La invención se refiere a ingeniería genética, biotecnología, medicina, farmacología. Un nuevo plásmido recombinante multicopia de ADN pSX50, que codifica la síntesis del interferón alfa-2b de leucocitos humanos, cuya expresión está bajo el control de promotores de lactosa y triptófano y de un terminador de la transcripción. Como resultado de la transformación de células de la cepa receptora E. coli BL21 con ADN plasmídico recombinante pSX50, se obtuvo la cepa E. coli SX50, productora de interferón alfa-2b humano leucocitario recombinante con una productividad de hasta 0,9-1,0 g de interferón alfa-2b de 1 litro de medio de cultivo. El método para producir interferón alfa-2b recombinante se basa en el uso de una cepa recombinante creada de E. coli SX50 e implica su cultivo profundo en un medio nutritivo con contenido reducido triptófano con la adición continua de sustratos nutritivos en el proceso de biosíntesis, destrucción mecánica de células de microorganismos con hipertensión, disolución de la proteína agregada en una solución concentrada de clorhidrato de guanidina, seguida de renaturalización del interferón en soluciones tampón fisiológicas en presencia de agentes caotrópicos y su purificación mediante purificación cromatográfica en tres etapas del interferón sobre resinas quelantes de Sefarosa Fast Flow inmovilizadas con Cu+. 2 iones, cromatografía de intercambio iónico sobre resinas de intercambio iónico tipo SM Sephsrose Fast Flow y cromatografía de filtración en gel sobre resinas tipo Superdex 75. El método permite obtener una sustancia de interferón de más del 99% de pureza según electroforesis en reducción y no reducción. condiciones al teñir geles con plata y más del 98% según RF HPLC y no contiene pirógenos (prueba LAL) en cantidades de al menos 400-800 mg por 1 litro de medio de cultivo. 3 n. y 3 puestos asalariados, 6 enfermos.
Dibujos para la patente RF 2242516
La invención se refiere a medicamentos genéticamente modificados obtenidos biotecnológicamente, concretamente a métodos producción industrial interferón alfa-2b leucocitario humano recombinante fines médicos(en adelante, interferón), así como a cepas productoras recombinantes de Escherichia coli (E.coli) y ADN plasmídico que codifica la síntesis de interferón.
Los interferones son moléculas de proteínas con un peso molecular de 15.000 a 21.000 daltons producidas y secretadas por las células en respuesta a una infección viral u otros patógenos. Hay tres grupos principales de interferones: alfa, beta y gamma. Estos grupos en sí no son homogéneos y pueden contener varias especies moleculares diferentes de interferón. Así, se han identificado más de 14 variedades genéticas de interferón alfa, que resultan de interés y encuentran amplia aplicación en medicina como agentes antivirales, antiproliferativos e inmunomoduladores.
Se conocen métodos para obtener interferón leucocitario humano a partir de leucocitos de sangre de donante humano inducido por virus y otros inductores (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873).
La principal desventaja de estos métodos de producción de interferones es la probabilidad de contaminación del producto final con virus humanos, como el virus de la hepatitis B y C, el virus de la inmunodeficiencia, etc.
Actualmente, se considera más prometedor el método de producción de interferón mediante síntesis microbiológica, que permite obtener el producto objetivo con un rendimiento significativamente mayor a partir de materiales de partida relativamente económicos. Los enfoques utilizados aquí permiten crear variantes de un gen estructural que son óptimas para la expresión bacteriana, así como elementos reguladores que controlan su expresión.
Los microorganismos de partida utilizados son varios diseños cepas de Pichia pastoris, Pseudomonas putida y Escherichia coli.
La desventaja de utilizar P. pastoris como productor de interferón (J.N. García, J.A. Aguiar et. al. //High levelexpresion of human IFN-2b in Pichia pastoris.//Biotecnologia Aplicada, 12(3),152-155, 1995 ), Las condiciones de fermentación de este tipo de levadura son extremadamente difíciles, siendo necesario mantener estrictamente la concentración del inductor, en particular metanol, durante el proceso de biosíntesis. La desventaja de usar Ps. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) es la complejidad del proceso de fermentación a un nivel de expresión bajo (10 mg de interferón por 1 litro de medio de cultivo). Más productivo es el uso de cepas de Escherichia coli (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3 Suppl. 9): S9-41-S9-51).
Se conocen una gran cantidad de plásmidos y cepas de E. coli creadas a partir de ellos que expresan interferón: cepas de E. coli ATCC 31633 y 31644 con plásmidos Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 o Z-pBR 322(Pstl)/ HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), cepa de E. coli pINF-AP2 (SU 1312961), cepa de E. coli pINF-F-Pa (AU 1312962), cepa de E. coli SG 20050 con plásmido p280/21FN (Kravchenko V.V. y otros Bioorganic chemistry, 1987, v. 13, no. 9, págs. 1186-1193), cepa E. coli SG 20050 con plásmido pINF14 (SU 1703691), cepa E. coli SG 20050 con plásmido pINF16 (RU 2054041). y etc. La desventaja de las tecnologías basadas en el uso de estas cepas es su inestabilidad, así como el nivel insuficiente de expresión de interferón.
Además de las características de las cepas utilizadas, la eficiencia del proceso depende en gran medida de la tecnología utilizada para el aislamiento y purificación del interferón.
Existe un método conocido para producir interferón, que incluye el cultivo de células Ps. putida, destrucción de biomasa, tratamiento con polietilenimina, fraccionamiento con sulfato de amonio, cromatografía hidrofóbica sobre fenilsilocromo C-80, fraccionamiento por pH del lisado, su concentración y diafiltración, cromatografía de intercambio iónico sobre celulosa DE-52, elución en gradiente de pH, ionización cromatografía de intercambio del eluyente resultante sobre celulosa SM -52, concentración pasando a través de un casete de filtro y filtración en gel sobre Sephadex G-100 (SU 1640996). La desventaja de este método, además de la compleja fermentación en varias etapas, es el proceso de varias etapas para obtener el producto final.
También existe un método conocido para producir interferón, que incluye cultivar la cepa de E. coli SG 20050/pIF16 en caldo LB en matraces en un agitador termostático, centrifugar la biomasa, lavarla con una solución tampón y un tratamiento ultrasónico para destruir las células. El lisado resultante se centrifuga, se lava con una solución de urea 3 M en tampón, se disuelve en una solución de cloruro de guanidina en tampón, se trata con ultrasonidos, se centrifuga, sulfitolisis oxidativa, diálisis frente a urea 8 M, renaturalización y cromatografía final de dos etapas en CM- 52 celulosa y Sephadex G-50 (RU 2054041). Las desventajas de este método son su productividad relativamente baja de las etapas principales del proceso de aislamiento y purificación. Esto se aplica especialmente al tratamiento ultrasónico del producto, la diálisis y la sulfitolisis oxidativa, lo que provoca inestabilidad en la liberación de interferón, así como la imposibilidad de utilizar este método para producción industrial interferón.
