Проба Кумбса є методом лабораторного дослідження, Зроблений шляхом впливу на гемаглютинацію У її підставі лежить сприйнятливість антитіл до імуноглобулінів і елементів ферменту, і навіть їх здатність аглютинувати еритроцити, вкриті C3 чи Lg.
Пряма діагностика Кумбса
Використовується для виявлення антитіл або компонентів комплементу, встановлених із зовнішньої частини клітин. Пряма проба Кумбса виконується такими діями.
Застосування такої проби
Пряму діагностику Кумбса використовують у певних випадках, таких як:
- трансфузійні дії;
- аутоімунний гемоліз;
- медикаментозна гемолітична анемія.
Непряма проба Кумбса
Ця діагностика дає можливість виявити антитіла до клітин у сироватці, яку інкубують, як правило, з донорськими еритроцитами типу 0, а потім здійснюють пряму пробу. Застосовують непряму діагностикуКумбса у таких випадках:
Як готуватись до аналізу
Існують деякі правила підготовки до обстеження.
- Якщо пацієнт є новонародженим, батькам потрібно знати, що дослідження сприятиме діагностуванню ГЗН (гемолітичному захворюванню новонароджених).
- Якщо у хворого є підозри гемолітичного недокрів'я, йому повинні пояснити, що аналіз дозволить дізнатися, чи воно викликане захисними розладами, прийомами ліків або іншими факторами.
- Проба Кумбса пряма та непряма не робить жодних обмежень у режимі харчування чи дієті.
- Необхідно повідомити пацієнта, що для обстеження потрібно взяти кров із вени, а також сказати йому, коли саме проводитиметься венепункція.
- Ще слід попередити про ймовірність неприємних відчуттіву період накладення пов'язки на руку та самої процедури.
- Препарати, які здатні вплинути на результат зразка, потрібно скасувати.
До таких ліків відносяться:
- "Стрептоміцин";
- "Метілдофа";
- «Прокаїнамід»;
- сульфаніламіди;
- "Мелфалан";
- "Хінідин";
- "Ріфампін";
- «Ізоніазид»;
- цефалоспорини;
- «Гідралазин»;
- "Хлорпромазин";
- "Леводопа";
- "Тетрациклін";
- «Діфенілгідантоїн»;
- «Цесуксімід»;
- "Пеніцилін";
- мефенамінова кислота.
Забір крові роблять з ранку натще.
Як проводиться захід
Проба Кумбса здійснюється в такому порядку:
- При виконанні діагностики у дорослого хворого після венепункції беруть кров у трубочки з ЕДТА (етилендіамінтетраацетатом).
- У новонародженого виробляють забір крові з пуповини у мензурку з ЕДТА.
- Зону проколу притискають ватним тампоном до припинення кровотечі.
- При появі синця в місці венепункції прописують компреси, що зігрівають.
- Після набору крові пацієнту дозволяється повернутися до прийому відмінних препаратів.
- Необхідно повідомити батькам новонародженого, що для спостереження за динамікою анемії може знадобитися вторинний аналіз.
Переваги проби Кумбса
Таке дослідження має деякі переваги, а саме:
Мінуси аналізу
Проба Кумбса позитивна є досить трудомістким методом огляду, що передбачає характерну точність виконання. При її використанні можна зіткнутися з певними труднощами, пов'язаними з інтерпретацією слабопозитивних впливів.
Встановлено, що помилкові негативні або слабопозитивні реакції під час виробництва проб Кумбса можуть стати наслідками незадовільно активної відмивання клітин, ослаблення антиглобулінового реагенту залишками сироватки, і навіть сполуки з необезжиренной зовнішністю, де може закріплюватися антиглобулін, втрачаючи у своїй свою дієвість.
Проба Кумбса відрізняється ще одним недоліком - малостійкістю антиглобулінового реагенту, придбання та збереження якого мають індивідуальні особливостіщо аналогічно робить складною чисельну оцінку впливу антиглобулінової сироватки на гемаглютинацію.
