واکنش آگلوتیناسیون (از لات آگلوتیناسیون- چسباندن) - چسباندن سلول ها (باکتری ها، گلبول های قرمز و غیره) توسط آنتی بادی ها در حضور الکترولیت ها.

واکنش آگلوتیناسیونخود را به شکل ورقه‌ها یا رسوبات متشکل از ذرات (مثلاً باکتری) که توسط آنتی‌بادی‌ها به هم چسبیده‌اند نشان می‌دهد (شکل 7.37). واکنش آگلوتیناسیون برای: تعیین پاتوژن جدا شده از بیمار استفاده می شود. تعیین آنتی بادی در سرم خون بیمار؛ تعیین گروه های خونی

برنج. 7.37 a, b. واکنش آگلوتیناسیون باIgM-آنتی بادی (a) وIgG- آنتی بادی ها (ب)

1. تعیین پاتوژن جدا شده از بیمار واکنش آگلوتیناسیون تقریبی روی شیشه (شکل 7.38). سوسپانسیون باکتری جدا شده از بیمار به یک قطره سرم آگلوتینه کننده (رقت 1:20) اضافه می شود. یک رسوب لخته تشکیل می شود.

برنج. 7.38.

یک واکنش آگلوتیناسیون گسترده با یک پاتوژن جدا شده از یک بیمار (شکل 7.39). یک سوسپانسیون از باکتری های جدا شده از بیمار به رقت های سرم آگلوتینه کننده اضافه می شود.

برنج. 52

2. تعیین آنتی بادی در سرم خون بیمار
واکنش آگلوتیناسیون دقیق با سرم خون بیمار (شکل 7.39). Diagnosticum به رقت های سرم بیمار اضافه می شود.
- آگلوتیناسیون با O-diagnosticum (باکتری که در اثر گرما کشته می شود، آنتی ژن O را حفظ می کند) به شکل آگلوتیناسیون ریزدانه رخ می دهد.
- آگلوتیناسیون با H-diagnosticum (باکتری های کشته شده توسط فرمالدئید، حفظ آنتی ژن H تاژکدار) زیاد است و سریعتر اتفاق می افتد.
3. واکنش آگلوتیناسیون برای تعیین گروه های خونیواکنش آگلوتیناسیون برای تعیین گروه های خونی برای ایجاد سیستم ABO (جدول b) با استفاده از آگلوتیناسیون گلبول های قرمز با آنتی بادی های سرم ایمنی علیه آنتی ژن های گروه خونی A (I)، B (III) استفاده می شود. کنترل این است: سرمی که حاوی آنتی بادی نباشد، یعنی. گروه خونی AB (IV) سرم؛ آنتی ژن های موجود در گلبول های قرمز خون گروه های A (II)، B (III). کنترل منفی حاوی آنتی ژن نیست، یعنی از گلبول های قرمز گروه O (I) استفاده می شود.

جدول 7.6. تعیین گروه های خونی ABO

نتایج واکنش		گروه
		متعلق
		تحقیق کرد خون
گلبول های قرمز خون با	سرم (پلاسما)
استاندارد	با استاندارد
سرم ها

واکنش آگلوتیناسیون (RA) چسبندگی و رسوب میکروب ها یا سلول های دیگر تحت تأثیر آنتی بادی ها در حضور الکترولیت است. رسوب حاصل را آگلوتینات می نامند.

RA استفاده می شود:

1. برای تشخیص آنتی بادی در سرم خون بیمار (سروداگنوز).

2. تعیین نوع و سرووار کشت خالص میکروارگانیسم های بیماری زا جدا شده از بیمار (سروتایپینگ).

واکنش آگلوتیناسیون برای تعیین آنتی بادی ها در سرم خون بیماران استفاده می شود، به عنوان مثال، با تب حصبه و تب پاراتیفوئید (واکنش ویدال)، بروسلوز (واکنش رایت، هدلسون)، تولارمی، لپتوسپیروز و غیره. بیماری های عفونیو همچنین برای تعیین پاتوژن جدا شده از بیمار ( عفونت های روده ای، سیاه سرفه و غیره). RA برای تعیین گروه های خونی، فاکتور Rh و غیره استفاده می شود.

واکنش به اجزای زیر نیاز دارد:

1. آنتی ژن (آگلوتینوژن) باید کورپوسکولار باشد، یعنی سوسپانسیون میکروارگانیسم های زنده یا کشته شده (تشخیص m)، گلبول های قرمز یا سلول های دیگر است. به طور معمول، از کشت روزانه میکروارگانیسم های رشد یافته بر روی کج آگار استفاده می شود. کشت با 3 تا 4 میلی لیتر محلول ایزوتونیک شسته شده، به یک لوله استریل منتقل شده و دانسیته تعیین می شود. سوسپانسیون باید همگن بوده و حاوی حداکثر 3 میلیارد سلول میکروبی در هر 1 میلی لیتر باشد. استفاده از سوسپانسیون میکروب های کشته شده - تشخیصی - کار را تسهیل می کند (تهیه شده در تولید).

2. آنتی بادی ها (آگلوتینین ها) در سرم بیمار (در حین تشخیص سروی) یا در سرم آگلوتینه کننده (در حین سروتیپ) یافت می شوند. سرم های آگلوتینه کننده با ایمن سازی خرگوش ها با باکتری های کشته شده به دست می آیند.

تیتر آگلوتینه کنندهسرم بالاترین رقت آن نامیده می شود که در آن تحت شرایط آزمایشی خاص با آنتی ژن مربوطه واکنش نشان می دهد.

سرم های آگلوتینه کننده می توانند بومی (غیر جذبی) و جذب شونده باشند. سرم های بومی در رقت های کوچک نه تنها با نوع میکروارگانیسم هایی که حیوان با آنها برای به دست آوردن سرم واکسینه شده است، بلکه با انواع میکروارگانیسم های مرتبط نیز تعامل دارد، زیرا آنها حاوی آنتی بادی های گروهی هستند (آنتی بادی برای میکروارگانیسم هایی که آنتی ژن های مشترک دارند). سرم های بومی برای یک واکنش آگلوتیناسیون دقیق (برای تشخیص سرمی) استفاده می شود که نه تنها حضور واکنش، بلکه پویایی افزایش تیتر آنتی بادی را نیز در نظر می گیرد.

اگر آنتی بادی های گروهی از سرم بومی از طریق تعامل با باکتری های مرتبط که دارای آنتی ژن های گروهی هستند استخراج (جذب) شوند، سرم های جذب شده به دست می آیند. سرم های جذب شده می توانند تک گیرنده (یا نوع خاص) باشند که حاوی آنتی بادی فقط برای یک گیرنده آنتی ژن هستند.سرم های چند ظرفیتی از مخلوطی از چندین سرم جذب شده یا غیرجذب تشکیل شده است. سرم های جذب شده برای واکنش آگلوتیناسیون شیشه استفاده می شود.

هنگامی که حیوانات با باکتری های متحرک با آنتی ژن H ایمن سازی می شوند، سرم های آگلوتینه کننده H حاوی آنتی بادی های H بدست می آیند (به عنوان مثال، سرم آگلوتینه کننده H-مونورسپتور سالمونلا). با ایمن سازی با آنتی ژن O، سرم های آگلوتینه کننده O حاوی آنتی بادی های O به دست می آیند (به عنوان مثال، سرم O-aglutinating جذب شده توسط گروه سالمونلا، سرم O-aglutinating آنتی کلرا). با ایمن سازی با آنتی ژن های H و O، سرم هایی با آنتی بادی های H و O بدست می آید.

علاوه بر این، O-اگلوتینین ها یک آگلوتینات ریزدانه تولید می کنند و H-اگلوتینین ها یک رسوب دانه درشت تولید می کنند.

3. محلول الکترولیت - ایزوتونیک NaCl (محلول کلرید سدیم 9/0 درصد تهیه شده در آب مقطر).

دو روش اصلی برای انجام واکنش آگلوتیناسیون وجود دارد: واکنش روی شیشه (که گاهی اوقات واکنش نشانگر یا صفحه ای نامیده می شود) و واکنش دقیق (در لوله های آزمایش).

راه اندازی واکنش آگلوتیناسیون روی شیشه دو قطره سرم و یک قطره محلول کلرید سدیم ایزوتونیک روی یک اسلاید شیشه ای بدون چربی ریخته می شود. سرم آگلوتینه کننده تشخیصی در یک رقت گرفته می شود که بسته به تیتر آن 1:10، 1:25، 1:50 یا 1:100 است. کشت میکروارگانیسم مورد مطالعه با استفاده از یک حلقه به یک قطره سرم و یک قطره محلول ایزوتونیک اضافه شده و کاملاً مخلوط می شود. یک قطره کلرید سدیم با میکروارگانیسم ها کنترل آنتی ژن است، یک قطره سرم بدون میکروارگانیسم کنترل سرم است. شما نمی توانید کشت را از یک قطره با سرم به قطره با NaCl انتقال دهید. واکنش در دمای اتاق به مدت 1-3 دقیقه انجام می شود. اگر کنترل سرم شفاف باقی بماند، کدورت یکنواختی در کنترل آنتی ژن مشاهده شود و در قطره ای که کشت با سرم مخلوط می شود، تکه های آگلوتینه ظاهر شوند، نتیجه مثبت در نظر گرفته می شود. اگر کدورت یکنواخت در قطره با سرم و آنتی ژن وجود داشته باشد، این یک نتیجه منفی است. واکنش در پس زمینه تاریک به وضوح قابل مشاهده است.

سرم

1. کنترل آنتی ژن

2. کنترل سرم

واکنش های ایمنی کاربرد واکنش های ایمنی در تشخیص بیماری های عفونی.

طرح:

انواع واکنش های ایمنی

شرایط برای انجام واکنش های سرولوژیکی.

سرم مورد نیاز

مفهوم نتایج مثبت و منفی.

مطالب اصلی:

انواع واکنش های ایمنی

واکنش ایمونولوژیک – این برهمکنش یک آنتی ژن با یک آنتی بادی است که با برهمکنش خاص مراکز فعال آنتی بادی (پاراتوپ) با اپی توپ های آنتی ژن مشخص می شود.

طبقه بندی کلی واکنش های ایمونولوژیک:

واکنش های سرولوژیکی - واکنش بین آنتی ژن ها (Ag) و آنتی بادی ها (Ig)

درونکشتگاهی ;

واکنش های سلولی با مشارکت سلول های ایمنی بدن؛

تست های آلرژی - تشخیص حساسیت

واکنش های سرولوژیکی: 1) تعریف، 2) مراحل، 3) اهداف، 4) طبقه بندی کلی.

1) تعریف

روش های سرولوژیکیتحقیق (از سرم لاتین - سرم و آرم - آموزش) با استفاده از واکنش آنتی ژن-آنتی بادی.