Como análogo más cercano (prototipo) puede estar indicado un método para obtener interferón leucocitario humano, que consiste en cultivar una cepa recombinante de E. coli, congelar la biomasa resultante a una temperatura no superior a -70°C, descongelarla y destruir las células de los microorganismos. con lisozima, eliminación de ADN y ARN mediante introducción en el lisado de ADNasa y purificación de la forma insoluble aislada de interferón mediante lavado con una solución tampón con detergentes, disolución del precipitado de interferón en una solución de clorhidrato de guanidina, renaturalización y purificación iónica en un solo paso cromatografía de intercambio. Como productor se utiliza la cepa de E. coli SS5 obtenida utilizando el plásmido recombinante pSS5 que contiene tres promotores: P lac , P t7 y P trp, y como productor el gen del interferón alfa con sustituciones de nucleótidos introducidas.
La expresión de interferón por la cepa SS5 de E. coli que contiene este plásmido está controlada por tres promotores: Plac, Pt7 y Ptrp. El nivel de expresión de interferón es de aproximadamente 800 mg por 1 litro de suspensión celular (RU 2165455).
La desventaja de este método es la baja eficiencia tecnológica del uso de la destrucción enzimática de células, ADN y ARN del microorganismo y la purificación cromatográfica en un solo paso del interferón. Esto provoca inestabilidad en el proceso de liberación de interferón, conduce a una disminución de su calidad y limita la posibilidad de utilizar el esquema anterior para la producción industrial de interferón. Las desventajas de este plásmido y de la cepa basada en él son el uso en el plásmido de un fuerte promotor no regulado del fago T7 en la cepa BL21 (DE3) de E. coli, en la que el gen de la ARN polimerasa T7 se encuentra debajo del promotor de el operón lac y que siempre está “fluyendo”. En consecuencia, la síntesis de interferón se produce continuamente en la célula, lo que conduce a la disociación del plásmido y a una disminución de la viabilidad de las células de la cepa y, como resultado, a una disminución de la producción de interferón.
El objetivo de esta invención es construir una cepa productora industrial recombinante de E. coli utilizando un nuevo ADN plasmídico recombinante, que tenga un alto nivel de biosíntesis de interferón, y desarrollar una tecnología industrial efectiva para producir una sustancia de interferón para uso médico, correspondiente en calidad a la "Farmacopea Europea" para la sustancia interferón alfa-2b.
Este problema se resolvió mediante la creación del ADN plasmídico recombinante pSX50 y la cepa de Escherichia coli SX50, depositada en la Colección de Cepas Industriales de toda Rusia del Instituto Estatal de Investigación de Genética de la Empresa Unitaria del Estado Federal, número VKPM B-8550.
así como un método para producir interferón alfa-2b recombinante, basado en el uso de una cepa recombinante de E. coli SX50 y que implica su cultivo profundo en un medio nutritivo con un contenido reducido de triptófano con la adición continua de sustratos nutritivos en el proceso. de biosíntesis, destrucción mecánica de células de microorganismos a alta presión, disolución de proteínas agregadas en una solución concentrada de clorhidrato de guanidina, seguida de renaturalización del interferón en soluciones tampón fisiológicas en presencia de agentes caotrópicos y purificación cromatográfica en tres etapas del interferón en resinas como como Chelating Sepharose Fast Flow, inmovilizado con iones Cu+2, cromatografía de intercambio iónico sobre resinas de intercambio iónico como CM Sepharose Fast Flow y cromatografía de filtración en gel sobre resinas como Superdex 75.
Según la invención, se propone un nuevo ADN plasmídico multicopia recombinante pSX50, que codifica la síntesis del interferón alfa-2b de leucocitos humanos, cuya expresión está bajo el control de promotores de lactosa y triptófano y de un terminador de la transcripción. El plásmido pSX50 tiene 3218 pares de bases (pb) y se caracteriza por la presencia de los siguientes fragmentos:
La secuencia del nucleótido 1 al nucleótido (nt) 176 incluye un fragmento de ADN de 176 pb que contiene el promotor triptófano (P trp);
Secuencia de 177 nt. al 194 n. incluye un fragmento de ADN sintético de 18 pb que contiene la secuencia Shine Delgarno, responsable del inicio de la traducción;
Secuencia de 195 nt. al 695 n. incluye un fragmento de ADN de 501 pb de tamaño que contiene la secuencia del gen del interferón con las siguientes sustituciones de nucleótidos: en la posición 37, sustitución de A por C, en la posición 39, sustitución de G por T, en la posición 40, sustitución de A por C, en la posición 42, sustitución de G por T, en la posición 67, sustitución de A por C, en la posición 69, sustitución de G por T, en la posición 70, sustitución de A por C, en la posición 72, sustitución de A por T, en la posición 96, reemplazo de G por A, en la posición 100, reemplazo de A por C, en en la posición 102, reemplazo de A por T, en la posición 114, reemplazo de A por C, en la posición 120, reemplazo de C por G , en la posición 126, reemplazo de G por A, en la posición 129, reemplazo de G por A, en la posición 330, reemplazo de C por G, en la posición 339 reemplazando G por A, en la posición 342 reemplazando G por A, en la posición 487 reemplazando A por C, en la posición 489 reemplazando A por T, en la posición 495 reemplazando G por A;
Secuencia de 696 nt. según 713 n. incluye un fragmento de ADN sintético de 18 pb que contiene un polienlazador sintético;
Secuencia de 714 nt. al 1138 n. incluye un fragmento de ADN del plásmido pKK223-3 con 4129 nt. al 4553 n. 425 pb de tamaño, que contiene la secuencia del terminador de transcripción estricto rrnBT 1 T 2;
Secuencia desde 1139 a.C. al 1229 n. Incluye un fragmento de ADN del plásmido pUC19 con 2487 nt. al 2577 n. 91 pb de tamaño, que contiene el promotor del gen de la β-lactomasa (gen de resistencia a la ampicilina - Amp R);
Secuencia desde 1230 a.C. hasta 2045 norte. Incluye un fragmento de ADN del plásmido pUC4K con 720 nt. hasta 1535 d.C. 816 pb de tamaño, que contiene la región estructural del gen kan;
Secuencia desde 2046 a.c. al 3218 n. incluye un fragmento de ADN del plásmido pUC19 de 1625 a 453 nt. 1173 pb de tamaño, que contiene la secuencia responsable de la replicación del plásmido (ori) y el promotor lac (P lac).
Las figuras 1 a 5 muestran diagramas de diseño y mapa fisico Plásmidos pSH50.
La Figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos completa determinada para el plásmido pSX50.
La cepa SX50 de Escherichia coli se obtuvo transformando células BL21 de Escherichia coli con el plásmido pSX50 usando técnicas tradicionales. tecnología de ingeniería genética. La cepa E.Coli SX50 se caracteriza por las siguientes características.
Características culturales y morfológicas.
Las células son pequeñas, rectas, en forma de bastón engrosado, gramnegativas y no portadoras de esporas. Las células crecen bien en medios nutritivos simples. Cuando se cultiva en agar Difco, se forman colonias redondas, lisas, convexas, turbias, brillantes y grises con bordes lisos. Cuando se cultiva en medios líquidos (en medio mínimo con glucosa o en caldo LB), se forma una turbidez intensa y uniforme.
Características físicas y biológicas.
Aerobio. El rango de temperatura para el crecimiento es de 4 a 42 °C con un pH óptimo de 6,5 a 7,5.
