Dom Zapalenie miazgi Diagnostyczna reakcja aglutynacji. Reakcja aglutynacji

Zapalenie miazgi

Diagnostyczna reakcja aglutynacji. Reakcja aglutynacji

Reakcja aglutynacji opiera się na specyficznym oddziaływaniu przeciwciał (aglutynin) z całymi komórkami drobnoustrojów lub innymi komórkami. W wyniku tego oddziaływania tworzą się cząstki aglomeratu, które wytrącają się (aglutynują). W reakcji aglutynacji mogą brać udział bakterie, pierwotniaki, grzyby, drożdże, riketsje, erytrocyty i inne komórki, zarówno żywe, jak i zabite. Reakcja przebiega w dwóch fazach: pierwsza to specyficzne połączenie antygenu i przeciwciała, druga jest nieswoista, tj. utworzenie widocznego aglutynianu. Wytrącanie aglutynatu następuje w obecności elektrolitów, takich jak chlorek sodu. Mikroorganizmy w aglutynacie pozostają żywe, ale tracą swoją ruchliwość.

Reakcja aglutynacji jest szeroko stosowana w diagnostyce serologicznej chorób zakaźnych i określaniu struktury antygenowej izolowanych drobnoustrojów. Do określenia struktury antygenowej patogenu wyizolowanego z organizmu pacjenta lub nosiciela wykorzystuje się swoistą surowicę odpornościową, otrzymywaną w wyniku immunizacji zwierząt (królika, osła, owcy) określonymi mikroorganizmami. Identyfikację drobnoustroju przeprowadza się w reakcji aglutynacji na szkle z surowicami zaadsorbowanymi lub monoreceptorowymi lub w probówkach ze specyficznymi surowicami aglutynującymi. Surowice zaadsorbowane zawierają przeciwciała tylko dla antygenów specyficznych dla danego drobnoustroju, a surowice monoreceptorowe zawierają przeciwciała tylko dla jednego specyficznego antygenu patogenu.

Surowice gatunkowe zawierają przeciwciała przeciwko wszystkim antygenom danego drobnoustroju.

Do której należy wyizolowana kultura mikroorganizmu ten gatunek określone przez aglutynację ze znaną surowicą do miana przeciwciał wskazanego na etykiecie ampułki surowicy. Za miano przeciwciał w surowicy uważa się jej ostatnie rozcieńczenie, w którym nadal obserwuje się aglutynację hodowli drobnoustrojów użytych do immunizacji zwierzęcia. W reakcji aglutynacji szkła stosuje się zwykle surowice adsorbowane i monoreceptorowe w postaci nierozcieńczonej.

Przy oznaczaniu obecności przeciwciał w surowicy krwi pacjenta rozcieńcza się ją izotonicznym roztworem chlorku sodu, zaczynając od rozcieńczenia 1:50 do 1:800 lub więcej. Do każdego rozcieńczenia dodaje się zawiesinę żywych lub zabitych drobnoustrojów. Preparaty zawierające drobnoustroje zabite przez ciepło lub formaldehyd nazywane są diagnostykami. Diagnostyki uzyskane w wyniku ogrzewania kultur mikroorganizmów zawierają wyłącznie antygeny somatyczne. Stosując wyłącznie formaldehyd, drobnoustroje zachowują swoje antygeny wiciowe.

W obecności przeciwciał we krwi pacjenta, pobrany w reakcji materiał diagnostyczny skleja się i na dwóch probówkach tworzy się osad (aglutynat). W tym przypadku wyniki reakcji aglutynacji uważa się za pozytywne. W probówce kontrolnej, do której dodaje się izotoniczny roztwór chlorku sodu i narzędzie diagnostyczne, zawiesina drobnoustrojów powinna być jednorodna (ujemna reakcja aglutynacji).