Хвороби, які можна виявити під час дослідження
Діагностика Кумбса дає можливість виявити деякі види захворювань, такі як:
- гемолітичне нездужання новонароджених;
- різні трансфузійні реакції;
- аутоімунний гемоліз;
- лікарська гемолітична недокрів'я.
На сьогоднішній день проба Кумбса вважається досить популярною системою дослідження крові як у дорослої людини, так і новонародженої дитини. Вона дає можливість виявити безліч різноманітних хвороб.
Антитіла, що знаходяться на поверхні еритроцитів, можуть бути як у статичному, так і у вільному стані плазмі крові. Залежно стану антитіл проводиться пряма чи непряма реакція Кумбса. Якщо є підстави припустити, що антитіла зафіксовані на поверхні еритроцитів, проводиться прямий тест Кумбса. В цьому випадку тест проходить в один етап – додається антиглобулінова сироватка. Якщо на поверхні еритроцитів є неповні антитіла, відбувається аглютинаціяеритроцитів.
Непряма реакція
Непряма реакція Кумбса протікає у 2 етапи. Спочатку необхідно штучно здійснити сенсибілізаціюеритроцитів. Для цього еритроцити та досліджувану сироватку крові інкубують, що викликає фіксацію антитіл на поверхні еритроцитів. Після чого проводиться другий етап тесту Кумбса – додавання антиглобулінової сироватки.
Реакція преципітації - РП (від лат praecipilo осаджувати) - це формування та осадження комплексу розчинного молекулярного антигену з антитілами у вигляді помутніння, званого преципітатом. Він утворюється при змішуванні антигенів та антитіл в еквівалентних кількостях, надлишок одного з них знижує рівень утворення імунного комплексу. Реакцію преципітації ставлять у пробірках (реакція кільцепреципітації), в гелях, поживних середовищах та ін. Оухтерлоні, радіапна імунодифузія, імуноепектрофорезта ін.
|
Реакція кільцепреципітації. Реакцію проводять у вузьких преципітаційних пробірках: імунну сироватку нашаровують розчинний антиген. При оптимальному співвідношенні антигену та антитіл на межі цих двох розчинів утворюється непрозорекільце преципітату | |
|
.Якщо в якості антигенів реакції використовують прокип'ячені і профільтровані екстракти тканин, то така реакція називається I реакцією-термопреципітації (реакція, при якій виявляють сибірковий гаптен). |
|
|
Реакція подвійної імунодифузії щодо ОухтерлоніІмунну сироватку з розплавленим агаровим гелем поступово наливають на скло. Після застигання в гелі роблять лунки, які поміщають антиген в різних розведеннях. Антиген, дифузуючи в гель, утворює з антитілами кільцеві зони преципітації навколо лунок. Діаметр кільця преципітації пропорційний концентрації антигену.Реакцію використовують для визначення у сироватці крові імуноглобулінів |
|
|
різних класів, компонентів системи комплементу та ін. |
|
|
Імуноелектрофорез- поєднання методу електрофорезу та імунопреципітації: суміш антигенів вноситься в лунки гелю і розділяється в гелі за допомогою електрофорезу, потім в канавку паралельно зонам електрофорезу вносять імуннук сироватку, антитіла якої дифундують в гель і утворюють у місці "зустрічі" з антигеном лінії. |
Реакція флоккуляції(за Рамоном) (від лат. f1оecus - пластівці вовни) - поява опалесценції або пластів'єподібної маси (імунопреципітації) у пробірці при реакції токсин - антитоксин або анатоксин - антитоксин. Її застосовують визначення активності антитоксичної сироватки чи анатоксина.
