Aglütinasyon reaksiyonu (lat. aglütinasyon- yapıştırma) - elektrolitlerin varlığında korpüsküllerin (bakteri, kırmızı kan hücreleri vb.) antikorlar tarafından yapıştırılması.
Aglütinasyon reaksiyonu Antikorlar tarafından "birbirine yapıştırılmış" parçacıklardan (örneğin bakterilerden) oluşan pullar veya tortular şeklinde kendini gösterir (Şekil 7.37). Aglütinasyon reaksiyonu şu amaçlarla kullanılır: hastadan izole edilen patojenin belirlenmesi; hastanın kan serumundaki antikorların belirlenmesi; kan gruplarının belirlenmesi.
Pirinç. 7.37a,b. ile aglütinasyon reaksiyonuIgM-antikorlar (a) veIgG-antikorlar (b)
1. Hastadan izole edilen patojenin cam üzerinde yaklaşık aglütinasyon reaksiyonunun belirlenmesi (Şekil 7.38). Hastadan izole edilen bir bakteri süspansiyonu, bir damla aglütinasyon serumuna (1:20 seyreltme) eklenir. Topaklı bir çökelti oluşur.
Pirinç. 7.38.
Bir hastadan izole edilen bir patojenle kapsamlı bir aglütinasyon reaksiyonu (Şekil 7.39). Hastadan izole edilen bir bakteri süspansiyonu aglütinasyon serumunun seyreltilerine eklenir.
Pirinç. 52
2. Hastanın kan serumunda antikorların belirlenmesi
Hastanın kan serumu ile ayrıntılı aglütinasyon reaksiyonu (Şekil 7.39). Hasta serumunun seyreltilerine Diagnosticum eklenir.
- O-diagnosticum ile aglütinasyon (ısı ile öldürülen, O-antijeni tutan bakteri) ince taneli aglütinasyon şeklinde meydana gelir.
- H-diagnosticum ile aglütinasyon (kamçılı H-antijenini koruyan, formaldehit tarafından öldürülen bakteri) büyüktür ve daha hızlı gerçekleşir.
3. Kan gruplarının belirlenmesi için aglütinasyon reaksiyonu Kan gruplarını belirlemek için aglütinasyon reaksiyonu, eritrositlerin kan grubu antijenleri A (I), B (III)'e karşı immün serum antikorları ile aglütinasyonunu kullanarak ABO sistemini oluşturmak için kullanılır (Tablo b). Kontrol şudur: Antikor içermeyen serum, yani. serum AB (IV) kan grubu; A (II), B (III) gruplarının kırmızı kan hücrelerinde bulunan antijenler. Negatif kontrol antijen içermez, yani grup O(I) eritrositler kullanılır.
Tablo 7.6. ABO kan gruplarının belirlenmesi
| Reaksiyon sonuçları |
Grup |
|
|
ait |
||
|
araştırıldı |
||
|
kırmızı kan hücreleri |
serum (plazma) |
|
|
standart |
standart ile |
|
|
serumlar | ||
Aglütinasyon reaksiyonu (RA), bir elektrolit varlığında antikorların etkisi altında mikropların veya diğer hücrelerin yapışması ve çökelmesidir. Ortaya çıkan çökeltiye aglütinat adı verilir.
RA'nın kullanıldığı yerler:
1. Hastanın kan serumundaki antikorları tespit etmek (serodiagnoz).
2. Bir hastadan izole edilen saf patojen mikroorganizma kültürünün tipini ve serovarını belirlemek (serotipleme).
Aglütinasyon reaksiyonu, örneğin tifo ateşi ve paratifo ateşi (Vidal reaksiyonu), bruselloz (Wright, Heddleson reaksiyonu), tularemi, leptospirosis ve diğerleri gibi hastaların kan serumundaki antikorları belirlemek için kullanılır. bulaşıcı hastalıklar hastadan izole edilen patojenin belirlenmesinin yanı sıra ( bağırsak enfeksiyonları, boğmaca vb.). RA kan gruplarını, Rh faktörünü vb. belirlemek için kullanılır.
Reaksiyon aşağıdaki bileşenleri gerektirir:
1. Antijen (aglutinojen) tanecikli olmalıdır, yani yaşayan veya öldürülmüş mikroorganizmaların (tanısal m), eritrositler veya diğer hücrelerin bir süspansiyonu olmalıdır. Tipik olarak agar slantlarında büyüyen mikroorganizmaların günlük kültürü kullanılır. Kültür 3-4 ml izotonik solüsyonla yıkanır, steril bir tüpe aktarılır ve yoğunluk belirlenir. Süspansiyon homojen olmalı ve 1 ml'de 3 milyara kadar mikrobiyal hücre içermelidir. Öldürülen mikropların (diagnostikums) süspansiyonunun kullanılması işi kolaylaştırır (üretimde hazırlanır).
2. Antikorlar (aglutininler) hastanın serumunda (serodiagnoz sırasında) veya aglütinasyon serumunda (serotipleme sırasında) bulunur. Aglütinasyon serumları, tavşanların öldürülmüş bakterilerle aşılanmasıyla elde edilir.
Aglütinasyon titresi serum, belirli deneysel koşullar altında karşılık gelen antijenle reaksiyona girdiği en yüksek seyreltme olarak adlandırılır.
Aglütinasyon serumları doğal (adsorbe edilmemiş) ve adsorbe edilmiş olabilir. Küçük seyreltmelerdeki doğal serumlar, yalnızca serumu elde etmek için hayvanın aşılandığı mikroorganizma türleri ile değil aynı zamanda grup antikorları (ortak antijenlere sahip mikroorganizmalara karşı antikorlar) içerdikleri için ilgili mikroorganizma türleri ile de etkileşime girer. Yerli serumlar, yalnızca reaksiyonun varlığını değil aynı zamanda antikor titresindeki artışın dinamiklerini de hesaba katan ayrıntılı bir aglütinasyon reaksiyonu (serodiyagnoz için) için kullanılır.
Grup antikorları, grup antijenlerine sahip ilgili bakterilerle etkileşime girerek doğal serumdan ekstrakte edilirse (adsorbe edilirse), adsorbe edilmiş serumlar elde edilir. Adsorbe edilmiş serumlar, yalnızca bir antijen reseptörüne karşı antikorlar içeren monoreseptör (veya tipe özgü) olabilir. Polivalan serumlar, birkaç adsorbe edilmiş veya adsorbe edilmemiş serumun bir karışımından oluşur. Cam aglütinasyon reaksiyonu için adsorbe edilmiş serumlar kullanılır.
Hayvanlar, H-antijeni ile hareketli bakterilerle immünize edildiğinde, H-antikorları içeren H-aglutinasyon serumları elde edilir (örneğin, Salmonella monoreseptör H-aglütinasyon serumu). O-antijen ile immünizasyon yoluyla, O-antikorları içeren O-aglutinasyon serumları elde edilir (örneğin, Salmonella grubu adsorbe edilmiş O-aglütinasyon serumu, antikolera O-aglütinasyon serumu). H- ve O-antijenlerle immünizasyon yoluyla H- ve O-antikorlara sahip serumlar elde edilir.
Ayrıca, O-aglutininler ince taneli bir aglütinat üretir ve H-aglutininler kaba taneli bir çökelti üretir.
3. Elektrolit - izotonik NaCl çözeltisi (damıtık suda hazırlanmış %0,9 sodyum klorür çözeltisi).
Bir aglütinasyon reaksiyonu gerçekleştirmek için iki ana yöntem vardır: cam üzerinde bir reaksiyon (bazen gösterge veya plaka reaksiyonu olarak adlandırılır) ve ayrıntılı bir reaksiyon (test tüplerinde)
Cam üzerinde aglütinasyon reaksiyonunun kurulması. Yağsız bir cam slayta iki damla serum ve bir damla izotonik sodyum klorür çözeltisi uygulanır. Tanısal aglütinasyon serumu, titresine bağlı olarak 1:10, 1:25, 1:50 veya 1:100 olan bir seyreltide alınır. İncelenen mikroorganizmanın kültürü bir damla serum ve bir damla izotonik çözelti içerisine bir öze kullanılarak eklenir ve iyice karıştırılır. Mikroorganizma içeren bir damla sodyum klorür antijen kontrolü, mikroorganizma içermeyen bir damla serum ise serum kontrolüdür. Kültürü serumlu bir damladan NaCl'li bir damlaya aktaramazsınız. Reaksiyon oda sıcaklığında 1-3 dakika süreyle gerçekleştirilir. Serum kontrolü berrak kalırsa, antijen kontrolünde düzgün bir bulanıklık gözlenirse ve kültürün serumla karıştığı damlada aglütinat pullar görülürse sonuç pozitif kabul edilir. Damlada serum ve antijen ile aynı bulanıklık varsa bu olumsuz bir sonuçtur. Reaksiyon karanlık bir arka planda daha net bir şekilde görülebilir.
Serum
1. antijen kontrolü
2. serum kontrolü
Bağışıklık reaksiyonları. Bağışıklık reaksiyonlarının teşhiste uygulanması bulaşıcı hastalıklar.
PLAN:
Bağışıklık reaksiyonlarının türleri.
Serolojik reaksiyonların yürütülmesi için koşullar.
Serum gereksinimleri.
Olumlu ve olumsuz sonuçlar kavramı.
ANA İÇERİK:
Bağışıklık reaksiyonlarının türleri.
İmmünolojik reaksiyon – Bu, bir antijenin bir antikorla etkileşimidir ve antikorun aktif merkezlerinin (paratop) antijenlerin epitopları ile spesifik etkileşimi ile belirlenir.
İmmünolojik reaksiyonların genel sınıflandırması:
serolojik reaksiyonlar – antijenler (Ag) ve antikorlar (Ig) arasındaki reaksiyonlar
laboratuvar ortamında ;
hücresel reaksiyonlar immünokompetan hücrelerin katılımıyla;
alerji testleri – aşırı duyarlılığın tespiti.
Serolojik reaksiyonlar: 1) tanım, 2) aşamalar, 3) hedefler, 4) genel sınıflandırma.