Skutki reakcji aglutynacji w niektórych chorobach, np. leptospirozie, uwzględnia się jedynie mikroskopowo w ciemnym polu widzenia mikroskopu (mikroaglutynacja). Aby postawić diagnozę serologiczną choroby, należy wziąć pod uwagę choroba diagnostyczna. Zwykle odpowiada to rozcieńczeniu surowicy 1:100 lub 1:200.

Przeciwciała w surowicy krwi pacjenta można wykryć za pomocą reakcji aglutynacji w przypadku duru brzusznego i duru brzusznego (reakcja Vidala), brucelozy (reakcja Wrighta), tularemii itp.
Reakcja Castellaniego. Dla niektórych choroba zakaźna lub immunizacji drobnoustrojami zawierającymi antygeny grupowe, w surowicy krwi oprócz przeciwciał specyficznych dla danego typu pojawiają się także przeciwciała grupowe. W takim przypadku pokrewne gatunki bakterii ulegną aglutynacji z uzyskaną surowicą.

Castellani zaproponował metodę adsorpcji przeciwciał grupowych z surowic odpornościowych, polegającą na ich usuwaniu za pomocą mikroorganizmów spokrewnionych gatunków, które posiadają antygeny grupowe, ale brakuje im specyficznych. Hodowla takich drobnoustrojów dodana do surowicy adsorbuje przeciwciała z grup nieswoistych, a po usunięciu kompleksu antygen-przeciwciało poprzez odwirowanie w surowicy pozostają jedynie swoiste immunoglobuliny. Surowice przygotowane metodą Castellani mogą być stosowane w reakcji aglutynacji jako wysoce specyficzne.

Aglutynacja to sklejanie się bakterii w wyniku interakcji z nimi określonych AT. Do przeprowadzenia RA wymagane są trzy składniki: 1) AG (aglutynogen); 2) AT (aglutynina); 3) roztwór elektrolitu (izotoniczny roztwór chlorku sodu). W reakcji aglutynacji biorą udział wyłącznie antygeny korpuskularne (bakterie, czerwone krwinki, cząsteczki lateksu obciążone antygenem).

Reakcja aglutynacji na szkle. Za pomocą pipety umieścić kroplę na odtłuszczonym szkiełku. surowica diagnostyczna(rozcieńczenie surowicy 1:10 - 1:20). Za pomocą ezy bakteriologicznej z powierzchni skośnego agaru pobiera się czystą kulturę badanego drobnoustroju, przenosi się do kropli surowicy i miesza. Wynik reakcji bierze się pod uwagę gołym okiem po 3-5 minutach. Jeżeli reakcja jest pozytywna, w kropli surowicy zauważa się pojawienie się płatków (dużych lub małych), wyraźnie widocznych na ciemnym tle podczas wstrząśnięcia szkiełkiem. W przypadku negatywnej reakcji ciecz pozostaje jednolicie mętna.

Reakcja aglutynacji w probówkach. Do rzędu probówek dodaje się 1 ml roztworu fizjologicznego. Do pierwszej probówki dodaje się taką samą objętość badanej surowicy krwi. Przygotowuje się seryjne dwukrotne rozcieńczenia surowicy (miareczkowanie surowicy), po czym do każdej probówki dodaje się 2 krople zawiesiny inaktywowanych bakterii (diagnosticum). Probówki umieszcza się w termostacie w temperaturze 37°C na 2 godziny. Reakcja przebiega z utworzeniem drobnych płatków, niewidocznych gołym okiem, dlatego też wyniki rejestruje się pod niewielkim powiększeniem w specjalnym urządzeniu – aglutynoskopie. Intensywność aglutynacji uwzględnia się w systemie „cztery plus”: aglutynacja całkowita – 4+, aglutynacja częściowa – 3+ lub 2+, wynik wątpliwy – +. Za miano przeciwciał w surowicy testowej przyjmuje się ostatnie rozcieńczenie, w którym obserwuje się aglutynację 2+.