2) فازها

2 مرحله تعامل:

من. خاص (قابل مشاهده) - به سرعت رخ می دهد، آنتی بادی ها با آنتی ژن های مربوطه خود ترکیب می شوند. در طول این مرحله، گروه های تعیین کننده آنتی ژن ها (AG) و مراکز فعال آنتی بادی ها (AT) با هم تعامل دارند.

نیروهای درگیر در تشکیل مجموعه AG + AT عبارتند از:

آویز؛

واندروالس

پیوند های هیدروژنی.

هیچ یک تغییرات قابل مشاهدهدر این فاز نیست میکروسکوپ الکترونی کمپلکس AG+AT را به شکل شبکه نشان می دهد.

II. غیر اختصاصی - به آهستگی اتفاق می افتد، کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی حاصل با یک عامل محیطی غیر اختصاصی اضافی واکنش نشان می دهد که در آن واکنش رخ می دهد و این با چشم قابل مشاهده است - چسباندن، انحلال، دانه های رسوب و غیره. در حضور الکترولیت، بار کاهش می یابد. حلالیت کاهش می یابد، کنگلومراهای قابل مشاهده تشکیل می شوند، رسوب می کنند (آگلوتینه).

3) تعیین اهداف :

الف) برای شناسایی آنتی ژن (سرم تشخیصی شناخته شده آنتی بادی):

• در مواد پاتولوژیک (تشخیص سریع)؛

  در فرهنگ ناب:

  1. شناسایی سرولوژیکی (شناسایی گونه)؛

     سروتیپ (تعیین سرووار) - تعیین سویه.

ب) برای شناسایی آنتی بادی ها (Ig) (آنتی ژن شناخته شده-diagnosticum است):

• حضور (واکنش های کیفی)؛

  مقادیر (افزایش تیتر - روش "سرم جفت").

4) طبقه بندی کلی واکنش های سرولوژیکی :

الف) ساده (2 جزء: Ag+Ig):

واکنش های آگلوتیناسیون RA (با آنتی ژن کورپوسکولار)؛

واکنش های رسوب PR (با آنتی ژن محلول)؛

ب) کمپلکس (3 جزء: Ag+Ig+C).

ج) استفاده از تگ

انواع واکنش های آگلوتیناسیون و بارش

واکنش آگلوتیناسیون :

واکنش آگلوتیناسیون (RA) یک واکنش ایمنی از برهم کنش تعلیق آنتی ژن ها (گلبول های قرمز، باکتری ها) با آنتی ژن ها در محلول فیزیولوژیکی است.

در طول آگلوتیناسیون، ذرات AT به هم می چسبند و رسوب لخته ای تشکیل می دهند.

واکنش هماگلوتیناسیون غیرفعال(RPGA) نوعی واکنش آگلوتیناسیون است که در آن از آنتی بادی یا آنتی ژن تشخیصی گلبول قرمز استفاده می شود (گلبول های قرمز با AT یا AG جذب شده در سطح آنها).

گلبول های قرمز خون به عنوان حامل های غیرفعال در این واکنش عمل می کنند.

ارزیابی نتایج RPGA به شرح زیر انجام می شود:

- در واکنش مثبت گلبول های قرمز غیرفعال چسبیده پایین سوراخ U یا V شکل را در یک لایه یکنواخت با لبه های اسکالوپ ("چتر") می پوشانند.

- در واکنش منفی (در غیاب آگلوتیناسیون)، گلبول های قرمز خون در شکاف مرکزی سوراخ جمع می شوند و یک "دکمه" فشرده با لبه های مشخص را تشکیل می دهند.

تست مهار هماگلوتیناسیون (HAI) در تشخیص عفونت های ویروسی استفاده می شود. برخی از ویروس ها حاوی پروتئینی به نام هماگلوتینین در سطح خود هستند که گلبول های قرمز خون را به هم می چسباند. افزودن آنتی بادی های ضد ویروسی خاص هماگلوتینین ویروسی را مسدود می کند - هماگلوتیناسیون وجود ندارد.

واکنش هماگلوتیناسیون غیر مستقیم (IRHA) یا واکنش کومبس، برای تعیین آنتی بادی های ناقص استفاده می شود. افزودن سرم آنتی گلوبولین (AT در برابر Ig انسانی) نتایج واکنش را افزایش می دهد. RNGA برای تعیین فاکتور Rh استفاده می شود.

برای انجام یک واکنش آگلوتیناسیون (RA)، سه جزء مورد نیاز است:

1) آنتی ژن (آگلوتینوژن) AG;

2) پادتن(آگلوتینین) AT;

3) الکترولیت (محلول ایزوتونیک کلرید سدیم).
Ag + AT + الکترولیت = آگلوتینه

آگلوتیناسیون (از لاتین agglutinatio - چسباندن) - چسباندن ذرات (باکتری ها، گلبول های قرمز و غیره) با آنتی بادی ها در حضور الکترولیت ها - کلرید سدیم.

آرتریت روماتوئید به شکل ورقه‌ها یا رسوبات متشکل از سلول‌ها (مثلاً باکتری‌ها، گلبول‌های قرمز) که توسط آنتی‌بادی‌ها به هم چسبیده‌اند، ظاهر می‌شود.

RA برای موارد زیر استفاده می شود:

واکنش آگلوتیناسیون میکروبی مستقیم (RA).

در این واکنش، آنتی بادی ها (آگلوتینین ها) به طور مستقیم آنتی ژن های بدن (آگلوتینوژن ها) را آگلوتینه می کنند.

آنها معمولاً با سوسپانسیون میکروارگانیسم های غیرفعال (واکنش آگلوتیناسیون میکروبی) نشان داده می شوند.

برای تعیین نوع میکروارگانیسم ها استفاده کنیدآگلوتیناسیون تشخیصی استاندارد سرم ( AT معروف ).

شایع ترین آنها RA لایه ای (تقریبی) و منبسط شده هستند.

صفحه RA روی شیشه قرار می گیرد. از آن به عنوان استفاده کنید روش تسریع شدهشناسایی آنتی بادی ها یا شناسایی میکروارگانیسم ها.

اجزاء:

1. سرم آگلوتیناسیون تشخیصی استاندارد (AT);

2. کشت خالص تحت مطالعه از بیمار.

3. محلول نمک.

در کشت خالص مورد مطالعه، آنتی ژن ها (AG) به شکل ذرات (سلول های میکروبی، گلبول های قرمز و سایر آنتی ژن های بدن) هستند که توسط آنتی بادی ها به هم چسبیده و رسوب می کنند.

مثال:

صحنه سازی نشان دهنده واکنش های آگلوتیناسیون (RA ) روی شیشه به منظور شناسایی باکتری های کلیفرم

قطره ها را روی یک اسلاید شیشه ای بمالید:

1 اسهال خونی ;
2 - قطره - سرم آگلوتینه کننده در برابر عوامل بیماری زاتب حصبه ;

(1-2 سرم تشخیصی)
3 قطره -ام: - محلول نمک (شاهد).
کشت خالص باکتریایی آزمایش شده را به هر قطره اضافه کنید. هم بزنید.

نتیجه : مثبت - وجود تکه های آگلوتینه،
منفی - عدم وجود تکه های آگلوتینه
نتیجه:باکتری های مورد مطالعه عوامل ایجاد کننده تب حصبه هستند (آنتی ژن ها مشخص شد).

برای تعیین AT در سرم بیمار (تشخیص سرولوژیکی)، یک میکروبی استانداردتشخیصی ، حاوی تعلیقمعروف میکروب ها یا آنتی ژن های آنهاAG .

تعیین گروه های خونی ABO (واکنش هماگلوتیناسیون (HRA)) - گلبول های قرمز خون را آگلوتینه می کند.

اجزای واکنش:

1. AG (گلبول های قرمز) خون را آزمایش می کند

2. AT (آریتروتست - زولیکلون)

مجموعه زولیکلون ها:

معرف ضد A کولیکلون (صورتی)

معرف کولیکلون آنتی بی (آبی)

معرف Tsoliklon anti-AV (بی رنگ)

3. الکترولیت (محلول نمکی)

تکنیک تعیین:

1 .

یک قطره (0.1 میلی لیتر) زولیکن anti-A، anti-B و anti-AB به چاه های قرص (برای کنترل) ریخته می شود.

2.

در کنار هر قطره از معرف، یک قطره کوچک (0.05-0.01 میلی لیتر) از خون مورد آزمایش قرار می گیرد.

سپس یک قطره زولیکلون را با یک قطره خون با استفاده از یک میله شیشه ای تمیز مخلوط می کنند.

3.

واکنش آگلوتیناسیون در 3-5 ثانیه اول هنگامی که صفحه به آرامی تکان می خورد، ایجاد می شود.

نتایج واکنش 2.5 تا 3 دقیقه پس از مخلوط کردن قطره ها در نظر گرفته می شود. از چپ به راست در چاه ها ضد A، ضد B، ضد AB هستند.

یک نتیجه مثبت ظاهر یک رسوب دانه ای (آگلوتینه) است.

RA مثبت (+)

منفی - بدون رسوب.

RA منفی (-)

4.

تجزیه و تحلیل نتایج.

O(من) αβ - بدون آگلوتیناسیون

آ(IIβ – آگلوتیناسیون با آنتی A

ب(III) α – آگلوتیناسیون با آنتی بی

AB(IV)O – آگلوتیناسیون با آنتی A، با آنتی B

نمایش شماتیک آگلوتیناسیون.

آنتی ژن های Ag روی گلبول های قرمز (قابل تشخیص) + آنتی بادیAT(زولیکلون) سرم تشخیصی

محاسبه آگلوتیناسیون در قرص ها

واکنش بارش:

واکنش رسوبی یک واکنش ایمنی از برهمکنش آنتی ژن در حالت محلول با آنتی ژن در محلول فیزیولوژیکی است.

در طی رسوب، یک کمپلکس ایمنی ماکرومولکولی تشکیل می شود که با تبدیل یک محلول کلوئیدی شفاف به یک سوسپانسیون یا رسوب مات ظاهر می شود.

مقدار هر دو معرف باید در نسبت های کاملاً مشخص باشد، زیرا بیش از حد یکی از آنها نتیجه را کاهش می دهد.

وجود داشته باشد راه های مختلفمرحله بندی واکنش بارش

1. واکنش رسوب حلقه ای در لوله های بارش با قطر کم انجام می شود. سرم ایمنی به لوله آزمایش اضافه می شود و آنتی ژن محلول به دقت لایه بندی می شود. AG و AT به دلیل حرکت حرارتی مولکول ها با هم مخلوط می شوند و برهم کنش می کنند. در نتیجه مثبتحلقه ای از رسوب مات در مرز دو محلول تشکیل می شود.

