Пасивні реакції аглютинації. Непрямі реакції аглютинації. Реакція непрямої, чи пасивної, гемаглютинації (РНГА, РПГА). Зворотній РНГА. Реакція гальмування пасивної гемаглютинації (РТПГА).
Ці реакціїназиваються непрямими (пасивними), так як при їх проведенні використовують Аг (або AT) штучно сорбовані на поверхні різних корпускулярних частинок.
Реакція непрямої, чи пасивної, гемаглютинації (РНДА, РПДА) - Одна з найбільш чутливих серологічних реакцій. Заснована на здатності AT взаємодіяти з Аг, фіксованими на різних еритроцитах, які при цьому аглютинують. Для більшої стабільності діагностикумів еритроцити формалінізують.
Зворотня РНДАзастосовується виявлення Аг в сироватці крові; при цьому на еритроцитах фіксуються не Аг, a AT. Реакції цього широко застосовують для діагностики інфекційних хвороб, встановлення вагітності, виявлення підвищеної чутливостідо ліків тощо.
Реакція гальмування пасивної гемаглютинації (РТПГА) - подальший розвиток РНДА; у певному сенсі контролює її специфічність. На відміну від РНДАвключає три компоненти; Аг, AT та Аг (AT), адсорбовані на еритроцитах. Спочатку Аг реагує з AT (стандартна антисироватка), потім суміш вносять еритроцити, сенсибілізовані аналогічним Аг (або AT). Якщо при взаємодії Аг із AT у системі не залишаються вільні AT (або Аг), то аглютинації еритроцитарного діагностикуму не спостерігають.
У ній використовують еритроцити або нейтральні синтетичні матеріали(Наприклад, частинки латексу), на поверхні яких сорбовані антигени (бактеріальні, вірусні, тканинні) або антитіла. Їхня аглютинація відбувається при додаванні відповідних сироваток або антигенів. Еритроцити, сенсибілізовані антигенами, називають антигенним еритроцитарним діагностикумом і використовують для виявлення та титрування антитіл. Еритроцити, сенсибілізовані антитілами. називають імуноглобуліновими еритроцитарними діагностикумами та застосовують для виявлення антигенів.
Реакцію пасивної гемаглютинації використовують для діагностики захворювань, спричинених бактеріями. черевний тифі паратифи, дизентерія, бруцельоз, чума, холера та ін), найпростішими (малярія) та вірусами (грип, аденовірусні інфекції, вірусний гепатитВ, кір, кліщовий енцефаліт, кримська геморагічна лихоманка та ін.), а також для визначення деяких гормонів, виявлення підвищеної чутливості хворого до лікарським препаратамі гормонів, наприклад пеніциліну та інсуліну.
Реакція пасивної гемаглютинації (РПГА). Реакція пасивної гемаглютинації є чутливим методом серологічної діагностикиі використовується як для ранньої, так і для ретроспективної діагностики, а також для визначення імунопогічного стану щеплених. У хворих на туляремію антитіла зазвичай виявляються в кінці 1-го або на 2-му тижні захворювання, через 1-1,5 місяці титри РПГА досягають максимальних показників(1:100000-1:20000, рідше вище), після чого знижуються і на рівні 1:100-1:200 зберігаються тривалий час.
У щеплених антитіла також виявляються постійно, однак у нижчих титрах, що не перевищують 1:2000-1:5000 через 1-1,5 місяця після вакцинації, зберігаються протягом декількох років на низькому рівні 1:20-1:80.
Антигеном для постановки РПГА є туляремійний еритроцитарний діагностикум (антигенний). Препарат являє собою формалінізовані еритроцити барана, сенсибілізовані антигеном туляремійним, випускається в рідкому і сухому вигляді. Рідкий препарат - 10%-на завись еритроцитів у розчині формаліну 10%-ної концентрації. Сухий ліофілізований препарат - висушена у вакуумі 10%-на суспензія еритроцитів без консерванту. Перед вживанням його розводять відповідно до вказівок на етикетці. Для постановки реакції в полістиролових пластинах обидва препарати застосовують у 2,5%-ної концентрації, а при постановці реакції в мікрооб'ємах - в 0,5%-ноq концентрації.