Reakcję aglutynacji w probówkach (rozległa reakcja aglutynacji) przeprowadza się w celu określenia miana przeciwciał przeciwko czynnikom wywołującym dur brzuszny i dur brzuszny (reakcja Vidala), brucelozę (reakcja Wrighta) i tyfus (reakcja Weigla).

Aglutynacja (od łac. aglutinatio – klejenie) to sklejanie (połączenie) cząstek korpuskularnych zawierających antygen (całych komórek, cząstek lateksu itp.) z cząsteczkami specyficznych przeciwciał w obecności elektrolitów, co kończy się utworzeniem płatków lub osadu (aglutynacja) widoczna gołym okiem. Charakter osadu zależy od charakteru antygenu: bakterie wiciowe wytwarzają gruboziarnisty kłaczkowaty osad, bakterie wiciowe i nietorebkowe wytwarzają drobnoziarnisty osad, a bakterie otoczkowe wytwarzają włóknisty osad. Rozróżnia się aglutynację bezpośrednią, w której własne antygeny bakterii lub dowolnej innej komórki, takiej jak erytrocyty, bezpośrednio uczestniczą w interakcji ze specyficznymi przeciwciałami; oraz pośrednie lub pasywne, w którym komórki bakteryjne, erytrocyty lub cząstki lateksu nie są nośnikami własnymi, ale obcych antygenów (lub przeciwciał) zaadsorbowanych na nich w celu identyfikacji specyficznych dla nich przeciwciał (lub antygenów). W reakcji aglutynacji biorą udział głównie przeciwciała należące do klas IgG i IgM. Zachodzi on w dwóch fazach: w pierwszej następuje specyficzne oddziaływanie centrum aktywnego przeciwciał z determinantą antygenu; etap ten może zachodzić przy braku elektrolitów i nie towarzyszy mu widoczne zmiany reagujący układ. W drugim etapie - tworzeniu aglutynatu - konieczna jest obecność elektrolitów, które redukują ładunek elektryczny kompleksy antygen + przeciwciało i przyspieszają proces ich sklejania. Faza ta kończy się utworzeniem aglutynatu.

Reakcje aglutynacji przeprowadza się na płytkach szklanych, gładkich kartonach lub w sterylnych probówkach do aglutynacji. Reakcje aglutynacji (bezpośredniej i pasywnej) na szkle są zwykle stosowane jako metoda przyspieszona wykrycie specyficznych przeciwciał w surowicy pacjenta (np. przy brucelozie) lub serologiczna identyfikacja patogenu. W tym drugim przypadku stosuje się zazwyczaj dobrze oczyszczoną (adsorbowaną) surowicę diagnostyczną zawierającą wyłącznie przeciwciała monoreceptorowe lub ich zestaw przeciwko różnym antygenom. Niewątpliwą zaletą reakcji aglutynacji na szkle jest prostota jej przeprowadzenia oraz fakt, że zajmuje ona kilka minut, a nawet sekund, ponieważ oba składniki stosuje się w postaci skoncentrowanej. Ma ona jednak jedynie wartość jakościową i jest mniej czuła niż probówka. Rozległa reakcja aglutynacji w probówkach daje dokładniejsze wyniki, gdyż pozwala określić ilościową zawartość przeciwciał w surowicy (ustalić jej miano) i w razie potrzeby zarejestrować fakt wzrostu miana przeciwciał, co ma wartość diagnostyczną . Aby przygotować reakcję, do roztworu dodaje się surowicę rozcieńczoną w określony sposób 0,85% roztworem NaCl i równą objętość (zwykle 0,5 ml) zawiesiny standardowego testu diagnostycznego (lub hodowli testowej) zawierającej 1 miliard bakterii w 1 ml. probówki aglutynacyjne. Wyniki reakcji aglutynacji rejestruje się najpierw po 2 godzinach inkubacji probówek w temperaturze 37°C, a na koniec po 20-24 godzinach według dwóch kryteriów: obecności i wielkości osadu oraz stopnia przezroczystości cieczy supernatantu. Ocena przeprowadzana jest w systemie czterokrzyżowym. Reakcji koniecznie towarzyszy kontrola surowicy i antygenu. W przypadku, gdy w celu serologicznej identyfikacji patogenu przeprowadza się szczegółową reakcję aglutynacji w probówce, ma ona wartość diagnostyczną, jeśli odczyn zostanie oceniony jako pozytywny po rozcieńczeniu surowicy diagnostycznej do co najmniej połowy jej miana.