Como fuente de nitrógeno se utilizan tanto sales minerales en forma de amonio como de nitrato, así como compuestos orgánicos en forma de aminoácidos, peptona, triptona, extracto de levadura, etc.
Como fuente de carbono se utilizan aminoácidos, glicerol y carbohidratos. Resistencia a los antibióticos. Las células presentan resistencia a la kanamicina (hasta 100 μg/ml).
La cepa 8X50 de Escherichia coli es productora de interferón.
Método, condiciones y composición del medio de almacenamiento de cepas.
En L-arape con la adición de kanamicina a una concentración de 20 mcg/ml en aceite, en L-caldo que contiene 15% de glicerol y antibióticos apropiados en ampollas a una temperatura de menos 70°C, en estado liofilizado en ampollas a una temperatura de más 4°C.
La cepa SX50 de Escherichia coli fue identificada según la Guía de Bergey (1974) como una cepa de la especie Escherichia coli.
Método para la producción industrial de interferón alfa-2b.
Una característica del método propuesto es el desarrollo de una tecnología que permite aislar el interferón de una forma insoluble que se acumula durante la fermentación, lo que permite simplificar significativamente esquema tecnológico proceso de aislamiento y aumentar el rendimiento del producto objetivo.
El método consiste en cultivar la cepa de Escherichia coli SH50 en un medio nutritivo, con la adición constante de sustratos nutritivos, preferiblemente glucosa y extracto de levadura, en el proceso de biosíntesis, preferiblemente con un contenido reducido de triptófano, destrucción mecánica de células de microorganismos a alta presión. 700-900 bar, disolución del interferón en solución tampón de clorhidrato de guanidina, renaturalización del interferón en soluciones tampón fisiológicas en presencia de agentes caotrópicos, seguida de purificación cromatográfica en tres etapas del interferón sobre resinas Chelating Sepharose tipo Fast Flow inmovilizadas con Cu+2 iones, cromatografía de intercambio iónico sobre resinas de intercambio iónico tipo CM Sepharose Fast Flow y cromatografía de filtración en gel sobre resinas como Superdex 75.
Las condiciones óptimas para llevar a cabo las distintas etapas de la producción de interferón son las siguientes:
La fermentación se realiza con la adición continua de sustratos durante todo el proceso, lo que determina alto nivel expresión de interferón;
La destrucción celular se lleva a cabo en un desintegrador tipo Gaulin a una presión de 900 bar;
La eliminación de componentes celulares solubles (ADN, ARN, proteínas, lipopolisacáridos, etc.) se realiza lavando la forma insoluble de interferón con soluciones tampón que contienen detergentes (Triton XI00, urea, etc.);
El precipitado resultante que contiene interferón se disuelve en una solución tampón de clorhidrato de guanidina 6 M;
La renaturalización del interferón se lleva a cabo en una solución tampón fisiológica que contiene agentes caotrópicos;
La purificación cromatográfica en tres etapas del interferón se realiza sobre Chelating Sepharose Fast Flow, inmovilizada con iones Cu+2, sobre resina de intercambio catiónico SM Sepharose Fast Flow y cromatografía de filtración en gel sobre una resina tipo Superdex 75;
Después de cada purificación cromatográfica se realiza una filtración esterilizante a través de filtros libres de pirógenos con un tamaño de poro de 0,22 micras.
El rendimiento de interferón como resultado del uso del método descrito es de aproximadamente 400 a 800 mg de interferón por 1 litro de medio de cultivo. La calidad del producto resultante cumple con los estándares y requisitos de la "Farmacopea Europea" para la sustancia interferón alfa-2b.
Las diferencias significativas entre el método propuesto y el prototipo son:
El uso de un diseño de cepa con mayor productividad, que permite obtener una mayor cantidad de interferón a partir de 1 litro de medio de cultivo durante la biosíntesis;
El uso de una destrucción mecánica eficaz de la biomasa celular, que permite obtener un extracto más puro de la forma insoluble de interferón durante más tiempo. poco tiempo, con menos pérdidas;
El uso de soluciones tampón fisiológicas durante la renaturalización en presencia de agentes caotrópicos permite aumentar el rendimiento de la forma de interferón correctamente renaturalizada;
La purificación cromatográfica en tres etapas del interferón permite obtener una sustancia de interferón con una pureza superior al 99% según electroforesis en condiciones reductoras y no reductoras al teñir geles con plata y más del 98% según RF HPLC y prácticamente libre de pirógenos. (Prueba LAL).
La esencia y las ventajas del grupo de invenciones reivindicadas se ilustran con los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1. Construcción del plásmido recombinante pSH50
El método para construir el plásmido pSX50 incluye los siguientes pasos:
Construcción del plásmido vector pSX10;
1. construcción del plásmido pSX3 (2641 pb)
2. construcción del plásmido vector pSX10 (2553 pb)
Construcción del plásmido recombinante pSX41 (3218 pb);
Construcción del plásmido recombinante pSX43 (3218 pb);
Construcción del plásmido recombinante pSX45 (3218 pb);
Construcción del plásmido recombinante pSX50 (3218 pb).
Construcción del plásmido vectorial pSX10.
El plásmido vector pSX10 es un vector pUC19 en el que la secuencia codificante del gen de la beta lactomasa, que proporciona resistencia a la ampicilina, se reemplaza por la secuencia codificante del gen kan y contiene el terminador de la transcripción del plásmido pKK223-3.
La construcción del plásmido vector pSS10 se realiza en dos etapas:
Preparación del plásmido pSX3 (2641 pb), que es el plásmido pUC19, en el que la región codificante del gen amp se reemplaza por la región codificante del gen kan;
Preparación del vector plásmido pSX10 (2553 pb), que es un plásmido pSX3 en el que detrás del sitio BamHI se inserta un fragmento de ADN que codifica el terminador de la transcripción rBT 1 T 2.
Se realizan cinco rondas de amplificación de ADN para obtener el plásmido pSX3. método de PCR(reacción en cadena de la polimerasa). Durante la primera ronda, utilizando ADN del plásmido pUC19 como plantilla, se amplifica un fragmento de ADN de 1828 pb de tamaño. (fragmento PU1-PU2) utilizando cebadores:
Esta y las reacciones de PCR posteriores se llevan a cabo en las siguientes condiciones: Tis-HCl 20 mM, pH 8,8, (NH 4) 2 SO 4 10 mM, KCl 10 mM, MgCl 2 2 tM, Triton X100 al 0,1%, 0,1 mg/ml. BSA, 0,2 mM de cada dNTP, 1,25 unidades. Pfu ADN polimerasa, 100 ng de ADN. El proceso de amplificación consta de las siguientes etapas: calentamiento a 95°C durante 5 min, 35 ciclos de PCR (30 s 95°C, 30 s 56°C, 2 min 72°C) e incubación durante 10 min a 72°C. Después de la amplificación (y después de amplificaciones posteriores), el fragmento de ADN se purifica mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1%. Durante la segunda y tercera ronda, utilizando ADN plasmídico pUC4K como plantilla, se amplifica un fragmento de ADN de 555 pb. (fragmento KM1-KM2) utilizando cebadores:
y amplificación de un fragmento de ADN de 258 pb. (KMZ-KM4) de cebadores
En la quinta ronda de PCR, los fragmentos (PU1-PU2) y (KM1-KM4) se combinan en las siguientes condiciones: calentamiento a 95 °C durante 5 min, 5 ciclos de PCR (30 s 95 °C, 30 s 56 °C , 10 min 72°C C) e incubación durante 10 min a 72°C. El ADN obtenido después de la última PCR se transforma directamente en células de la cepa DH5 de E. coli y se siembra en placas en medio LA que contiene 20 µg/ml de kanamicina. Después de una incubación durante 12 horas a 37°C, se eliminan los clones, se aísla el ADN plasmídico y se realiza un análisis de restricción. Como resultado, se obtiene el plásmido pSX3 con un tamaño de 2641 pb.