1) Tanım
Serolojik yöntemler antijen-antikor reaksiyonunu kullanarak araştırma (Latince Serum'dan - serum ve logolar - öğretim).
2) Aşamalar
2 aşamalı etkileşim:
BEN. Özel (görünür) – hızlı bir şekilde oluşur, antikorlar karşılık gelen antijenlerle birleşir. Bu aşamada antijenlerin belirleyici grupları (AG) ve antikorların aktif merkezleri (AT) etkileşime girer.
AG + AT kompleksinin oluşumunda rol oynayan kuvvetler şunlardır:
kolye;
van der Waals
Hidrojen bağları.
Hiçbiri görünür değişiklikler bu aşamada değil. Elektron mikroskobu AG+AT kompleksini kafes şeklinde göstermektedir.
II. spesifik olmayan – yavaşça oluşur, ortaya çıkan antijen-antikor kompleksi, reaksiyonun meydana geldiği ek bir spesifik olmayan çevresel faktörle reaksiyona girer ve bu gözle görülebilir – yapışma, çözünme, çökelme pulları vb. Bir elektrolit varlığında yük azalır çözünürlük azalır, görünür konglomeralar oluşur, çökelir (aglutinat).
3) Hedef belirlemek :
a) antijeni tanımlamak için (antikoru bilinen teşhis serumu):
serolojik tanımlama (tür tanımlaması);
serotipleme (serovarın belirlenmesi) – suşun belirlenmesi;
patolojik materyalde (hızlı teşhis);
saf kültürde:
b) Antikorları (Ig) tespit etmek için (antijen bilinmektedir-diagnostikum):
mevcudiyet (niteliksel reaksiyonlar);
miktar (titrede artış - “eşleştirilmiş serum” yöntemi).
4) Genel sınıflandırma serolojik reaksiyonlar :
a) basit (2 bileşenli: Ag+Ig):
RA aglütinasyon reaksiyonları (korpüsküler antijen ile);
PR çökelme reaksiyonları (çözünür antijen ile);
b) kompleks (3-bileşenli: Ag+Ig+C);
c) etiket kullanmak.
Aglütinasyon ve çökelme reaksiyonlarının çeşitleri
Aglütinasyon reaksiyonu :
Aglütinasyon reaksiyonu (RA), bir antijen süspansiyonunun (eritrositler, bakteriler) fizyolojik çözeltideki antijenlerle etkileşiminin immün reaksiyonudur.
Aglütinasyon sırasında AT parçacıkları birbirine yapışarak topaklayıcı bir çökelti oluşturur.
Reaksiyon pasif hemaglutinasyon(RPGA), bir antikor veya antijen eritrosit diagnostiğinin (yüzeylerinde AT veya AG adsorbe edilmiş eritrositler) kullanıldığı bir tür aglütinasyon reaksiyonudur.
Kırmızı kan hücreleri bu reaksiyonda pasif taşıyıcı görevi görür.
RPGA sonuçlarının değerlendirilmesi şu şekilde gerçekleştirilir:
- en olumlu tepki pasif olarak yapışan kırmızı kan hücreleri, U veya V şeklindeki deliğin tabanını fistolu kenarlara sahip eşit bir tabaka halinde ("şemsiye") kaplar;
- en olumsuz tepki (aglütinasyon olmadığında), kırmızı kan hücreleri deliğin merkezi girintisinde birikir ve keskin kenarları olan kompakt bir "düğme" oluşturur.
Viral enfeksiyonların tanısında hemaglutinasyon inhibisyon testi (HAI) kullanılır. Bazı virüslerin yüzeyinde, kırmızı kan hücrelerini birbirine yapıştıran hemaglutinin adı verilen bir protein bulunur. Spesifik antiviral antikorların eklenmesi viral hemaglutininini bloke eder; hemaglutinasyon olmaz.
Eksik antikorları belirlemek için dolaylı hemaglutinasyon reaksiyonu (IRHA) veya Coombs reaksiyonu kullanılır. Antiglobulin serumunun (insan Ig'sine karşı AT) eklenmesi reaksiyonun sonuçlarını güçlendirir. RNGA, Rh faktörünü belirlemek için kullanılır.
Bir aglütinasyon reaksiyonu (RA) gerçekleştirmek için üç bileşen gereklidir:
1) antijen (aglutinojen) AG;
2) antikor(aglutinin) AT;
3)
elektrolit
(izotonik sodyum klorür çözeltisi).
Ag + AT + elektrolit = aglütinat
Aglütinasyon (Latince aglütinatio'dan - yapıştırma) - elektrolitler - sodyum klorür varlığında korpüsküllerin (bakteriler, kırmızı kan hücreleri vb.) antikorlarla yapıştırılması.
RA, antikorlar tarafından "birbirine yapıştırılmış" korpüsküllerden (örneğin bakteriler, kırmızı kan hücreleri) oluşan pullar veya tortular şeklinde kendini gösterir.
RA aşağıdakiler için kullanılır:
Doğrudan mikrobiyal aglütinasyon reaksiyonu (RA).
Bu reaksiyonda antikorlar (aglutininler) doğrudan korpüsküler antijenleri (aglutinojenler) aglütine eder.
Genellikle inaktive edilmiş mikroorganizmaların bir süspansiyonu (mikrobiyal aglütinasyon reaksiyonu) ile temsil edilirler.
Mikroorganizmaların türünü belirlemek için kullanın.standart tanısal aglütinasyon serum (ünlü AT ).
En yaygın olanları katmanlı (yaklaşık) ve genişletilmiş RA'dır.
RA plakası camın üzerine yerleştirilir. Olarak kullan hızlandırılmış yöntem Antikorların tespiti veya mikroorganizmaların tanımlanması.
Bileşenler:
1. standart tanısal aglütinasyon serumları (AT);
2. Hastadan incelenmekte olan saf kültür;
3. tuzlu su çözeltisi.
İncelenen saf kültürde antijenler (AG), antikorlar tarafından birbirine yapıştırılan ve çökelen parçacıklar (mikrobiyal hücreler, eritrositler ve diğer korpüsküler antijenler) formundadır.
Örnek:
Evreleme gösterge niteliğinde aglütinasyon reaksiyonları (RA ) cam üzerinde Koliform bakterilerin tanımlanması amacıyla.
Damlaları bir cam slayta uygulayın:
1
dizanteri
;
2
-inci damla: - patojenlere karşı aglütinasyon serumuTifo
;
(1-2 teşhis serumu)
3
-inci damla: - salin solüsyonu (kontrol).
Test edilen saf bakteri kültürünü her damlaya ekleyin. Karıştırmak.
Sonuç
:
pozitif
- aglütinat pulların varlığı,
olumsuz
- aglütinat pulların olmaması
Çözüm:İncelenen bakteriler tifo ateşinin etken maddeleridir (antijenler belirlendi).
Hastanın serumunda AT'yi belirlemek için (serolojik tanı), standart bir mikrobiyalteşhis , süspansiyon içerenünlü mikroplar veya bunların antijenleriAG .
ABO kan gruplarının belirlenmesi (hemaglutinasyon reaksiyonu (HRA)) – aglütine kırmızı kan hücreleri.
Reaksiyon bileşenleri:
1. AG (kırmızı kan hücreleri) kan testi
2. AT (eritrotestler - zoliklonlar)
Zoliklon seti:
Reaktif Tsoliklon anti-A (pembe)
Koliklon anti-B reaktifi (mavi)
Reaktif Tsoliklon anti-AV (renksiz)
3. elektrolit (tuzlu su çözeltisi)
Belirleme tekniği:
1
.
Tabletin oyuklarına (kontrol için) bir damla (0,1 ml) anti-A, anti-B ve anti-AB zolikon uygulanır.
2.
Reaktifin her damlasının yanına, test edilen kandan küçük bir damla (0,05-0,01 ml) uygulanır.
Daha sonra ayrı bir temiz cam çubuk kullanılarak bir damla zoliklon bir damla kanla karıştırılır.
3.
Aglütinasyon reaksiyonu ilk 3-5 saniye içinde plağın hafifçe sallanmasıyla gelişir.
Reaksiyon sonuçları, damlaların karıştırılmasından 2,5 - 3 dakika sonra dikkate alınır. Kuyularda soldan sağa anti-A, anti-B, anti-AB bulunmaktadır.
Olumlu bir sonuç, granüler bir çökeltinin (aglutinat) ortaya çıkmasıdır.
pozitif RA (+)
Negatif - tortu yok.
negatif RA(-)
4.
Sonuçların analizi.
Ö(BEN) α β – aglütinasyon yok
A(II) β – anti-A ile aglütinasyon
B(III) α – anti-B ile aglütinasyon
AB(IV)O – anti-A ile anti-B ile aglütinasyon
Aglütinasyonun şematik gösterimi.
Eritrositlerdeki Ag antijenleri (tespit edilebilir) + antikorAT(zoliklon) teşhis serumu
Tabletlerde aglütinasyonun muhasebeleştirilmesi
Yağış reaksiyonu:
Çökelme reaksiyonu, çözünür bir durumdaki antijenin fizyolojik bir çözelti içindeki antijenle etkileşiminin immün reaksiyonudur.
Çökelme sırasında, şeffaf bir koloidal çözeltinin opak bir süspansiyona veya çökeltiye geçişi ile kendini gösteren makromoleküler bir bağışıklık kompleksi oluşur.
Her iki reaktifin miktarı kesin olarak tanımlanmış oranlarda olmalıdır, çünkü bunlardan birinin fazlası sonucu azaltır.
Var olmak çeşitli yollarçökelme reaksiyonunun aşamalandırılması.
1. Halka çökeltme reaksiyonu küçük çaplı çökeltme tüplerinde gerçekleştirilir. Bağışıklık serumu test tüpüne eklenir ve çözünür antijen dikkatlice katmanlanır. AG ve AT, moleküllerin termal hareketi nedeniyle karışır ve etkileşime girer. Şu tarihte: olumlu sonuç iki çözeltinin sınırında opak bir çökelti halkası oluşur.