Техніка постановки РПГА. Випробувані сироватки розводять фізіологічним розчином 1:5 (1:10) і прогрівають при 56 ° С протягом 30 хвилин. Після цього з метою видалення гетерогенних антитіл до баранячих еритроцитів, сироватки обробляють 50% суспензією формалінізованих баранячих еритроцитів. Для цього еритроцити додають з розрахунку 2 краплі (0,05 мл) на 1 мл сироватки і ретельно перемішують струшуванням. Сироватку залишають до осідання еритроцитів, або центрифугують після одногодинної витримки при кімнатній температурі, після чого вона готова до дослідження.
Рідина, що розводить, розливають в об'ємі 0,5 мл в ряд лунок полістиролової пластини. При попередньому дослідженні сироваток їх доцільно випробовувати шляхом постановки реакції короткому ряду пластини (6-лунок). У разі виявлення антитіл у короткому ряду сироватки повторно досліджують у довгому ряді розведень (12 лунок). Після розливу рідини, що розводить, в першу лунку кожного ряду (короткого або довгого) додають по 0,5 мл випробуваних сироваток в розведенні 1:5. Потім у тих самих обсягах сироватки титрують дворазовими розведеннями. Таким чином, отримують розведення сироватки у короткому ряду з 1:10 до 1:320, а в довгому – з 1:10 до 1:20480. Після титрування сироваток в кожну лунку додають по одній краплі (0,05 мл) робочої 2,5% суспензії сенсибілізованих еритроцитів. Вміст пластин ретельно струшують до отримання гомогенної суспензії. Пластини залишають за кімнатної температури на нерухомій поверхні столу. Попередній облік реакції проводять через 2-3 години, остаточне визначення титру проводять після повного осідання еритроцитів у лунках. До реакції передбачають такі контролі: 1) випробувана сироватка в розведенні 1:10 в об'ємі 0,5 мл + 1 крапля 2,5% суспензії несенсибілізованих еритроцитів; 2) рідина, що розводить, в обсязі 0,5 мл + 1 крапля 2,5%-суспензії несенсибілізованих еритроцитів; 3) рідина, що розводить, в обсязі 0,5 мл + 1 крапля 2,5%-ної суспензії сенсибілізованих еритроцитів. Усі контролі мають дати чітко негативну реакцію.
Облік та оцінка РПГА. Оцінку реакції проводять за наступною схемою:
1) різко позитивна реакція(++++) – еритроцити випадають на дно лунки рівномірним шаром у вигляді «парасольки», у якого нерідко спостерігається фестончасте обпливання країв;
2) позитивна реакція (+++) – еритроцити встеляють не менше 2/3 дна лунки;
3) слабопозитивна реакція (++) – аглютинат невеликий і розташований у самому центрі лунки;
4) сумнівна реакція (+) – навколо осаду еритроцитів у самому центрі лунки є окремі зерна аглютинату;
5) негативна (-) - на дні лунки еритроцити осідають у вигляді «гудзика» або маленького кільця з рівними, різко окресленими краями.
Титр сироватки враховують за останнім розведенням сироватки, яке дало цілком чітку реакцію (не менше трьох плюсів). Діагностичним титром вважається розведення 1:100 і вище, однак, як і у разі РА необхідно простежити за його наростанням.
РПГА при туляремії є досить специфічною і виявляє деякі перехресні реакціїтільки з бруцельозними сироватками. Диференційна діагностикаможлива за висотою титрів у РПГА, які значно вищі з гомологічним антигеном.