HLA типування - Дослідження головного комплексу гістосумісності людини - HLA комплексу. Це утворення включає область генів на 6-й хромосомі, які кодують HLA-антигени, що беруть участь в різних реакціях імунної відповіді.Завдання при HLA типуванняможуть стояти різні - біологічна ідентифікація (HLA-тип успадковується разом з батьківськими генами), визначення схильності до
різним захворюванням , підбір донорів для пересадки органів - при цьому проводиться порівняння результатів HLA типування тканин донора та реципієнта. За допомогою HLA типування визначають і наскільки подружжя подібне або помітне за антигенами тканинної сумісності, щоб діагностувати випадки безпліддя. HLA типування передбачає
аналіз поліморфізму HLA і проводиться двома методами – серологічним та молекулярно-генетичним. Класичний серологічний метод HLA типування ґрунтується на мікролімфоцитотоксичному тесті, а молекулярний метод використовує проведення ПЛР (полімеразну ланцюгову реакцію).проводиться на виділених клітинних популяціях. Антигени головного комплексу гістосумісності несуть у собі переважно лімфоцити. Тому суспензію Т лімфоцитів використовують як основні носії антигенів I класу, і суспензію лімфоцитів В для визначення антигенів HLA II класу. Для виділення необхідних клітинних популяцій із цільної крові використовують або центрифугування, або імуномагнітну сепарацію. Вважається, що перший спосіб може призвести до хибнопозитивних даних, так як при цьому відбувається загибель частини клітин. Другий спосіб визнаний більш специфічним – при цьому понад 95% клітин залишаються життєздатними.
Але основою постановки лімфоцитотоксичного тесту HLA типуванняє специфічна сироватка, що містить антитіла до різних алельних варіантів антигенів HLA I та II класів. Серологічний тест дозволяє визначити HLA-тип шляхом вивчення того, які сироватки реагують з лімфоцитами, а які - ні.
Якщо між клітинами та сироваткою відбувається реакція, в результаті на поверхні клітини утворюється комплекс антиген-антитіло. Після додавання розчину, що містить комплемент, відбувається лізис та загибель клітини. Оцінюють серологічний тест HLA типування за допомогою флуоресцентної мікроскопії щодо оцінки позитивної (червона флуоресценція) та негативної (зелена флуоресценція) реакцій, або фазово-контрастної мікроскопії щодо фарбування ядер загиблих клітин. Результат HLA типування виводять з урахуванням специфічності прореагували сироваток і перехресно реагують груп антигенів, інтенсивності реакції цитотоксичності.
Недоліками серологічного HLA типуванняє наявність перехресних реакцій, слабка спорідненість антитіл або низька експресія антигенів HLA, відсутність білкових продуктів у ряду HLA-генів.
Більш сучасні, молекулярні методи HLA типуваннявикористовують стандартизовані синтетичні зразки, які реагують не з антигенами на поверхні лейкоцитів, а з ДНК і прямо вказують на те, які антигени присутні в пробі. Молекулярні методи не вимагають живих лейкоцитів, будь-яка людська клітинаможе бути схильна до вивчення, і для роботи досить кілька мікролітрів крові або можна обмежитися зіскрібком зі слизової оболонки рота.
Молекулярно-генетичне і проводиться двома методами – серологічним та молекулярно-генетичним. Класичний серологічний метод HLA типування ґрунтується на мікролімфоцитотоксичному тесті, а молекулярний метод використовує проведення ПЛР (полімеразну ланцюгову реакцію).використовує метод ПЛР, першим етапом якої є одержання чистої геномної ДНК (з цільної крові, лейкоцитарної суспензії, тканин).
Потім зразок ДНК копіюється - ампліфікується в пробірці з використанням праймерів (коротких одноланцюгових ДНК), специфічних до певного HLA-локус. Кінці кожного з пари праймерів повинні бути суворо комплементарні унікальної послідовності, що відповідає конкретному алелю, інакше ампліфікація не здійснюється.