Para obtener el plásmido vector pSX10, se realizan tres rondas de amplificación del ADN mediante PCR. En la primera ronda, utilizando ADN del plásmido pSX3 como plantilla, se amplifica un fragmento de ADN de 2025 pb. (fragmento 10.1-10.2) utilizando cebadores:
Durante la segunda ronda, utilizando el ADN del plásmido pKK223-3 como plantilla, se amplifica un fragmento de ADN de 528 pb de tamaño. (fragmento KK1-KK2) utilizando cebadores:
En la tercera ronda de PCR, los fragmentos (10.1-10.2) y (KK1-KK2) se combinan en las siguientes condiciones: calentamiento a 95°C durante 5 minutos, 5 ciclos de PCR (30 segundos a 95°C, 30 segundos a 56°C , 10 min 72°C C) e incubación durante 10 min a 72°C. El ADN obtenido después de la última PCR se transforma directamente en células de la cepa DH5 de E. coli y se siembra en placas en medio LA que contiene 20 µg/ml de kanamicina. Después de una incubación durante 12 horas a 37°C, se eliminan los clones, se aísla el ADN plasmídico y se realiza un análisis de restricción. Como resultado, se obtiene el plásmido pSX10 con un tamaño de 2553 pb.
Construcción del plásmido recombinante pSX41.
El plásmido recombinante pSX41 es un fragmento de ADN Hind III - BamHI del plásmido vector pSX3 (2529 pb), un fragmento de ADN Hind III - EcoRI de 168 pb, que codifica el promotor del operón triptófano de E. coli (P trp), EcoRI-XbaI un sintético Fragmento de ADN de 20 pb de tamaño que codifica la secuencia SD (Shine-Delgarno) y un fragmento de ADN XbaI-BamHI de 501 pb de tamaño que codifica el gen del interferón alfa 2b humano.
Para obtener Hind III - fragmento de ADN BamHI del plásmido vector pSX3 (2529 pb), se trata el ADN del plásmido pSX3 con las enzimas de restricción HindIII y BamHI, seguido de purificación electroforética en gel de agarosa al 1%. El fragmento de ADN Hind III EcoRI de 168 pb que codifica el promotor del operón triptófano (P trp) se obtiene mediante PCR utilizando ADN total de E. coli como plantilla y los cebadores TRP1 y PRP2, seguido del tratamiento del fragmento amplificado con restricción Hindll y EcoRI. enzimas:
Para obtener EcoRI-Xbal, un fragmento sintético de ADN de 20 pb que codifica la secuencia SD (Shine-Delgarno), se sintetizan los siguientes oligonucleótidos complementarios:
El fragmento de ADN XbaI-BamIII de 501 pb de tamaño, que codifica el gen del interferón alfa 2b humano, se obtiene mediante PCR utilizando ADN humano total como plantilla y los cebadores IFN1 e IFN2, seguido del procesamiento del fragmento amplificado con las enzimas de restricción Xbal y BamIII:
A continuación, los fragmentos purificados electroforéticamente se combinan, se ligan con la enzima ligasa del fago T4, el ADN se transforma en células de la cepa DH5 de E. coli y se siembra en placas en medio LA que contiene 20 µg/ml de kanamicina. Después de una incubación durante 12 horas a 37°C, se eliminan los clones, se aísla el ADN plasmídico, se realiza un análisis de restricción y se determina la estructura primaria del ADN. Como resultado, se obtiene el plásmido pSX41 con un tamaño de 3218 pb. A continuación, se lleva a cabo una mutagénesis paso a paso del gen del interferón para aumentar el nivel de expresión del producto diana. La mutagénesis del gen del interferón consiste en sustituir tripletes que rara vez se encuentran en E. coli, que codifican los aminoácidos correspondientes, por tripletes que se encuentran a menudo en E. coli, que codifican los mismos aminoácidos. La mutagénesis del ADN del gen del interferón se lleva a cabo mediante el método de PCR.
Construcción del plásmido recombinante pSX43.
Para obtener el plásmido recombinante pSX43 se realiza una ronda de amplificación del ADN mediante PCR utilizando como molde el ADN del plásmido pSX41 y los cebadores IFN3 e IFN4:
La PCR se lleva a cabo en las siguientes condiciones: calentamiento a 95°C durante 5 min, 20 ciclos de PCR (30 s 95°C, 30 s 56°C, 10 min 72°C) e incubación durante 20 min a 72°C. El ADN obtenido después de la PCR se transforma directamente en células de la cepa DH5 de E. coli y se siembra en placas en medio LA que contiene 20 µg/ml de kanamicina. Después de una incubación durante 12 horas a 37°C, se eliminan los clones, se aísla el ADN plasmídico, se realiza un análisis de restricción y se determina la estructura primaria del ADN. Como resultado, se obtiene el plásmido pSX43 con un tamaño de 3218 pb.
Construcción del plásmido recombinante pSX45.
Para obtener el plásmido recombinante pSX45 se realiza una ronda de amplificación del ADN mediante PCR utilizando como molde el ADN del plásmido pSX43 y los cebadores IFN5 e IFN6:
La PCR se lleva a cabo en las siguientes condiciones: calentamiento a 95 °C durante 5 min, 20 ciclos de PCR (30 s 95 °C, 30 s 56 °C, 10 min 72 °C) e incubación durante 20 min a 72 °C. El ADN obtenido después de la PCR se transforma directamente en células de la cepa DH5 de E. coli y se siembra en placas en medio LA que contiene 20 µg/ml de kanamicina. Después de una incubación durante 12 horas a 37°C, se eliminan los clones, se aísla el ADN plasmídico, se realiza un análisis de restricción y se determina la estructura primaria del ADN. Como resultado, se obtiene el plásmido pSX45 con un tamaño de 3218 pb.
Construcción del plásmido recombinante pSX50.
Para obtener el plásmido recombinante pSX50 se realiza una ronda de amplificación del ADN mediante PCR utilizando como molde el ADN del plásmido pSX45 y los cebadores IFN7 e IFN8:
La PCR se lleva a cabo en las siguientes condiciones: calentamiento a 95 °C durante 5 min, 20 ciclos de PCR (30 s 95 °C, 30 s 56 °C, 10 min 72 °C) e incubación durante 20 min a 72 °C. El ADN obtenido después de la PCR se transforma directamente en células de la cepa DH5 de E. coli y se siembra en placas en medio LA que contiene 20 µg/ml de kanamicina. Después de una incubación durante 12 horas a 37°C, se eliminan los clones, se aísla el ADN plasmídico, se realiza un análisis de restricción y se determina la estructura primaria del ADN. Como resultado, se obtiene el plásmido pSX50 con un tamaño de 3218 pb.