Техніка постановки РПГА у мікрооб'ємах. РПГА може бути виконана в мікрооб'ємах за допомогою мікротитратора типу Такачі (або круглодонних мікропланшетів з мікропіпетками), який дозволяє здійснювати титрування матеріалу в об'ємах 25 мкл та 50 мкл. Техніка постановки реакцій, послідовність всіх операцій така сама, як і для дослідження в полистироловых пластинах. Слід, проте, пам'ятати, що чутливість мікрометоду зазвичай одне розведення (тобто. 2 разу) нижче, ніж макрометода.
Для постановки реакції в мікротитраторі за допомогою піпетки - крапельниці в кожну лунку вносять рідину, що розводить, в об'ємі 50 мкл. Потім за допомогою титраторів з головкою об'ємом 50 мкл забирають сироватку, що досліджується, занурюючи в неї голівку. Слід переконатись, що рідина заповнила головку титратора. Титратор із сироваткою переносять у першу лунку і, тримаючи його в вертикальному положенні, роблять кілька обертальних рухівв обидві сторони. Потім титратор переносять наступну лунку і повторюють маніпуляцію. Титрування можна проводити одночасно у кількох рядах. Після титрування всього ряду титратор промивають дистильованою водою (зі зміною 2-х порцій) шляхом обертальних рухів, видаляють воду з голівки за допомогою тампона та обпалюють її на полум'ї пальника.
У лунки після титрування додають 25 мкл еритроцитарного діагностикуму. Концентрація діагностикуму для РПГА в мікрообсягах повинна становити 0,5% (тобто 2,5%-ву завись еритроцитів додатково розводять у 5 разів). Після додавання еритроцитів пластини слід трохи потрясти до отримання гомогенної суспензії. Облік результатів може бути зроблено вже через 1-1,5 години, у чому суттєва перевага РПГА у мікротитраторі. Крім того, цей прийом вимагає малої кількості всіх інгредієнтів реакції та випробуваних сироваток.
Облік реакції проводять за такою схемою:
1) "+" - повноцінна гемаглютинація, при якій еритроцити випадають на дно лунки рівномірним шаром у вигляді "парасольки", що займає не менше 2/3 дна;
2) «+-« - часткова гемаглютинація, при якій еритроцити випадають на дно у вигляді пухкого кільця невеликого розміру;
3) «-« - відсутність гемаглютинації, коли еритроцити випадають на дно у вигляді маленького ґудзика або кільця з рівним краєм.
Специфічність позитивного результату, отриманого в РПГА, може бути перевірена за допомогою трикомпонентної реакції - реакції торможення пасивної гемаглютинації (РТПГА).
Техніка постановки РТПГА. Цю реакцію ставлять на підтвердження специфічності позитивного результату РПГА, що він викликає сумнів чи становить особливий епідеміологічний інтерес. Механізм реакції полягає у специфічному гальмуванні гемаглютинації при додаванні до випробуваної сироватці суспензії вбитих туляремійних бактерій. В реакції взаємодіють три компоненти: випробувана сироватка, специфічний антиген туляремійний і антигенний еритроцитарний діагностикум РТПГА зазвичай ставлять в ряду з 7-8 лунок. Доцільно паралельно із РТПГА ставити повторну РПГА. У два ряди лунок розливають по 0,25 мл рідини, що розводить, потім в перші лунки обох рядів вносять випробувану сироватку в об'ємі 0,25 мл і проводять титрування. Одержують два однакових ряду розведень сироватки. У всі лунки другого ряду додають по 0,25 мл рідини, що розводить, а в лунки першого ряду - по 0,25 мл суспензії туляремійних бактерій. Використовують туляремійний діагностикум (що містить 25 млрд туляремійних бактерій в 1 мл), попередньо розведений в 50 разів. Така суспензія містить 500 млн. бактерій на 1 мл або 125 млн. в обсязі 0,25 мл. Після додавання антигену пластину залишають на 1 годину при кімнатній температурі, після чого у всі лунки обох рядів додають по одній краплі (0,05 мл) еритроцитарного діагностикума, пластину струшують і залишають на рівній столі. Облік проводять через 2-3 години.
