych krwinek w obecności dopełniacza. Do reakcji hemolizy hemolizynę pobiera się w potrójnym mianowaniu, tj. rozcieńcza się 3 razy mniej niż przed mianem. Na przykład przy mianie surowicy wynoszącym 1:1200 surowicę rozcieńcza się 1:400 (0,1 ml surowicy * i 39,9 ml roztworu izotonicznego). Nadmiar hemolizyny jest konieczny, ponieważ część z niej może zostać zaadsorbowana przez inne składniki reakcji.
* (Nie należy przyjmować mniej niż 0,1 ml surowicy - ucierpi na tym dokładność pomiaru.)
3. Dopełniacz rozcieńcza się w stosunku 1:10 (0,2 ml dopełniacza i 1,8 ml roztworu izotonicznego).
4. Roztwór izotoniczny.
Tabela 19. Schemat reakcji hemolizy
Rozliczanie wyników. Jeśli reakcja zostanie przeprowadzona prawidłowo, w pierwszej probówce nastąpi hemoliza - jej zawartość stanie się przezroczysta. W kontrolach płyn pozostaje mętny: w 2. probówce nie ma wystarczającej ilości dopełniacza, aby nastąpiła hemoliza, w 3. probówce nie ma hemolizyny, w 4. probówce nie ma ani hemolizyny ani dopełniacza, w piątej probówce antygen nie występuje nie pasuje do przeciwciała,
W razie potrzeby miareczkuje się surowicę hemolityczną według poniższego schematu (Tabela 20).
Przed miareczkowaniem przygotować początkowe rozcieńczenie surowicy 1:100 (0,1 ml surowicy i 9,9 ml roztworu izotonicznego), z którego niezbędne rozcieńczenia, Na przykład:
Z tych rozcieńczeń dodać 0,5 ml surowicy do probówek do miareczkowania, jak pokazano w tabeli. 20.
Tabela 20. Schemat miareczkowania surowicy hemolitycznej (hemolizyny)
W przykładzie podanym w tabeli. 20, miano surowicy hemolitycznej wynosi 1:1200.
Stosując świeżą surowicę hemolityczną należy ją inaktywować, aby zniszczyć obecny w niej dopełniacz. W tym celu ogrzewa się go przez 30 minut w temperaturze 56°C w łaźni wodnej lub w inaktywatorze z termostatem. Ta druga metoda jest lepsza: eliminuje możliwość przegrzania serwatki, czyli jej denaturacji. Surowice zdenaturowane nie nadają się do badania.
Reakcja bakteriolizy. W tej reakcji dopełniacz powoduje lizę bakterii w obecności odpowiedniej (homologicznej) surowicy. Schemat reakcji jest zasadniczo podobny do schematu reakcji hemolizy. Różnica polega na tym, że po dwugodzinnej inkubacji wszystkie probówki wysiewa się na szalki Petriego z pożywką korzystną dla mikroorganizmu przyjętego do doświadczenia, aby sprawdzić, czy uległa ona lizie. Jeżeli doświadczenie zostanie przeprowadzone prawidłowo, hodowle z 2-5 probówek (kontroli) powinny wykazywać obfity wzrost. Brak wzrostu lub słaby wzrost w inokulacji z pierwszej probówki (eksperyment) wskazuje na śmierć drobnoustrojów, czyli na to, że są one homologiczne z przeciwciałem.
Uwaga! Reakcję bakteriolizy należy przeprowadzić w warunkach aseptycznych.
Pytania kontrolne
1. Co stanie się z czerwonymi krwinkami, jeśli zamiast izotonicznego roztworu chlorku sodu zostanie użyta woda destylowana? Jaka jest podstawa tego zjawiska?
2. Jaka reakcja nastąpi w przypadku interakcji erytrocytów z homologiczną surowicą odpornościową przy braku dopełniacza?
Ćwiczenia
Ustawić reakcję hemolizy. Zapisz i naszkicuj wynik.
Powiązana informacja.