Ejemplo 2. Preparación de la cepa E. coli SX50 - productora de interferón
La cepa de E. coli SX50 productora de interferón se obtiene transformando células de la cepa de E. coli BL21 con el plásmido recombinante pSX50. La cepa productora de interferón se cultiva en un fermentador de 30 litros hasta una densidad óptica de 25,0-30,0 p.u. en medio M9 que contenía 1% de hidrolizado ácido de caseína (Difco), 1% de glucosa, 40 µg/ml de kanamicina, a una temperatura de 38-39°C. Durante el proceso de fermentación se realiza una adición continua de sustrato nutritivo mediante un controlador gravimétrico.
Ejemplo 3. Método para aislar interferón de la cepa SX50 de E. coli
El interferón se obtuvo en 4 etapas:
Etapa 1. Cultivo de la cepa SX50 de E. coli.
Etapa 2. Aislamiento y purificación de la forma insoluble de interferón.
Etapa 3. Disolución y renaturalización del interferón.
Etapa 4. Purificación cromatográfica de interferón.
Etapa 1. Cultivo de la cepa SX50 de E. coli.
El inóculo cultivado de la cepa SX50 de E. coli en un volumen de 3 litros de medio rico LB durante 12 horas a 26°C se introduce asépticamente en un fermentador que contiene 27 litros de medio estéril que contiene M9, 1% de hidrolizado ácido de caseína, 1% de glucosa, MgCl2 1 mM, CaCl2 0,1 mM, kanamicina 40 mg/ml. El cultivo en fermentador se realiza a una temperatura de 38-39°C, manteniendo un pH de 7±0,15 mediante titulación automática con una solución de hidróxido de sodio al 40%. La concentración de oxígeno disuelto en el rango de (50±10)% de saturación se mantiene cambiando la velocidad del agitador de 100 a 800 rpm y el suministro de aire de 1 a 15 l/min. La concentración de sustratos, particularmente glucosa y extracto de levadura, se mide durante la fermentación y su concentración se mantiene variando la velocidad de alimentación de soluciones concentradas a través de bombas peristálticas usando un controlador gravimétrico.
La acumulación de interferón en forma insoluble se controla mediante microscopía de contraste de fases, electroforesis en gel de poliacrilamida al 15% (SDS-PAAG) y cromatografía de alta resolución de fase inversa (HPLC RF). La fermentación se detiene cuando se alcanza la densidad óptica máxima (~ 25-30 p.u.) y se detiene la síntesis de interferón. Al final de la fermentación, el líquido de cultivo se separa mediante centrifugación en un rotor de flujo a una velocidad de rotación de 5000-10000 rpm. La biomasa se envasa en bolsas de plastico y congelado a -70°C.
Etapa 2. Aislamiento y purificación de la forma insoluble de interferón.
Se suspenden 300-400 g de biomasa congelada de la cepa SX50 de E. coli en 3000 ml de tampón 1 (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, EDTA 10 mM, Triton X100 al 0,1%). La suspensión se pasa a través de un homogeneizador de flujo tipo Gaulin, se mantiene a una presión de 900 bar y se centrifuga en un rotor de flujo a 15.000 rpm. El precipitado resultante se lava en condiciones similares secuencialmente con los tampones 2 (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, urea 3 M) y el tampón 3 (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM) y finalmente el interferón. El precipitado se suspende en 200 ml de tampón 3. En este caso, el tiempo para aislar y purificar la forma insoluble de interferón no supera las 5 horas.
Etapa 3. Disolución y renaturalización del interferón.
A la suspensión de la forma insoluble de interferón obtenida en la etapa anterior, agregar clorhidrato de guanidina seco a una concentración de 6 M, agregar ditiotreitol a una concentración de 50 mM, Tris-HCl pH 8,0 a una concentración de 50 mM, NaCl a una concentración de 150 mM y Triton X100 a una concentración de 0,1%, se incuba a temperatura ambiente durante 2 horas. El material no disuelto se separa mediante filtración esterilizante a través de membranas con diámetros de poro de 0,22 micras.
La renaturalización del interferón se lleva a cabo diluyendo lentamente la solución resultante 100-200 veces con el tampón 4 (Tris-HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM, EDTA 0,1 mM). Después de lo cual la mezcla de renaturalización se incuba con agitación constante durante 12 a 15 horas a una temperatura de 4 a 8°C. Luego se añade sulfato de magnesio a una concentración de 1 mM y el material agregado se elimina mediante filtración esterilizante a través de un filtro de membrana con un diámetro de poro de 0,22 micrómetros.
Etapa 4. Purificación cromatográfica de interferón.
La purificación cromatográfica del interferón se realiza en tres etapas.
1. El interferón renaturalizado resultante se purifica primero usando cromatografía de afinidad en una resina Chelating Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) inmovilizada con iones Cu+2. Para ello, se aplica la solución de interferón a una columna con Cu+2 Chelating Sepharose Fast Flow y se eluye el interferón con tampón 0,1 M. ácido cítrico pH 2,2.
2. En la segunda etapa de purificación cromatográfica, la solución de interferón se aplica a una resina de intercambio catiónico tipo CM Sepharose Fast Flow (Amersham Biosciences) y el interferón se eluye con un gradiente de soluciones (NaCl 0,0-0,5 M) en una solución de 50 mM. Tampón Na(CH3COO), pH 5,5.
3. La purificación de la forma monomérica de interferón a partir de los restos de formas poliméricas de interferón se lleva a cabo en la tercera etapa de purificación de interferón mediante filtración en gel sobre resina Superdex 75 (Amersham Biosciences). La cromatografía se lleva a cabo en un tampón de Na(CH3COO) 50 mM, pH 5,0, que contiene NaCl 0,15 M.
El método descrito para aislar y purificar interferón permite obtener de 4 a 8 g de interferón altamente purificado en un ciclo de aislamiento durante 7 a 10 días a partir de la biomasa obtenida de 10 litros de medio de cultivo. La calidad del interferón resultante cumple plenamente con los requisitos de la "Farmacopea Europea" para la sustancia interferón alfa-2b, a saber:
La concentración de interferón no es inferior a 2×10 8 UI/ml;
La actividad específica del interferón no es inferior a 2,0×10 8 UI/mg;
La pureza electroforética del fármaco es de al menos el 99% en condiciones reductoras y no reductoras cuando se tiñen geles con plata;
El punto isoeléctrico del interferón aislado está en la región de pH 5,8-6,3;
El mapa peptídico del interferón aislado no es fundamentalmente diferente del mapa peptídico del interferón alfa 2b CRS estándar europeo;
Como se desprende de los ejemplos dados, el grupo de invenciones reivindicado permite obtener interferón alfa-2b con un alto rendimiento utilizando una tecnología relativamente simple y confiable.