2. واکنش ایمونودیفیوژن مضاعف Ouchterlony در یک ژل آگار انجام می شود که طبق طرح به چاهک های آن یک محلول AG یا یک محلول AT اضافه می شود. AG و AT در ژل به سمت یکدیگر منتشر می شوند و در صورت مثبت بودن واکنش، کمپلکس های ایمنی را به صورت خطوط رسوب تشکیل می دهند.

واکنش بارش -این شکل گیری استو رسوب کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی مولکولی محلول به صورت ابری به نام رسوب. از مخلوط کردن آنتی ژن ها و آنتی بادی ها در مقادیر معادل تشکیل می شود.

اجزای RA:

سرم رسوب (AT-precipitin شناخته شده)؛

سرم آزمایش (آنتی ژن رسوب زا ناشناخته)؛

فیزیکی راه حل.

واکنش ته نشینی یا در لوله های آزمایش باریک مخصوص (واکنش رسوب حلقه ای) و یا در ظروف پتری در ژل ها، محیط های غذایی و غیره انجام می شود.

واکنش رسوب حلقه

بیان و ثبت نتایج واکنشبارش حلقهبرای تشخیص پاتوژن سیاه زخم(واکنش آسکولی).

صحنه سازی .

1. مواد مورد مطالعه (چرم، پشم، نمد، پرز، پارچه، گوشت، خاک، مدفوع حیوانات و ...) در محلول نمکی به مدت 5-45 دقیقه می جوشانند. برای به دست آوردن عصاره ایزوتونیک (عصاره). فیلتر شده.

2. سرم ضد سیاه زخم رسوب دهنده در لوله آزمایش ریخته می شود.

3. مواد مورد آزمایش (عصاره) را با دقت روی آن قرار دهید.

حسابداری .

در 10 دقیقه آینده در موارد مثبت، حلقه ای از کدورت در حد فاصل بین سرم و عصاره ظاهر می شود (رسوب حلقه). واکنش آسکولی بسیار حساس و خاص است

با کمک آن می توان به سرعت مواد آلوده به سیاه زخم را شناسایی کرد.

واکنش بارش در آگار

بیانیه و ثبت نتایجواکنش های بارش در آگاربرای تعیین سمیت کورینه باکتری ها (عوامل ایجاد کننده دیفتری)

صحنه سازی

در پتری دیش روی فسفات پپتون آگار قرار داده می شود.

1. یک نوار از کاغذ صافی استریل مرطوب شده را در امتداد وسط فنجان قرار دهید.سرم آنتی سمی.

2. پس از خشک شدن، در فاصله 1 سانتی متری از لبه نوار، پلاک هایی به قطر 10 میلی متر بذرکاری می شود.محصولات منتخب.

در یک فنجان می توانید از 3 تا 10 محصول بکارید که یکی از آنهاستکنترل، باید شناخته شودسم زا.

محصولات در یک ترموستات قرار می گیرند.

حسابداری

تجزیه و تحلیل پس از 24-48-72 ساعت انجام می شود.

نتیجه مثبت - (فرهنگسم زا) - در فاصله ای از نوار کاغذ ظاهر می شودخطوط رسوب, « فلش های پیچک"، که به وضوح در نور عبوری قابل مشاهده هستند.

شکل، واکنش بارش در آگار را برای تعیین سمیت باسیل دیفتری نشان می دهد. کشت‌های متوسط ​​«پیکان-پایک» را تشکیل ندادند؛ اینها پاتوژن‌های سمی نیستند.

سویه های عامل ایجاد کننده دیفتری می توانند سم زا (تولید کننده اگزوتوکسین) و غیر سمی باشند. تشکیل یک اگزوتوکسین بستگی به حضور در باکتری های یک پروفاژ حامل یک ژن سمی دارد که تشکیل اگزوتوکسین را رمزگذاری می کند.

در صورت بیماری، تمام پاتوژن های دیفتری از نظر سم زایی آزمایش می شوند - تولید اگزوتوکسین دیفتری با استفاده از واکنش رسوب در آگار.

واکنش های سرولوژیکی پیچیده ( 3 جزء: Ag+Ig+C):

واکنش تثبیت کمپلمان (CFR).

واکنش در دو مرحله انجام می شود.

در مرحله اول، AT با آنتی ژن و مکمل تعامل می کند؛ در مرحله دوم، یک شاخص اضافه می شود - سیستم همولیتیک (مخلوطی از گلبول های قرمز و سرم ضد گلبول قرمز).

اگر نتیجه مثبت باشد، در مرحله اول، آنتی بادی ها با آنتی ژن ها یک کمپلکس ایمنی تشکیل می دهند که مکمل مخلوط واکنش را متصل می کند.

در این حالت گلبول های قرمز سیستم همولیتیک اضافه شده در مرحله دوم از بین نمی روند.

در غیر این صورت، کمپلمان بدون پیوند باعث لیز گلبول های قرمز شاخص می شود.

برای انجام آن، پنج ماده مورد نیاز است: AG، AT و مکمل (نظام اول)، گلبول های قرمز گوسفند و سرم همولیتیک (سیستم دوم) (شکل 1).

واکنش در دو فاز انجام می شود (شکل 3).

فاز اول - تعامل آنتی ژن و آنتی بادی در طول مشارکت اجباریمتمم.

دومین - شناسایی نتایج واکنش با استفاده از سیستم همولیتیک نشانگر (گلبول های قرمز گوسفند و سرم همولیتیک). تخریب گلبول های قرمز خون توسط سرم همولیتیک تنها در صورتی اتفاق می افتد که مکمل به سیستم همولیتیک اضافه شود. اگر مکمل قبلاً روی کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی جذب شده باشد، همولیز گلبول های قرمز اتفاق نمی افتد (شکل).

نتیجه را تجربه کنید ارزیابی شده (شکل 2)، با ذکر وجود یا عدم وجود همولیز در همه لوله ها. واکنش مثبت در نظر گرفته می شود زمانی که همولیز به طور کامل به تعویق افتاد، هنگامی که مایع در لوله آزمایش بی رنگ است و گلبول های قرمز خون به ته نشست می شوند، منفی - زمانی که گلبول های قرمز کاملاً لیز می شوند، هنگامی که مایع به شدت رنگ می شود (خون "لاک" ).

درجه تاخیر همولیز بسته به شدت رنگ مایع و اندازه رسوب گلبول قرمز در پایین (++++، +++، ++، +) ارزیابی می شود.

برنج. 4. بیانیه و نتیجه RSC.

نتیجه:آنتی بادی در سرم آزمایش تشخیص داده شد.

RSK به شما امکان می دهد آنتی بادی ها را برای هر گونه از همان سروتیپ ویروس شناسایی کنید.

ارزش تشخیصیاین دارد:

افزایش چهار برابری تیتر آنتی بادی در سرم های جفت شده (در طول یک اپیدمی آنفولانزا).

افزایش دو برابری در سرم خون بیماران با تصویر بالینی مشخص.

واکنش با استفاده از یک برچسب :

این روش ها بسیار حساس هستند. رنگ ها، ایزوتوپ های رادیواکتیو، آنزیم ها و غیره به عنوان برچسب آنتی ژن ها یا آنتی بادی ها استفاده می شوند.

RIF - واکنش ایمونوفلورسانس

واکنش ایمونوفلورسانس بر اساس نور کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی است

سنجش ایمونوسوربنت مرتبط

یک آزمایش آزمایشگاهی مدرن که آنتی‌بادی‌های خاص در خون یا آنتی‌ژن‌های بیماری‌های خاص را جستجو می‌کند تا نه تنها علت، بلکه مرحله بیماری را نیز شناسایی کند.

نتایج ELISA را می توان به صورت کیفی و کمی ارائه کرد.

در حال حاضر، الایزا در شرایط زیر استفاده می شود:

1) جستجو برای آنتی بادی های خاص برای هر بیماری عفونی.

2) جستجو برای آنتی ژن های هر بیماری (عفونی، عفونی).

3) تحقیق وضعیت هورمونیصبور؛

4) بررسی نشانگرهای تومور؛

5) معاینه برای وجود بیماری های خود ایمنی.

در شکل، ELISA فاز جامد آنتی ژن های شناخته شده (در سمت چپ) را نشان می دهد که در چاه یک صفحه، (در سمت راست) در چاهک های یک صفحه آنتی ژن های شناخته شده جذب شده اند.

مزایای روش الایزا:

1) ویژگی و حساسیت بالا روش الایزا (بیش از 90%).

2) توانایی تعیین بیماری و ردیابی پویایی فرآیند، یعنی مقایسه تعداد آنتی بادی ها در دوره های زمانی مختلف.

3) در دسترس بودن تشخیص الایزا در هر موسسه پزشکی.

مضرات نسبی: تشخیص یک پاسخ ایمنی (آنتی بادی)، اما نه خود پاتوژن، کونژوگه به ​​آنزیم برچسب.

تست الایزا (مکانیسم عمومی):

اساس ایمونواسی آنزیمی واکنش ایمنی آنتی ژن و آنتی بادی با تشکیل یک کمپلکس ایمنی است: آنتی ژن-آنتی بادی، که منجر به تغییر در فعالیت آنزیمی علائم خاص روی سطح آنتی بادی ها می شود.

اجزای واکنش:

1. AG(AT) شناخته شده - روی چاه لوح.

2. AT (AG) در حال مطالعه.

3. AT با آنزیم، مخصوص کمپلکس AT(AG)-AG(AT).

4. سوبسترای کروموژنیک که با آنزیم تعامل دارد

5. محلول توقف

مراحل اصلی الایزا

1. در سطح چاه های صفحه یک آنتی ژن خالص از یک پاتوژن خاص وجود دارد. اضافه می کنند مواد بیولوژیکیبیمار، یک واکنش خاص بین این آنتی ژن و آنتی بادی مورد نظر (ایمونوگلوبولین) رخ می دهد. یک مجموعه تشکیل می شود.

2. یک مزدوج اضافه می شود - AT با آنزیم. مزدوج مخصوص کمپلکس AT-AG مرحله اول است. آنزیم فعال می شود.

3. سوبسترا اضافه می شود و آنزیم فعال با آن واکنش می دهد و رنگ بی رنگ محلول را تغییر می دهد.

4. یک محلول توقف برای توقف برهمکنش آنزیم- سوبسترا اضافه می شود.

حسابداری.

مثبت نتیجه - تغییررنگ ها، در تصویر - زرد.

آنالیز ایمونوکروماتوگرافی

روش آنالیز ایمونوکروماتوگرافی (ICA، تست های سریع) یک روش غربالگری اولیه با کیفیت بالا است که به شما امکان می دهد به سرعت، در عرض چند دقیقه، آنالیز را تحت هر شرایطی از جمله انجام دهید. "رشته".