Należy wziąć pod uwagę, że podczas mieszania roztworów homologicznych antygenów i przeciwciał nie zawsze obserwuje się widoczne objawy reakcji aglutynacji. Osad tworzy się tylko przy pewnych optymalnych stosunkach obu składników reakcji. Poza tymi granicami, przy znacznym nadmiarze antygenu lub przeciwciał, nie obserwuje się żadnej reakcji. Zjawisko to nazywane jest „zjawiskiem prozonu”. Obserwuje się to zarówno w reakcji aglutynacji, jak i w reakcji strącania. Pojawienie się prozonu w reakcjach immunologicznych tłumaczy się faktem, że zaangażowane w nie antygeny są z reguły wielodeterminantowe, a cząsteczki Przeciwciała IgG mają dwa aktywne ośrodki. Przy nadmiarze przeciwciał powierzchnia każdej cząsteczki antygenu pokrywa się cząsteczkami przeciwciał tak, że nie pozostają wolne grupy determinacyjne, przez co drugie, niezwiązane centrum aktywne przeciwciał nie może oddziaływać z inną cząsteczką antygenu i wiązać je ze sobą. Tworzenie widocznego aglutynatu lub osadu jest również hamowane w przypadku nadmiaru antygenu, gdy nie pozostaje ani jedno wolne centrum aktywne przeciwciał, w związku z czym kompleksy antygen + przeciwciało + antygen nie mogą się już powiększać.

Opcje przyspieszonych reakcji aglutynacji. Reakcja bierna hemaglutynacja i jego warianty

Klasyczna reakcja aglutynacji polega na wykorzystaniu antygenów korpuskularnych. Jednakże w grę mogą wchodzić także rozpuszczalne antygeny. Aby było to możliwe, takie antygeny są adsorbowane na cząstkach obojętnych immunologicznie. Jako nośnik można zastosować cząstki lateksu lub bentonitu, ale obecnie najczęściej wykorzystuje się erytrocyty zwierzęce lub ludzkie, poprawiając ich właściwości adsorbcyjne poprzez traktowanie ich roztworami garbników, formaliny lub benzydyny. Czerwone krwinki, które zaadsorbowały na sobie antygen, nazywane są uczulonymi na ten antygen i reakcja immunologiczna w której uczestniczą, jest pośrednią lub pasywną reakcją hemaglutynacji (IRHA lub RPHA), gdyż krwinki czerwone uczestniczą w niej biernie.

RPGA umieszcza się w specjalnych płytach styropianowych z otworami i półkulistym dnem. Kiedy go używasz diagnostyka serologiczna W dołkach tych przygotowuje się dwukrotne rozcieńczenia surowicy testowej w roztworze fizjologicznym, a następnie dodaje się do niej zawiesinę uczulonych erytrocytów jako środek diagnostyczny. Wyniki rejestruje się po 2 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C, stosując system czterokrzyżowy. Przy pozytywnej reakcji zaglutynowane czerwone krwinki osiadają na dnie otworu i równomiernie pokrywają go w postaci odwróconego parasola. Na reakcja negatywna czerwone krwinki również osiadają, ciecz staje się przezroczysta, osad wygląda jak mały „krążek” pośrodku otworu. Za miano surowicy w RPHA uważa się jej ostatnie rozcieńczenie, które nadal daje wyraźną hemaglutynację bez znaczących oznak obecności „krążka”.

