Dolaylı (pasif) hemaglütinasyon reaksiyonu (IRHA), eğer çözünebilir bir antijen yüzeylerine adsorbe edilirse, kırmızı kan hücrelerinin, adsorbe edilmiş antijene karşı antikorlarla etkileşime girdiğinde aglütinasyon yeteneği kazanması gerçeğine dayanır. RNGA diyagramı Şekil 2'de gösterilmektedir. 34. RNGA birçok enfeksiyonun tanısında yaygın olarak kullanılmaktadır.
Pirinç. Şekil 34. Pasif hemaglutinasyon reaksiyonunun (RPHA) şeması. A - eritrosit tanısının elde edilmesi: B - RPGA: 1 - eritrosit: 2 - çalışılan antijen; 3 - eritrosit tanısı; 4 - incelenen antijene karşı antikor: 5 - aglütinat
Bir reaksiyon oluşturmak. Test serumu 56°C'de 30 dakika ısıtılır, sırayla 1:10 - 1:1280 oranında seyreltilir ve 2 damla eritrosit diagnostiğinin (üzerlerine antijen adsorbe edilmiş eritrositler) yerleştirildiği test tüpleri veya kuyucuklara 0,25 ml dökülür. ) daha sonra eklenir.
Kontroller: bilinen bağışıklık serumu ile eritrosit diagnostiğinin bir süspansiyonu; diagnostikumun normal serumla süspansiyonu; normal kırmızı kan hücrelerinin test serumu ile süspansiyonu. İlk kontrolde aglütinasyon oluşmalı, ikinci ve üçüncü kontrolde ise aglütinasyon oluşmamalıdır.
RIGA'yı kullanarak, eğer bilinen antikorlar kırmızı kan hücrelerine adsorbe edilmişse, bilinmeyen bir antijeni tespit edebilirsiniz.
Hemaglutinasyon reaksiyonu, bir Takachi mikrotitratörü kullanılarak 0,025 ml'lik bir hacimde (mikro yöntem) gerçekleştirilebilir.
1. Pozitif bir X-ışını analizi sonucu, kırmızı kan hücreleri ile virüsün varlığı açısından test edilen materyal arasında neyi gösterir?
2. Kırmızı kan hücrelerine bir virüs ve buna karşılık gelen serum eklenirse aglütinasyon meydana gelir mi? Bu olguyu ortaya çıkaran reaksiyonun adı nedir?
Egzersiz yapmak
RIGA sonucunu dikkate alın ve kaydedin.
Yağış reaksiyonu
Çökeltme reaksiyonunda, elektrolitlerin varlığında çözünebilir bir antijen (lizat, ekstrakt, hapten) ve spesifik bir antikordan oluşan spesifik bir bağışıklık kompleksi çökeltilir.
Bu reaksiyon sonucunda oluşan bulutlu halka veya çökeltiye çökelti adı verilir. Bu reaksiyon esas olarak antijen parçacıklarının boyutunda aglütinasyon reaksiyonundan farklılık gösterir.
Çökelme reaksiyonu genellikle bir dizi enfeksiyonun tanısında antijeni belirlemek için kullanılır ( şarbon, menenjit, vb.); adli tıpta - kan, sperm vb. türlerinin belirlenmesi; sıhhi ve hijyenik çalışmalarda - ürünlerin tahrifatını oluştururken; onun yardımıyla hayvanların ve bitkilerin filogenetik ilişkisi belirlenir. İhtiyacınız olan reaksiyon için:
1. Antikorlar (çökeltiler) - yüksek antikor titresine sahip bağışıklık serumu (1:100.000'den düşük değil). Çöken serumun titresi, reaksiyona girdiği antijenin en yüksek seyreltilmesiyle belirlenir. Serum genellikle seyreltilmeden veya 1:5 - 1:10 oranında seyreltilerek kullanılır.
2. Antijen - protein veya lipoid polisakarit niteliğindeki çözünmüş maddeler (tam antijenler ve haptenler).
3. İzotonik çözüm.
Çökeltme reaksiyonunu gerçekleştirmenin ana yöntemleri şunlardır: halka çökeltme reaksiyonu ve agarda (jel) çökeltme reaksiyonu.
Dikkat! Çöktürme reaksiyonunda yer alan tüm bileşenler tamamen şeffaf olmalıdır.
Halka yağış reaksiyonu. Bir Pasteur pipeti kullanarak çökeltme tüpüne 0,2-0,3 ml (5-6 damla) serum ekleyin (serum tüpün duvarlarına bulaşmamalıdır). Aynı hacimdeki antijen, serumun üzerine dikkatlice katmanlanır ve ince bir Pasteur pipeti ile test tüpünün duvarı boyunca dökülür. Test tüpü eğimli bir konumda tutulur. Düzgün bir şekilde katmanlandığında serum ile antijen arasında net bir sınır olmalıdır. Sıvının karışmaması için test tüpünü dikkatlice bir standa yerleştirin. Reaksiyon pozitifse, antijen ve antikorun arayüzünde bulanık bir "halka" oluşur - bir çökelti (bkz. Şekil 48).
Reaksiyona bir dizi kontrol eşlik eder (Tablo 18). Reaksiyon bileşenlerinin test tüpüne eklenme sırası çok önemlidir. Serumu antijenin üzerine (kontrolde - izotonik bir çözelti üzerine) katmanlayamazsınız, çünkü serumun göreceli yoğunluğu daha büyük olduğundan test tüpünün dibine çökecek ve sıvılar arasındaki sınır açığa çıkmayacaktır.
Tablo 18. Halka çökeltme reaksiyonunun kurulum şeması
Not. + bir “yüzüğün” varlığı; - bir “yüzüğün” yokluğu.