Облік та оцінка РТПГА. Якщо у випробуваній сироватці містяться специфічні туляремійні антитіла, вони нейтралізуються доданим антигеном і в першому ряду лунок гемагглютинації не відбудеться, або, при високому титрі сироватки, гемагглютинація відзначатиметься в меншій (2-4) кількості лунок, ніж у ряді. І тут специфічність результатів підтверджено. Якщо ж гемаглютинація буде відзначено обох рядах, тобто. результати РТПГА і РПГА збігатимуться, це свідчить про відсутність у випробуваній сироватці туляремійних антитіл. У разі первинний результат РПГА визнається неспецифічним.
Техніка постановки РТПГА у мікрооб'ємах. РТПГА, як і РПГА, може бути виконана в мікрооб'ємах з використанням мікротитратора типу Такачі. Для цього в лунки мікропластинок вносять по 0,25 мкл рідини, що розводить, в два ряди по 7-8 лунок в кожному. Потім за допомогою титратора забивають по 0,25 мкл сироватки, що досліджується, і титрують її в обох рядах. Після цього в перший ряд вносять по 25 мкл туляреміймого антигену (концентрація якого 500 млн. туляремійних бактерій в 1 мл) в кожну лунку, а в другий - 25 мкл рідини, що розводить. Пластини залишають на 1 годину при кімнатній температурі, після чого до всіх лунок обох рядів додають 25 мкл антигенного зритроцитарного діагностикуму (0,5%-ної концентрації). Облік та оцінку результатів проводять аналогічно реакції в макрообсягах.
Реакція пасивної гемаглютинації) метод виявлення та ідентифікації антигенів або антитіл, заснований на феномен аглютинації еритроцитів, що виникає в їх присутності, на поверхні яких були попередньо адсорбовані відповідні специфічні або антигени.
1. Мала медична енциклопедія. - М: Медична енциклопедія. 1991-96 р.р. 2. Перша медична допомога. - М: Велика Російська Енциклопедія. 1994 3. Енциклопедичний словник медичних термінів. - М: Радянська енциклопедія. - 1982-1984 рр..
Дивитись що таке "Реакція непрямої гемаглютинації" в інших словниках:
реакція непрямої гемаглютинації- РНДА Лабораторний тестз використанням еритроцитарних діагностикумів. [Англо російський глосарій основних термінів з вакцинології та імунізації. Всесвітня організація охорони здоров'я, 2009 р.] Тематики вакцинологія, імунізація Синоніми РНГА EN… … Довідник технічного перекладача
- (РНГА; син. реакція пасивної гемагглютинації) метод виявлення та ідентифікації антигенів або антитіл, заснований на феномен аглютинації еритроцитів, що виникає в їх присутності, на поверхні яких були попередньо адсорбовані ... ... Великий медичний словник
- (РПГА) див. Реакція непрямої гемаглютинації … Великий медичний словник
Ця сторінка глосарій. # А … Вікіпедія
Основні скорочення, прийняті у Ветеринарному енциклопедичному словнику- a., aa, artena, arteriae aa ana (порівну) АМН СРСР Академія медичних наук СРСР АН СРСР Академія наук СРСР Bac. Bacillus Bact. Bacterium БРСР Білоруська РСР ст., ст. століття, століття v., vv. vena, venae ВАСХНІЛ Всесоюзна ордена Леніна і… …
Цей термін має й інші значення, див. Чумка. Чума м'ясоїдних (хвороба Каре) гостра або підгостра контагіозна вірусна хвороба, що виявляється лихоманкою, катаральним запаленням слизових оболонок, ураженнями шкіри, центральною… … Вікіпедія
- (renes) парний екскреторний та інкреторний орган, що виконує за допомогою функції сечоутворення регуляцію хімічного гомеостазу організму. АНАТОМО ФІЗІОЛОГІЧНИЙ НАЧЕРК Нирки розташовані в заочеревинному просторі (Заочеревинний простір) на… Медична енциклопедія