RPGA można również stosować jako przyspieszoną metodę diagnostyki bakteriologicznej do wykrywania bezpośrednio w materiale badanym nieznanych bakterii, wirusów, toksyn, np. patogenów dżumy, enterotoksyn gronkowcowych itp. Dzięki tej wersji RPGA zaadsorbowane są erytrocyty znane ze swojej właściwości swoistość wykorzystuje się jako znany składnik reakcji przeciwciał – przeciwciało erythrocyte Diagnosum. Jeśli materiał testowy zawiera wystarczającą ilość znanego antygenu, wynik RPGA będzie dodatni.

Możliwości zastosowania RPHA to: reakcja neutralizacji antygenu (RNAg), reakcja neutralizacji przeciwciał (RNAb), reakcja pasywnego hamowania hemaglutynacji (PHA). W przypadku tych reakcji wykorzystuje się diagnostykę erytrocytów pod kątem antygenów i przeciwciał. Można jednocześnie zastosować dwie wzajemnie kontrolujące się reakcje jednokierunkowe, na przykład RPHA z diagnostyką antygenu i RNAg z diagnostyką erytrocytów przeciwciał.

Reakcja neutralizacji przeciwciał (RNAb) polega na zmieszaniu zawiesiny zawierającej pożądany antygen ze specyficzną surowicą odpornościową zawierającą znane przeciwciała w odpowiednich objętościach i inkubacji w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Następnie dodaje się antygenową diagnostykę erytrocytów. Mieszaninę wytrząsa się i pozostawia w temperaturze pokojowej. Wyniki uwzględnia się po 3-4 h i ostatecznie po 18-24 h. Jeżeli materiał do badania zawiera antygen, to zwiąże on przeciwciała (zneutralizuje je), dzięki czemu nie nastąpi hemaglutynacja.

Reakcję neutralizacji antygenu (RNAg) przeprowadza się na tej samej zasadzie. Tylko w tym przypadku w badanym materiale wykrywane są przeciwciała. Specyficzny antygen dodany do takiego materiału testowego zwiąże się z zawartymi w nim przeciwciałami, czyli nastąpi neutralizacja antygenu przez przeciwciała, a co za tym idzie, w przypadku dodania przeciwciała erythrocyte Diagnosum nie nastąpi hemaglutynacja.

Reakcja koaglutynacji. Jest to jedna z opcji biernej, tj. przyspieszonej reakcji aglutynacji na szkle, w której pośredniczą komórki niosące przeciwciała. Reakcja ta opiera się na unikalnej właściwości Staphylococcus aureus, który zawiera w ścianie komórkowej białko A, wiąże się z fragmentami Fc IgG i IgM. W tym przypadku centra aktywne przeciwciał pozostają wolne i mogą oddziaływać ze specyficznymi determinantami antygenów. Na szkiełko szklane nanosi się kroplę 2% zawiesiny gronkowców uczulonych odpowiednimi przeciwciałami i dodaje się kroplę zawiesiny badanych bakterii. Jeśli antygen pasuje do przeciwciał, w ciągu 30-60 sekund następuje wyraźna aglutynacja gronkowców obciążonych przeciwciałami.

Reakcja aglutynacji lateksu (LAR). Nośnikiem przeciwciał w tym systemie diagnostycznym są małe, standardowe cząsteczki lateksu. Reakcję prowadzi się mikrometodą w dołkach na szkle. Głównym warunkiem pomyślnego określenia stopnia zaawansowania WWA jest ścisłe przestrzeganie proporcji ilościowych składników układu: do 50 µl materiału badawczego dodaje się 10 µl preparatu lateksowego uczulanego przeciwciałami. Specyficzność WWA sprawdza się za pomocą trzech testów kontrolnych zawartych w komercyjnych systemach testowych: znanych pozytywna reakcja, oczywiście negatywna reakcja i kontrola jakości zawiesiny lateksowej na obecność lateksów nieuczulanych na WWA (nie zawierających przeciwciał) z materiałem testowym. W naszym kraju jako nośniki specyficznych przeciwciał stosuje się monodyspersyjne lateksy polistyrenowe o różnych średnicach cząstek (0,3; 0,66; 0,75; 0,8 µm). LAG służy do szybkiego wykrywania mikroorganizmów lub ich antygenów w materiale testowym.