Sonuçlar her zaman kontrollerden başlayarak 5-30 dakika sonra, bazı durumlarda ise bir saat sonra kaydedilir. 2. test tüpündeki "halka", bağışıklık serumunun içeri girme yeteneğini gösterir. spesifik reaksiyon karşılık gelen antijen ile. 3-5 test tüpünde "halka" olmamalıdır - birbirine karşılık gelen antikor ve antijen yoktur. 1. tüpteki bir "halka" - pozitif reaksiyon sonucu - test antijeninin alınan bağışıklık serumuna karşılık geldiğini gösterir, bir "halkanın" yokluğu (yalnızca 2. tüpte bir "halka") tutarsızlıklarını gösterir - negatif reaksiyon sonucu.
Agarda (jel) çökelme reaksiyonu. Reaksiyonun özelliği, antijen ve antikor etkileşiminin yoğun bir ortamda, yani bir jelde meydana gelmesidir. Ortaya çıkan çökelti, ortamın kalınlığında bulanık bir çizgi oluşturur. Bir bandın yokluğu reaksiyon bileşenleri arasında bir tutarsızlık olduğunu gösterir. Bu reaksiyon biyomedikal araştırmalarda, özellikle de difteri etken maddesindeki toksin oluşumunun araştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır.
Kontrol soruları
1. Aglütinasyon ve çökelme reaksiyonları arasındaki temel fark nedir?
2. Çökeltme reaksiyonunda neden bulanık bileşenler kullanılamıyor?
Egzersiz yapmak
1. Halka çökeltme reaksiyonunu kurun ve sonucu çizin.
2. Agardaki çökelme reaksiyonunda antijen ile antikor arasındaki etkileşimin doğasını inceleyin, sonucun taslağını çıkarın (öğretmeninizden bir bardak alın).
Lizis reaksiyonu (immün sitoliz)
İmmün lizis, hücrelerin antikorların etkisi altında çözünmesidir. zorunlu katılım Tamamlayıcı. İhtiyacınız olan reaksiyon için:
1. Antijen – mikroplar, kırmızı kan hücreleri veya diğer hücreler.
2. Antikor (lizin) - bağışıklık serumu, daha az sıklıkla hasta serumu. Bakteriyolitik serum, bakterilerin parçalanmasında rol oynayan antikorları içerir; hemolitik - kırmızı kan hücrelerinin parçalanmasını destekleyen hemolizinler; spiroketlerin parçalanması için spiroketolizinlere, hücrelere - itolizinlere vb. ihtiyaç vardır.
3. Tamamlayıcı. Serumdaki en fazla tamamlayıcı kobaylar. Bu serum (birkaç hayvanın karışımı) genellikle tamamlayıcı olarak kullanılır. Taze (doğal) tamamlayıcı kararsızdır ve ısıtma, çalkalama veya saklama yoluyla kolayca yok edilir, bu nedenle alındıktan sonra iki günden daha uzun süre kullanılamaz. Komplemanı korumak için buna %2 eklenir borik asit ve %3 sodyum sülfat. Bu tamamlayıcı 4°C'de iki haftaya kadar saklanabilir. Kuru tamamlayıcı en sık kullanılır. Kullanmadan önce izotonik bir çözelti içinde orijinal hacmine (etikette belirtilmiştir) çözülür.
4. İzotonik çözüm.
Hemoliz reaksiyonu(Tablo 19). İhtiyacınız olan reaksiyon için:
1. Antijen - 0,3 ml eritrosit çökeltisi ve 9,7 ml izotonik çözelti oranında yıkanmış koyun eritrositlerinin% 3 süspansiyonu.
2. Antikor - koyun eritrositlerine karşı hemolitik serum (hemolizin); genellikle üretimde hazırlanır, liyofilize edilir ve titresi etikette belirtilir.
Hemolizin titresi, kompleman varlığında kırmızı kan hücrelerinin %3'lük süspansiyonunun tam hemolizinin meydana geldiği serumun en yüksek dilüsyonudur. Hemoliz reaksiyonu için hemolizin üçlü titrede alınır, yani. titre öncesinden 3 kat daha az seyreltilir. Örneğin, 1:1200 serum titresi ile serum 1:400 oranında seyreltilir (0,1 ml serum * ve 39,9 ml izotonik çözelti). Bir kısmı diğer reaksiyon bileşenleri tarafından adsorbe edilebildiğinden hemolizin fazlası gereklidir.
* (0,1 ml'den az serum almamalısınız - ölçümün doğruluğu zarar görecektir.)
3. Kompleman 1:10 oranında seyreltilir (0,2 ml kompleman ve 1,8 ml izotonik çözelti).
4. İzotonik çözüm.
Tablo 19. Hemoliz reaksiyon şeması
Sonuçların muhasebeleştirilmesi. Reaksiyon doğru şekilde gerçekleştirilirse 1. test tüpünde hemoliz meydana gelecek - içeriği şeffaf hale gelecektir. Kontrollerde sıvı bulanık kalıyor: 2. tüpte hemoliz oluşması için yeterli kompleman yok, 3. tüpte hemolizin yok, 4. tüpte ne hemolizin ne de kompleman yok, 5. tüpte antijen yok antikorla eşleşmiyor,
Gerekirse hemolitik serum aşağıdakilere göre titre edilir: aşağıdaki diyagram(Tablo 20).
Titrasyondan önce, 1:100'lük (0,1 ml serum ve 9,9 ml izotonik çözelti) bir başlangıç serum dilüsyonu hazırlayın; gerekli seyreltmeler, Örneğin:
Bu dilüsyonlardan 0,5 ml serumu Tabloda gösterildiği gibi titrasyon test tüplerine ekleyin. 20.
Tablo 20. Hemolitik serum (hemolizin) için titrasyon şeması
Tabloda verilen örnekte. 20, hemolitik serumun titresi 1:1200'dür.
Taze hemolitik serum kullanıldığında, içindeki mevcut komplemanı yok etmek için inaktive edilmelidir. Bunu yapmak için su banyosunda veya termostatlı inaktivatörde 56 ° C'de 30 dakika ısıtılır. İkinci yöntem daha iyidir: Peynir altı suyunun aşırı ısınması, yani denatürasyonu olasılığını ortadan kaldırır. Denatüre serumlar test için uygun değildir.