Після ПЛР, протягом багаторазового копіювання, виходить велика кількість фрагментів ДНК, яку можна оцінити візуально. Для цього реакційні суміші піддають електролізу або гібридизації і визначають, чи відбулася специфічна ампліфікація, за допомогою програми або таблиці. Результат HLA типування подається у формі всебічного звіту на генному та алельному рівнях. Через стандартизованість зразків, що використовуються, молекулярне і проводиться двома методами – серологічним та молекулярно-генетичним. Класичний серологічний метод HLA типування ґрунтується на мікролімфоцитотоксичному тесті, а молекулярний метод використовує проведення ПЛР (полімеразну ланцюгову реакцію).точніше серологічного. Крім того, воно дає більше інформації (більше нових алелей ДНК) та більше високий рівеньїї деталізації, оскільки дозволяє ідентифікувати як антигени, а й самі алелі, що зумовлюють, який саме антиген присутній на клітині.
Реакція імунного лізису.В основі реакції лежить здатність специфічних антитіл утворювати імунні комплекси з клітинами, у тому числі з еритроцитами, бактеріями, що призводить до активації системи комплементу за класичним шляхом та лізисом клітин. З реакцій імунного лізису найчастіше застосовується реакція гемолізу та рідко – реакція бактеріолізу (головним чином при диференціації холерних та холероподібних вібріонів).
Реакція гемолізу.Під впливом реакції з антитілами в присутності комплементу каламутна завись еритроцитів перетворюється на яскраво-червону прозору рідину - «лакову кров» внаслідок виходу гемоглобіну. При постановці діагностичної реакції зв'язування комплементу (РСК) реакція гемолізу використовується як індикаторна для тестування присутності або відсутності (зв'язування) вільного комплементу.
Реакція локального гемолізу у гелі(Реакція Ерне) є одним з варіантів реакції гемолізу. Вона дозволяє визначити кількість антитілоутворюючих клітин. Кількість клітин, секретирующих антитіла - гемолізини, визначають за кількістю бляшок гемолізу, що виникають в агаровому гелі, що містить еритроцити, суспензію клітин досліджуваної лімфоїдної тканини і комплемент.
Імунофлюоресцентний метод
(РІФ, реакція імунофлюоресценції) – метод виявлення специфічних Аг (Ат) за допомогою Ат (Аг), кон'югованих з флюорохромом. Має високу чутливість і специфічність. Застосовується для експрес-д-ки інфекцій. захворювань (ідентифікація збудника в ісл. матеріалі), а також для визначення Ат та поверхневих рецепторів та маркерів лейкоцитів (імунофенотипування) та ін клітин. Прямий І. м.полягає в обробці зрізу тканини або мазка з патологічного матеріалу або мікробної к-ри с-кою, що містить специфічні Ат, кон'юговані з флюорохромом; препарат промивають для звільнення від незв'язаних Ат та розглядають у люмінесцентний мікроскоп. У позитивних випадках по периферії об'єкта з'являється імунний комплекс, що світиться. Необхідний контроль для виключення неспецифічного свічення. При непрямий. І. м.на першому етапі зріз тканини або мазок обробляють нефлюоресцентною специфічною с-кою, на другому -люмінесцентною с-кою проти-глобулінів тієї тварини, с-ка якого була застосована на першому етапі. У позитивному випадку утворюється комплекс, що світиться, що складається з Аг, Ат до нього і Ат проти Ат (сендвіч-метод). Крім люмінесцентного мікроскопа для обліку РІФ при фенотипуванні клітин застосовують лазерний сортувальник клітин .
Проточна цитометрія- метод оптичного вимірювання параметрів клітини, її органел і процесів, що відбуваються в ній.
Методика полягає у виявленні розсіювання світла лазерного променя при проходженні через нього клітини в струмені рідини, причому ступінь світлової дисперсії дозволяє отримати уявлення про розміри і структуру клітини. Крім того, в ході аналізу враховується рівень флуоресценції хімічних сполук, що входять до складу клітини (аутофлуоресценція) або внесених до зразка перед проведенням проточної цитометрії.