مزایای ICA عبارتند از:

سرعت و سهولت استفاده؛

حجم نمونه کوچک، عدم آماده سازی نمونه؛

ارزانی برای تولید کننده و مصرف کننده؛

امکان تولید تست در حجم زیاد;

سهولت خواندن و تفسیر نتیجه؛

حساسیت و تکرارپذیری بالا؛

امکان تعیین کمی;

امکان استفاده از ریدرهای قابل حمل سازگار با کامپیوتر;

امکان تحلیل چندگانه

اجزاء (به کار رفته در نوار تست):

1. مزدوج با برچسب طلای کلوئیدی مخصوص آنتی ژن شناسایی شده است.

2. خط تست AT - مخصوص مجموعه AT-AG

3. Abs خط کنترل مخصوص مزدوج است.

تنظیمات ICA:

1. نمونه را در ناحیه شروع مشخص شده نوار بمالید.

2. به دست آوردن نتیجه به صورت ظاهر شدن نوارهای رنگی در محل خطوط تست و کنترل.

حسابداری

مثبت - زمانی که خط آزمایش رنگ آمیزی می شود.

منفی - در صورت عدم رنگ آمیزی خط آزمایش.

نامعتبر - اگر خط کنترل لکه دار نباشد.

مکانیسم کلی ICA:

1. نمونه بر روی قسمت شروع (صفحه نمونه) معرفی می شود و با مزدوج (یک بدنه خاص با یک برچسب رنگی) که روی پد مزدوج قرار دارد، همراه است. در نتیجه یک مجتمع رنگی تشکیل می شود.

2. کمپلکس ایمنی رنگی حاصل تحت تأثیر نیروهای مویرگی در امتداد غشای نیتروسلولزی حرکت می کند.و تعامل می کندبا خط تست ATنتیجه یک نوار صورتی-قرمز تک رنگ است.

3. AT (کونژوگه) روی باند آزمایش شده محدود نمی شودبیشتر حرکت می کند و به خط کنترل می رسد، با AT خط کنترل ارتباط برقرار می کند.در نتیجه، یک نوار رنگی دوم ظاهر می شود.اگر تجزیه و تحلیل به درستی انجام شود، خط کنترل باید همیشه ظاهر شود، صرف نظر از وجود آنتی ژن آزمایشی (آنتی بادی) در نمونه مایع بیولوژیکی.

2. شرایط انجام واکنش های سرولوژیکی.

1. وجود همولوگ - مربوط به یکدیگر آنتی ژن و آنتی بادی.

2. ظروف تمیز و خشک.

3. نسبت معینی از داروها (اغلب برابر).

4. حضور اجباری یک الکترولیت (محلول ایزوتونیک NaCl).

5. PH خنثی یا نزدیک به کمی قلیایی.

6. درجه حرارت +37 درجه سانتیگراد یا دمای اتاق (الزام مثبت).

7. کنترل آنتی ژن و کنترل سرم (آنتی بادی) انجام می شود.

3 مورد نیاز سرم

سرم باید کاملا شفاف و بدون هیچ گونه ترکیب سلولی باشد.

آنها معمولاً آن را در هفته دوم بیماری، زمانی که آنتی بادی ها از قبل در دسترس هستند، دریافت می کنند.

خون به مقدار 5-3 میلی لیتر با معده خالی یا 6 ساعت بعد از غذا گرفته می شود.

برای بدست آوردن سرم خون را به مدت 1 ساعت در دمای اتاق می گذارند یا سانتریفیوژ می کنند. سرم با دقت مکیده می شود تا عناصر تشکیل شده را جذب نکند.

سرم های ایمنی از خون افراد یا حیوانات (معمولاً خرگوش و اسب) به دست می آیند که طبق یک طرح خاص با آنتی ژن (واکسن) مربوطه ایمن سازی شده اند. سرم ها معمولاً در مرحله تولید تهیه می شوند.

4. مفهوم نتایج مثبت و منفی.

RA

با یک واکنش مثبت، گلبول های قرمز غیرفعال چسبیده کف سوراخ را در یک لایه یکنواخت با لبه های اسکالوپ ("چتر") می پوشانند. در غیاب آگلوتیناسیون، گلبول های قرمز خون در شکاف مرکزی سوراخ تجمع می یابند و یک "دکمه" فشرده با لبه های مشخص را تشکیل می دهند (تصاویر بالا را ببینید).

RP

اگر نتیجه مثبت باشد، یک حلقه شیری رنگ در سطح مشترک دو محلول تشکیل می شود (تصاویر بالا را ببینید).

الایزا.

تغییر در رنگ محلول با یک واکنش مثبت رخ می دهد.

RSK.

همولیز تاخیری - واکنش مثبت است. اگر مکمل آزاد باشد، همولیز مشاهده می شود - واکنش منفی است(تصاویر بالا را ببینید).

نتایج واکنش واسرمن:

الف - تاخیر کامل همولیز (+ + ++)؛

ب - تاخیر در همولیز (+ ++)؛

ج - تأخیر جزئی همولیز (++)؛

د - تاخیر اندک در همولیز (+)؛

د - همولیز کامل (-).

واکنش با تأخیر جزئی، مشخص و کامل همولیز مثبت است که با درجه رنگ‌آمیزی محتویات لوله‌ها از صورتی روشن تا قرمز روشن مشخص می‌شود؛ گلبول‌های قرمز غیرهمولیز شده متعاقباً یک رسوب قرمز تشکیل می‌دهند.

مشق شب:

1. مطالب را مطالعه کنید

روی ویدیو 3 یادداشت کنید

در میکروبیولوژی

"واکنش آگلوتیناسیون و انواع آن (RA)"

طرح:

1. مقدمه…………………………………………………………………………..3

2. RA روی شیشه………………………………………………………………………………….4

3. لوله آزمایش RA…………………………………………………………………………………….5

4. ادبیات مورد استفاده………………………………………………………………………………………………………

1. معرفی.

برهمکنش آنتی ژن میکروبی و آنتی بادی ها کاملاً ماهیت خاصی دارد و در بدن حیوان در خنثی کردن پاتوژن و سموم آن است. تعامل آنتی ژن و آنتی بادی در شرایط آزمایشگاهی، تحت شرایط خاص، با پدیده های قابل مشاهده (آگلوتیناسیون، رسوب، لیز ایمنی) همراه است که امکان استفاده از واکنش های AG-AT، به نام سرولوژیک (از سرم لاتین) را برای اهداف عملی فراهم می کند. کارخانه‌های زیستی آنتی‌ژن‌ها و سرم‌های ایمنی (آنتی بادی‌ها) با ماهیت مشخص (تشخیصی) تولید می‌کنند. با استفاده از چنین سرم هایی در واکنش های سرولوژیکی، می توان یک میکروارگانیسم ناشناخته را شناسایی کرد یا با استفاده از یک آنتی ژن شناخته شده، آنتی بادی های سنتز شده در بدن را در پاسخ به معرفی یک پاتوژن شناسایی کرد و در نتیجه تشخیص داد (تشخیص سرولوژیکی). علاوه بر این، از واکنش های سرولوژیکی می توان برای ارزیابی شدت پاسخ ایمنی پس از واکسیناسیون یا یک بیماری عفونی استفاده کرد.

واکنش‌های آگلوتیناسیون، مانند آگلوتیناسیون غیرمستقیم و کومبس، بر اساس برهمکنش آزمایشگاهی آنتی‌ژن‌های کورپوسکولار با آنتی‌بادی‌ها و توانایی کمپلکس‌های حاصل برای رسوب است. سلول‌های باکتریایی یا آنتی‌ژن‌های محلول استخراج‌شده از میکروارگانیسم‌ها و جذب روی سلول‌های حامل: گلبول‌های قرمز خون، ذرات لاتکس و غیره به‌عنوان آنتی‌ژن‌های کورپوسکولار استفاده می‌شوند.

تعیین کننده های آنتی ژنی آنتی ژن های کورپوسکولار به طور خاص با آنتی بادی های همولوگ (فاز خاص و نامرئی واکنش) برهم کنش می دهند و سپس کمپلکس های آنتی ژن-آنتی بادی کنگلومراهای بزرگی را تشکیل می دهند که با چشم غیر مسلح قابل مشاهده است که رسوب می کنند - یک آگلوتینات (فاز غیر اختصاصی و قابل مشاهده واکنش). ). اشکال بدون تاژک میکروب ها (Brucellae) آگلوتینان های دانه ای تولید می کنند، در حالی که شکل های تاژک دار (Escherichia، Salmonella) آگلوتینانت های پنبه ای درشت تولید می کنند که به شکل یک چتر معکوس در ته لوله آزمایش می نشینند و با تکان دادن به راحتی می شکنند. آنتی ژن ها و آنتی بادی ها فقط در حضور یک الکترولیت (محلول کلرید سدیم 0.8٪) با هم تعامل دارند. روند واکنش تحت تأثیر غلظت نمک در الکترولیت، تعداد سلول های میکروبی در سوسپانسیون، غلظت سرمی، pH، دما و عوامل دیگر است.

واکنش آگلوتیناسیون (ra).

آگلوتیناسیون خاصی وجود دارد که بر اساس برهمکنش آنتی ژن است باآنتی بادی همولوگ , موجود در بدن حیوانی که این آنتی ژن به آن وارد شده است (ایمونوآگلوتیناسیون). غیر اختصاصی (شیمیایی)، ناشی از تغییرات pH محیط، غلظت الکترولیت ها؛ خود به خود، که زمانی که باکتری ها (به شکل R) در محلول فیزیولوژیکی معلق می شوند و هنگام گرم شدن مشاهده می شود، که با تغییر در حالت کلوئیدی سلول باکتری همراه است. آنتی ژن , درگیر در آرتریت روماتوئید، آگلوتینوژن، آنتی بادی آگلوتینین و رسوب حاصله آگلوتینات نامیده می شود. هنگامی که یک آگلوتینات تشکیل می شود، نسبت کمی آنتی ژن و آنتی بادی ها مهم است (پدیده بهینه). با کمبود یا بیش از حد آنتی بادی ها، تاخیر رخ می دهد.

واکنش آگلوتیناسیون (RA) یکی از اولین واکنش های ایمونولوژیکی است که در عمل میکروبیولوژیکی استفاده می شود. برای اولین بار (1895) F. Vidal از RA برای تشخیص تب تیفوئید استفاده کرد. بعدها (1897) A. Wright از همین واکنش برای تشخیص بروسلوز در انسان استفاده کرد. RA همچنین در تشخیص پولوروز در جوجه ها، لپتوسپیروز، سقط عفونی مادیان و همچنین برای تایپ کردن کشت های میکروبی ناشناخته با استفاده از یک سرم آگلوتینه کننده شناخته شده کاربرد پیدا کرده است. RA بسیار حساس است. می توان از آن برای تشخیص 0.01 میکروگرم نیتروژن پروتئین آنتی بادی در 1 میلی لیتر استفاده کرد.

انواع مختلفی از واکنش آگلوتیناسیون ایجاد شده است که در اجرای روش شناختی و هدف مطالعه متفاوت است.