Bakteriyoliz reaksiyonu. Bu reaksiyonda kompleman uygun (homolog) serum varlığında bakterileri parçalar. Reaksiyon şeması temel olarak hemoliz reaksiyon şemasına benzer. Aradaki fark, iki saatlik bir inkübasyondan sonra tüm test tüplerinin, deneye alınan mikroorganizmanın parçalanıp parçalanmadığının anlaşılması için uygun bir besiyeri ile Petri kaplarına ekilmesidir. Deney doğru şekilde yürütülürse, 2-5 test tüpünden (kontrol) alınan kültürlerde bol miktarda büyüme görülmelidir. 1. test tüpünden (deney) yapılan aşılamada büyüme olmaması veya zayıf büyüme, mikropların öldüğünü, yani bunların antikorla homolog olduğunu gösterir.
Dikkat! Bakteriyoliz reaksiyonu aseptik koşullar altında gerçekleştirilmelidir.
Kontrol soruları
1. İzotonik sodyum klorür çözeltisi yerine damıtılmış su kullanılırsa kırmızı kan hücrelerine ne olur? Bu olgunun temeli nedir?
2. Kompleman yokluğunda eritrositler homolog immün serumla etkileşime girdiğinde hangi reaksiyon meydana gelecektir?
Egzersiz yapmak
Hemoliz reaksiyonunu ayarlayın. Sonucu kaydedin ve çizin.
İlgili bilgi.
Kırmızı kan hücreleri veya nötr kullanır sentetik materyaller(örneğin lateks parçacıkları), yüzeyinde antijenlerin (bakteriyel, viral, doku) veya antikorların emildiği. Uygun serum veya antijenler eklendiğinde aglütinasyon meydana gelir. Antijenlerle duyarlı hale getirilen kırmızı kan hücrelerine antijenik eritrosit diagnostiği denir ve antikorları tespit etmek ve titre etmek için kullanılır. Antikorlarla duyarlı hale getirilmiş eritrositler. immünoglobulin eritrosit diagnostikleri olarak adlandırılır ve antijenleri tanımlamak için kullanılır.
Pasif hemaglütinasyon reaksiyonu, bakterilerin (tifo ve paratifo ateşi, dizanteri, bruselloz, veba, kolera vb.), protozoaların (sıtma) ve virüslerin (grip, adenoviral enfeksiyonlar, viral hepatit B, kızamık, kene kaynaklı ensefalit, Kırım kanamalı ateşi vb.) ve ayrıca belirli hormonları belirlemek için aşırı duyarlılık sabırlı ilaçlar ve penisilin ve insülin gibi hormonlar.
Pasif hemaglutinasyon reaksiyonu (RPHA). Pasif hemaglutinasyon testi duyarlı bir yöntemdir serolojik teşhis Hem erken hem de geriye dönük tanının yanı sıra aşılanan kişilerin immünolojik durumunun belirlenmesi amacıyla da kullanılıyor. Tularemi hastalarında genellikle hastalığın 1. veya 2. haftasının sonunda antikorlar saptanır ve 1-1,5 ay sonra RPHA titreleri ulaşır; maksimum performans(1:100000-1:20000, nadiren daha yüksek) sonrasında azalarak uzun süre 1:100-1:200 seviyesinde kalırlar.
Aşılanmış kişilerde antikorlar da sürekli olarak tespit edilir, ancak aşılamadan 1-1,5 ay sonra 1:2000-1:5000'i geçmeyecek şekilde daha düşük titrelerde bulunur ve birkaç yıl boyunca 1:20-1:80 gibi düşük bir seviyede kalır.
RPHA'yı evrelemek için kullanılan antijen tularemi eritrosit diagnostiğidir (antijenik). İlaç, sıvı ve kuru formda bulunan, tularemi antijeni ile duyarlı hale getirilmiş, formalize edilmiş koyun kırmızı kan hücreleridir. Sıvı preparat -% 10 konsantrasyonlu bir formaldehit çözeltisi içinde% 10'luk bir kırmızı kan hücresi süspansiyonu. Kuru liyofilize preparasyon - koruyucu madde olmadan vakumda kurutulan% 10'luk kırmızı kan hücreleri süspansiyonu. Kullanmadan önce etiketteki talimatlara göre seyreltilir. Polistiren plakalarda reaksiyonu ayarlamak için, her iki ilaç da% 2,5'lik bir konsantrasyonda ve reaksiyonu mikro hacimlerde ayarlarken -% 0,5'lik bir konsantrasyonda kullanılır.
RPGA'yı kurma tekniği. Test serumları fizyolojik çözelti 1:5 (1:10) ile seyreltilir ve 56 derece C'de 30 dakika ısıtılır. Bundan sonra koyun eritrositlerine karşı heterojen antikorları uzaklaştırmak için serumlar %50'lik formalize edilmiş koyun eritrosit süspansiyonu ile muamele edilir. Bunun için 1 ml seruma 2 damla (0,05 ml) oranında kırmızı kan hücreleri ekleyin ve çalkalayarak iyice karıştırın. Serum, eritrositler tamamen çökene kadar bırakılır veya bir saat sonra oda sıcaklığında santrifüj edilerek incelemeye hazır hale getirilir.