Клітинна суспензія, попередньо мічена моноклональними флуоресцентними антитілами або флуоресцентними барвниками, потрапляє в потік рідини, що проходить через проточну комірку. Умови підібрані таким чином, що клітини вишиковуються одна за одною за рахунок т.з. гідродинамічного фокусування струменя в струмені У момент перетину клітиною лазерного променя детектори фіксують:
розсіювання світла під малими кутами (від 1 ° до 10 °) ( дана характеристикавикористовується визначення розмірів клітин).
розсіювання світла під кутом 90° (дозволяє судити про співвідношення ядро/цитоплазма, а також про неоднорідність та гранулярність клітин).
інтенсивність флуоресценції по кількох каналах флуоресцентності (від 2 до 18-20)- дозволяє визначити субпопуляційний склад клітинної суспензії та ін.
Coombs test
Пряма проба Кумбса - антиглобуліновий тест (аглютинація в гелі, що дозволяє виявити повні двовалентні антитіла), за допомогою якого визначають антитіла класу IgG і С3-компонент комплементу на поверхні еритроцитів. Зазвичай антитіла, що виявляються прямою пробою Кумбса, мають широку специфічність, не асоційовану з добре встановленим антигеном. Позитивна пряма проба Кумбса чітко вказує на наявність у хворого на гемолітичну анемію, хоча не всі хворі з позитивним прямим антиглобуліновим тестом страждають на це захворювання. Приблизно у 10% хворих антитіла або компоненти комплементу на мембрані еритроцитів не вдається визначити прямою пробою Кумбса (тест негативний), але вони страждають на аутоімунну гемолітичну анемію. Для уточнення специфічності антитіл у таких випадках використовують тести з їх елюцією. Пряма проба Кумбса, позитивна тільки до комплементу, зазвичай має відношення до холодових антитіл типу IgM. В цьому випадку антитіла IgMне присутні на еритроцитах при базальної температуритіла. Однак внаслідок того, що антитіла IgM активно фіксують комплемент, і комплемент залишається на еритроцитах, при даній формі аутоімунної гемолітичної анемії (хвороба холодових аггютининов) проба Кумбса буде позитивна тільки до комплементу.
Пряма проба Кумбса позитивна при аутоімунній гемолітичній анемії, що викликається тепловими антитілами, аутоімунної лікарської анемії (при прийомі метилдопу до 20% хворих мають позитивну реакцію), лікарсько-адсорбційному типі гемолітичної анемії, імунокомплексному типі гемолітичної анемії (проба позитивна тільки по відношенню С3), при аутоімунній гемолітичній анемії, що викликається холодовими антитілами - хвороби холодових аглютинінів (проба позитивна тільки по відношенню до С3). При пароксизмальній холодовій гемоглобінурії пряма проба Кумбса негативна.
У гострому періодізахворювання, у зв'язку з руйнуванням еритроцитів, на яких фіксувалася велика кількість антитіл, при гемолітичному кризі, а також за недостатньої кількості антитіл при хронічному перебігухвороби може спостерігатися негативна пряма проба Кумбса.
| : | ||
|---|---|---|
- Важливою умовою забезпечення якості лабораторного дослідження крові є взяття матеріалу натщесерце, в ранковий час (до 12:00).
- За 12 годин до дослідження слід виключити прийом алкоголю, куріння, їжу, обмежити фізичну активність.
- Вранці на день взяття крові на дослідження можна випити воду.
- Виключити прийом ліків; якщо скасувати прийом ліків неможливо, необхідно проінформувати про це лабораторію.
- Взяття матеріалу бажано проводити до будь-яких медичних діагностичних маніпуляцій.