2. Ra روی شیشه.

در این نوع RA، افراد مورد آزمایش می توانند سرم یا آنتی ژن باشند، اما اغلب از این گزینه برای شناسایی میکروارگانیسم ها استفاده می شود.

1. برای شناسایی میکروارگانیسم (m/o)، یک قطره از سرم آگلوتیناسیون شناخته شده، به عنوان مثال سرم سالمونلا، و یک قطره محلول فیزیولوژیکی (شاهد) به طور جداگانه روی یک لام شیشه ای بدون چربی استفاده می شود. سپس با استفاده از حلقه باکتریولوژیک، توده باکتریایی کشت مورد مطالعه از یک کلنی در پتری دیش یا از سطح MPA کج در لوله آزمایش گرفته شده و به طور جداگانه در سرم ایمنی و محلول فیزیولوژیک معلق می شود تا سوسپانسیون همگن به دست آید. . نتیجه بعد از 2 ... 4 دقیقه در نظر گرفته می شود.

حسابداری برای نتایج: هیچ تغییری در نمونه کنترل نباید وجود داشته باشد. اگر کشت باکتری به طور خاص با سرم ایمنی مطابقت داشته باشد، پوسته های آگلوتینات ظاهر می شوند (نتیجه مثبت)؛ اگر پدیده آگلوتیناسیون وجود نداشته باشد، نتیجه گیری می شود که کشت باکتریایی مورد مطالعه با سرم ایمنی مطابقت ندارد.

2. اجازه دهید با استفاده از نمونه آزمایش رز بنگال مورد استفاده در تشخیص سرمی بروسلوز، تشخیص آنیتل ها در سرم خون آزمایش را در نظر بگیریم. 0.3 میلی‌لیتر از سرم خون حیوان مورد آزمایش و 0.03 میلی‌لیتر آنتی‌ژن بروسلوز (سلول‌های بروسلا رنگ‌آمیزی شده با بنگال رز) روی یک اسلاید شیشه‌ای اعمال می‌شود. اجزاء با تکان دادن لیوان کاملاً مخلوط می شوند و پس از 4 دقیقه نتیجه در نظر گرفته می شود.

ثبت نتایج: اگر واکنش مثبت باشد، پوسته های صورتی رنگ آگلوتینات ظاهر می شود. یک واکنش سرولوژیکی از این نوع به عنوان کیفی طبقه بندی می شود، زیرا می توان از آن برای تشخیص آنتی بادی های پاتوژن در سرم خون حیوان استفاده کرد، اما ارزیابی محتوای کمی آنها غیرممکن است.

1.1. واکنش آگلوتیناسیون (RA)

واکنش آگلوتیناسیون (RA)

واکنش آگلوتیناسیون به دلیل ویژگی، سهولت کارایی و نمایش آن، در عمل میکروبیولوژیکی برای تشخیص بسیاری از بیماری های عفونی رایج شده است.

واکنش آگلوتیناسیون بر اساس ویژگی تعامل آنتی بادی ها (آگلوتینین ها) با کل میکروبی یا سایر سلول ها (آگلوتینوژن ها) است. در نتیجه این فعل و انفعال، ذرات و آگلومراهایی به وجود می آیند که به صورت ورقه ای رسوب می کنند (آگلوتینه می شوند).

واکنش آگلوتیناسیون می تواند شامل باکتری های زنده و کشته شده، اسپیروکت ها، قارچ ها، تک یاخته ها، ریکتزیا و همچنین گلبول های قرمز خون و سایر سلول ها باشد. واکنش در دو مرحله رخ می دهد: مرحله اول (نامرئی) اختصاصی، ترکیب آنتی ژن و آنتی بادی، دوم (قابل مشاهده) غیر اختصاصی، چسباندن آنتی ژن ها، به عنوان مثال. تشکیل آگلوتینه

یک آگلوتینات زمانی تشکیل می شود که یک مرکز فعال آنتی بادی دو ظرفیتی با گروه تعیین کننده یک آنتی ژن ترکیب شود. واکنش آگلوتیناسیون، مانند هر واکنش سرولوژیکی، در حضور الکترولیت ها رخ می دهد.

از نظر خارجی، تظاهرات یک واکنش آگلوتیناسیون مثبت دارای ویژگی دوگانه است. در میکروب های تاژک دار که فقط آنتی ژن O2 سوماتیک دارند، خود سلول های میکروبی مستقیماً به هم می چسبند. به این آگلوتیناسیون ریزدانه می گویند. در عرض 18 22 ساعت رخ می دهد. v

میکروب های تاژک دار دو آنتی ژن دارند: آنتی ژن O2 سوماتیک و آنتی ژن H2 تاژک دار. اگر سلول ها توسط تاژک ها به هم بچسبند، تکه های بزرگ و شل ایجاد می شود و این واکنش آگلوتیناسیون را دانه درشت می نامند. در عرض 24 ساعت رخ می دهد.

واکنش آگلوتیناسیون را می توان هم به منظور تعیین کمی و کیفی آنتی بادی های خاص در سرم خون بیمار و هم به منظور تعیین گونه های پاتوژن جدا شده انجام داد. v

واکنش آگلوتیناسیون را می توان هم در یک نسخه توسعه یافته انجام داد که به شما امکان می دهد با سرم رقیق شده تا یک تیتر تشخیصی کار کنید و هم در یک نوع دیگر. واکنش نشان دهنده، که در اصل امکان تشخیص آنتی بادی های خاص یا تعیین گونه های پاتوژن را می دهد.

هنگام انجام یک واکنش آگلوتیناسیون دقیق، به منظور تشخیص آنتی بادی های خاص در سرم خون فرد، سرم آزمایش با رقت 1:50 یا 1:100 گرفته می شود. این به دلیل این واقعیت است که آنتی بادی های طبیعی ممکن است در غلظت های بسیار بالا در سرم کامل یا کمی رقیق شده وجود داشته باشد و سپس نتایج واکنش ممکن است نادرست باشد. ماده ای که در این نسخه از واکنش آزمایش می شود، خون بیمار است.

خون با معده خالی یا زودتر از 6 ساعت پس از غذا گرفته می شود (در غیر این صورت ممکن است قطرات چربی در سرم خون وجود داشته باشد که آن را کدر و برای تحقیق نامناسب می کند). سرم خون بیمار معمولاً در هفته دوم بیماری با جمع آوری 3 × 4 میلی لیتر خون به صورت استریل از ورید کوبیتال گرفته می شود (در این زمان حداکثر مقدار آنتی بادی های اختصاصی متمرکز می شود). یک تشخیصی تهیه شده از سلول های میکروبی کشته شده اما نابود نشده یک گونه خاص با ساختار آنتی ژنی خاص به عنوان آنتی ژن شناخته شده استفاده می شود.

هنگام انجام یک واکنش آگلوتیناسیون دقیق به منظور تعیین گونه و نوع پاتوژن، آنتی ژن یک پاتوژن زنده جدا شده از ماده مورد مطالعه است. آنتی بادی های موجود در سرم تشخیصی ایمنی شناخته شده است. v

مصون سرم تشخیصیاز خون یک خرگوش واکسینه شده به دست می آید. پس از تعیین تیتر (حداکثر رقت که در آن آنتی بادی ها شناسایی می شوند)، سرم تشخیصی با افزودن ماده نگهدارنده در آمپول ها ریخته می شود. این سرم برای شناسایی توسط ساختار آنتی ژنی پاتوژن جدا شده استفاده می شود.

گزینه های واکنش آگلوتیناسیون

این واکنش‌ها شامل آنتی‌ژن‌هایی به شکل ذرات (سلول‌های میکروبی، گلبول‌های قرمز و سایر آنتی‌ژن‌های بدن) می‌شوند که توسط آنتی‌بادی‌ها به هم چسبیده و رسوب می‌کنند.

برای انجام واکنش آگلوتیناسیون (RA)، سه جزء مورد نیاز است: 1) آنتی ژن (اگلوتینوژن). 2) آنتی بادی (آگلوتینین) و 3) الکترولیت (محلول ایزوتونیک کلرید سدیم).

واکنش آگلوتیناسیون جهت‌دار (صفحه‌ای) (RA)

یک نشانگر، یا صفحه، RA روی یک اسلاید شیشه ای در دمای اتاق قرار می گیرد. برای انجام این کار، از یک پیپت پاستور استفاده کنید تا به طور جداگانه یک قطره سرم را با رقت 1:10 1:20 و یک قطره کنترل محلول کلرید سدیم ایزوتونیک را روی شیشه بمالید. کلنی ها یا کشت روزانه باکتری ها (یک قطره تشخیص) به هر دو حلقه باکتریولوژیک وارد شده و کاملاً مخلوط می شوند. واکنش ها بعد از چند دقیقه به صورت بصری در نظر گرفته می شوند، گاهی اوقات با استفاده از ذره بین (x5). با RA مثبت، ظاهر پوسته های بزرگ و کوچک در یک قطره سرم مشخص می شود، با منفی، سرم یکنواخت کدر می ماند.

واکنش هماگلوتیناسیون غیر مستقیم (منفعل) (RNGA، RPGA)

این واکنش انجام می شود: 1) برای شناسایی پلی ساکاریدها، پروتئین ها، عصاره های باکتری ها و سایر مواد بسیار پراکنده، ریکتزیا و ویروس ها که کمپلکس هایی از آنها با آگلوتینین ها در RA معمولی دیده نمی شود، یا 2) برای تشخیص آنتی بادی ها در سرم بیماران این مواد بسیار پراکنده و کوچکترین میکروارگانیسم ها.

آگلوتیناسیون غیرمستقیم یا غیرفعال به عنوان واکنشی درک می شود که در آن آنتی بادی ها با آنتی ژن های از پیش جذب شده روی ذرات بی اثر (لاتکس، سلولز، پلی استایرن، اکسید باریم و غیره یا گلبول های قرمز گوسفند، گروه خونی I(0) انسان) تعامل می کنند.

در واکنش هماگلوتیناسیون غیرفعال (RPHA) از گلبول های قرمز خون به عنوان ناقل استفاده می شود. گلبول های قرمز حاوی آنتی ژن در حضور آنتی بادی های خاص این آنتی ژن به هم می چسبند و رسوب می کنند. گلبول های قرمز حساس شده با آنتی ژن در RPGA به عنوان یک تشخیص گلبول قرمز برای تشخیص آنتی بادی ها (سرودیاگنوز) استفاده می شود. اگر گلبول های قرمز با آنتی بادی ها (آنتی بادی گلبول قرمز تشخیصی) بارگیری شوند، می توان از آن برای شناسایی آنتی ژن ها استفاده کرد.

صحنه سازی. یک سری رقت های سریالی سرم در چاهک های پلی استایرن تهیه می شود. 0.5 میلی لیتر سرم آشکارا مثبت را به چاه ماقبل آخر و 0.5 میلی لیتر محلول فیزیولوژیکی (شاهد) را به آخرین چاه اضافه کنید. سپس 0.1 میلی لیتر از گلبول های قرمز تشخیصی رقیق شده را به همه چاه ها اضافه کنید، تکان دهید و به مدت 2 ساعت در ترموستات قرار دهید.