I (trichinellosis; синонім: трихіноз, «одутловатка») гельмінтоз із групи нематодозів, що характеризується лихоманкою, міалгіями, набряком обличчя, шкірними висипамиеозинофілією крові, а при тяжкому перебігу ураженням внутрішніх органівта центральної… … Медична енциклопедія
- (Nematodoses) гельмінтози, що викликаються нематодами круглими хробаками класу Nematoda. Серед інших гельмінтозів Н. мають найбільше значенняу патології людини, більшість із них геогельмінтози (див. Гельмінтози); розвиток їх яєць або личинкових. Медична енциклопедія
епідідиміт інфекційний- Мал. 1. Збільшення лівого насінника у барана при інфекційному епідидиміті. Мал. 1. Збільшення лівого насінника у барана при інфекційному епідидиміті. епідидиміт інфекційний баранів (Epididymitis infectiosa arietum), хронічна інфекційна… Ветеринарний енциклопедичний словник
Див. Реакція непрямої гемаглютинації … Великий медичний словник
Реакція ставиться:
1) для виявлення полісахаридів, білків, екстрактів бактерій та інших високодисперсних речовин, рикетсій та вірусів, комплекси яких з аглютинінами у звичайних РА побачити не вдається,
2) для виявлення антитіл у сироватках хворих до цих високодисперсних речовин та найдрібніших мікроорганізмів.
Під непрямою або пасивною аглютинацією розуміють реакцію, в якій антитіла взаємодіють з антигенами, попередньо адсорбованими на інертних частинках (латекс, целюлоза, полістерол, оксид барію та ін. або еритроцити барана, I(0)-групи крові людини)
У реакції пасивної гемаглютинації (РПГА) як носій використовують еритроцити. Навантажені антигеном еритроцити склеюються у присутності специфічних антитіл до цього антигену і випадають осад. Сенсибілізовані антигеном еритроцити використовують у РПГА як еритроцитарний діагностикум для виявлення антитіл (серодіагностика). Якщо навантажити еритроцити антитілами (еритроцитарний антільний діагностикум), можна застосовувати виявлення антигенів.
Мал. 3. Схема РПГА: еритроцити (1), навантажені антигеном (3), зв'язуються специфічними антитілами (4).
Постановка. У лунках полістиролових планшетів готують низку послідовних розведень сироватки. У передостанню лунку вносять - 0,5 мл свідомо позитивної сироватки та в останню 0,5 мл фізіологічного розчину (контролі). Потім у всі лунки додають по 0,1 мл розведеного еритроцитарного діагностикуму, струшують і поміщають термостат на 2 год.
Облік. У позитивному випадкуеритроцити осідають на дні лунки у вигляді рівного шару клітин зі складчастим або зазубреним краєм (перевернутий парасольку), у негативному - осідають у вигляді гудзика або кільця.
Рис.4. Облік РНДА (РПДА).
Облік результатів рНГ, поставленої з метою виявлення ботулотоксину.
Збудник ботулізму - Clostridium botulinum виробляє токсини семи сероварів (А, B, C, D, E, F, G), проте найчастіше зустрічаються серовари А, В, Е. Всі токсини відрізняються за антигенними властивостями і можуть бути диференційовані в реакціях типоспецифічними сироватками . Для цієї мети можна поставити реакцію пасивної (непрямої) гемаглютинації із сироваткою хворого, в якій передбачається наявність токсину, та еритроцитами, навантаженими антитілами антитоксичних протиботулінічних сироваток типів А, В, Е. Контролем служить нормальна сироватка.
Мал. 3. Постановка та результат РНДА.
Облік. У позитивному випадку еритроцити осідають на дні лунки у вигляді рівного шару клітин зі складчастим або зазубреним краєм (перевернутий парасольку), у негативному - осідають у вигляді гудзика або кільця.
Висновок: У сироватці хворого виявлено ботулотоксин тип Е.
Реакція гальмування гемаглютинації (РТГ).