FÓRMULA DE LA INVENCIÓN
1. ADN plasmídico recombinante pSX50, que codifica la síntesis del interferón alfa-2b humano recombinante, caracterizado porque tiene un tamaño de 3218 pares de bases (pb) y consta de los siguientes fragmentos: la secuencia de 1 a 176 nucleótidos (pb) incluye un fragmento de ADN de 176 pb de tamaño que contiene el promotor triptófano (P trp), secuencia de 177 a 194 nt. Incluye un fragmento de ADN sintético de 18 pb de tamaño que contiene la secuencia Shine Delgarno, responsable del inicio de la traducción, secuencia de 195 a 695 nt. incluye un fragmento de ADN de 501 pb que contiene el gen del interferón alfa-2b con sustituciones de nucleótidos: 37 (A>C), 39 (G>T), 40 (A>C), 42 (G>T), 67 (A> C), 69 (G>T), 70 (A>C), 72 (A>T), 96 (G>A), 100 (A>C), 102 (A>T), 114 (A >С ), 120 (C>G), 126 (G>A), 129 (G>A), 330 (C>G), 339 (G>A), 342 (G>A), 487 (A>C) , 489 (A>T), 495 (G>A), secuencia de 696 a 713 nt. Incluye un fragmento de ADN sintético de 18 pb que contiene un polienlazador sintético, secuencia de 714 a 1138 nt. incluye un fragmento de ADN del plásmido pKK223-3 de 4129 a 4553 nt. 425 pb de tamaño, que contiene la secuencia del terminador de transcripción estricto rrnBT 1 T 2, secuencia de 1139 a 1229 nt. incluye un fragmento de ADN del plásmido pUC19 de 2487 a 2577 nt. De 91 pb de tamaño, que contiene el promotor del gen de la -lactomasa (gen de resistencia a la ampicilina -Amp R), secuencia de 1230 a 2045 nt. Incluye un fragmento de ADN del plásmido pUC4K con 720 nt. hasta 1535 d.C. 816 pb de tamaño, que contiene la región estructural del gen kan, secuencia con 2046 pb. al 3218 n. incluye un fragmento de ADN del plásmido pUC19 de 1625 a 453 nt. 1173 pb de tamaño, que contiene la secuencia responsable de la replicación del plásmido (ori) y el promotor lac (P lac).
2. La cepa bacteriana Eschcerichia coli SX50 transformada con el plásmido recombinante según la reivindicación 1 es productora de interferón alfa-2b leucocitario humano recombinante.
3. Un método para obtener interferón alfa-2b humano, que incluye el cultivo de la cepa Escherichia coli SX5 según la reivindicación 2 en un medio nutritivo con la adición constante de sustratos nutritivos durante el proceso de biosíntesis, destrucción mecánica de células de microorganismos a una presión de 700- 900 bar, disolución del interferón en una solución tampón de clorhidrato de guanidina, renaturalización del interferón en soluciones tampón fisiológicas en presencia de agentes caotrópicos, purificación cromatográfica en tres etapas del interferón sobre resinas Chelating Sepharose tipo Fast Flow inmovilizadas con iones Cu+2, intercambio iónico cromatografía sobre resinas de intercambio iónico tipo CM Sepharose Fast Flow y cromatografía de filtración en gel sobre resinas tipo Superdex 75.
4. Método según la reivindicación 3, en el que el cultivo se realiza en un medio nutritivo con un contenido reducido de triptófano con la adición continua de sustratos nutritivos, preferiblemente glucosa y extracto de levadura.
5. El método según la reivindicación 3, en el que antes de disolver el interferón, se purifica eliminando componentes celulares solubles, incluidos ADN, ARN, proteínas, lipopolisacáridos, lavando con soluciones tampón que contienen detergentes como Triton XI 00, urea.
6. Método según la reivindicación 3, en el que después de cada purificación cromatográfica se realiza una filtración esterilizante a través de filtros con tamaños de poro de 0,22 micras.
En estudios clínicos realizados con amplia gama indicaciones y con un amplio rango de dosis (desde 6 millones de UI/m2 por semana - para la leucemia de células peludas; hasta 100 millones de UI/m2 por semana - para el melanoma), los eventos adversos más comunes fueron fiebre, fatiga, dolor de cabeza, mialgia. La fiebre y la fatiga desaparecieron dentro de las 72 horas posteriores a la interrupción del fármaco. Aunque la fiebre puede ser un síntoma del síndrome similar a la influenza que a menudo se presenta con el tratamiento con interferón, se debe realizar una evaluación para descartar otros. posibles razones fiebre persistente.
El siguiente perfil de seguridad se obtuvo de 4 ensayos clínicos en pacientes con hepatitis C crónica que recibieron Intron A como monoterapia o en combinación con ribavirina durante 1 año. Todos los pacientes recibieron 3 millones de UI de Intron A 3 veces por semana.
La Tabla 2 muestra los eventos adversos que ocurren con una frecuencia mayor o igual al 10% en pacientes no tratados previamente que recibieron Intron A (o Intron A en combinación con ribavirina) durante 1 año. En general, los eventos adversos observados fueron leves o moderados.
Tabla 2.
| Eventos adversos | Intrón A (n=806) | Intrón A + ribavirina (n=1010) |
| Reacciones locales | ||
| Reacciones inflamatorias en el lugar de la inyección | 9–16% | 6–17% |
| Otras reacciones en el lugar de la inyección | 5–8% | 3–36% |
| Reacciones generales | ||
| Dolor de cabeza | 51–64% | 48–64% |
| Fatiga | 42–79% | 43–68% |
| Escalofríos | 15–39% | 19–41% |
| Fiebre | 29–39% | 29–41% |
| Síndrome parecido a la gripe | 19–37% | 18–29% |
| Astenia | 9–30% | 9–30% |
| Pérdida de peso | 6–11% | 9–19% |
| Reacciones del tracto gastrointestinal. | ||
| Náuseas | 18–31% | 25–44% |
| Anorexia | 14–19% | 19–26% |
| Diarrea | 12–22% | 13–18% |
| Dolor de estómago | 9–17% | 9–14% |
| Vomitar | 3–10% | 6–10% |
| Reacciones del sistema musculoesquelético. | ||
| Mialgia | 41–61% | 30–62% |
| Artralgia | 25–31% | 21–29% |
| Dolor en huesos y músculos. | 15–20% | 11–20% |
| Reacciones del sistema nervioso central. | ||
| Depresión | 16–36% | 25–34% |
| Irritabilidad | 13–27% | 18–34% |
| Insomnio | 21–28% | 33–41% |
| Ansiedad | 8–12% | 8–16% |
| Capacidad deteriorada para concentrarse. | 8–14% | 9–21% |
| labilidad emocional | 8–14% | 5–11% |
| Reacciones de la piel | ||
| Alopecia | 22–31% | 26–32% |
| Picor | 6–9% | 18–37% |
| Piel seca | 5–8% | 5–7% |
| Erupción | 10–21% | 15–24% |
| Reacciones desde el exterior sistema respiratorio | ||
| Faringitis | 3–7% | 7–13% |
| Tos | 3–7% | 8–11% |
| disnea | 2–9% | 10–22% |
| Otros | ||
| Mareo | 8–18% | 10–22% |
| infección viral | 0–7% | 3–10% |
Eventos adversos observados en pacientes con hepatitis viral C, corresponden a los que se observaron al utilizar Intron A para otras indicaciones con algún aumento dosis-dependiente en la frecuencia de desarrollo.
Cuando se utiliza Intron A para otras indicaciones (en estudios clínicos y no clínicos) rara vez (|1/10000,< 1/1000) или очень редко (.