حسابداری. که در مورد مثبتگلبول های قرمز به شکل یک لایه یکنواخت از سلول ها با لبه تا شده یا دندانه دار (چتر معکوس) در پایین سوراخ قرار می گیرند؛ در حالت منفی به شکل یک دکمه یا حلقه می نشینند.

1.2. واکنش خنثی سازی لیز،
واکنش اپسونوفاگوسیتیک، واکنش حساسیت بیش از حد

واکنش خنثی سازی اگزوتوکسین با آنتی توکسین (RN)

این واکنش بر اساس توانایی سرم آنتی سمی برای خنثی کردن اثر اگزوتوکسین است. برای تیتراسیون سرم های آنتی توکسیک و تعیین اگزوتوکسین استفاده می شود.

هنگام تیتراسیون سرم، دوز معینی از سم مربوطه به رقت های مختلف سرم آنتی سمی اضافه می شود. هنگامی که آنتی ژن به طور کامل خنثی می شود و هیچ آنتی بادی مصرف نشده ای وجود ندارد، لخته سازی اولیه رخ می دهد. واکنش لخته سازی را می توان نه تنها برای تیتراسیون سرم (به عنوان مثال، دیفتری)، بلکه برای تیتراسیون سم و توکسوئید نیز استفاده کرد. واکنش خنثی سازی سم با آنتی توکسین به عنوان روشی برای تعیین فعالیت سرم های درمانی آنتی سمی از اهمیت عملی بالایی برخوردار است. آنتی ژن در این واکنش یک اگزوتوکسین واقعی است.

قدرت سرم آنتی سمی توسط واحدهای معمولی AE تعیین می شود.

1 AE سرم بوتولینوم مقدار آن 1000 DLM سم بوتولینوم را خنثی می کند. واکنش خنثی سازی برای تعیین گونه یا نوع اگزوتوکسین (برای تشخیص کزاز، بوتولیسم، دیفتری و غیره) می تواند در شرایط آزمایشگاهی (طبق گفته رامون) انجام شود، و هنگام تعیین سمیت سلول های میکروبی - در یک ژل ( با توجه به Ouchterlony).

واکنش لیز (RL)

یکی از خواص محافظتی سرم ایمنی توانایی آن در حل کردن میکروب ها یا عناصر سلولی وارد شده به بدن است.

آنتی بادی های خاصی که باعث انحلال سلولی (لیز) می شوند، لیزین نامیده می شوند. بسته به ماهیت آنتی ژن، آنها می توانند باکتریولیزین ها، سیتولیزین ها، اسپیروکتولیزین ها، همولیزین ها و غیره باشند.

لیزین ها اثر خود را تنها در حضور یک عامل مکمل اضافی نشان می دهند. مکمل به عنوان یک عامل غیر اختصاصی ایمنی هومورالتقریباً در تمام مایعات بدن به جز مایع مغزی نخاعی و مایع محفظه قدامی یافت می شود. محتوای نسبتاً بالا و ثابت مکمل در سرم خون انسان مشاهده شد و مقدار زیادی از آن در سرم خون وجود دارد. خوکچه هندی. در سایر پستانداران، محتوای مکمل در سرم خون متفاوت است.

مکمل است یک سیستم پیچیدهپروتئین های آب پنیر ناپایدار است و در دمای 55 درجه به مدت 30 دقیقه فرو می ریزد. در دمای اتاق، مکمل در عرض دو ساعت از بین می رود. به تکان های طولانی مدت، اسیدها و اشعه ماوراء بنفش بسیار حساس است. با این حال، مکمل برای مدت طولانی (تا شش ماه) در حالت خشک در دمای پایین ذخیره می شود. مکمل باعث لیز سلول های میکروبی و گلبول های قرمز می شود.

بین واکنش های باکتریولیز و همولیز تمایز قائل می شود.

ماهیت واکنش باکتریولیز این است که وقتی یک سرم ایمنی خاص با سلول های میکروبی زنده همولوگ مربوطه در حضور مکمل ترکیب می شود، لیز میکروبی رخ می دهد.

واکنش همولیز به این صورت است که وقتی گلبول های قرمز در حضور مکمل در معرض سرم خاصی قرار می گیرند که در برابر آنها ایمن است (همولیتیک)، انحلال گلبول های قرمز مشاهده می شود، یعنی. همولیز

واکنش همولیز در عمل آزمایشگاهی برای تعیین محدوده مکمل و همچنین ثبت نتایج استفاده می شود واکنش های تشخیصیتثبیت مکمل تیتر کمپلمان کمترین مقدار آن است که باعث لیز گلبول های قرمز خون در مدت 30 دقیقه در یک سیستم همولیتیک در حجم 2.5 میلی لیتر می شود. واکنش لیز مانند تمام واکنش های سرولوژیکی در حضور یک الکترولیت رخ می دهد.

واکنش های حساسیت بیش از حد (آلرژیک)

اشکال خاصی از آنتی ژن، پس از تماس مکرر با بدن، می تواند واکنشی را ایجاد کند که اساس آن خاص است، اما شامل عوامل سلولی و مولکولی غیر اختصاصی یک پاسخ التهابی حاد است. دو شکل شناخته شده از حساسیت وجود دارد: حساسیت نوع فوری (IHT) و افزایش حساسیت نوع تاخیری (DTH). اولین نوع واکنش با مشارکت آنتی بادی ها رخ می دهد و واکنش حداکثر 2 ساعت پس از تماس مکرر با آلرژن ایجاد می شود. نوع دوم با کمک سلول های T التهابی (Tgc) به عنوان عوامل اصلی واکنش ایجاد می شود و از تجمع ماکروفاژها در ناحیه التهاب اطمینان حاصل می کند؛ واکنش پس از 6-8 ساعت و بعد خود را نشان می دهد.

ایجاد یک واکنش حساسیت مفرط با مواجهه با آنتی ژن و بروز حساسیت، یعنی. ظهور آنتی بادی ها، لنفوسیت های فعال فعال و آنتی بادی های سیتوفیل حساس غیرفعال سایر لکوسیت ها (ماکروفاژها، گرانولوسیت ها).

واکنش های حساسیت بیش از حد دارای سه مرحله از رشد هستند: ایمونولوژیک. پاتوشیمیایی؛ پاتوفیزیولوژیک

در مرحله اول و خاص، آلرژن با آنتی بادی ها و (یا) سلول های حساس شده تعامل می کند. در مرحله دوم، انتشار بیولوژیکی رخ می دهد مواد فعالاز سلول های فعال شده واسطه های آزاد شده (هیستامین، سروتونین، لکوترین ها، برادی کینین، و غیره) باعث ایجاد اثرات محیطی مختلف مشخصه نوع متناظر از واکنش فاز سوم می شوند.

واکنش ها حساسیت بیش از حدنوع چهارم

واکنش‌های این نوع ناشی از برهمکنش‌های بین سلولی بیماری‌زای سلول‌های T-helper حساس، لنفوسیت‌های T سیتوتوکسیک (سلول‌های T-قاتل) و سلول‌های فعال شده سیستم فاگوسیت تک هسته‌ای است که در اثر تحریک طولانی‌مدت سیستم ایمنی توسط آنتی‌ژن‌های باکتریایی ایجاد می‌شود. نارسایی نسبی سیستم ایمنی بدن برای از بین بردن محیط داخلیپاتوژن های باکتریایی بیماری های عفونی. این واکنش های حساسیتی باعث ایجاد حفره های سلی ریه، نکروز موردی آنها و مسمومیت عمومی در بیماران مبتلا به سل می شود. گرانولوماتوز جلدی در سل و جذام از نظر مورفوپاتوژنتیک عمدتاً از واکنش‌های افزایش حساسیت نوع چهارم تشکیل شده است.

اکثر مثال معروفواکنش های حساسیت بیش از حد از نوع چهارم این یک واکنش Mantoux است که در محل تزریق داخل جلدی توبرکولین به بیماری که بدن و سیستمش به آنتی ژن های مایکوباکتری حساس است ایجاد می شود. در نتیجه واکنش، یک پاپول پرخون متراکم با نکروز در مرکز ایجاد می شود که تنها چند ساعت (به آهستگی) پس از تزریق داخل جلدی توبرکولین ظاهر می شود. تشکیل پاپول با آزاد شدن فاگوسیت های تک هسته ای خون در گردش از بستر عروقی به فضاهای بین سلولی آغاز می شود. همزمان، مهاجرت سلول های پلی مورفونکلئر از بستر عروقی آغاز می شود. سپس نفوذ نوتروفیل ها فروکش می کند و ارتشاح شروع به تشکیل عمدتاً از لنفوسیت ها و فاگوسیت های تک هسته ای می کند. این با واکنش مانتو و واکنش آرتوس که در آن لکوسیت‌های پلی‌مورفونوکلئر عمدتاً در محل ضایعه تجمع می‌یابند، متفاوت است.

در واکنش های حساسیت نوع 4، تحریک طولانی مدت لنفوسیت های حساس با آنتی ژن ها منجر به تغییرات پاتولوژیکبافت ها از نظر پاتولوژیک شدید و طولانی مدت سیتوکین ها توسط سلول های کمکی T آزاد می شوند. انتشار شدید سیتوکین ها در محل آسیب بافت باعث بیش فعال شدن سلول های سیستم فاگوسیت تک هسته ای واقع در آنجا می شود که بسیاری از آنها در حالت بیش فعال، رشته هایی از سلول های اپیتلیوئید را تشکیل می دهند و برخی با یکدیگر ادغام می شوند و سلول های غول پیکر را تشکیل می دهند. ماکروفاژها که در سطح آن آنتی ژن های باکتریایی و ویروسی قرار می گیرند، می توانند از طریق عملکرد Tkillers (قاتل های طبیعی) از بین بروند.

نوع چهارم واکنش حساسیت بیش از حد با شناسایی یک آنتی ژن باکتریایی خارجی توسط سلول های T helper حساس به آن ایجاد می شود. یک شرط ضروری برای شناسایی، برهمکنش القاء کننده ها با آنتی ژن هایی است که در سطح سلول های ارائه دهنده آنتی ژن پس از اندوسیتوز و پردازش ایمونوژن های خارجی توسط فاگوسیت های تک هسته ای قرار می گیرند. یکی دیگر شرط لازمقرار گرفتن در معرض آنتی ژن ها در ترکیب با مولکول های کلاس I از مجموعه اصلی سازگاری بافتی. پس از شناسایی آنتی ژن، سلول های کمکی حساس شده، سیتوکین ها و به ویژه اینترلوکین 2 را آزاد می کنند که سلول های کشنده طبیعی و فاگوسیت های تک هسته ای را فعال می کند. فاگوسیت های تک هسته ای فعال آنزیم های پروتئولیتیک و رادیکال های آزاد اکسیژن آزاد می کنند که به بافت آسیب می زند.