2. Ouchterlony çift immünodifüzyon reaksiyonu, şemaya göre kuyucuklara ya bir AG çözeltisi ya da bir AT çözeltisinin eklendiği bir agar jeli içinde gerçekleştirilir. AG ve AT jelin içine birbirlerine doğru yayılırlar ve reaksiyon pozitifse çökelme çizgileri olarak görülebilen immün kompleksler oluştururlar.
Yağış reaksiyonu -bu formasyonve çözünür moleküler antijen-antikor kompleksinin çökelti adı verilen bir bulut halinde çökelmesi. Antijen ve antikorların eşit miktarlarda karıştırılmasıyla oluşur.
RA bileşenleri:
çökeltici serum (bilinen AT-çökeltisi);
test serumu (bilinmeyen çökeltici antijen);
fiziksel Çözüm.
Çökeltme reaksiyonu ya özel dar test tüplerinde (halka çökeltme reaksiyonu) ya da jeller, besin ortamları vb. içindeki Petri kaplarında gerçekleştirilir.
Halka çökelme reaksiyonu
Reaksiyon sonuçlarının beyanı ve kaydedilmesihalka çökelmesipatojen tespiti için şarbon(Askoli reaksiyonu).
Evreleme .
1. İncelenen materyal (deri, yün, keçe, kıl, kumaş, et, toprak, hayvan dışkısı vb.) tuzlu su çözeltisinde 5-45 dakika kaynatılır. izotonik bir ekstrakt (ekstre) elde etmek için. Filtrelendi.
2. Şarbon karşıtı serum çökelerek bir test tüpüne dökülür.
3. Test materyalini (ekstreyi) dikkatlice üzerine yerleştirin.
Muhasebe .
Önümüzdeki 10 dakika içinde. Pozitif durumlarda serum ve ekstrakt arasındaki arayüzde bir bulanıklık halkası belirir (halka çökelmesi). Ascoli reaksiyonu çok hassas ve spesifiktir
Onun yardımıyla şarbon bulaşmış materyalleri hızlı bir şekilde tespit etmek mümkündür.
Agarda çökelme reaksiyonu
Sonuçların beyanı ve kaydedilmesiagarda çökelme reaksiyonlarıKorinebakterilerin (difteri etken maddeleri) toksijenitesini belirlemek için
Evreleme
Petri kabındaki fosfat pepton agar üzerine yerleştirildi.
1. Nemlendirilmiş bir steril filtre kağıdı şeridini kabın ortasına yerleştirin.antitoksik serum.
2. Kuruduktan sonra şeridin kenarından 1 cm mesafede 10 mm çapında plakalar ekilir.seçilmiş mahsuller.
Bir bardağa 3 ila 10 ürün ekebilirsiniz; bunlardan birikontrol, bilinmelidirtoksikojenik.
Mahsuller bir termostata yerleştirilir.
Muhasebe
Analiz 24-48-72 saat sonra gerçekleştirilir.
Olumlu sonuç - (kültürtoksikojenik) - kağıt şeridinden biraz uzakta görünüyorçökelti çizgileri, « dal okları", iletilen ışıkta açıkça görülebilmektedir.
Şekil, difteri basilinin toksijenitesini belirlemek için agardaki çökeltme reaksiyonunu göstermektedir. Ortam kültürleri "ok dalları" oluşturmamıştır; bunlar toksikojenik patojenler değildir.
Difteri etkeninin türleri toksijenik (ekzotoksin üreten) olabilir ve toksik olmayabilir. Bir ekzotoksin oluşumu, bir ekzotoksin oluşumunu kodlayan bir toksin genini taşıyan bir profajın bakterilerdeki varlığına bağlıdır.
Hastalık durumunda, tüm difteri patojenleri toksijenite açısından test edilir - agarda çökeltme reaksiyonu kullanılarak difteri ekzotoksin üretimi
Karmaşık serolojik reaksiyonlar ( 3 bileşenli: Ag+Ig+C):
Kompleman fiksasyon reaksiyonu (CFR).
Reaksiyon iki aşamada gerçekleştirilir.
İlk aşamada AT, antijen ve kompleman ile etkileşime girer; ikinci aşamada, bir gösterge eklenir - hemolitik sistem (eritrositler ve anti-eritrosit serumu karışımı).
Sonuç pozitifse, ilk aşamada antikorlar, reaksiyon karışımının tamamlayıcısını bağlayan antijenlerle bir bağışıklık kompleksi oluşturur.
Bu durumda ikinci aşamada eklenen hemolitik sistemin kırmızı kan hücreleri yok edilmez.
Aksi halde bağlanmamış kompleman indikatör kırmızı kan hücrelerinin parçalanmasına neden olur.
Bunu gerçekleştirmek için beş bileşene ihtiyaç vardır: AG, AT ve kompleman (birinci sistem), koyun eritrositleri ve hemolitik serum (ikinci sistem) (Şekil 1).
Reaksiyon iki aşamada gerçekleşir (Şekil 3).
İlk etap - sırasında antijen ve antikorların etkileşimi zorunlu katılım Tamamlayıcı.
Saniye - bir gösterge hemolitik sistemi (koyun kırmızı kan hücreleri ve hemolitik serum) kullanılarak reaksiyon sonuçlarının tanımlanması. Kırmızı kan hücrelerinin hemolitik serum tarafından yok edilmesi, yalnızca hemolitik sisteme kompleman eklenmesi durumunda gerçekleşir. Kompleman daha önce antijen-antikor kompleksi üzerine adsorbe edilmişse, eritrositlerin hemolizi meydana gelmez (Şekil).
Deneyim sonucu
değerlendirildi (Şekil 2), tüm tüplerde hemoliz olup olmadığına dikkat edildi. Hemoliz tamamen geciktiğinde, test tüpündeki sıvı renksiz olduğunda ve kırmızı kan hücreleri dibe çöktüğünde reaksiyon pozitif olarak kabul edilir, negatif - kırmızı kan hücreleri tamamen parçalandığında, sıvı yoğun şekilde renklendiğinde (“vernikli” kan) ).
Hemoliz gecikmesinin derecesi, sıvının renginin yoğunluğuna ve alttaki kırmızı kan hücresi çökeltisinin boyutuna (++++, +++, ++, +) bağlı olarak değerlendirilir.
Pirinç. 4. RSC'nin beyanı ve sonucu.
Çözüm:Test serumunda antikorlar tespit edildi.
RSK, virüsün aynı serotipinin herhangi bir suşuna karşı antikorları tespit etmenize olanak sağlar.
Teşhis değeriŞunlara sahiptir:
eşleştirilmiş serumlarda antikor titresinde dört kat artış (bir grip salgını sırasında);
karakteristik bir klinik tabloya sahip hastaların kan serumunda iki kat artış.
Etiket kullanan reaksiyonlar :
Bu yöntemler oldukça hassastır. Boyalar, radyoaktif izotoplar, enzimler vb. antijenler veya antikorlar için etiket olarak kullanılır.
RIF – immünofloresan reaksiyonu
İmmünofloresan reaksiyonu, antijen-antikor kompleksinin ışıkla gösterilmesine dayanır.
Bağlantılı immünosorbent tahlili.
Hastalığın yalnızca etiyolojisini değil aynı zamanda evresini de belirlemek amacıyla kandaki spesifik antikorları veya belirli hastalıklara yönelik antijenleri araştıran modern bir laboratuvar testi.
ELISA sonuçları niteliksel ve niceliksel olarak verilebilmektedir.
Şu anda ELISA aşağıdaki durumlarda kullanılmaktadır:
1) herhangi bir bulaşıcı hastalığa karşı spesifik antikorların araştırılması;
2) herhangi bir hastalığın (bulaşıcı, zührevi) antijenlerini aramak;
3) araştırma hormonal durum hasta;
4) tümör belirteçlerinin incelenmesi;
5) otoimmün hastalıkların varlığının incelenmesi.
Şekilde, katı faz ELISA, bir plakanın bir kuyucuğu üzerinde adsorbe edilmiş bilinen antijenleri (solda) ve bir plakanın kuyucukları üzerinde (sağda) bilinen antijenleri göstermektedir.
ELISA yönteminin avantajları:
1) ELISA yönteminin yüksek özgüllüğü ve duyarlılığı (%90'dan fazla).
2) Hastalığı belirleme ve sürecin dinamiklerini takip etme, yani farklı zaman dilimlerindeki antikor sayısını karşılaştırma yeteneği.
3) Herhangi bir tıbbi kurumda ELISA teşhisinin mevcudiyeti.
Göreceli dezavantaj: Bir etiket enzimine konjuge olan patojenin kendisi değil, bir bağışıklık tepkisinin (antikorlar) saptanması.
ELISA testi (genel mekanizma):
Enzim immünoanalizinin temeli, antijen ve antikorun bir immün kompleksinin oluşumu ile immün reaksiyonudur: antijen-antikor, bu, antikorların yüzeyindeki spesifik işaretlerin enzimatik aktivitesinde bir değişiklikle sonuçlanır.
Reaksiyon bileşenleri:
1. AG(AT) biliniyor - tabletin yuvasında.
2. AT (AG) inceleniyor.
3. AT(AG)-AG(AT) kompleksine özgü enzimli AT
4. enzimle etkileşime giren kromojenik substrat
5. çözümü durdurun
ELISA'nın ana aşamaları
1. Plakanın oyuklarının yüzeyinde belirli bir patojenin saflaştırılmış bir antijeni bulunur. Eklediler biyolojik materyal hastada bu antijen ile istenen antikor (immünoglobulin) arasında spesifik bir reaksiyon meydana gelir. Bir kompleks oluşuyor.
2. Enzimle birlikte bir konjugant eklenir – AT. Konjugant, ilk aşamadaki AT-AG kompleksine özgüdür. Enzim aktive edilir.
3. Substrat eklenir ve aktif enzim onunla reaksiyona girerek çözeltinin renksiz rengini değiştirir.
4. Enzim-substrat etkileşimini durdurmak için bir durdurma çözeltisi eklenir.
Muhasebe.
Pozitif sonuç - değişiklik resimdeki renkler – sarı.
İmmünokromatografik analiz
İmmünokromatografik analiz yöntemi (ICA, hızlı testler), birkaç dakika içinde hızlı bir şekilde her koşulda analiz yapmanızı sağlayan yüksek kaliteli bir ön tarama yöntemidir. "alan".