Seyreltme sıvısı, polistiren plaka üzerindeki bir sıra kuyucuğa 0,5 ml'lik bir hacimde dökülür. Serumların ön çalışması sırasında, reaksiyonu plakanın kısa bir sırasına (6 kuyucuk) yerleştirerek bunların test edilmesi tavsiye edilir. Kısa bir seride antikorlar tespit edilirse serumlar uzun bir seyreltme serisinde (12 kuyucuk) yeniden test edilir. Seyreltme sıvısını döktükten sonra, her sıranın (kısa veya uzun) ilk kuyucuğuna 1:5 seyreltmede 0,5 ml test serumu ekleyin. Daha sonra aynı hacimdeki serum iki kat seyreltmelerle titre edilir. Böylece 1:10 ila 1:320 arası kısa seride ve 1:10 ila 1:20480 arası uzun seride serum dilüsyonları elde edilir. Serumun titre edilmesinden sonra, her bir oyuğa bir damla (0,05 ml) %2,5'lik duyarlılaştırılmış eritrosit süspansiyonu ilave edilir. Plakaların içeriği homojen bir süspansiyon elde edilene kadar iyice çalkalanır. Plakalar sabit bir masa yüzeyinde oda sıcaklığında bırakılır. Reaksiyonun ön kaydı 2-3 saat sonra gerçekleştirilir, titrenin nihai tespiti, kırmızı kan hücrelerinin kuyucuklara tamamen çökeltilmesinden sonra yapılır. Reaksiyon için aşağıdaki kontroller sağlanmıştır: 1) 0,5 ml hacimde 1:10 oranında seyreltilmiş test serumu + 1 damla %2,5'lik duyarlılaştırılmamış eritrosit süspansiyonu; 2) 0,5 ml hacimde seyreltme sıvısı + 1 damla %2,5'lik hassaslaştırılmamış eritrosit süspansiyonu; 3) 0,5 ml + 1 damla %2,5'lik hassaslaştırılmış eritrosit süspansiyonu hacminde seyreltme sıvısı. Tüm kontroller açıkça olumsuz tepki vermelidir.
RPGA'nın muhasebeleştirilmesi ve değerlendirilmesi. Reaksiyon aşağıdaki şemaya göre değerlendirilir:
1) keskin bir şekilde olumlu tepki(++++) - eritrositler, genellikle kenarları taraklı bir şekilde eriyen bir “şemsiye” şeklinde eşit bir tabaka halinde deliğin dibine düşer;
2) pozitif reaksiyon (+++) - kırmızı kan hücreleri kuyucuğun tabanının en az 2/3'ünü kaplar;
3) zayıf pozitif reaksiyon (++) - aglütinat küçüktür ve kuyucuğun tam merkezinde bulunur;
4) şüpheli reaksiyon (+) - kuyucuğun tam ortasındaki eritrosit çökeltisinin etrafında ayrı ayrı aglütinat taneleri vardır;
5) negatif (-) - deliğin dibinde kırmızı kan hücreleri bir "düğme" veya pürüzsüz, keskin kenarları olan küçük bir halka şeklinde yerleşir.
Serum titresi, çok net bir reaksiyon veren (en az üç artı) serumun son seyreltilmesine göre dikkate alınır. 1:100 veya daha yüksek bir dilüsyon tanısal titre olarak kabul edilir; ancak RA'da olduğu gibi artışın izlenmesi gerekir.
Tularemi için RPGA oldukça spesifiktir ve bazı çapraz reaksiyonlar sadece bruselloz serumlarıyla. Ayırıcı tanı Homolog antijen ile önemli ölçüde daha yüksek olan RPGA'daki titrelerin yüksekliği ile mümkündür.
Mikro hacimlerde RPHA kurma tekniği. RPGA, 25 ul ve 50 ul hacimlerde malzemenin titrasyonuna izin veren Takachi tipi bir mikrotitratör (veya mikropipetli yuvarlak tabanlı mikroplakalar) kullanılarak mikro hacimlerde gerçekleştirilebilir. Reaksiyon tekniği ve tüm işlemlerin sırası polistiren plakalarda çalışırken olduğu gibi aynıdır. Bununla birlikte, mikro yöntemin duyarlılığının genellikle makro yönteminkinden bir seyreltme (yani 2 kat) daha düşük olduğu akılda tutulmalıdır.
Reaksiyonu bir mikrotitratörde ayarlamak için, bir damlalık pipeti kullanılarak her bir kuyucuğa 50 ul hacimde bir seyreltme sıvısı eklenir. Daha sonra 50 µl başlıklı titratörler kullanılarak, başlığın içine daldırılmasıyla test serumu toplanır. Sıvının titratör başlığını doldurduğundan emin olun. Serumlu titratör ilk kuyucuğa aktarılır ve burada tutulur. dikey pozisyon, birkaç tane yap dönme hareketleri gidiş. Daha sonra titratör bir sonraki kuyucuğa aktarılır ve manipülasyon tekrarlanır. Titrasyon birkaç sıra halinde aynı anda gerçekleştirilebilir. Tüm serinin titre edilmesinden sonra titratör, damıtılmış suyla (2 porsiyon değiştirilerek) döner hareketlerle yıkanır, su bir çubukla başlıktan çıkarılır ve brülör alevinde yakılır.
Titrasyondan sonra kuyucuklara 25 µl eritrosit teşhis sıvısı ekleyin. Mikro hacimlerde RPHA için diagnostik konsantrasyonu %0,5 olmalıdır (yani %2,5'lik kırmızı kan hücresi süspansiyonu ek olarak 5 kez seyreltilir). Kırmızı kan hücreleri eklendikten sonra plakalar homojen bir süspansiyon elde edilinceye kadar hafifçe çalkalanmalıdır. Sonuçların 1-1,5 saat içerisinde kaydedilebilmesi, mikrotitrede RPGA'nın önemli bir avantajıdır. Ayrıca bu teknik, tüm reaksiyon bileşenlerinden ve test serumlarından küçük miktarlarda gerektirir.
Reaksiyon aşağıdaki şemaya göre dikkate alınır:
1) “+” - kırmızı kan hücrelerinin çukurun dibine eşit bir tabaka halinde “şemsiye” şeklinde düştüğü ve tabanın en az 2 / 3'ünü kapladığı tam hemaglütinasyon;
2) “+-“ - kırmızı kan hücrelerinin küçük boyutlu gevşek bir halka şeklinde dibe düştüğü kısmi hemaglutinasyon;
3) "-" - kırmızı kan hücreleri küçük bir düğme veya pürüzsüz kenarlı bir halka şeklinde dibe düştüğünde hemaglutinasyonun olmaması.
özgüllük olumlu sonuç RPHA'da elde edilen, üç bileşenli bir reaksiyon - pasif hemaglütinasyonun inhibisyonunun reaksiyonu (RPHA) kullanılarak test edilebilir.