تست های تست آلرژی پوستی برای تعیین حساسیت بدن به آلرژن ها، تعیین سطح عفونت آن، به عنوان مثال، سل، بروسلوز، مصونیت گلهبه عنوان مثال، به تولارمی. بر اساس محل تجویز آلرژن، موارد زیر وجود دارد: 1) تست های پوستی. 2) زخم شدن؛ 3) داخل پوستی؛ 4) زیر جلدی واکنش بالینی به یک آلرژن در طی تست حساسیت پوستی به دو دسته موضعی، عمومی و کانونی و همچنین فوری و تاخیری تقسیم می شود.

واکنش های موضعی از نوع واسطه GNT بعد از 520 دقیقه رخ می دهد، به صورت اریتم و یک تاول بیان می شود، پس از چند ساعت ناپدید می شود و با روش پلاس با اندازه اریتم، برحسب میلی متر اندازه گیری می شود. واکنش‌های موضعی HRT در عرض 24-48 ساعت رخ می‌دهد، مدت زیادی طول می‌کشد، به شکل ارتشاح ظاهر می‌شود، گاهی اوقات با نکروز در مرکز، و با اندازه ارتشاح بر حسب میلی‌متر، همچنین با استفاده از سیستم پلاس ارزیابی می‌شود. با انواع سیتوتوکسیک و ایمونوکمپلکس HNT، پرخونی و نفوذ پس از 3-4 ساعت مشاهده می شود، در 6-8 ساعت به حداکثر می رسد و پس از حدود یک روز فروکش می کند. گاهی اوقات واکنش های ترکیبی مشاهده می شود.

1.3. واکنش تثبیت مکمل (FFR)

این واکنش در مطالعات آزمایشگاهی برای تشخیص آنتی بادی های سرم خون برای عفونت های مختلف و همچنین شناسایی پاتوژن با ساختار آنتی ژنی آن استفاده می شود.

واکنش تثبیت کمپلمان یک واکنش سرولوژیکی پیچیده است و بسیار حساس و اختصاصی است.

یکی از ویژگی های این واکنش این است که تغییر در آنتی ژن در طول تعامل آن با آنتی بادی های خاص تنها در حضور مکمل رخ می دهد. مکمل فقط روی کمپلکس "آنتی بادی آنتی ژن" جذب می شود. کمپلکس "آنتی ژن آنتی بادی" تنها در صورتی تشکیل می شود که بین آنتی ژن و آنتی بادی در سرم قرابت وجود داشته باشد.

جذب کمپلمان روی کمپلکس "آنتی بادی آنتی ژن" بسته به ویژگی های آنتی ژن می تواند اثرات متفاوتی بر سرنوشت آنتی ژن داشته باشد.

برخی از آنتی ژن ها تحت این شرایط تحت تغییرات مورفولوژیکی شدیدی از جمله انحلال (همولیز، پدیده ایزاف-فایفر، عمل سیتولیتیک) قرار می گیرند. برخی دیگر سرعت حرکت را تغییر می دهند (بی حرکتی ترپونما). برخی دیگر بدون تغییرات مخرب ناگهانی (اثر باکتری کش یا سیتوتوکسیک) می میرند. در نهایت، جذب مکمل ممکن است با تغییرات آنتی ژنی که به راحتی قابل مشاهده است همراه نباشد.

با توجه به مکانیسم RSC، در دو مرحله رخ می دهد:

1. فاز اول تشکیل کمپلکس «آنتی بادی آنتی ژن» و جذب روی این کمپلمان است. نتیجه فاز از نظر بصری قابل مشاهده نیست (تعامل آنتی ژن و آنتی بادی با مشارکت اجباری مکمل).
2. فاز دوم تغییر در آنتی ژن تحت تأثیر آنتی بادی های خاص در حضور مکمل است. نتیجه فاز می تواند به صورت بصری قابل مشاهده باشد یا قابل مشاهده نباشد (تشخیص نتایج واکنش با استفاده از سیستم همولیتیک نشانگر (گلبول های قرمز گوسفند و سرم همولیتیک).

تخریب گلبول های قرمز خون توسط سرم همولیتیک تنها در صورتی اتفاق می افتد که مکمل به سیستم همولیتیک اضافه شود. اگر مکمل قبلاً روی کمپلکس آنتی ژن-آنتی بادی جذب شده باشد، همولیز گلبول های قرمز اتفاق نمی افتد.

نتیجه آزمایش با ذکر وجود یا عدم وجود همولیز در تمام لوله های آزمایش ارزیابی می شود. هنگامی که همولیز کاملاً به تأخیر می افتد، هنگامی که مایع داخل لوله آزمایش بی رنگ است و گلبول های قرمز به ته نشست می شوند، واکنش مثبت در نظر گرفته می شود، زمانی که گلبول های قرمز کاملاً لیز شوند، هنگامی که مایع به شدت رنگ می شود، منفی تلقی می شود ("لاک" خون). درجه تاخیر همولیز بسته به شدت رنگ مایع و اندازه رسوب گلبول قرمز در پایین (++++، +++، ++، +) ارزیابی می شود.

در صورتی که تغییرات در آنتی ژن برای مشاهده بصری غیرقابل دسترس باقی بماند، لازم است از یک سیستم دوم استفاده شود که به عنوان یک شاخص عمل می کند و به فرد امکان می دهد وضعیت مکمل را ارزیابی کرده و در مورد نتیجه واکنش نتیجه گیری کند.

این سیستم شاخص توسط اجزای واکنش همولیز نشان داده می شود که شامل گلبول های قرمز گوسفند و سرم همولیتیک است که حاوی آنتی بادی های خاص برای گلبول های قرمز (همولیزین ها) است، اما حاوی مکمل نیست. این سیستم نشانگر یک ساعت پس از قرار دادن RSC اصلی به لوله های آزمایش اضافه می شود. اگر واکنش تثبیت مکمل مثبت باشد، یک کمپلکس آنتی ژن آنتی بادی تشکیل می شود که مکمل را روی خود جذب می کند. از آنجایی که مکمل به مقدار لازم برای یک واکنش استفاده می شود و لیز گلبول های قرمز تنها در حضور مکمل می تواند اتفاق بیفتد، پس وقتی روی کمپلکس «آنتی بادی آنتی ژن» جذب شود، لیز گلبول های قرمز در سیستم همولیتیک (نشانگر) انجام می شود. رخ نمی دهد. اگر واکنش تثبیت کمپلمان منفی باشد، کمپلکس "آنتی بادی آنتی ژن" تشکیل نمی شود، مکمل آزاد می ماند و هنگامی که سیستم همولیتیک اضافه می شود، لیز گلبول قرمز اتفاق می افتد.

1.4. کاوشگرهای DNA واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR)،
روش آنزیم ایمنی (ELISA)، روش آنتی بادی فلورسینگ (FFA)

روشهای کاوش ژن

توسعه فشرده زیست شناسی مولکولی و ایجاد یک پایگاه روش شناختی کامل برای تحقیقات ژنتیکی، اساس مهندسی ژنتیک را تشکیل داد. در زمینه تشخیص، جهتی پدید آمده است و به سرعت در حال توسعه است تا توالی های نوکلئوتیدی خاصی از DNA و RNA، به اصطلاح کاوشگر ژن، تعیین شود. چنین تکنیک هایی مبتنی بر توانایی اسیدهای نوکلئیک برای هیبریداسیون و تشکیل ساختارهای دو رشته ای به دلیل برهمکنش نوکلئوتیدهای مکمل (AT, GC) است.

برای تعیین توالی DNA (یا RNA) مورد نظر، یک پروب به اصطلاح پلی نوکلئوتیدی با یک توالی پایه خاص به طور خاص ایجاد می شود. یک برچسب ویژه به ترکیب آن وارد شده است که امکان شناسایی تشکیل مجتمع را فراهم می کند.

اگرچه کاوش ژن را نمی توان به عنوان یک روش تجزیه و تحلیل ایمونوشیمیایی طبقه بندی کرد، اما اصل اساسی آن (برهمکنش ساختارهای مکمل) به روشی مشابه روش های شاخص ایمونوداگنوستیک اجرا می شود. علاوه بر این، روش‌های کاوش ژن امکان پر کردن اطلاعات در مورد یک عامل عفونی را در غیاب بیان فنوتیپی آن (ویروس‌های جاسازی شده در ژنوم، ژن‌های "ساکت") ممکن می‌سازد.

برای انجام تجزیه و تحلیل DNA، نمونه دناتوره می شود تا ساختارهای تک رشته ای به دست آید که مولکول های پروب DNA یا RNA با آن واکنش نشان می دهند. برای تهیه کاوشگرها، از بخش‌های مختلف DNA (یا RNA) جدا شده از یک منبع طبیعی (به عنوان مثال، یک میکروارگانیسم خاص)، که معمولاً به شکل توالی‌های ژنتیکی در پلاسمیدهای ناقل ارائه می‌شوند، یا از الیگونوکلئوتیدهای سنتز شده شیمیایی استفاده می‌شود. در برخی موارد، آماده سازی DNA ژنومی هیدرولیز شده به قطعات به عنوان یک پروب، گاهی اوقات آماده سازی RNA، و به خصوص اغلب RNA ریبوزومی استفاده می شود. همان شاخص ها به عنوان برچسب در انواع مختلف تجزیه و تحلیل ایمونوشیمیایی استفاده می شود: ایزوتوپ های رادیواکتیو، فلورسین ها، بیوتوپ (با توسعه بیشتر توسط مجتمع آویدین-آنزیم) و غیره.

ترتیب تجزیه و تحلیل توسط خواص کاوشگر موجود تعیین می شود

در حال حاضر، کیت های تجاری حاوی تمام مواد لازم به طور فزاینده ای مورد استفاده قرار می گیرند.

در اکثر موارد، روش تجزیه و تحلیل را می توان به مراحل زیر تقسیم کرد: آماده سازی نمونه (شامل استخراج DNA و دناتوراسیون)، تثبیت نمونه بر روی یک حامل (اغلب یک فیلتر غشایی پلیمری)، پیش هیبریداسیون، خود هیبریداسیون، شستشوی محصولات غیر متصل، تشخیص . در غیاب یک آماده سازی استاندارد DNA یا RNAپروب، ابتدا به دست می آید و نشاندار می شود.

برای تهیه یک نمونه، ممکن است لازم باشد که مواد آزمایش اولیه برای شناسایی مستعمرات منفرد باکتری ها یا افزایش غلظت ویروس ها در یک کشت سلولی، "رشد" اولیه باشد. نیز انجام می شود تحلیل مستقیمنمونه سرم خون، ادرار، عناصر شکلخون یا خون کامل برای حضور یک عامل عفونی. برای آزادسازی اسیدهای نوکلئیک از ساختارهای سلولی، لیز سلولی انجام می شود و در برخی موارد آماده سازی DNA با استفاده از فنل خالص سازی می شود.