ICA'nın avantajları şunları içerir:
Hız ve kullanım kolaylığı;
Küçük numune hacimleri, numune hazırlama eksikliği;
Üretici ve tüketici açısından ucuzluk;
Büyük hacimlerde test üretme imkanı;
Sonucun okunması ve yorumlanması kolaylığı;
Yüksek hassasiyet ve tekrarlanabilirlik;
Kantitatif belirleme imkanı;
Bilgisayarla uyumlu taşınabilir okuyucuları kullanma imkanı;
Çoklu analiz imkanı.
Bileşenler (test şeridine uygulanır):
1. Kolloidal altınla işaretlenmiş bir konjugat, tespit edilen antijene spesifiktir.
2. AT test çizgisi – AT-AG kompleksine özel
3. Kontrol çizgisinin abs'leri konjugata özeldir.
ICA ayarı:
1. Örneği şeridin belirlenen başlangıç alanına uygulayın.
2. Test ve kontrol çizgileri yerine renkli şeritlerin ortaya çıkması şeklinde sonucun elde edilmesi.
Muhasebe
Pozitif – test çizgisi boyandığında.
Negatif - test çizgisinde lekelenme yoksa.
Geçersiz – kontrol çizgisi lekeli değilse.
ICA'nın genel mekanizması:
1. Numune başlangıç alanına (numune pedi) yerleştirilir ve konjugat pedi üzerinde yer alan konjugatla (renkli etiketli özel bir gövde) ilişkilendirilir. Sonuç olarak renkli bir kompleks oluşur.
2. Ortaya çıkan renkli bağışıklık kompleksi, nitroselüloz membran boyunca kılcal kuvvetlerin etkisi altında hareket eder. Ve etkileşime girerAT test hattı ile.Sonuç, tek renkli pembe-kırmızı bir şerittir.
3. AT (konjugat) test edilen banda bağlı değildaha da hareket eder ve kontrol hattına ulaşır, kontrol hattının AT'si ile iletişim kurar.Sonuç olarak ikinci bir renkli şerit belirir.Analiz doğru şekilde yapılırsa biyolojik sıvı örneğinde test antijeninin (antikor) varlığına bakılmaksızın Kontrol çizgisi her zaman görünmelidir.
2. Serolojik reaksiyonların yürütülmesi için koşullar.
1. Homolog varlığı - birbirine karşılık gelen antijen ve antikor.
2. Bulaşıkları temizleyin ve kurulayın.
3. Belirli bir ilaç oranı (çoğunlukla eşittir).
4. Bir elektrolitin zorunlu varlığı (izotonik NaCl çözeltisi).
5. pH nötr veya hafif alkaliye yakın.
6. Sıcaklık +37°C veya oda sıcaklığı (mutlaka pozitif).
7. Antijen kontrolü ve serum (antikor) kontrolü yapılır.
3 Serum gereksinimleri
Serum, herhangi bir hücre karışımı olmadan tamamen şeffaf olmalıdır.
Genellikle antikorların zaten mevcut olduğu hastalığın 2. haftasında alırlar.
Kan aç karnına veya yemekten 6 saat sonra 3-5 ml miktarında alınır.
Serum elde etmek için kan oda sıcaklığında 1 saat bekletilir veya santrifüj edilir. Serum, oluşan elemanları yakalamamak için çok dikkatli bir şekilde emilir.
Bağışıklık serumları, belirli bir şemaya göre karşılık gelen antijenle (aşı) aşılanan insanların veya hayvanların (genellikle tavşanlar ve atlar) kanından elde edilir. Serumlar genellikle üretimde hazırlanır.
4. Olumlu ve olumsuz sonuçlar kavramı.
RA.
Pozitif bir reaksiyonla, pasif olarak yapıştırılmış kırmızı kan hücreleri, deliğin tabanını fistolu kenarlara sahip eşit bir tabaka halinde (“şemsiye”) kaplar; Aglütinasyonun yokluğunda, kırmızı kan hücreleri deliğin merkezi girintisinde birikerek keskin kenarları olan kompakt bir "düğme" oluşturur (yukarıdaki resimlere bakın).
RP.
Sonuç pozitifse, iki çözümün arayüzünde süt rengi bir halka oluşur (yukarıdaki resimlere bakın).
ELISA.
Pozitif reaksiyonla çözeltinin renginde bir değişiklik meydana gelir.
RSK.
Gecikmiş hemoliz - reaksiyon pozitiftir; kompleman serbestse hemoliz gözlenir - reaksiyon negatiftir(yukarıdaki resimlere bakın).
Wasserman reaksiyonunun sonuçları:
a - hemolizin tamamen gecikmesi (+ + ++);
b - hemolizde belirgin gecikme (+ ++);
c - hemolizin kısmi gecikmesi (++);
d - hemolizde hafif gecikme (+);
d - tam hemoliz (-).
Reaksiyon, tüplerin içeriğinin açık pembeden parlak kırmızıya boyanma derecesine göre belirlenen kısmi, belirgin ve tam hemoliz gecikmesiyle pozitiftir; hemolize olmayan eritrositler daha sonra kırmızı bir çökelti oluşturur.
1. Materyali inceleyin
Videoya 3 not yazın
mikrobiyolojide
"Aglütinasyon reaksiyonu ve çeşitleri (RA)"
Plan:
1. Giriş………………………………………………………………………………..3
2. Cam üzerinde RA……………………………………………………………………………….4
3. Test tüpü RA……………………………………………………………………………………….5
4. Kullanılan literatür…………………………………………………………………..7
1. Giriş.
Mikrobiyal antijen ve antikorların etkileşimi doğası gereği kesinlikle spesifiktir ve hayvan vücudunda patojeni ve onun toksinlerini nötralize etmeyi amaçlamaktadır. Antijen ve antikorların in vitro etkileşimine, belirli koşullar altında, serolojik (Latin serumundan) adı verilen AG-AT reaksiyonlarının pratik amaçlar için kullanılmasına izin veren görünür fenomenler (aglütinasyon, çökelme, immün lizis) eşlik eder. Biyofabrikalar, bilinen spesifik yapıya sahip (tanısal) antijenler ve bağışıklık serumları (antikorlar) üretir. Bu tür serumları serolojik reaksiyonlarda kullanarak, bilinmeyen bir mikroorganizmayı tanımlamak veya bilinen bir antijeni kullanarak, vücutta bir patojenin girişine yanıt olarak sentezlenen antikorları tespit etmek ve böylece bir teşhis (serolojik teşhis) yapmak mümkündür. Ek olarak serolojik reaksiyonlar, aşılama veya bulaşıcı bir hastalık sonrasında oluşan bağışıklık tepkisinin yoğunluğunu değerlendirmek için de kullanılabilir.
Dolaylı aglütinasyon ve Coombs gibi aglütinasyon reaksiyonları, korpüsküler antijenlerin antikorlarla in vitro etkileşimine ve ortaya çıkan komplekslerin çökelme yeteneğine dayanır. Mikroorganizmalardan ekstrakte edilen ve taşıyıcı küreciklere emilen bakteriyel hücreler veya çözünür antijenler: kırmızı kan hücreleri, lateks parçacıkları vb. korpüsküler antijenler olarak kullanılır.
Korpüsküler antijenlerin antijenik determinantları, spesifik olarak homolog antikorlarla (reaksiyonun spesifik, görünmez fazı) etkileşime girer ve daha sonra antijen-antikor kompleksleri, çıplak gözle görülebilen büyük kümeler oluşturur ve bunlar çökelir - aglütinat (reaksiyonun spesifik olmayan, görünür fazı) ). Mikropların kamçısız formları (Brucellae) granüler aglütinantlar üretirken, kamçılı formları (Escherichia, Salmonella) büyük pamuklu aglütinantlar üretir ve bunlar ters bir şemsiye şeklinde test tüpünün dibine yerleşir ve çalkalandığında kolayca kırılır. Antijenler ve antikorlar yalnızca bir elektrolit (%0,8 sodyum klorür çözeltisi) varlığında etkileşime girer. Reaksiyonun seyri elektrolitteki tuz konsantrasyonundan, süspansiyondaki mikrobiyal hücre sayısından, serum konsantrasyonundan, pH'dan, sıcaklıktan ve diğer faktörlerden etkilenir.
Aglütinasyon reaksiyonu (ra).
Antijenin etkileşimine dayanan spesifik aglütinasyon vardır. İle homolog antikor , bu antijenin verildiği hayvanın vücudunda bulunan (immünoaglütinasyon); ortamın pH'ındaki değişikliklerden, elektrolit konsantrasyonundan kaynaklanan spesifik olmayan (kimyasal); bakteriler (R-formunda) fizyolojik çözelti içinde süspanse edildiğinde ve ısıtıldığında gözlenen, bakteri hücresinin kolloidal durumundaki bir değişiklik ile ilişkili olan spontan. Antijen , RA'da rol oynayanlara aglütinojen, antikora aglütinin ve ortaya çıkan çökeltiye aglütinat adı verilir. Bir aglütinat oluştuğunda antijen ve antikorların kantitatif oranı önemlidir (optimum olay). Antikorların fazlalığı veya eksikliği ile bir gecikme meydana gelir.
Aglütinasyon reaksiyonu (RA), mikrobiyolojik uygulamada kullanılan ilk immünolojik reaksiyonlardan biridir. İlk kez (1895), F. Vidal, tifo ateşini teşhis etmek için RA'yı kullandı. Daha sonra (1897) A. Wright, insanlarda brusellozu teşhis etmek için aynı reaksiyonu kullandı. RA aynı zamanda tavuklarda pullorosis, leptospirosis, kısraklarda bulaşıcı düşüklerin teşhisinde ve ayrıca bilinen bir aglütinasyon serumu kullanılarak bilinmeyen mikrobiyal kültürlerin tiplendirilmesinde de uygulama alanı bulmuştur. RA oldukça hassastır; 1 ml'de 0,01 μg antikor protein nitrojenini tespit etmek için kullanılabilir.