- При оцінці рівня гормонів у жінок важливо враховувати день менструального циклуколи найбільш оптимально визначати деякі гормони. Цю інформацію Ви можете отримати у лікаря.
| Показник | Характеристика |
|---|---|
| Аналізатор та тест-система | Гелеві карти; DiaMed AG (Швейцарія) |
| Референтні значення | Негативний результат / Позитивний результат |
| Інтерферуючі фактори. Медикаменти | |
| Можлива позитивна проба при прийомі наступних медикаментів: ацетамінофен, саліцилова кислота, амінопірин, антигістамінні препарати, карбромал, цефалоспорини, хлорпромазин, хлорпропамід, цисплатин, клонідин, дипірон, етосуксимід, фенфлюрамін, фуадин, гідралазин, гідрохлортіазид, ібупрофен, інсулін, ізоніазид, леводопа, мефенамінова фен, пеніциламін, пеніциліни, фенацетин, фенілбутазон, пробенецид, прокаїнамід, хінідин, хінін, рифампін, стрептоміцин, сульфонаміди, похідні сульфонілсечовини, тетрациклін, тріамтерен, тримелітовий ангідрид | |
| Показання до призначення | |
|
|
| Інтерпретація результатів | |
|
У нормі пряма проба Кумбса – негативна. Позитивна пробаКумбса при:
|
|
Реакція Кумбса ефективний методвиявлення антигенів еритроцитів та антиеритроцитарних антитіл крові людини в непрямої реакціїаглютинації. Основа тесту - використання при типуванні антигенів еритроцитів специфічних моноклональних реагентів на основі імуноглобулінів класу G (IgG) з подальшим застосуванням другого етапу реакції антиглобулінової сироватки Кумбса (АГС).
АГС проводиться шляхом змішування сироватки з крові лабораторних тварин, імунізованих імуноглобулінами класу G людини, та моноклональних антитіл до одного з компонентів - C3D комплементу сироватки людини. АГС викликає аглютинацію еритроцитів, сенсибілізованих специфічними антитілами. За відсутності антитіл на еритроцитах під впливом АГС, позитивна реакція не відбувається.
Непряма реакція Кумбса дозволяє визначити наявність:
- антигенів еритроцитів, що виявляються IgG-реагентами («неповними» антитілами, наприклад, моноклональними реагентами анти-D, анти-F Y a , анти-F Y b);
- антиеритроцитарних антитіл класу IgG.
Непрямий антиглобуліновий тест: виявлення антигенів еритроцитів
Наводимо методику непрямої реакції Кумбса на прикладі цоліклону анти-D IgG.
- Промаркуйте чисту пробірку: вкажіть ПІБ досліджуваної особи.
- Внесіть у пробірку 2 краплі (приблизно 0,1 мл) цоліклону анти-D IgG.
- Додайте 2 краплі 5 % суспензії попередньо відмитих фізіологічним розчином аналізованих еритроцитів. Змішайте досліджувані зразки із цоліклоном.
- Інкубуйте суміш на водяній бані або термостаті при 37 °С протягом 30 хвилин.
- Додайте в пробірку пастерівської піпетки 5 - 10 мл фізрозчину.
- Центригугуйте пробірку з відцентровим прискоренням 1200 g при 18 - 25 °С протягом однієї хвилини.
- Видаліть фізрозчин.
- Повторно проведіть процедуру відмивання еритроцитів за допомогою центрифугування ще 2-3 рази.
- Додайте 2 краплі антиглобулінової сироватки до осаду кров'яних тілець, виконайте перемішування.
- Центрифугуйте пробірку з відцентровим прискоренням 1200 g протягом хвилини за температури 18 - 25 °С.
- Додайте за допомогою дозатора або пастерівської піпетки 3-5 крапель фізрозчину.
- Ресуспендуйте осад та візуально оцініть наявність аглютинації. Виражені аглютинати на дні пробірки на фоні прозорого розчинусвідчать про виявлення антигену еритроцитів. Непрозора суспензія кров'яних тілець говорить про відсутність антигену.
Реакція Кумбса: скринінг ізоімунних антиеритроцитарних антитіл
Дослідження здійснюється в рамках проведення проби на індивідуальну сумісність з усіх антигенів еритроцитів крові донора та реципієнта. Висновок про повної сумісностісироватки реципієнта з еритроцитами донора виробляють на підставі відсутності гемолізу та/або аглютинації на всіх етапах проведення аналізу. Ознаки гемолізу та/або аглютинації на якомусь етапі тестування свідчать про несумісність зразків крові.Оцінка сумісності системи АВ0, виявлення «холодових» антитіл
- Приготуйте зразок крові донора:
- внесіть у пробірку автоматичним дозатором 0,2 мл крові;
- 3 рази відмийте еритроцити у 5,0 мл фізіологічного розчину;
- Ресуспендуйте осад у 3-4 мл розчину з низькою іонною силою LISS.