Мал. 8. Реакція гальмування гемаглютинації (РТГА) (схема).
Принцип реакції заснований на здатності АТ пов'язувати різні віруси та нейтралізувати їх, позбавляючи можливості аглютинувати еритроцити. Візуально цей ефект і проявляється у «гальмуванні» гемаглютинації. РТГА застосовують при діагностиці вірусних інфекцій для виявлення специфічних антигемагглютинінів та ідентифікації різних вірусів за їх гемагглютиніном, що виявляє властивості Аг.
Типування вірусу проводять реакції РТГА з набором типоспецифічних сироваток. Результати реакції враховують за відсутністю гемаглютинації. Підтипи вірусу типу А з антигенами H0N1, H1N1, H2N2, H3N2 та інші можуть бути диференційовані в РТГА з набором гомологічних типоспецифічних сироваток
Мал. 9. Результати РТГА при типуванні вірусу грипу
Умовні позначення: - гальмування гемаглютинації (гудзик); - гемаглютинація (парасолька).
Висновки: Досліджуваний матеріал містить вірус грипу тип А з антигеном H3N2
Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації (РНГА) заснована на тому, що еритроцити, якщо на їхній поверхні адсорбувати розчинний антиген, набувають здатності аглютинуватися при взаємодії з антитілами до адсорбованого антигену. Схема РНДА представлена на рис. 34. РНГА широко застосовують при діагностиці низки інфекцій.
Мал. 34. Схема реакції пасивної гемаглютинації (РПГА). А - отримання еритроцитарного діагностикуму: Б - РПГА: 1 - еритроцит: 2 - антиген, що вивчається; 3 – еритроцитарний діагностикум; 4 - антитіло до антигену, що вивчається: 5 - аглютинат
Постановка реакції. Випробувану сироватку прогрівають 30 хв при 56° С, розводять послідовно у співвідношенні 1:10 - 1:1280 і розливають по 0,25 мл у пробірки або лунки, куди потім додають по 2 краплі еритроцитарного діагностикуму (еритроцити з адсорбованим).
Контролі: завись еритроцитарного діагностикуму із свідомо імунною сироваткою; завись діагностикуму з нормальною сироваткою; завись нормальних еритроцитів з випробуваною сироваткою. У першому контролі має відбутися аглютинація, у другому та третьому її не повинно бути.
За допомогою РІГА можна визначати невідомий антиген, якщо адсорбувати на еритроцити свідомо відомі антитіла.
Реакцію гемаглютинації можна ставити в об'ємі 0,025 мл (мікрометод), користуючись мікротитратором Такачі.
1. Про що свідчить позитивний результатРДА між еритроцитами та досліджуваним на наявність вірусу матеріалом?
2. Чи відбудеться аглютинація еритроцитів, якщо до них додати вірус та відповідну йому сироватку? Як називається реакція, яка виявляє цей феномен?
Завдання
Врахуйте та зареєструйте результат РІГА.
Реакція преципітації
У реакції преципітації відбувається випадання осад специфічного імунного комплексу, що складається з розчинного антигену (лізату, екстракту, гаптена) і специфічного антитіла в присутності електролітів.
Утворене в результаті цієї реакції каламутне кільце або осад називають преципітатом. Від реакції аглютинації ця реакція переважно відрізняється розміром частинок антигену.
Реакцію преципітації зазвичай застосовують визначення антигену при діагностиці низки інфекцій ( сибірська виразка, менінгіт та ін); у судовій медицині - для визначення видової приналежності крові, сперми та ін; у санітарно-гігієнічних дослідженнях – при встановленні фальшування продуктів; з її допомогою визначають філогенетичну спорідненість тварин та рослин. Для реакції необхідні:
1. Антитіла (преципітіни) - імунна сироватка з високим титромантитіл (не нижче 1:100000). Титр преципітуючої сироватки встановлюють за найбільшим розведенням антигену, з яким вона дає реакцію. Сироватку зазвичай застосовують нерозведеною або у розведенні 1:5 – 1:10.