Metodolojik uygulama ve çalışmanın amacı açısından farklılık gösteren aglütinasyon reaksiyonunun çeşitli varyantları geliştirilmiştir.
2. Cam üzerinde Ra.
RA'nın bu varyantında test denekleri serum veya antijen olabilir, ancak çoğu zaman bu seçenek mikroorganizmaları tanımlamak için kullanılır.
1. Mikroorganizmayı (m/o) tanımlamak için, bilinen bir aglütinasyon serumundan (örneğin Salmonella serumu) bir damla ve bir damla fizyolojik çözelti (kontrol) yağsız bir cam slayta ayrı ayrı uygulanır. Daha sonra, bir bakteriyolojik döngü kullanılarak, incelenen kültürün bakteri kütlesi bir Petri kabındaki bir koloniden veya bir test tüpündeki eğimli bir MPA'nın yüzeyinden alınır ve homojen bir süspansiyon oluşana kadar immün serum ve fizyolojik çözelti içinde ayrı ayrı süspanse edilir. Elde edilen. Sonuç 2...4 dakika sonra dikkate alınır.
Sonuçların muhasebeleştirilmesi: Kontrol örneğinde herhangi bir değişiklik olmamalıdır. Bakteri kültürü özellikle bağışıklık serumu ile eşleşiyorsa, aglütinasyon pulları ortaya çıkar (pozitif sonuç); aglütinasyon fenomeni yoksa, incelenen bakteri kültürünün bağışıklık serumuna karşılık gelmediği sonucuna varılır.
2. Bruselloz serodiyagnozunda kullanılan gül bengal testi örneğini kullanarak test kan serumunda antitellerin saptanmasını ele alalım. 0,3 ml test hayvanı kan serumu ve 0,03 ml bruselloz antijeni (gül-Bengal boyalı Brucella hücreleri) bir cam slayta uygulanır. Bileşenler camı çalkalayarak iyice karıştırılır ve 4 dakika sonra sonuç dikkate alınır.
Sonuçların kaydedilmesi: Reaksiyon pozitifse pembe aglütinat pulları görünür. Bu tür bir serolojik reaksiyon, hayvanın kan serumundaki patojene karşı antikorları tespit etmek için kullanılabildiğinden kalitatif olarak sınıflandırılır, ancak bunların kantitatif içeriğini değerlendirmek imkansızdır.
1.1. AGLÜTİNASYON REAKSİYONU (RA)
AGLÜTİNASYON REAKSİYONU (RA)
Spesifitesi, uygulama kolaylığı ve kanıtlanabilirliği nedeniyle aglütinasyon reaksiyonu, birçok bulaşıcı hastalığın teşhisi için mikrobiyolojik uygulamada yaygınlaşmıştır.
Aglütinasyon reaksiyonu, antikorların (aglutininler) bütün mikrobiyal veya diğer hücrelerle (aglutinojenler) etkileşiminin spesifikliğine dayanır. Bu etkileşimin bir sonucu olarak, pul şeklinde çökelen (aglutinasyon yapan) parçacıklar ve topaklanmalar oluşur.
Aglütinasyon reaksiyonu hem canlı hem de öldürülmüş bakterileri, spiroketleri, mantarları, protozoaları, riketsiyayı, ayrıca kırmızı kan hücrelerini ve diğer hücreleri içerebilir. Reaksiyon iki aşamada meydana gelir: ilk (görünmez) spesifik, antijen ve antikorların kombinasyonu, ikinci (görünür) spesifik olmayan, antijenlerin yapıştırılması, yani. aglütinat oluşumu.
İki değerlikli bir antikorun bir aktif merkezi, bir antijenin belirleyici grubuyla birleştiğinde bir aglütinat oluşur. Herhangi bir serolojik reaksiyon gibi aglütinasyon reaksiyonu da elektrolitlerin varlığında meydana gelir.
Dışarıdan, pozitif aglütinasyon reaksiyonunun tezahürü iki yönlü bir karaktere sahiptir. Yalnızca somatik O2 antijenine sahip kamçılı mikroplarda, mikrobiyal hücrelerin kendisi doğrudan birbirine yapışır. Bu aglütinasyona ince taneli denir. 18 22 saat içerisinde ortaya çıkar. v
Kamçılı mikropların iki antijeni vardır: somatik O2 antijeni ve kamçılı H2 antijeni. Hücreler flagella ile birbirine yapıştırılırsa büyük, gevşek pullar oluşur ve bu aglütinasyon reaksiyonuna iri taneli denir. 2 4 saat içerisinde ortaya çıkar.
Aglütinasyon reaksiyonu hem hastanın kan serumundaki spesifik antikorların niteliksel ve niceliksel olarak belirlenmesi amacıyla hem de izole edilen patojenin türünün belirlenmesi amacıyla gerçekleştirilebilir. v
Aglütinasyon reaksiyonu, hem teşhis titresine kadar seyreltilmiş serumla çalışmanıza izin veren genişletilmiş bir versiyonda hem de bir varyantta gerçekleştirilebilir. gösterge reaksiyonu Prensip olarak spesifik antikorların tespit edilmesine veya patojenin türünün belirlenmesine olanak sağlar.
Ayrıntılı bir aglütinasyon reaksiyonu gerçekleştirirken, deneğin kan serumundaki spesifik antikorları tespit etmek için test serumu 1:50 veya 1:100 seyreltide alınır. Bunun nedeni, normal antikorların tam veya az miktarda seyreltilmiş serumda çok yüksek konsantrasyonlarda bulunabilmesi ve ardından reaksiyon sonuçlarının hatalı olabilmesidir. Reaksiyonun bu versiyonunda test edilen materyal hastanın kanıdır.
Kan, aç karnına veya yemekten en geç 6 saat sonra alınır (aksi takdirde kan serumunda yağ damlacıkları olabilir, bu da onu bulanık ve araştırma için uygunsuz hale getirebilir). Hastanın kan serumu genellikle hastalığın ikinci haftasında kübital venden steril olarak 3 x 4 ml kan toplanarak elde edilir (bu zamana kadar spesifik antikorların maksimum miktarı konsantre edilir). Belirli bir antijenik yapıya sahip belirli bir türün öldürülmüş fakat yok edilmemiş mikrobiyal hücrelerinden hazırlanan bir diagnostikum, bilinen bir antijen olarak kullanılır.
Patojenin türünü ve tipini belirlemek için ayrıntılı bir aglütinasyon reaksiyonu gerçekleştirirken, antijen, çalışılan materyalden izole edilen canlı bir patojendir. İmmün teşhis serumunda bulunan antikorlar bilinmektedir. v
Bağışıklık teşhis serumu aşılanmış bir tavşanın kanından elde edilmiştir. Titreyi (antikorların tespit edildiği maksimum seyreltme) belirledikten sonra, teşhis serumu bir koruyucu ilavesiyle ampullere dökülür. Bu serum, izole edilen patojenin antijenik yapısına göre tanımlama için kullanılır.
AGLUTİNASYON REAKSİYONUNUN SEÇENEKLERİ
Bu reaksiyonlar, antikorlar tarafından birbirine yapıştırılan ve çöken parçacıklar (mikrobiyal hücreler, kırmızı kan hücreleri ve diğer korpüsküler antijenler) formundaki antijenleri içerir.
Bir aglütinasyon reaksiyonu (RA) gerçekleştirmek için üç bileşen gereklidir: 1) antijen (aglütinojen); 2) antikor (aglutinin) ve 3) elektrolit (izotonik sodyum klorür çözeltisi).
YÖNLENDİRİCİ (PLAK) AGLÜTİNASYON REAKSİYONU (RA)
Bir gösterge veya plaka RA, oda sıcaklığında bir cam slayt üzerine yerleştirilir. Bunu yapmak için, bir Pasteur pipeti kullanarak 1:10 1:20 seyreltmede bir damla serum ve bir kontrol damlası izotonik sodyum klorür çözeltisini camın üzerine ayrı ayrı uygulayın. Her iki bakteriyolojik döngüye koloniler veya günlük bakteri kültürü (bir damla diagnostikum) eklenir ve iyice karıştırılır. Tepkiler birkaç dakika sonra, bazen bir büyüteç (x5) kullanılarak görsel olarak dikkate alınır. Pozitif RA ile, bir damla serumda irili ufaklı pulların görünümü not edilir; negatif ile serum eşit şekilde bulanık kalır.
DOLAYLI (PASİF) HEMAGLUTİNASYON REAKSİYONU (RNGA, RPGA)
Reaksiyon şu şekilde gerçekleştirilir: 1) aglütininlerle kompleksleri geleneksel RA'da görülemeyen polisakkaritleri, proteinleri, bakteri ekstraktlarını ve diğer oldukça dağılmış maddeleri, riketsiyaları ve virüsleri tespit etmek için veya 2) hastaların serumundaki antikorları tespit etmek için bu oldukça dağılmış maddeler ve en küçük mikroorganizmalar.
Dolaylı veya pasif aglütinasyon, antikorların inert parçacıklar (lateks, selüloz, polistiren, baryum oksit vb. veya koyun kırmızı kan hücreleri, insan kan grubu I(0)) üzerinde önceden adsorbe edilmiş antijenlerle etkileşime girdiği bir reaksiyon olarak anlaşılır.
Pasif hemaglutinasyon reaksiyonunda (RPHA) taşıyıcı olarak kırmızı kan hücreleri kullanılır. Antijen yüklü kırmızı kan hücreleri, bu antijene karşı spesifik antikorların varlığında birbirine yapışır ve çöker. Antijene duyarlı hale getirilmiş eritrositler, RPGA'da antikorların tespiti (serodiagnoz) için bir eritrosit teşhisi olarak kullanılır. Kırmızı kan hücreleri antikorlarla yüklüyse (eritrosit antikor diagnostiği), antijenleri tespit etmek için kullanılabilir.
Sahneleme. Polistiren plakaların oyuklarında bir dizi seri serum seyreltisi hazırlanır. Sondan bir önceki kuyucuğa 0,5 ml açıkça pozitif serum ve son kuyucuğa 0,5 ml fizyolojik çözelti (kontroller) ekleyin. Daha sonra tüm kuyucuklara 0,1 ml seyreltilmiş eritrosit diagnostiği ekleyin, çalkalayın ve 2 saat boyunca bir termostata yerleştirin.