Del cuerpo en su conjunto. Muy raramente - hinchazón de la cara.
Condiciones asténicas (astenia, malestar y fatiga), deshidratación, palpitaciones, psoriasis, infecciones por hongos y infección bacteriana(incluida la sepsis).
Del sistema inmunológico. Muy raramente: sarcoidosis o su exacerbación.
Se han informado varios trastornos autoinmunes y mediados por el sistema inmunológico con el uso de interferones alfa, incluida la púrpura trombocitopénica idiopática o trombótica, la artritis reumatoide, el lupus eritematoso sistémico, la vasculitis y el síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada.
Se han reportado casos reacciones agudas hipersensibilidad, incluyendo urticaria, angioedema y anafilaxia.
Desde el exterior sistema cardiovascular: raramente - arritmia (generalmente ocurre en pacientes con antecedentes de enfermedades previas del sistema cardiovascular o con terapia cardiotóxica previa), miocardiopatía reversible transitoria (observada en pacientes sin antecedentes de sobrecarga del sistema cardiovascular); muy raramente: hipotensión arterial, isquemia de miocardio e infarto de miocardio.
Del sistema nervioso central y periférico. sistema nervioso. Rara vez - tendencias suicidas; muy raramente - comportamiento agresivo, incluidos los dirigidos a otras personas, intentos de suicidio, suicidio, psicosis (incluidas alucinaciones), alteración de la conciencia, neuropatía, polineuropatía, encefalopatía, isquemia cerebrovascular, hemorragia cerebrovascular, neuropatía periférica, convulsiones.
Desde el lado del órgano auditivo. Muy raramente: pérdida de audición.
Del sistema endocrino. Muy raramente: diabetes mellitus, empeoramiento de la existente. diabetes mellitus.
Del tracto gastrointestinal. Muy raramente: pancreatitis, aumento del apetito, encías sangrantes, colitis.
Del hígado y conductos biliares. Muy raramente: hepatotoxicidad (incluido fatal).
Cambios en los dientes y periodonto. En pacientes que recibieron terapia combinada con Nitron A y ribavirina, hubo cambios patologicos de los dientes y periodonto. Boca seca durante mucho tiempo. terapia combinada ribavirina e Intron A pueden contribuir al daño de los dientes y la mucosa oral. Los pacientes deben cepillarse los dientes dos veces al día y realizarse controles dentales periódicos. Además, algunos pacientes pueden experimentar vómitos.
Del lado del metabolismo. Rara vez: hiperglucemia, hipertrigliceridemia.
Del sistema musculoesquelético. En raras ocasiones: rabdomiolisis (a veces grave), calambres en las piernas, dolor de espalda, miositis.
Del lado de la piel. Muy raramente: eritema multiforme, síndrome de Stevens-Johnson, necrólisis epidérmica tóxica, necrosis en el lugar de la inyección.
Del sistema respiratorio. Rara vez - neumonía; muy raramente: infiltrados pulmonares, neumonitis.
Del sistema urinario. Muy raramente - síndrome nefrótico, disfunción renal, insuficiencia renal.
Del sistema hematopoyético. Muy raramente, cuando se usa Intron A como monoterapia o en combinación con ribavirina, se observaron anemia aplásica y aplasia roja completa. médula ósea.
Desde el lado del órgano de la visión. En raras ocasiones: hemorragia retiniana, cambios focales en el fondo de ojo, trombosis de las arterias y venas de la retina, disminución de la agudeza visual, disminución del campo visual, neuritis. nervio óptico, papiledema.
Clínicamente cambios significativos indicadores de laboratorio.(observado con mayor frecuencia cuando el medicamento se prescribe en dosis de más de 10 millones de UI/día): disminución del número de granulocitos y leucocitos, disminución de los niveles de hemoglobina y recuento de plaquetas, aumento de la actividad de la fosfatasa alcalina, LDH , el nivel de creatinina y nitrógeno ureico sérico. Un aumento en la actividad de ALT y AST en el plasma sanguíneo se considera patológico cuando se usa para todas las indicaciones excepto para la hepatitis, así como en algunos pacientes con hepatitis B crónica en ausencia de ADN del VHB.
Si se desarrollan eventos adversos durante el uso de Intron A para cualquier indicación, se debe reducir la dosis o interrumpir temporalmente el tratamiento hasta que se eliminen los eventos adversos. Si se desarrolla intolerancia persistente o recurrente a un régimen de dosificación adecuado o si la enfermedad progresa, se debe suspender el tratamiento con Intron A.
Con la administración parenteral del fármaco, es posible que se produzcan escalofríos, fiebre, fatiga, dolor de cabeza, malestar general y síndrome similar a la gripe. Estos efectos secundarios se alivian parcialmente con paracetamol o indometacina. En aplicación local
del medicamento en la membrana mucosa del ojo, es posible que se produzca infección conjuntival, hiperemia de la membrana mucosa del ojo, folículos individuales e hinchazón de la conjuntiva del fondo de saco inferior. Cuando se usa el medicamento, es posible que se produzcan desviaciones de los parámetros de laboratorio normales, que se manifiestan por leucopenia, linfopenia, trombocitopenia, niveles elevados de alanina aminotransferasa y fosfatasa alcalina. Para la detección oportuna de estas desviaciones durante la terapia, general pruebas clínicas
Los análisis de sangre deben repetirse cada 2 semanas y los análisis bioquímicos cada 4 semanas. En general, estos cambios suelen ser menores, asintomáticos y reversibles.
Efectos secundarios del interferón beta.Leucopenia. Trombocitopenia. Anemia. Hemólisis autoinmune. Anorexia. Diarrea. Aumento de los niveles de transaminasas. Hipotensión. Taquicardia. Disnea. Mareo. Trastornos del sueño. Dolor en huesos y articulaciones. Fiebre. Debilidad. Mialgia. Dolores de cabeza. Náuseas. Vomitar; con uso prolongado - caída del cabello. Esta sección presenta instrucciones de uso de interferones alfa 2b y alfa 2a
En 1943, V. y J. Heile descubrieron el llamado fenómeno de interferencia. La idea inicial del interferón era ésta: un factor que impide la reproducción de virus. En 1957, el científico inglés Alik Isaacs y el investigador suizo Jean Lindenman aislaron este factor, lo describieron claramente y lo llamaron interferón.
El interferón (IFN) es una molécula de proteína que se produce en el cuerpo humano. El aparato genético humano codifica una "receta" para su síntesis (gen del interferón). El interferón es una de las citocinas, moléculas de señalización que desempeñan papel importante en el funcionamiento del sistema inmunológico.
A lo largo del medio siglo transcurrido desde el descubrimiento del IFN, se han estudiado decenas de propiedades de esta proteína. Desde el punto de vista médico, las principales son las funciones antivirales y antitumorales.
El cuerpo humano produce alrededor de 20 tipos (una familia completa) de interferones. El IFN se divide en dos tipos: I y II.
Los IFN de tipo I (alfa, beta, omega, theta) son producidos y secretados por la mayoría de las células del cuerpo en respuesta a la acción de virus y algunos otros agentes. El IFN tipo II incluye el interferón gamma, que es producido por células del sistema inmunológico en respuesta a la acción de agentes extraños.