- Промаркуйте другу чисту пробірку: вкажіть ПІБ реципієнта та ПІБ донора.
- Внесіть автоматичним дозатором 0,1 мл сироватки реципієнта у промарковану пробірку.
- Додайте 2 краплі 5% суспензії еритроцитів у розчині LISS.
- Негайно центрифугуйте суміш з відцентровим прискоренням 1200 g при температурі 18 - 25 °С протягом 15 - 20 секунд.
- Легким похитуванням пробірки відокремте осад від дна. Оцініть наявність аглютинатів. Присутність гемолізу та/або аглютинатів означає:
- несумісність у системі АВ0;
- наявність у сироватці хворого на «холодові» антитіла класу IgM або IgА, не специфічні до антигенів АВ0.
Виявлення «теплових» антитіл
- За відсутності гемолізу та/або аглютинатів інкубуйте пробірку 10 - 15 хвилин при 37 °С.
- Центригугуйте пробірку при 1200 g протягом 15 - 20 секунд при кімнатній температурі.
- Струсіть пробірку та перевірте наявність гемолізу та/або аглютинатів у супернатанті. Позитивний результат свідчить про виявлення у сироватці хворого на «теплові» IgM-антитілі проти антигенів еритроцитів донора.
Виявлення IgG-антитіл у тесті Кумбса
- При негативному результаті минулого етапу дослідження додайте в пробірку пастеровской піпеткою 5 мл 0,9 % розчину NaCl.
- Центрифугуйте пробірку при 1200 g протягом 15-20 секунд при температурі повітря 18-25 °С. Пастерівською піпеткою акуратно позбавтеся супернатанта.
- Повторно виконайте відмивання еритроцитів ще 2-3 рази.
- Додайте в пробірку 1-2 краплі антиглобулінової сироватки. Виконайте ретельне перемішування.
- Центрифугуйте пробірку при 1200 g 15 - 20 секунд.
- Акуратно розбийте осад еритроцитів та проведіть візуальну оцінку результату реакції. Виявлення аглютинації означає присутність у сироватці хворого на IgG-антитіл проти антигенів еритроцитів донора.
Гемолітичні анемії, Викликані аутоімунними тілами, які спрямовані проти власних еритроцитів, точно не з'ясовані. Однак передбачається, що якісь фактори (наприклад, вірус, ненормальний білок) так змінюють еритроцити, що організм сприймає їх уже як щось чуже і вступає з ними в боротьбу за допомогою антитіл. За іншою теорією, спрямовані проти еритроцитів антитіла виникають майже випадково в процесі утворення ненормальних білкових тіл плазми при деяких хворобах. Такі білкові тіла, так само «випадково», можуть дати реакції, які можна використовувати для встановлення діагнозу (наприклад, вірусна пневмонія, як відомо, дає позитивну реакцію Вассермана, позитивну реакцію Пауль - Буннеля і реакцію холодової аглютинації).
Є два головного типу аутоантитілпри гемолітичних анеміях, а саме: теплові антитіла (реагують при 37°) та холодові антитіла (реактивна здатність яких посилюється при наближенні температури до нуля). Теплові антитіла зустрічаються частіше за Холодові. Dacie виявив, що теплові гемолізини зустрічаються в 2 рази частіше, ніж холодові. Гемолізини та аглютиніни не є принципово різними антитілами: вони відрізняються лише характером їхньої дії. Аглютинини аглютинують еритроцити, а гемолізини роблять їх більш схильними до складного процесу гемолізу (комплемент!). Аутоантитіла, фіксуючись на еритроцитах, утворюють комплекс еритроцитів – глобін. Цей комплекс виявляється за допомогою антиглобінової проби Кумбса.