Muhasebe. İÇİNDE olumlu durum eritrositler, katlanmış veya pürüzlü kenarlı (ters çevrilmiş şemsiye) eşit bir hücre tabakası şeklinde deliğin dibine yerleşir; negatif olarak bir düğme veya halka şeklinde yerleşirler.
1.2. NÖTRLEŞTİRME REAKSİYONU. LİZİS,
OPSONOFAGOSİTİK REAKSİYON, AŞIRI DUYARLILIK REAKSİYONU
EKZOTOKSİNİN ANTİTOKSİN (RN) İLE NÖTRALİZASYONUNUN REAKSİYONU
Reaksiyon, antitoksik serumun ekzotoksinin etkisini nötralize etme yeteneğine dayanmaktadır. Antitoksik serumların titrasyonu ve ekzotoksin tayini için kullanılır.
Serum titre edilirken, antitoksik serumun farklı seyreltilerine karşılık gelen toksinin belirli bir dozu eklenir. Antijen tamamen nötralize edildiğinde ve harcanmamış antikor kalmadığında, ilk flokülasyon meydana gelir. Flokülasyon reaksiyonu yalnızca serum titrasyonu için (örneğin difteri) değil aynı zamanda toksin ve toksoid titrasyonu için de kullanılabilir. Toksin nötralizasyonunun antitoksin ile reaksiyonu, antitoksik terapötik serumların aktivitesini belirlemeye yönelik bir yöntem olarak büyük pratik öneme sahiptir. Bu reaksiyondaki antijen gerçek bir ekzotoksindir.
Antitoksik serumun gücü geleneksel AE birimleriyle belirlenir.
1 AE botulinum serumu miktarı 1000 DLM botulinum toksini nötralize eder. Ekzotoksin türünü veya tipini (tetanoz, botulizm, difteri vb. tanısı için) belirlemek için nötrleştirme reaksiyonu in vitro (Ramon'a göre) ve mikrobiyal hücrelerin toksijenitesini belirlerken - bir jelde ( Ouchterlony'ye göre).
Lizis reaksiyonu (RL)
Bağışıklık serumunun koruyucu özelliklerinden biri vücuda giren mikropları veya hücresel elementleri çözme yeteneğidir.
Hücre çözünmesine (lizis) neden olan spesifik antikorlara lizinler denir. Antijenin doğasına bağlı olarak bakteriyolizinler, sitolizinler, spiroketolizinler, hemolizinler vb. olabilirler.
Lizinler etkilerini yalnızca ek bir tamamlayıcı faktörün varlığında gösterirler. Spesifik olmayan bir faktör olarak tamamlayıcı humoral bağışıklık Beyin omurilik sıvısı ve ön kamara sıvısı hariç hemen hemen tüm vücut sıvılarında bulunur. İnsan kan serumunda oldukça yüksek ve sabit bir tamamlayıcı içeriği kaydedildi ve kan serumunda çok fazla var Gine domuzu. Diğer memelilerde kan serumundaki kompleman içeriği farklıdır.
Tamamlayıcı: karmaşık bir sistem peynir altı suyu proteinleri. Dengesizdir ve 55 derecede 30 dakika boyunca çöker. Oda sıcaklığında kompleman iki saat içinde yok edilir. Uzun süreli çalkalamaya, asitlere ve ultraviyole ışınlara karşı çok hassastır. Bununla birlikte, kompleman düşük sıcaklıklarda kurutulmuş halde uzun süre (altı aya kadar) saklanır. Kompleman, mikrobiyal hücrelerin ve kırmızı kan hücrelerinin parçalanmasını teşvik eder.
Bakteriyoliz ve hemoliz reaksiyonları arasında bir ayrım yapılır.
Bakteriyoliz reaksiyonunun özü, spesifik bir bağışıklık serumu, tamamlayıcının varlığında karşılık gelen homolog canlı mikrobiyal hücrelerle birleştiğinde mikrobiyal liziz meydana gelmesidir.
Hemoliz reaksiyonu, eritrositlerin, kompleman varlığında kendilerine karşı bağışık olan spesifik bir seruma (hemolitik) maruz bırakıldığında, eritrositlerin çözünmesinin gözlemlenmesidir; hemoliz.
Laboratuvar pratiğindeki hemoliz reaksiyonu, kompleman aralığını belirlemek ve sonuçları kaydetmek için kullanılır. teşhis reaksiyonları tamamlayıcı fiksasyon. Kompleman titresi, 2,5 ml hacimde hemolitik bir sistemde kırmızı kan hücrelerinin 30 dakika içinde parçalanmasına neden olan en küçük miktardır. Tüm serolojik reaksiyonlar gibi lizis reaksiyonu da bir elektrolit varlığında meydana gelir.
AŞIRI DUYARLILIK REAKSİYONLARI (ALERJİK)
Belirli antijen formları, vücutla tekrarlanan temas halinde, temelinde spesifik olan ancak akut inflamatuar yanıtın spesifik olmayan hücresel ve moleküler faktörlerini içeren bir reaksiyona neden olabilir. Aşırı duyarlılığın bilinen iki biçimi vardır: ani tip aşırı duyarlılık (IHT) ve gecikmiş tip aşırı duyarlılık (DTH). İlk reaksiyon türü, antikorların katılımıyla meydana gelir ve reaksiyon, alerjenle tekrar tekrar temastan en geç 2 saat sonra gelişir. İkinci tip, reaksiyonun ana efektörleri olan inflamatuar T hücrelerinin (Tgc) yardımıyla gerçekleştirilir ve inflamasyon alanında makrofajların birikmesi sağlanır; reaksiyon 6-8 saat sonra ve daha sonra kendini gösterir.
Aşırı duyarlılık reaksiyonunun gelişmesinden önce bir antijenle karşılaşma ve duyarlılığın ortaya çıkması gerçekleşir; antikorların, aktif olarak duyarlılaştırılmış lenfositlerin ve diğer lökositlerin (makrofajlar, granülositler) pasif olarak duyarlılaştırılmış sitofilik antikorlarının görünümü.
Aşırı duyarlılık reaksiyonlarının üç gelişim aşaması vardır: immünolojik; patokimyasal; patofizyolojik.
İlk spesifik aşamada alerjen, antikorlarla ve/veya duyarlılaşmış hücrelerle etkileşime girer. İkinci aşamada biyolojik salınım meydana gelir aktif maddeler aktifleştirilmiş hücrelerden. Salınan aracılar (histamin, serotonin, lökotrienler, bradikinin, vb.), üçüncü faz reaksiyonunun ilgili tipinin karakteristiği olan çeşitli çevresel etkilere neden olur.
Tepkiler aşırı duyarlılık dördüncü tip
Bu tip reaksiyonlara, duyarlılaştırılmış T yardımcı hücreleri, sitotoksik T lenfositleri (T öldürücü hücreler) ve mononükleer fagosit sisteminin aktive edilmiş hücrelerinin patojenik hücrelerarası etkileşimleri neden olur; bu, bağışıklık sisteminin bakteriyel antijenler tarafından uzun süreli uyarılmasının neden olduğu, bu da neden olur. vücudun bağışıklık sisteminin bunları ortadan kaldırmak için göreceli yetersizliği İç ortam bulaşıcı hastalıkların bakteriyel patojenleri. Bu aşırı duyarlılık reaksiyonları tüberkülozlu akciğer boşluklarına, bunların kazeöz nekrozuna ve tüberkülozlu hastalarda genel zehirlenmeye neden olur. Morfopatogenetik açıdan tüberküloz ve cüzzamdaki kutanöz granülomatoz büyük ölçüde dördüncü tip aşırı duyarlılık reaksiyonlarından oluşur.
En ünlü örnek dördüncü tip aşırı duyarlılık reaksiyonları, vücudu ve sistemi mikobakteriyel antijenlere karşı duyarlı olan bir hastaya intradermal tüberkülin enjeksiyonu bölgesinde gelişen bir Mantoux reaksiyonudur. Reaksiyonun bir sonucu olarak, intradermal tüberkülin enjeksiyonundan sadece birkaç saat sonra (yavaş yavaş) ortaya çıkan, merkezinde nekroz bulunan yoğun bir hiperemik papül oluşur. Papül oluşumu, dolaşımdaki kanın mononükleer fagositlerinin vasküler yataktan hücreler arası boşluklara salınmasıyla başlar. Aynı zamanda polimorfonükleer hücrelerin vasküler yataktan göçü başlar. Daha sonra nötrofillerin sızması azalır ve sızıntı ağırlıklı olarak lenfositlerden ve mononükleer fagositlerden oluşmaya başlar. Bu, ağırlıklı olarak polimorfonükleer lökositlerin lezyon bölgesinde biriktiği Mantoux reaksiyonundan Arthus reaksiyonundan farklıdır.
Tip 4 aşırı duyarlılık reaksiyonlarında, duyarlılaşmış lenfositlerin antijenlerle uzun süreli uyarılması, patolojik değişiklikler T yardımcı hücreleri tarafından patolojik olarak yoğun ve uzun süreli sitokin salınımına neden olur. Doku hasarı bölgelerinde yoğun sitokin salınımı, burada bulunan mononükleer fagosit sisteminin hücrelerinin hiperaktivasyonuna neden olur; bunların çoğu, hiperaktif bir durumda, epiteloid hücrelerin şeritlerini oluşturur ve bazıları dev hücreler oluşturmak için birbirleriyle birleşir. Yüzeyinde bakteriyel ve viral antijenlerin açığa çıktığı makrofajlar, Tkiller'lerin (doğal öldürücüler) işleyişi yoluyla yok edilebilir.