Inicialmente, los preparados de interferón se obtenían únicamente de células sanguíneas de donantes; Se llamaban así: interferones leucocitarios. En 1980 comenzó la era de los interferones recombinantes o genéticamente modificados. La producción de medicamentos recombinantes se ha vuelto significativamente más barata que la producción de medicamentos similares a partir de sangre de donantes humanos u otras materias primas biológicas; no utilizados en su producción sangre de donante que puede servir como fuente de infección. Fármacos recombinantes no contienen impurezas extrañas y por lo tanto tienen menos efectos secundarios. Su potencial curativo es mayor que el de fármacos naturales similares.
Para el tratamiento de enfermedades virales, en particular la hepatitis C, se utiliza principalmente el interferón alfa (IFN-α). Hay interferones alfa 2b y alfa 2a “simples” (“de corta duración”) y pegilados (peginterferón alfa-2a y peginterferón alfa-2b). Los interferones "simples" prácticamente no se utilizan en la UE y los EE. UU., pero en nuestro país, debido a su bajo precio comparativo, se utilizan con bastante frecuencia. En el tratamiento de la hepatitis C se utilizan ambas formas de IFN-α "corto": interferón alfa-2a e interferón alfa-2b (que se diferencian en un aminoácido). Las inyecciones de interferones simples generalmente se realizan en días alternos (con peginterferones, una vez por semana). La eficacia del tratamiento con IFN de vida corta cuando se administra en días alternos es menor que con peginterferones. Algunos expertos recomiendan inyecciones diarias de IFN "simple", ya que la eficacia de AVT es ligeramente mayor.
La gama de IFN “cortos” es bastante amplia. estan liberados por diferentes fabricantes bajo diferentes nombres: Roferon-A, Intron A, Laferon, Reaferon-EC, Realdiron, Eberon, Interal, Altevir, Alfarona y otros.
Los más estudiados (y por tanto más caros) son Roferon-A e Intron-A. La eficacia del tratamiento con estos IFN en combinación con ribavirina, según el genotipo del virus y otros factores, oscila entre el 30% y el 60%. Lista de principales marcas En la tabla se dan los fabricantes de interferones simples y sus descripciones.
Todos los interferones deben almacenarse en refrigeración (de +2 a +8 grados Celsius). No se deben calentar ni congelar. No agite ni exponga el medicamento a la luz directa. rayos de sol. Es necesario transportar las drogas en contenedores especiales.
sustancia-solución: paquetes Reg. N°: LSR-007009/08
Grupo clínico y farmacológico:
Forma de liberación, composición y embalaje.
sustancia -solución.
botellas (1) - envases de cartón.
Descripción de los componentes activos del fármaco ". Interferón alfa-2b»
Acción farmacológica
Interferón. Es una proteína recombinante altamente purificada con un peso molecular de 19.300 daltons. Obtenido a partir de un clon de Escherichia coli mediante hibridación de plásmidos bacterianos con el gen de leucocitos humanos que codifica la síntesis de interferón. A diferencia del interferón, el alfa-2a tiene arginina en la posición 23.
Tiene un efecto antiviral, que se debe a la interacción con receptores de membrana específicos y a la inducción de la síntesis de ARN y, en última instancia, de proteínas. Estos últimos, a su vez, impiden la reproducción normal del virus o su liberación.
Tiene actividad inmunomoduladora, que se asocia con la activación de la fagocitosis, estimulación de la formación de anticuerpos y linfocinas.
Tiene un efecto antiproliferativo sobre las células tumorales.
Indicaciones
hepatitis B aguda, hepatitis crónica B, hepatitis crónica C.
Leucemia de células pilosas, leucemia mieloide crónica, carcinoma de células renales, sarcoma de Kaposi por SIDA, linfoma cutáneo de células T (micosis fungoide y síndrome de Sézary), melanoma maligno.
Régimen de dosificación
Administrado por vía intravenosa o subcutánea. La dosis y el régimen de tratamiento se establecen individualmente, según las indicaciones.
Efecto secundario
Síntomas parecidos a los de la gripe: a menudo: fiebre, escalofríos, dolor en los huesos, articulaciones, ojos, mialgia, dolor de cabeza, aumento de la sudoración, mareos.
Desde el exterior sistema digestivo: posible pérdida de apetito, náuseas, vómitos, diarrea, estreñimiento, alteración sensaciones gustativas, sequedad de boca, pérdida de peso, dolor abdominal leve, cambios leves en las pruebas de función hepática (normalmente se normalizan después del tratamiento).
Del sistema nervioso central y del sistema nervioso periférico: raramente: mareos, deterioro de la actividad mental, alteraciones del sueño, deterioro de la memoria, ansiedad, nerviosismo, agresividad, euforia, depresión (después tratamiento a largo plazo), parestesia, neuropatía, temblor; en algunos casos - tendencias suicidas, somnolencia.
Del sistema cardiovascular: posible - taquicardia (con fiebre), hipotensión arterial o hipertensión, arritmia; en algunos casos, trastornos del sistema cardiovascular, enfermedad de las arterias coronarias, infarto de miocardio.
Del sistema respiratorio: raramente - dolor en el pecho, tos, ligera dificultad para respirar; en algunos casos - neumonía, edema pulmonar.
Del sistema hematopoyético: posible leucopenia leve, trombocitopenia, granulocitopenia.
Reacciones dermatológicas: posible picazón, alopecia reversible.
Otros: raramente - rigidez muscular; en casos aislados, anticuerpos contra interferones naturales o recombinantes.
Contraindicaciones
Pesado enfermedades cardiovasculares, cirrosis hepática descompensada, depresión grave, psicosis, adicción al alcohol o drogas, mayor sensibilidad al interferón alfa-2b.
Embarazo y lactancia
El uso durante el embarazo sólo es posible si el beneficio esperado del tratamiento para la madre supera el riesgo potencial para el feto.
No se sabe si el interferón alfa-2b es secretado por leche materna. Si es necesario utilizarlo durante la lactancia, se debe decidir la cuestión de interrumpir la lactancia.
Las mujeres en edad fértil deben utilizar métodos anticonceptivos fiables durante el tratamiento.
Uso para la disfunción hepática.
Contraindicado en cirrosis hepática descompensada. Usar con precaución en pacientes con insuficiencia hepática.
Uso para insuficiencia renal
Usar con precaución en pacientes con insuficiencia renal.
Instrucciones especiales
Utilizar con precaución en pacientes con insuficiencia renal, hepática, hematopoyesis de la médula ósea o con tendencia a intentos de suicidio.
En pacientes con enfermedades del sistema cardiovascular, es posible la arritmia. Si la arritmia no disminuye o aumenta, la dosis se debe reducir 2 veces o se debe suspender el tratamiento.
Durante el período de tratamiento, es necesario controlar el estado neurológico y mental.
En casos de supresión grave de la hematopoyesis de la médula ósea, es necesario un examen regular de la composición de la sangre periférica.
El interferón alfa-2b tiene un efecto estimulante sobre el sistema inmunológico y debe usarse con precaución en pacientes propensos a enfermedades autoinmunes debido a un mayor riesgo de reacciones autoinmunes.
Interacciones medicamentosas
Interacciones medicamentosas
El interferón alfa-2b inhibe el metabolismo de la teofilina y reduce su eliminación.