RTPGA'yı kurma tekniği. Bu reaksiyon, şüpheli olduğunda veya özellikle epidemiyolojik açıdan ilgi çekici olduğunda pozitif bir RPGA sonucunun özgüllüğünü doğrulamak için kullanılır. Reaksiyon mekanizması, test serumuna öldürülmüş tularemi bakterisi süspansiyonu eklendiğinde hemaglutinasyonun spesifik inhibisyonundan oluşur. Reaksiyonda üç bileşen etkileşime girer: test serumu, spesifik tularemi antijeni ve antijenik eritrosit diagnostikum RTPHA genellikle 7-8 kuyucukluk bir sıraya yerleştirilir. Tekrarlanan bir RPGA'nın RTPGA'ya paralel olarak kurulması tavsiye edilir. İki sıra kuyucuğa 0,25 ml seyreltme sıvısı dökülür, ardından her iki sıranın ilk kuyucuklarına 0,25 ml hacimde test serumu eklenir ve iki özdeş serum seyreltme sırası elde edilir. İkinci sıradaki tüm kuyucuklara 0,25 ml seyreltme sıvısı ve birinci sıradaki kuyucuklara 0,25 ml tularemi bakterisi süspansiyonu ekleyin. Daha önce 50 kez seyreltilmiş olan Tularemia diagnosum kullanılır (1 ml'de 25 milyar tularemi bakterisi içerir). Bu süspansiyonun 1 ml'sinde 500 milyon, 0,25 ml'sinde ise 125 milyon bakteri bulunmaktadır. Antijen eklendikten sonra plaka 1 saat oda sıcaklığında bırakılır, ardından her iki sıradaki tüm oyuklara bir damla (0,05 ml) eritrosit diagnostiği eklenir, plaka çalkalanır ve düz bir masa yüzeyi üzerinde bırakılır. Muhasebe 2-3 saat sonra gerçekleştirilir.
RTPGA'nın muhasebeleştirilmesi ve değerlendirilmesi. Test serumu spesifik tularemi antikorları içeriyorsa, bunlar eklenen antijen ile nötralize edilir ve ilk kuyucuk sırasında hemaglutinasyon meydana gelmez; yüksek titre Serumda RPGA sırasına göre daha küçük (2-4) sayıda kuyucukta hemaglutinasyon gözlenecektir. Bu durumda sonuçların özgüllüğü doğrulandı. Her iki satırda da hemaglutinasyon görülüyorsa, ör. RTPGA ve RPGA sonuçları çakışırsa bu, test serumunda tularemi antikorlarının bulunmadığını gösterir. Bu durumda RPGA'nın birincil sonucunun spesifik olmadığı kabul edilir.
Mikro hacimlerde RTHG'yi evreleme tekniği. RTPGA, RPGA gibi, Takachi tipi bir mikrotitre kullanılarak mikro hacimlerde gerçekleştirilebilir. Bunu yapmak için, her biri 7-8 kuyucuklu iki sıra halinde mikroplakaların kuyucuklarına 0,25 µl seyreltme sıvısı ekleyin. Daha sonra bir titratör kullanılarak 0,25 µl test serumu eklenir ve her iki sıraya da titre edilir. Daha sonra ilk sıradaki her kuyucuğa 25 µl tularemi antijeni (konsantrasyonu 1 ml'de 500 milyon tularemi bakterisi olan) eklenir, ikinci sıraya ise 25 µl seyreltme sıvısı eklenir. Plakalar 1 saat boyunca oda sıcaklığında bırakılır, ardından her iki sıradaki tüm oyuklara 25 ul antijenik zritrocytic diagnosum (%0,5 konsantrasyon) eklenir. Sonuçların muhasebeleştirilmesi ve değerlendirilmesi makro hacimlerdeki reaksiyonlara benzer şekilde gerçekleştirilir.
"İmmünomodülatörler. Bulaşıcı hastalıkların immünodiyagnozu." konusunun içindekiler tablosu:Pasif aglütinasyon reaksiyonları. Dolaylı aglütinasyon reaksiyonları. Dolaylı veya pasif hemaglutinasyon reaksiyonu (IRHA, RPHA). RNGA'yı ters çevirin. Pasif hemaglutinasyon inhibisyon reaksiyonu (PHA).
Bunlar reaksiyonlar arandı dolaylı (pasif), çünkü çeşitli parçacık parçacıklarının yüzeyinde yapay olarak emilen Ag (veya AT) kullanırlar.
Dolaylı veya pasif hemaglutinasyon reaksiyonu (RNGA, RPGA) en hassas serolojik reaksiyonlardan biridir. AT'nin çeşitli kırmızı kan hücrelerine sabitlenen ve daha sonra aglütine olan Ag ile etkileşime girme yeteneğine dayanmaktadır. Diagnostiklerin daha fazla stabilitesi için kırmızı kan hücreleri formalize edilir.
Ters RNGA kan serumunda Ag'yi tespit etmek için kullanılır; Bu amaçla eritrositler üzerine Ag değil AT sabitlenir. Bu tip reaksiyonlar bulaşıcı hastalıkları teşhis etmek, hamilelik oluşturmak, ilaçlara karşı aşırı duyarlılığı tespit etmek vb. için yaygın olarak kullanılmaktadır.
Pasif hemaglutinasyon inhibisyonu reaksiyonu (RTPGA) - Daha fazla gelişme RNGA; bir bakıma onun özgüllüğünü kontrol eder. Farklı RNGA, üç bileşen içerir; Ag, AT ve Ag (AT) eritrositler üzerinde adsorbe edilir. Başlangıçta Ag, AT (standart antiserum) ile reaksiyona girer, ardından aynı Ag (veya AT) ile duyarlı hale getirilen eritrositler karışıma eklenir. Ag'nin AT ile etkileşimi sırasında sistemde serbest AT (veya Ag) kalmazsa, eritrosit diyagnozunun aglütinasyonu gözlenmez.
11621 0
Serolojik reaksiyonlar, farklı özelliklere sahip bileşenlerin etkileşimi sırasında antijen-antikor kompleksinin oluşumuna eşlik eden olaylara göre belirlenir. Aglütinasyon, çökelme ve lizis reaksiyonları vardır.