Dördüncü tip aşırı duyarlılık reaksiyonu, yabancı bir bakteriyel antijenin, ona duyarlı hale getirilmiş T yardımcı hücreleri tarafından tanınmasıyla indüklenir. Tanıma için gerekli bir koşul, endositozdan sonra antijen sunan hücrelerin yüzeyinde maruz kalan antijenlerle indükleyicilerin etkileşimi ve yabancı immünojenlerin mononükleer fagositler tarafından işlenmesidir. Bir diğer gerekli kondisyon antijenlerin ana doku uyumluluk kompleksinden sınıf I moleküllerle kombinasyon halinde maruz bırakılması. Antijen tanındıktan sonra, duyarlı hale getirilmiş yardımcı hücreler sitokinleri ve özellikle doğal öldürücü hücreleri ve mononükleer fagositleri aktive eden interlökin2'yi serbest bırakır. Aktive edilmiş mononükleer fagositler, dokuya zarar veren proteolitik enzimleri ve serbest oksijen radikallerini serbest bırakır.
Cilt alerji testleri, vücudun alerjenlere karşı duyarlılığını belirlemek, örneğin tüberküloz, bruselloz gibi enfeksiyon düzeyini belirlemek için testler yapar. sürü bağışıklığıörneğin tularemiye. Alerjenin uygulandığı yere bağlı olarak aşağıdakiler mevcuttur: 1) cilt testleri; 2) yara izi; 3) intradermal; 4) deri altı. Cilt alerjisi testi sırasında alerjene verilen klinik reaksiyon, lokal, genel ve fokal, ayrıca ani ve gecikmeli olarak ayrılır.
GNT aracı tipinin lokal reaksiyonları 520 dakika sonra ortaya çıkar, eritem ve kabarcık şeklinde ifade edilir, birkaç saat sonra kaybolur ve mm cinsinden ölçülen eritem boyutuna göre artı yöntemiyle değerlendirilir. Lokal HRT reaksiyonları 24-48 saat içinde ortaya çıkar, uzun sürer, bazen merkezinde nekroz bulunan bir infiltrasyon şeklinde ortaya çıkar ve artı sistemi kullanılarak infiltrasyonun mm cinsinden boyutuna göre değerlendirilir. HNT'nin sitotoksik ve immün kompleks tipleri ile hiperemi ve infiltrasyon 3-4 saat sonra gözlenir, 6-8 saatte maksimuma ulaşır ve yaklaşık bir gün sonra azalır. Bazen kombine reaksiyonlar gözlenir.
1.3. KOMPLEMAN SABİTLEME REAKSİYONU (FFR)
Bu reaksiyon, laboratuvar çalışmalarında çeşitli enfeksiyonlara karşı kan serumundaki antikorları tespit etmek ve ayrıca patojeni antijenik yapısına göre tanımlamak için kullanılır.
Kompleman fiksasyonu reaksiyonu karmaşık bir serolojik reaksiyondur ve oldukça duyarlı ve spesifiktir.
Bu reaksiyonun bir özelliği, spesifik antikorlarla etkileşimi sırasında antijendeki değişimin yalnızca kompleman varlığında meydana gelmesidir. Kompleman yalnızca “antikor antijeni” kompleksine adsorbe edilir. “Antikor antijen” kompleksi ancak serumdaki antijen ile antikor arasında bir afinite varsa oluşur.
Komplemanın “antijen antikor” kompleksi üzerine adsorpsiyonu, özelliklerine bağlı olarak antijenin kaderi üzerinde farklı etkilere sahip olabilir.
Antijenlerden bazıları bu koşullar altında çözünme (hemoliz, Isaev-Pfeiffer fenomeni, sitolitik etki) dahil olmak üzere keskin morfolojik değişikliklere uğrar. Diğerleri hareket hızını değiştirir (treponema immobilizasyonu). Yine de diğerleri ani yıkıcı değişiklikler (bakterisidal veya sitotoksik etki) olmadan ölürler. Son olarak kompleman adsorpsiyonuna kolaylıkla gözlemlenebilen antijen değişiklikleri eşlik etmeyebilir.
RSC mekanizmasına göre iki aşamada gerçekleşir:
- İlk aşama “antijen antikor” kompleksinin oluşması ve bu kompleman kompleksi üzerine adsorbsiyondur. Fazın sonucu görsel olarak görülmez (antijen ve antikorların tamamlayıcının zorunlu katılımıyla etkileşimi).
- İkinci aşama, kompleman varlığında spesifik antikorların etkisi altında antijende meydana gelen bir değişikliktir. Fazın sonucu görsel olarak görülebilir veya görülmeyebilir (bir gösterge hemolitik sistemi (koyun kırmızı kan hücreleri ve hemolitik serum) kullanılarak reaksiyon sonuçlarının tespiti).
Kırmızı kan hücrelerinin hemolitik serum tarafından yok edilmesi, yalnızca hemolitik sisteme kompleman eklenmesi durumunda gerçekleşir. Kompleman daha önce antijen-antikor kompleksi üzerine adsorbe edilmişse, eritrositlerin hemolizi meydana gelmez.
Deneyin sonucu, tüm test tüplerinde hemoliz olup olmadığına dikkat edilerek değerlendirilir. Hemoliz tamamen geciktiğinde, test tüpündeki sıvı renksiz olduğunda ve kırmızı kan hücreleri dibe çöktüğünde reaksiyon pozitif olarak kabul edilir, kırmızı kan hücreleri tamamen parçalandığında, sıvı yoğun şekilde renklendiğinde (“vernik”) reaksiyon negatif olarak kabul edilir. kan). Hemoliz gecikmesinin derecesi, sıvının renginin yoğunluğuna ve alttaki kırmızı kan hücresi çökeltisinin boyutuna (++++, +++, ++, +) bağlı olarak değerlendirilir.
Antijendeki değişikliklerin görsel gözlem için erişilemez kalması durumunda, tamamlayıcının durumunu değerlendirmeye ve reaksiyonun sonucu hakkında bir sonuca varmaya izin veren, gösterge görevi gören ikinci bir sistemin kullanılması gerekir.
Bu gösterge sistemi, koyun eritrositlerini ve eritrositlere karşı spesifik antikorlar (hemolizinler) içeren, ancak tamamlayıcı içermeyen hemolitik serumu içeren hemoliz reaksiyonunun bileşenleri ile temsil edilir. Bu indikatör sistemi, ana RSC yerleştirildikten bir saat sonra test tüplerine eklenir. Kompleman fiksasyon reaksiyonu pozitifse, komplemanı kendi üzerine adsorbe eden bir antikor antijen kompleksi oluşur. Kompleman yalnızca bir reaksiyon için gerekli miktarda kullanıldığından ve eritrositlerin parçalanması yalnızca kompleman varlığında gerçekleşebildiğinden, "antijen antikor" kompleksi üzerine adsorbe edildiğinde hemolitik (gösterge) sistemdeki eritrositlerin parçalanması gerçekleşir. olmaz. Kompleman fiksasyon reaksiyonu negatif ise “antijen antikor” kompleksi oluşmaz, kompleman serbest kalır ve hemolitik sistem eklendiğinde eritrosit lizizi meydana gelir.
1.4. DNA SONDALARI. POLİMERAZ ZİNCİR REAKSİYONU (PCR),
İMMÜNOENZİM YÖNTEMİ (ELISA), FLORESAN ANTİKOR YÖNTEMİ (FFA)
GEN İNCELEME YÖNTEMLERİ
Moleküler biyolojinin yoğun gelişimi ve genetik araştırmalar için mükemmel bir metodolojik temelin yaratılması, genetik mühendisliğinin temelini oluşturdu. Teşhis alanında, gen araştırması olarak adlandırılan, DNA ve RNA'nın spesifik nükleotid dizilerini belirlemek için bir yön ortaya çıktı ve hızla gelişiyor. Bu tür teknikler, tamamlayıcı nükleotidlerin (AT, GC) etkileşimi nedeniyle nükleik asitlerin hibritleşebilme ve çift sarmallı yapılar oluşturabilme yeteneğine dayanmaktadır.
İstenilen DNA (veya RNA) dizisini belirlemek için, spesifik bir baz dizisine sahip polinükleotid probu adı verilen bir prob özel olarak oluşturulur. Bileşimine, kompleksin oluşumunu tanımlamayı mümkün kılan özel bir etiket eklenmiştir.
Gen problaması bir immünokimyasal analiz yöntemi olarak sınıflandırılamasa da, temel prensibi (tamamlayıcı yapıların etkileşimi), immünolojik teşhisin gösterge yöntemleriyle aynı şekillerde metodik olarak uygulanır. Ek olarak, gen araştırma yöntemleri, fenotipik ifadesinin (genomda gömülü virüsler, "sessiz" genler) yokluğunda bulaşıcı bir ajan hakkındaki bilgilerin yenilenmesini mümkün kılar.
DNA analizi gerçekleştirmek için, DNA veya RNA prob moleküllerinin reaksiyona gireceği tek sarmallı yapılar elde etmek amacıyla numune denatüre edilir. Probları hazırlamak için, ya doğal bir kaynaktan (örneğin, belirli bir mikroorganizma) izole edilen, genellikle vektör plazmidlerinde genetik diziler halinde sunulan çeşitli DNA (veya RNA) bölümleri veya kimyasal olarak sentezlenmiş oligonükleotitler kullanılır. Bazı durumlarda, fragmanlara hidrolize edilmiş genomik DNA preparatları, bazen RNA preparatları ve özellikle sıklıkla ribozomal RNA, prob olarak kullanılır. Aynı göstergeler, çeşitli immünokimyasal analiz türlerinde olduğu gibi etiket olarak kullanılır: radyoaktif izotoplar, floresanslar, biyotop (avidin-enzim kompleksi tarafından daha da geliştirilerek), vb.
Analiz sırası mevcut probun özelliklerine göre belirlenir
Şu anda gerekli tüm bileşenleri içeren ticari kitler giderek daha fazla kullanılmaktadır.
Çoğu durumda analiz prosedürü aşağıdaki aşamalara ayrılabilir: numune hazırlama (DNA ekstraksiyonu ve denatürasyon dahil), numunenin bir taşıyıcı üzerinde sabitlenmesi (çoğunlukla bir polimer membran filtre), ön hibridizasyon, hibridizasyonun kendisi, bağlanmamış ürünlerin yıkanması, tespit . Standart bir DNA veya RNAprob preparatının bulunmaması durumunda öncelikle elde edilir ve etiketlenir.