2. Антиген - розчинені речовини білкової або ліпоїднополісахаридної природи (повні антигени та гаптени).
3. Ізотонічний розчин.
Основні методи проведення реакції преципітації: реакція кільцепреципітації та реакція преципітації в агарі (гелі).
Увага! Усі компоненти, що беруть участь у реакції преципітації, повинні бути прозорими.
Реакція кільцепреципітації. До преципітаційної пробірки за допомогою пастерівської піпетки вносять 0,2-0,3 мл (5-6 крапель) сироватки (сироватка не повинна потрапляти на стінки пробірки). На сироватку обережно нашаровують антиген у такому ж обсязі, наливаючи його тонкою пастерівською піпеткою по стінці пробірки. Пробірку при цьому тримають у похилому положенні. При правильному нашаруванні між сироваткою та антигеном має вийти чітка межа. Обережно, щоб не перемішати рідини, ставлять пробірку в штатив. При позитивному результаті реакції межі антигену і антитіла утворюється каламутне " кільце " - преципітат (див. рис. 48).
Реакцію супроводжують поряд контролів (табл. 18). Дуже важливою є послідовність внесення в пробірку інгредієнтів реакції. Не можна нашарувати сироватку на антиген (у контролі - на ізотонічний розчин), оскільки відносна щільність сироватки більше, вона опуститься на дно пробірки, і межа між рідинами не виявиться.
Таблиця 18. Схема постановки реакції кільцепреципітації
Примітка. + наявність "кільця"; - Відсутність "кільця".
Облік результатів проводять через 5-30 хв, у деяких випадках через годину, як завжди, починаючи з контролів. "Кільце" у 2-й пробірці свідчить про здатність імунної сироватки вступати в специфічну реакціюз відповідним антигеном. У 3-5 пробірках "кілець" не повинно бути - там немає відповідних один одному антитіл і антигенів. "Кільце" в 1-й пробірці - позитивний результат реакції - говорить про те, що випробуваний антиген відповідає взятій імунній сироватці, відсутність "кільця" ("кільце" тільки у 2-й пробірці) свідчить про їх невідповідність - негативний результат реакції.
Реакція преципітації в агарі (гелі). Особливість реакції в тому, що взаємодія антигену та антитіла відбувається в щільному середовищі, тобто в гелі. Преципітат, що утворюється, дає в товщі середовища каламутну смугу. Відсутність лінії свідчить про невідповідність компонентів реакції. Цю реакцію широко застосовують при медико-біологічних дослідженнях, зокрема щодо токсинообразования у збудника дифтерії.
Контрольні питання
1. У чому основна відмінність між реакцією аглютинації та преципітації?
2. Чому не можна застосовувати каламутні інгредієнти у реакції преципітації?
Завдання
1. Поставте реакцію кільцепреципітації та замалюйте результат.
2. Вивчіть характер взаємодії антигену з антитілом у реакції преципітації в агарі, замалюйте результат (чашку отримайте у викладача).
Реакція лізису (імунний цитоліз)
Імунний лізис - це розчинення клітин під впливом антитіл при обов'язкову участькомплементу. Для реакції необхідні:
1. Антиген – мікроби, еритроцити або інші клітини.
2. Антитіло (лізин) – імунна сироватка, рідше сироватка хворого. Бактеріолітична сироватка містить антитіла, що беруть участь у лізисі бактерій; гемолітична – гемолізини, що сприяють лізису еритроцитів; для лізису спірохет потрібні спірохетолізини, клітин – ітолізини тощо.
3. Комплемент. Найбільше комплементу у сироватці морських свинок. Цю сироватку (суміш від кількох тварин) зазвичай використовують як комплемент. Свіжий (нативний) комплемент нестійкий і легко руйнується при нагріванні, струшуванні, зберіганні, тому користуватися ним можна не більше двох днів після отримання. Для консервації комплементу до нього додають 2% борної кислотита 3% сульфату натрію. Такий комплемент можна зберігати при 4 ° С до двох тижнів. Найчастіше застосовують сухий комплемент. Перед вживанням розчиняють в ізотонічному розчині до початкового об'єму (вказаний на етикетці).