دناتوره شدن DNA، یعنی انتقال آن به شکل تک رشته ای، زمانی اتفاق می افتد که با قلیایی درمان شود. سپس نمونه اسید نوکلئیک روی یک تکیه گاه، غشای نیتروسلولزی یا نایلونی، معمولاً با انکوباسیون به مدت 10 دقیقه تا 4 ساعت در دمای 80 درجه سانتی گراد در خلاء ثابت می شود. علاوه بر این، در فرآیند پیش هیبریداسیون، غیرفعال کردن مکان‌های اتصال آزاد برای کاهش تعامل غیراختصاصی پروب با غشاء به دست می‌آید. فرآیند هیبریداسیون بسته به غلظت DNA در نمونه، غلظت پروب مورد استفاده و اندازه آن از 2 تا 20 ساعت طول می کشد.

پس از تکمیل هیبریداسیون و شسته شدن محصولات غیر متصل، کمپلکس تشکیل شده شناسایی می شود. اگر کاوشگر حاوی یک برچسب رادیواکتیو باشد، برای نشان دادن واکنش، غشاء در معرض فیلم عکاسی (اتورادیوگرافی) قرار می گیرد. برای برچسب های دیگر، رویه های مربوطه استفاده می شود.

امیدوار کننده ترین آنها به دست آوردن کاوشگرهای غیر رادیواکتیو (به اصطلاح سرد) است. بر همین اساس، یک تکنیک هیبریداسیون در حال توسعه است، که امکان ایجاد وجود یک پاتوژن در آماده سازی بخش و سوراخ های بافتی را فراهم می کند، که به ویژه در تجزیه و تحلیل پاتومورفولوژیکی (هیبریداسیون درجا) مهم است.

یک گام مهم در توسعه روش های کاوش ژن، استفاده از واکنش تقویت پلیمراز (PCR) بود. این رویکرد افزایش غلظت یک توالی DNA خاص (از پیش شناخته شده) را در یک نمونه با سنتز چندین نسخه در شرایط آزمایشگاهی ممکن می سازد. برای انجام واکنش، یک آماده سازی آنزیم DNA پلیمراز، مقدار اضافی دئوکسی نوکلئوتید برای سنتز و به اصطلاح پرایمرها به نمونه DNA مورد مطالعه اضافه می شود - دو نوع اولیگونوکلئوتید با اندازه 2025 باز مربوط به بخش های انتهایی توالی DNA مورد علاقه یکی از آغازگرها باید یک کپی از ابتدای ناحیه خواندن رشته DNA کد کننده در جهت خواندن 53 باشد و دومی باید یک کپی از انتهای مخالف رشته غیر کد کننده باشد. سپس با هر چرخه واکنش پلیمراز، تعداد کپی های DNA دو برابر می شود.

برای دستیابی به اتصال پرایمر، دناتوراسیون DNA (ذوب) در دمای 94 درجه سانتیگراد ضروری است و سپس مخلوط را به دمای 40-55 درجه سانتیگراد برسانید.

برای انجام واکنش، انکوباتورهای میکرونمونه قابل برنامه ریزی طراحی شده اند تا به راحتی بین تغییرات دمای بهینه برای هر مرحله از واکنش متناوب شوند.

واکنش تکثیر می تواند به طور قابل توجهی حساسیت تجزیه و تحلیل را در طول کاوش ژن افزایش دهد، که به ویژه در غلظت های پایین عامل عفونی مهم است.

یکی از مزایای قابل توجه کاوش ژن با تقویت، توانایی مطالعه مقادیر زیر میکروسکوپی از مواد پاتولوژیک است.

یکی دیگر از ویژگی های این روش که برای تجزیه و تحلیل مواد عفونی مهم تر است، توانایی شناسایی ژن های پنهان (بی صدا) است. روش های مرتبط با استفاده از کاوشگر ژن مطمئناً با ساده تر و ارزان تر شدن آنها به طور گسترده در تشخیص بیماری های عفونی معرفی می شوند.

روش های ELISA و RIF عمدتاً ماهیت کیفی یا نیمه کمی دارند. در غلظت های بسیار کم اجزا، تشکیل کمپلکس آنتی بادی آنتی ژن را نمی توان به صورت بصری یا با ابزار ساده ابزاری تشخیص داد. نشان دادن کمپلکس آنتی بادی آنتی ژن در چنین مواردی می تواند در صورتی انجام شود که یک برچسب به یکی از اجزای اولیه آنتی ژن یا آنتی بادی وارد شود، که به راحتی در غلظت های قابل مقایسه با غلظت تعیین شده آنالیت قابل تشخیص است.

ایزوتوپ های رادیواکتیو (به عنوان مثال، 125I)، مواد فلورسنت، و آنزیم ها می توانند به عنوان برچسب استفاده شوند.

بسته به برچسب مورد استفاده، روش‌های آنالیز رادیوایمیون (RIA)، ایمنی فلورسنت (FIA)، سنجش ایمونوسوربنت مرتبط با آنزیم (ELISA) و غیره وجود دارد. سال های گذشته ELISA استفاده عملی گسترده ای دریافت کرده است که به دلیل امکان است تعیین های کمی, حساسیت بالا، ویژگی و اتوماسیون حسابداری.

روش‌های ایمونواسی آنزیمی گروهی از روش‌ها هستند که امکان تشخیص کمپلکس آنتی‌ژن-آنتی‌بادی را با استفاده از بستری که توسط یک آنزیم شکافته شده و رنگ تولید می‌کند، می‌دهند.

ماهیت روش ترکیب اجزای واکنش آنتی بادی آنتی ژن با برچسب آنزیمی اندازه گیری شده است. آنتی ژن یا آنتی بادی که واکنش نشان می دهد با یک آنزیم نشاندار می شود. بر اساس دگرگونی سوبسترا تحت اثر آنزیم، می توان میزان مؤلفه متقابل واکنش آنتی بادی آنتی ژن را قضاوت کرد. آنزیم در در این موردبه عنوان یک نشانگر عمل می کند واکنش ایمنیو به شما امکان می دهد آن را به صورت بصری یا ابزاری مشاهده کنید.

آنزیم ها برچسب های بسیار مناسبی هستند زیرا خواص کاتالیزوری آنها به آنها اجازه می دهد تا به عنوان تقویت کننده عمل کنند، زیرا یک مولکول آنزیم می تواند تشکیل بیش از 1 × 105 مولکول محصول واکنش کاتالیزوری در دقیقه را افزایش دهد. لازم است آنزیمی انتخاب شود که فعالیت کاتالیزوری خود را برای مدت طولانی حفظ کند، هنگام اتصال به آنتی ژن یا آنتی بادی آن را از دست ندهد و از ویژگی بالایی نسبت به سوبسترا برخوردار باشد.

روش‌های اصلی تولید آنتی‌بادی‌ها یا آنتی‌ژن‌ها و کونژوگه‌های نشاندار آنزیمی عبارتند از: مهندسی شیمیایی، ایمونولوژیک و ژنتیک. آنزیم هایی که اغلب برای ELISA استفاده می شوند عبارتند از ترب پراکسیداز، آلکالین فسفاتاز، گالاکتوزیداز و غیره.

برای تشخیص فعالیت آنزیم در مجموعه آنتی ژن-آنتی بادی به منظور ثبت بصری و ابزاری واکنش، از بسترهای کروموژنیک استفاده می شود که محلول های آنها، در ابتدا بی رنگ، در طی واکنش آنزیمی رنگ می گیرند که شدت آن متناسب با مقدار است. از آنزیم بنابراین، برای تشخیص فعالیت پراکسیداز ترب کوهی در ELISA فاز جامد، اسید 5-آمینو سالیسیلیک که رنگ قهوه ای شدید ایجاد می کند و اورتو فنیلن دیامین که رنگ زرد نارنجی تولید می کند، به عنوان بستر استفاده می شود. برای تشخیص فعالیت آلکالین فسفاتاز و β-گالاتوزیداز، به ترتیب از نیتروفنیل فسفات ها و نیتروفنیل گالاکتوزیدها استفاده می شود.

نتیجه واکنش در تشکیل یک محصول رنگی به صورت بصری یا با استفاده از اسپکتروفتومتر تعیین می شود که جذب نور با طول موج مشخص را اندازه گیری می کند.

گزینه های زیادی برای انجام الایزا وجود دارد. گزینه های همگن و ناهمگن وجود دارد.

با توجه به روش تولید، روش های الایزا رقابتی و غیررقابتی متمایز می شوند. اگر در مرحله اول فقط ترکیب مورد تجزیه و تحلیل و مراکز اتصال مربوط به آن (آنتی ژن و آنتی بادی های اختصاصی) در سیستم وجود داشته باشد، روش غیر رقابتی است. اگر در مرحله اول ترکیب آنالیز شده (آنتی ژن) و آنالوگ آن (آنتی ژن نشاندار شده با آنزیم) وجود داشته باشند، برای اتصال به مراکز اتصال خاص (آنتی بادی) که کمبود دارند با یکدیگر رقابت می کنند، در این صورت روش رقابتی است. در این مورد، هر چه محلول حاوی آنتی ژن آزمایشی بیشتری باشد، تعداد آنتی ژن های برچسب دار محدود شده کمتر می شود.

روش آنتی بادی های فلورسنت (MFA) یا واکنش ایمونوفلورسانس (RIF)

روش ایمونوفلورسانس روش انتخابی برای تشخیص و شناسایی سریع یک میکروارگانیسم ناشناخته در ماده آزمایش است.

Ag + AT + الکترولیت = درخشش کمپلکس در پرتوهای UV

سرم میکروبی با برچسب فلوروکروم

رنگ مورد استفاده اغلب فلورسئین ایزوتیوسیانات FITC است

هنگام مطالعه این روش، از میکروسکوپ فلورسنت استفاده می شود.

مرحله بندی RIF

30 میکرولیتر محلول آنتی بادی نشاندار شده با FITC روی اسمیر اعمال می شود.

لیوان را در یک محفظه مرطوب قرار دهید و به مدت 20-25 دقیقه در دمای اتاق یا به مدت 15 دقیقه در ترموستات با دمای 37 درجه سانتیگراد قرار دهید.

لیوان را در ماشین در حال کار بشویید آب لوله کشی 2 دقیقه با آب مقطر بشویید و در هوا خشک کنید.

یک قطره مایع نصب بر روی اسمیر خشک شده ریخته می شود، اسمیر با یک ورقه پوششی پوشانده می شود و با استفاده از یک میکروسکوپ فلورسنت یا یک اتصال فلورسنت به یک میکروسکوپ نوری معمولی میکروسکوپ می شود.