Bir numune hazırlamak için, tek tek bakteri kolonilerini tanımlamak veya hücre kültüründeki virüs konsantrasyonunu artırmak amacıyla test materyalini önceden "büyütmek" gerekebilir. Ayrıca gerçekleştirilir doğrudan analiz kan serumu, idrar örnekleri, şekilli elemanlar bulaşıcı bir ajanın varlığı için kan veya tam kan. Nükleik asitleri hücresel yapılardan serbest bırakmak için hücre lizizi gerçekleştirilir ve bazı durumlarda DNA preparasyonu fenol kullanılarak saflaştırılır.
DNA'nın denatürasyonu, yani tek sarmallı forma geçişi, alkali ile işlendiğinde meydana gelir. Nükleik asit örneği daha sonra bir nitroselüloz veya naylon membran gibi bir desteğe, genellikle bir vakumda 80°C'de 10 dakika ila 4 saat süreyle inkübasyon yoluyla sabitlenir. Ayrıca ön hibridizasyon sürecinde, probun membran ile spesifik olmayan etkileşimini azaltmak için serbest bağlanma bölgelerinin etkisizleştirilmesi sağlanır. Hibridizasyon işlemi numunedeki DNA konsantrasyonuna, kullanılan probun konsantrasyonuna ve boyutuna bağlı olarak 2 ila 20 saat sürer.
Hibridizasyon tamamlandıktan ve bağlanmamış ürünler yıkandıktan sonra oluşan kompleks tespit edilir. Prob radyoaktif bir etiket içeriyorsa reaksiyonu göstermek için membran fotoğraf filmine (otoradyografi) maruz bırakılır. Diğer etiketler için ilgili prosedürler kullanılır.
En umut verici olanı radyoaktif olmayan (soğuk denilen) sondaların elde edilmesidir. Aynı temelde, özellikle patomorfolojik analizde (yerinde hibridizasyon) önemli olan kesit preparatlarında ve doku delinmelerinde patojenin varlığını tespit etmeyi mümkün kılan bir hibridizasyon tekniği geliştirilmektedir.
Gen araştırma yöntemlerinin geliştirilmesinde önemli bir adım, polimeraz amplifikasyon reaksiyonunun (PCR) kullanılmasıydı. Bu yaklaşım, birden fazla kopyayı in vitro sentezleyerek bir numunedeki belirli (önceden bilinen) bir DNA dizisinin konsantrasyonunu arttırmayı mümkün kılar. Reaksiyonu gerçekleştirmek için, bir DNA polimeraz enzim preparatı, sentez için fazla miktarda deoksinükleotid ve sözde primerler, incelenen DNA örneğine eklenir - terminal bölümlerine karşılık gelen 2025 baz büyüklüğünde iki tip oligonükleotid. İlgilenilen DNA dizisi. Primerlerden biri, kodlayan DNA ipliğinin okuma yönündeki (53) okuma bölgesinin başlangıcının bir kopyası olmalı ve ikincisi, kodlamayan ipliğin karşı ucunun bir kopyası olmalıdır. Daha sonra polimeraz reaksiyonunun her döngüsünde DNA kopya sayısı iki katına çıkar.
Primer bağlanmasını sağlamak için 94°C'de DNA denatürasyonu (erime) ve ardından karışımın 40-55°C'ye getirilmesi gerekir.
Reaksiyonu gerçekleştirmek için programlanabilir mikro numune inkübatörleri, reaksiyonun her aşaması için optimum sıcaklıktaki değişiklikler arasında kolayca geçiş yapacak şekilde tasarlanmıştır.
Amplifikasyon reaksiyonu, özellikle enfeksiyöz ajanın düşük konsantrasyonlarında önemli olan gen araştırması sırasında analizin hassasiyetini önemli ölçüde artırabilir.
Amplifikasyonla gen araştırmasının önemli avantajlarından biri, mikroskobik miktardaki patolojik materyali inceleme yeteneğidir.
Yöntemin bulaşıcı materyalin analizi için daha önemli olan bir diğer özelliği, gizli (sessiz) genleri tanımlama yeteneğidir. Gen araştırmasının kullanımıyla ilgili yöntemler, daha basit ve ucuz hale geldikçe, bulaşıcı hastalıkların teşhisi pratiğine kesinlikle daha yaygın bir şekilde dahil edilecektir.
ELISA ve RIF yöntemleri büyük ölçüde niteliksel veya yarı niceliksel niteliktedir. Çok düşük bileşen konsantrasyonlarında, antijen antikor kompleksinin oluşumu görsel olarak veya basit enstrümantal araçlarla tespit edilemez. Bu gibi durumlarda antijen antikor kompleksinin göstergesi, analitin belirlenen konsantrasyonuyla karşılaştırılabilir konsantrasyonlarda kolayca tespit edilebilen, antijen veya antikor başlangıç bileşenlerinden birine bir etiket eklenirse gerçekleştirilebilir.
Etiket olarak radyoaktif izotoplar (örneğin 125I), floresan maddeler ve enzimler kullanılabilir.
Kullanılan etikete bağlı olarak radyoimmün (RIA), floresan immün (FIA), enzim bağlantılı immünosorbent tahlili (ELISA) analiz yöntemleri vb. vardır. son yıllar ELISA, olasılığa bağlı olarak yaygın pratik kullanıma kavuşmuştur. niceliksel tespitler, yüksek hassasiyet Muhasebenin özgüllüğü ve otomasyonu.
Enzim immünoassay yöntemleri, bir enzim tarafından parçalanan ve renk üreten bir substrat kullanılarak antijen-antikor kompleksinin saptanmasına olanak tanıyan bir yöntem grubudur.
Yöntemin özü, antijen antikor reaksiyonunun bileşenlerini ölçülen bir enzim etiketiyle birleştirmektir. Reaksiyona giren antijen veya antikor bir enzimle etiketlenir. Enzimin etkisi altında substratın dönüşümüne dayanarak, antijen antikor reaksiyonunun etkileşime giren bileşeninin miktarı değerlendirilebilir. Enzim bu durumda işaretleyici görevi görür bağışıklık reaksiyonu ve bunu görsel veya aletli olarak gözlemlemenizi sağlar.
Enzimler çok kullanışlı etiketlerdir çünkü katalitik özellikleri onların yükseltici olarak hareket etmelerine izin verir, çünkü bir enzim molekülü dakikada 1 x 105 molekülden fazla katalitik reaksiyon ürünü oluşumunu teşvik edebilir. Katalitik aktivitesini uzun süre koruyan, bir antijene veya antikora bağlanırken kaybetmeyen, substrata göre yüksek spesifiteye sahip bir enzimin seçilmesi gerekir.
Enzim etiketli antikorlar veya antijenler ve konjugatların üretilmesine yönelik ana yöntemler şunlardır: kimyasal, immünolojik ve genetik mühendisliği. ELISA için en sık kullanılan enzimler yaban turpu peroksidazı, alkalin fosfataz, galaktosidaz vb.'dir.
Reaksiyonun görsel ve enstrümantal kaydı amacıyla antijen-antikor kompleksindeki enzim aktivitesini tespit etmek için, başlangıçta renksiz olan çözeltileri, enzimatik reaksiyon sırasında yoğunluğu miktarla orantılı olan renk kazanan kromojenik substratlar kullanılır. enzim. Bu nedenle, katı fazlı ELISA'da yaban turpu peroksidazının aktivitesini tespit etmek için, yoğun kahverengi bir renk üreten 5-aminosalisilik asit ve turuncu-sarı bir renk üreten orto-fenilendiamin, substrat olarak kullanılır. Alkalin fosfataz ve β-galatosidazın aktivitesini tespit etmek için sırasıyla nitrofenilfosfatlar ve nitrofenilgalaktozitler kullanılır.
Renkli bir ürünün oluşumundaki reaksiyonun sonucu görsel olarak veya belirli bir dalga boyundaki ışığın emilimini ölçen bir spektrofotometre kullanılarak belirlenir.
ELISA gerçekleştirmek için birçok seçenek vardır. Homojen ve heterojen seçenekler vardır.
Kullanılan yönteme bağlı olarak rekabetçi ve rekabetçi olmayan ELISA yöntemleri arasında bir ayrım yapılır. İlk aşamada sistemde yalnızca analiz edilen bileşik ve buna karşılık gelen bağlanma merkezleri (antijen ve spesifik antikorlar) mevcutsa, yöntem rekabetçi değildir. İlk aşamada analiz edilen bileşik (antijen) ve bunun analoğu (enzim etiketli antijen) mevcutsa, yetersiz tedarik edilen spesifik bağlanma merkezlerine (antikorlar) bağlanmak için birbirleriyle rekabet ediyorsa, o zaman yöntem rekabetçidir. Bu durumda, çözelti ne kadar çok test antijeni içerirse bağlı etiketli antijenlerin sayısı da o kadar az olur.
FLORESAN ANTİKORLARIN (MFA) veya İMMÜNOFLORESAN REAKSİYONUNUN (RIF) YÖNTEMİ
İmmünfloresan yöntemi, test materyalinde bilinmeyen bir mikroorganizmanın hızlı tespiti ve tanımlanması için tercih edilen yöntemdir.
Ag + AT + elektrolit = UV ışınlarında parlayan kompleks
Florokrom ile etiketlenmiş mikrop serumu
Sıklıkla kullanılan boya, floresan izotiyosiyanat FITC'dir.
Bu yöntemi incelerken floresan bir mikroskop kullanılır.
RIF'nin Aşamalandırılması
Smearın üzerine 30 µl FITC etiketli antikor solüsyonu uygulanır.
Bardağı nemli bir odaya yerleştirin ve oda sıcaklığında 20-25 dakika veya 37°C'deki termostatta 15 dakika bekletin.
Camı çalışan bir makinede yıkayın musluk suyu 2 dakika, damıtılmış suyla durulayın ve havayla kurutun.
Kurutulmuş smear'a bir damla montaj sıvısı uygulanır, smear bir lamel ile kaplanır ve bir floresan mikroskobu veya geleneksel bir optik mikroskoba bir floresan eklentisi kullanılarak mikroskoplanır.