4. Ізотонічний розчин.
Реакція гемолізу(Табл. 19). Для реакції необхідні:
1. Антиген - 3% завись відмитих еритроцитів барана з розрахунку 0,3 мл осаду еритроцитів та 9,7 мл ізотонічного розчину.
2. Антитіло – гемолітична сироватка (гемолізин) проти еритроцитів барана; зазвичай готують на виробництві, ліофілізують і на етикетці вказують титр.
Титр гемолізину - найбільше розведення сироватки, при якому відбувається повний гемоліз 3% суспензії еритроцитів у присутності комплементу. Для реакції гемолізу гемолізин беруть у потрійному титрі, тобто розводять у 3 рази менше, ніж до титру. Наприклад, при титрі сироватки 1:1200, розводять сироватку 1:400 (0,1 мл сироватки * і 39,9 мл ізотонічного розчину). Надлишок гемолізину необхідний, оскільки його можуть адсорбувати інші компоненти реакції.
* (Менше 0,1 мл сироватки брати не слід - страждає на точність вимірювання.)
3. Комплемент розводять 1:10 (0,2 мл комплементу та 1,8 мл ізотонічного розчину).
4. Ізотонічний розчин.
Таблиця 19. Схема реакції гемолізу
Облік результатів. При правильно поставленій реакції в 1 пробірці відбудеться гемоліз - вміст її стане прозорим. У контролю рідина залишається каламутною: у 2-й пробірці для наступу гемолізу немає комплементу, в 3-й - немає гемолізину, в 4-й - немає ні гемолізину, ні комплементу, в 5-й - антиген не відповідає антитілу,
У разі потреби гемолітичну сироватку титрують за наступною схемою (табл. 20).
Перед титруванням готують вихідне розведення сироватки 1:100 (0,1 мл сироватки та 9,9 мл ізотонічного розчину), з якого роблять необхідні розведення, наприклад:
З цих розведень вносять по 0,5 мл сироватки пробірки досвіду титрування, як показано в табл. 20.
Таблиця 20. Схема титрування гемолітичної сироватки (гемолізину)
У прикладі, наведеному у табл. 20 титр гемолітичної сироватки дорівнює 1:1200.
При використанні свіжої гемолітичної сироватки її необхідно інактивувати, щоб зруйнувати комплемент, що є в ній. Для цього її прогрівають 30 хв при 56° на водяній бані або в інактиваторі з терморегулятором. Останній спосіб кращий: він унеможливлює перегрівання сироватки, тобто її денатурації. Денатуровані сироватки непридатні до досвіду.
Реакція бактеріолізу. У цій реакції комплемент лізує бактерії у присутності відповідної (гомологічної) сироватки. Схема реакції важливо схожа зі схемою реакції гемолізу. Відмінність полягає в тому, що після двогодинної інкубації з усіх пробірок роблять висів на чашки Петрі з середовищем, сприятливим для взятого в досвід мікроорганізму, щоб дізнатися, чи він лізований. При правильно поставленому досвіді в посівах з 2-5 пробірок (контролі) має бути рясне зростання. Відсутність зростання або слабке зростання у посіві з 1-ї пробірки (досвід) говорить про загибель мікробів, тобто про те, що вони гомологічні антитілу.
Увага! Реакцію бактеріолізу слід проводити в асептичних умовах.
Контрольні питання
1. Що станеться з еритроцитами, якщо замість ізотонічного розчину натрію хлориду застосувати дистильовану воду? Що є основою цього феномена?
2. Яка реакція відбудеться при взаємодії еритроцитів із гомологічною імунною сироваткою без комплементу?
Завдання
Поставте реакцію гемолізу. Зафіксуйте та замалюйте результат.
Подібна інформація.