Aglütinasyon reaksiyonu (RA)
Aglütinasyon reaksiyonu (RA), spesifik antikorlarla etkileşime giren korpüsküler bir antijenin (bir bakteri süspansiyonu, hassaslaştırılmış eritrositler, lateks parçacıkları vb.) kullanımına dayanır ve bunun sonucunda ortaya çıkan antijen-antikor kompleksi çöker. Bu reaksiyon laboratuvar uygulamalarında serolojik tanı için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bakteriyel enfeksiyonlar ve izole edilmiş mikroorganizmaların tanımlanması için.
RA birçok bulaşıcı hastalığın teşhisinde kullanılır: bruselloz (Wright, Heddleson reaksiyonu), tularemi, leptospiroz (RAL - Leptospira aglütinasyon ve lizis reaksiyonu), listeriosis, tifüs (RAR - Rickettsia aglütinasyon reaksiyonu), şigelloz, yersiniosis, psödotüberküloz vb.
Dolaylı veya pasif aglütinasyon reaksiyonu (RIGA veya RPGA).
Bu reaksiyonu gerçekleştirmek için, antikorlar veya antijenlerle duyarlı hale getirilmiş hayvanların (koyun, maymun, kobay, bazı kuşlar) kırmızı kan hücreleri kullanılır; bu, kırmızı kan hücrelerinin bir süspansiyonunun ve bir antijen veya bağışıklık serumu çözeltisinin inkübe edilmesiyle elde edilir.
Antijenlerle duyarlı hale getirilmiş eritrositler esas alınarak elde edilen tanılara denir. antijen eritrosit tanıları. Bunlar, örneğin eritrosit shigella diagnosticums, eritrosit salmonella O-diagnosticums gibi kan serumlarının seri seyreltmelerindeki antikorların belirlenmesine yöneliktir.
Buna göre, spesifik immünoglobulinlerle duyarlılaştırılmış eritrositlere dayanan teşhislere denir. antikorlar(immünoglobulin) tanılamalar ve çeşitli materyallerdeki antijenleri saptamaya yararlar; örneğin, burun ve orofarenksten materyal buraya aşılandığında sıvı bir besin ortamında korinebakterilerin difteri ekzotoksinini saptamak için kullanılan RIGA için eritrosit immünoglobulin difteri diagnostiği.
Hemaglutinasyon reaksiyonu hem bakteriyel (tifo, paratifo, dizanteri, bruselloz, veba, kolera vb.) hem de viral (grip, adenoviral enfeksiyonlar, kızamık vb.) enfeksiyonların teşhisinde kullanılır. Duyarlılık ve özgüllük açısından RIGA, RA'dan üstündür.
Hemaglutinasyon inhibisyon reaksiyonu (HAI)
Hemaglütinasyon inhibisyon reaksiyonu (HAI), kan serumundaki antiviral antikorları titre etmek ve ayrıca izole edilmiş viral kültürlerin tipini belirlemek için kullanılır. RTGA bunları teşhis etmek için kullanılabilir viral enfeksiyonlar Patojenleri hemaglutinasyon özelliklerine sahip olan.
Yöntemin prensibi, belirli bir virüs türüne karşı antikor içeren serumun hemaglutinasyon aktivitesini baskılaması ve kırmızı kan hücrelerinin aglütine olmayan kalmasıdır.
Pasif hemaglutinasyon inhibisyonu (gecikme) reaksiyonu (RPHA).
RTPGA'da üç bileşen yer alır: bağışıklık serumu, antijen (test malzemesi) ve duyarlılaştırılmış eritrositler.
Test materyali özellikle immün antikorlarla reaksiyona giren bir antijen içeriyorsa standart serum, daha sonra onları bağlar ve daha sonra seruma homolog bir antijen ile duyarlı hale getirilmiş eritrositlerin eklenmesiyle hemaglutinasyon meydana gelmez.
RTPHA, mikrobiyal antijenleri tespit etmek, bunların niceliksel olarak belirlenmesi ve ayrıca RTPGA'nın özgüllüğünü kontrol etmek için kullanılır.
Lateks aglütinasyon reaksiyonu (RLA)
Lateks parçacıkları antikorların (immünoglobulinler) taşıyıcısı olarak kullanılır. RLA, gerekli süreyi (10 dakikaya kadar) ve küçük hacimli test materyalinde antijeni tespit etme yeteneğini dikkate alan, bulaşıcı hastalıkların teşhisine yönelik hızlı bir yöntemdir.
RLA, beyin omurilik sıvısındaki Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae tip b, Neisseria meningitidis antijenlerini belirtmek, boğaz sürüntülerinde A grubu streptokokları tespit etmek, salmonellosis, yersiniosis ve diğer hastalıkları teşhis etmek için kullanılır. Yöntemin duyarlılığı 1-10 ng/ml veya 1 µl'de 10³ -10⁶ bakteri hücresidir.
Pıhtılaşma reaksiyonu (CoA)
Pıhtılaşma reaksiyonu (CoA), stafilokokların protein A'sının spesifik immünoglobulinleri bağlama yeteneğine dayanmaktadır. Hızlı teşhis yöntemi olan RCA, insan salgılarında ve dolaşımdaki bağışıklık komplekslerinin (CIC) bileşiminde çözünebilir termostabil antijenlerin tanımlanmasına hizmet eder. CEC bileşimindeki spesifik antijenlerin tespiti, bunların kan serumundan ön çökelmesini gerektirir.
Yağış reaksiyonu
Çökelme reaksiyonunda (RP), antikorların yüksek oranda dağılmış çözünür antijenlerle (proteinler, polisakaritler) etkileşimi sonucu, kompleman çökeltilerinin katılımıyla kompleksler oluşur. Çeşitli antijen ve antikorları tespit etmek ve karakterize etmek için kullanılan hassas bir testtir. Yüksek kaliteli RP'nin en basit örneği, bir test tüpünde, bağışıklık serumu üzerindeki antijen katmanının sınırında opak bir çökelme bandının oluşmasıdır - halka çökelme reaksiyonu. Yarı sıvı agar veya agaroz jellerdeki çeşitli RP türleri yaygın olarak kullanılmaktadır (çift immünodifüzyon yöntemi, radyal immünodifüzyon yöntemi, immünelektroforez).