Проба Кумбсапроводиться із сироваткою Кумбса, для приготування якої сенсибілізують кролика сироваткою людини, проти якої у сироватці кролика утворюються антитіла. При дії такої сенсибілізованої сироватки на еритроцити людини настає їхня аглютинація, якщо рецептори еритроцитів зайняті блокуючими антитілами. Так як ці блокуючі антитіла походять із сироватки людини, вони дають аглютинацію із сироваткою кролика, сенсибілізованою до плазми людини і містить преципітини. Ця реакція названа пробою Кумбса; для гемолітичної анемії на ґрунті аутоімунних тіл (Lo tit) вона майже специфічна (подробиці див. у Maier).
Загалом при гемолітичних анеміяхз первинним порушенням еритроцитів проба Кумбса негативна, а при набутих – позитивна. Однак із цього правила є деякі винятки: помилково позитивна проба Кумбса знайдена при кризах конституційних гемолітичних анемій, а в слабкого ступеня- також іноді після спленектомії, при ревматичному поліартриті, саркоїдозі, після частих переливань крові і при системному червоному вовчаку. Природно, що з набутих гемолітичних анеміях без утворення аутоімунних тіл вона негативна.
Гемолітичні анемії, Викликані аутоімунними тілами, можна підрозділити на:
а) гострі, підгострі та хронічні форми, а також на
б) ідіопатичні з невідомою етіологією і в) симптоматичні [вірусна пневмонія (тільки холодові аглютиніни), хронічний лімфатичний лейкоз, ретикулосаркома, лімфосаркома, системний червоний вовчак Miescher з співробітниками)).
в) симптоматичні [вірусна пневмонія (тільки холодові аглютинини), хронічний лімфатичний лейкоз, ретикулосаркома, лімфосаркома, системний червоний вовчак (переважно теплові, рідше холодові аглютинини), сифіліс (холодові аглютини)
Клініка гемолітичних анемій, що розвиваються під дією аутоімунних тіл, дуже різноманітна, і навряд чи тому можна намалювати їх загальну клінічну картину. Уражаються особи різного віку та обох статей поступово. Все ж таки ідіопатичні форми начебто частіше спостерігаються у жінок (Sacks і Workman).
Клінічна картина ідіопатичної формизмінюється залежно від тяжкості захворювання. У хронічних випадкахПочаток поступово, хвороба тягнеться багато років з частими загостреннями. Тяжкість анемії різна в залежності від ступеня гемолізу. Спостерігаються падіння гемоглобіну до 10%, в інших випадках гемоглобін довго утримується на 50-60%. Інтенсивність ретикулоцитозу та жовтяничного забарвлення шкіри та сироватки відповідає ступеню гемолізу. Білірубін у сечі знаходять дуже рідко, оскільки він не проходить через нирки, але гемоглобінурія спостерігається. Селезінка в хронічних випадках частіше збільшена і може навіть досягати дуже значних розмірів, в інших випадках вона ще промацується. Печінка рідко коли не збільшена.
У крові у більшості випадківспостерігається макроцитоз, гострих стадіяхтакож багато мікроцитів, рідко відсутні нормобластоз та поліхромазія, лейкоцитоз може досягати 30 000, тромбоцити в нормі. У деяких випадках, однак, є виражена тромбоцитопенія. Evans пояснює ці випадки одночасною наявністю антитіл проти тромбоцитів, так що є одночасно гемолітична анемія і тромбоцитопенія на грунті дії аутоімунних тіл-синдром Еванса (Evans). Осмотична резистентність злегка знижена, але не такою мірою і не так постійно, як при конституціональній кулястоклітинній анемії. Проба на стійкість до нагрівання (Hegglin-Maier) після 6 годин також може дати незначний гемоліз (власне спостереження), але меншою мірою, ніж анемія Маркіафава. У сечі знаходять також гемосидерин (власне спостереження).