Kompleman fiksasyon reaksiyonu (CFR)
Kompleman fiksasyon reaksiyonu (CFR), komplemanın katılımıyla hemoliz olgusuna dayanır, yani. yalnızca kompleman sabitleyici antikorları tespit edebilir.
RSC, birçok bakteriyel ve viral enfeksiyonun, riketsiyal enfeksiyonların, klamidyanın, enfeksiyöz mononükleoz, protozoal enfeksiyonlar, helmintiyazis. RSK karmaşıktır serolojik reaksiyon iki sistemin dahil olduğu: antijen-antikor ve kompleman sistemi ile temsil edilen test sistemi (kan serumu) ve hemolitik sistem (koyun kırmızı kan hücreleri + hemolitik serum). Hemolitik serum, koyun eritrositleri ile immünize edilmiş, ısıyla inaktive edilmiş tavşan kanı serumudur. Koyun kırmızı kan hücrelerine karşı antikorlar içerir.
Test serumu antijene homolog antikorlar içeriyorsa, pozitif bir RSC sonucu (hemoliz yokluğu) gözlenir. Bu durumda ortaya çıkan antijen-antikor kompleksi komplemana bağlanır ve serbest kompleman yokluğunda hemolitik sistemin eklenmesine hemoliz eşlik etmez. Serumda antijene karşılık gelen antikor yoksa antijen-antikor kompleksi oluşmaz, kompleman serbest kalır ve serum kırmızı kan hücrelerinin hemolizine neden olur, yani. hemoliz varlığı reaksiyonun olumsuz bir sonucudur.
Yuşçuk N.D., Vengerov Yu.Ya.
Aglütinasyon reaksiyonu - RA(lat. agluti-natio- yapışma), antikorların korpüsküler antijenleri (bakteriler, eritrositler veya diğer hücreler, üzerlerinde adsorbe edilmiş antijenlerle çözünmeyen parçacıklar ve ayrıca makromoleküler agregatlar) bağladığı basit bir reaksiyondur. Elektrolitlerin varlığında, örneğin izotonik bir sodyum klorür çözeltisi eklendiğinde meydana gelir.
Uygula Çeşitli seçenekler aglütinasyon reaksiyonları: kapsamlı, gösterge niteliğinde, dolaylı vb. Aglütinasyon reaksiyonu, pul veya tortu oluşumuyla kendini gösterir.
RA aşağıdakiler için kullanılır:
örneğin brusellozlu hastaların kan serumundaki antikorların belirlenmesi (Wright, Heddelson reaksiyonları), Tifo ve paratifo ateşi (Vidal reaksiyonu) ve diğerleri bulaşıcı hastalıklar;
hastadan izole edilen patojenin belirlenmesi;
eritrosit alloantijenlerine karşı monoklonal antikorlar kullanılarak kan gruplarının belirlenmesi.
Bir hastadaki antikorları belirlemek için koymakgenişletilmiş aglütinasyon reaksiyonu: hastanın kan serumunun seyreltilerine ekleyin teşhis(öldürülen mikropların süspansiyonu) ve 37 °C'de birkaç saatlik inkübasyonun ardından, aglütinasyonun meydana geldiği, yani bir çökeltinin oluştuğu en yüksek serum seyreltmesi (serum titresi) not edilir.
Aglütinasyonun doğası ve hızı, antijen ve antikorların türüne bağlıdır. Bir örnek, diagnostiklerin (O- ve R-antijenleri) spesifik antikorlarla etkileşiminin özellikleridir. ile aglütinasyon reaksiyonu O-teşhis(bakteriler ısıyla öldürülür, ısıya dayanıklı kalır O-antijen) ince taneli aglütinasyon şeklinde oluşur. H-diagnosticum (termolabil flagellar H-antijenini koruyan, formaldehit tarafından öldürülen bakteri) ile aglütinasyon reaksiyonu kabadır ve daha hızlı ilerler.
Hastadan izole edilen patojenin belirlenmesi gerekiyorsa, gösterge aglütinasyon reaksiyonu, tanısal antikorlar (aglutinasyon serumu) kullanılarak, yani patojenin serotiplenmesi gerçekleştirilir. Bir cam slayt üzerinde gösterge niteliğinde bir reaksiyon gerçekleştirilir. Hastadan izole edilen saf bir patojen kültürü, 1:10 veya 1:20 oranında seyreltilmiş bir damla tanısal aglütinasyon serumuna eklenir. Yakına bir kontrol yerleştirilir: serum yerine bir damla sodyum klorür çözeltisi uygulanır. Serum ve mikrop içeren bir damlada pıhtılaşmış bir çökelti belirdiğinde, kapsamlı aglütinasyon reaksiyonu 2-3 damla patojen süspansiyonunun eklendiği aglütinasyon serumunun artan seyreltilerine sahip test tüplerinde. Aglütinasyon, çökelti miktarına ve sıvının berraklık derecesine göre dikkate alınır. Diagnostik serum titresine yakın bir dilüsyonda aglütinasyon gözlenirse reaksiyon pozitif kabul edilir. Aynı zamanda kontroller de dikkate alınır: izotonik sodyum klorür çözeltisi ile seyreltilmiş serum şeffaf olmalı, mikropların aynı çözelti içindeki süspansiyonu çökelti olmadan eşit şekilde bulanık olmalıdır.
Farklı ilgili bakteriler aynı teşhis amaçlı aglütinasyon serumu tarafından aglütine edilebilir, bu da onların tanımlanmasını zorlaştırır. Bu nedenle kullanıyorlar adsorbe edilmiş aglütinasyon serumları,çapraz reaksiyona giren antikorların ilgili bakterilere adsorpsiyon yoluyla uzaklaştırıldığı. Bu tür serumlar yalnızca belirli bir bakteriye özgü antikorları tutar. Özel monoreseptör diagnostik aglütinasyon serumlarının üretimi A. Castellani (1902) tarafından önerilmiştir.
Dolaylı (pasif) hemaglutinasyon reaksiyonu(RNGA, RPGA), yüzeylerinde adsorbe edilmiş antijenler veya antikorlar bulunan eritrositlerin kullanımına dayanır; bunların karşılık gelen antikorlar veya kan serumunun antijenleri ile etkileşimi, eritrositlerin birbirine yapışmasına ve testin dibine düşmesine neden olur. tüp veya hücre V fistolu tortu şeklinde (Şekil 13.2). Şu tarihte: olumsuz tepki kırmızı kan hücreleri bir “düğme” şeklinde ■ yerleşir. Tipik olarak antikorlar, RNGA'da adsorbe edilmiş eritrositler olan bir antijenik eritrosit diagnostiği kullanılarak tespit edilir. Açık onları antijenlerle birlikte. Bazen antikorların adsorbe edildiği anti-A eritrosit teşhisi kullanılır. Örneğin botulinum toksini, içine eritrosit antikoru botulinum toksini eklenerek tespit edilebilir (bu reaksiyona denir) ters dolaylı hemaglutinasyon reaksiyonu- RONG). RNGA, bulaşıcı hastalıkların teşhisinde ve gonadotropik hormonun belirlenmesinde kullanılır. V Hamilelik oluştururken idrar, ilaçlara, hormonlara ve diğer bazı durumlarda aşırı duyarlılığı tanımlamak için.
COMBES REAKSİYONU
(Coombs testi) - kan serumunda globülinlerin çökelmesine neden olan kırmızı kan hücrelerinin yüzeyindeki Rh antikorlarını belirlemek için bir yöntem. Bu test tanı için kullanılır hemolitik anemi Kırmızı kan hücrelerinin tahrip olduğu Rh uyumsuzluğu olan bebeklerde.
Pıhtılaşma reaksiyonu. Patojen hücreler, immün teşhis serumu ile ön işleme tabi tutulan stafilokoklar kullanılarak belirlenir. Stafilokok içeren protein A,İmmünoglobulinlerin Fc fragmanına yönelik bir afiniteye sahip olan bu antikorlar, antimikrobiyal antikorları spesifik olmayan bir şekilde adsorbe eder ve daha sonra aktif merkezlerle hastalardan izole edilen karşılık gelen mikroplarla etkileşime girer. Pıhtılaşma sonucunda stafilokoklar, tanısal serum antikorları ve tespit edilen mikroptan oluşan pullar oluşur.
Hemaglutinasyon inhibisyon reaksiyonu(RTGA), viral antijenlerin immün serum antikorları tarafından blokajına, baskılanmasına dayanır, bunun sonucunda virüsler kırmızı kan hücrelerini aglütine etme yeteneklerini kaybeder (Şekil 13.3). RTGA, etken maddeleri (grip virüsleri, kızamık, kızamıkçık, kene kaynaklı ensefalit vb.) çeşitli hayvanların kırmızı kan hücrelerini aglütine edebilen birçok viral hastalığın teşhisinde kullanılır.
- DSÖ'den bir grup doktor, çocuk felci hastalarını tespit etmek ve çocuk felcine karşı evrensel aşı yapılmasına yardımcı olmak için Hindistan'a geldi. Araştırmanın yapıldığı köylerden birinde, kalabalık bir ailenin 6 yaşında bir erkek çocuğu, 5 gün önce hastalanarak doktorlara götürüldü. Sıcaklık aniden yükseldi, şiddetli bir baş ağrısı, tekrarlanan kusma, kollarda ve bacaklarda ağrı vardı. Muayene sonrasında: sıcaklık, şiddetli halsizlik, meningeal semptomlar, sağ bacak azaltılmış kas tonusu, tendon refleksleri keskin bir şekilde zayıflar, ayak sarkar. Omurilik kanalının delinmesi sırasında beyin omurilik sıvısı alttan aktı yüksek tansiyon Lenfosit sayısı artar, bakteri izole edilmez. Teslim edilmiş ön teşhis"Çocuk felcinin paralitik formu." Çocuğa nasıl bulaşmış olabilir? Çocuk felcinin spesifik aktif önlenmesi nasıl gerçekleştirilir? Bu ailedeki diğer çocuklara bulaştırma tehlikesi var mı, ne yapılmalı?
Cevap:Çocuğa dışkı-ağız yoluyla, yiyeceklerden, sudan ve ayrıca havadaki damlacıklardan enfeksiyon kapmış olabilir. Çocuk felcinin önlenmesinde temel önlem, Sabin suşlarının 3 serotipinden canlı kültür aşısı ile aşılamadır. Rusya'da kullanılmaktadır. çocuk felci aşısı Adını Çocuk Felci ve Viral Ensefalit Enstitüsü tarafından üretilen oral uygulama için. M.P. Chumakova. Aşı, Afrika yeşil maymun böbrek hücrelerinin birincil kültüründen elde edilen, çocuk felci virüsü tip 1, 2, 3'ün zayıflatılmış Sabin suşlarının üç değerlikli bir preparasyonudur. . 3 ay ile 6 yaş arası çocuklar rutin çocuk felci aşılarına tabidir. Oral çocuk felci aşısı ile aşılamalar, 3, 4, 5 ve 6 ayda üç kez ağızdan 2 veya 4 damla aşı ile, 18, 20 ay ve 14 yılda üç yeniden aşılama ile gerçekleştirilir. Hasta çocuğun hastaneye yatırılması ve bu ailenin diğer tüm çocuklarına canlı çocuk felci aşısı yapılması gerekiyor.
- İnfluenza aşısı üç değerlikli polimer alt birim sıvısının (grip) bileşimi ve kullanımı
Bu moleküler bir aşıdır. Bileşim: Üç alt tipten (A/H1N1, A/H3N2, B) influenza virüsünün yüzey Ag'si. Uygulama: gribin önlenmesi için
23 numaralı sınav kartı