Immunomagnetyczne wykrywanie antygenów. Jedna z możliwości przyspieszonej reakcji aglutynacji na szkle wiąże się z zastosowaniem supermagnetycznych cząstek polimeru pokrytych specyficznymi przeciwciałami. Jedna taka cząsteczka wiąże do 107-108 komórek mikroorganizmów, co powoduje wrażliwość Ta metoda osiąga 5 CFU/ml. Immunomagnetyczne wykrywanie mikroorganizmów można stosować w połączeniu z RKO.

Łączna reakcja hemaglutynacji (AHA). Pozwala na szybkie wykrycie we krwi pacjentów zarówno antygenów swobodnie krążących (antygenemia), jak i antygenów związanych z przeciwciałami – krążących kompleksów immunologicznych (CIC). W przypadku RAHA stosuje się czerwone krwinki uwrażliwione odpowiednimi przeciwciałami. Dodanie surowicy krwi pacjenta zawierającej antygeny do uwrażliwionych erytrocytów, na których przyczepione są przeciwciała, prowadzi do sklejenia (aglutynacji) erytrocytów i kompleksów immunologicznych.

Test antyglobulinowy Coombsa (reakcja R. Coombsa). Pełne (dwuwartościowe) przeciwciała oznacza się za pomocą reakcji aglutynacji bezpośredniej i pasywnej. Niekompletne (monowalentne, blokujące) przeciwciała nie są wykrywane tymi metodami, ponieważ łącząc się z antygenem, blokują go, ale nie mogą powodować agregacji antygenu w duże konglomeraty. Niekompletne (blokujące) przeciwciała to takie, w których funkcjonuje tylko jedno centrum aktywne; drugie aktywne centrum nie działa z nieznanego powodu. Aby wykryć niekompletne przeciwciała, stosuje się specjalną reakcję Coombsa (ryc. 72). W reakcji biorą udział: surowica pacjenta, w której oznacza się niekompletne przeciwciała, antygen krwinkowy-diagnosticum, surowica antyglobulinowa zawierająca przeciwciała przeciwko globulinie ludzkiej. Reakcja przebiega w dwóch etapach:

Oddziaływanie antygenu z niekompletnymi przeciwciałami. Nie ma żadnych widocznych przejawów. Pierwszy etap kończy się wypłukaniem antygenu z pozostałej surowicy pacjenta.

Oddziaływanie surowicy antyglobulinowej otrzymanej w wyniku immunizacji zwierzęcia ludzką globuliną z niekompletnymi przeciwciałami zaadsorbowanymi na antygenie. Ze względu na to, że przeciwciała antyglobulinowe są dwuwartościowe, wiążą dwa przeciwciała jednowartościowe odrębnych kompleksów AG+ niekompletne przeciwciało, co prowadzi do ich sklejenia i pojawienia się widocznego osadu.

Aglutynacja to sklejanie i wytrącanie drobnoustrojów lub innych komórek pod wpływem przeciwciał w obecności elektrolitu (izotoniczny roztwór chlorku sodu). Grupy sklejonych bakterii (komórek) nazywane są aglutynatami. Do reakcji aglutynacji wymagane są następujące składniki:

1. Przeciwciała (aglutyniny) znajdujące się w surowicy chorego lub odpornego zwierzęcia.

2. Antygen – zawiesina żywych lub zabitych drobnoustrojów, czerwonych krwinek lub innych komórek.

3. Izotoniczny (0,9%) roztwór chlorku sodu.

Test aglutynacji służy do serodiagnostyki dur brzuszny i dur rzekomy (reakcja Vidala), bruceloza (reakcja Wrighta i Heddlesona), tularemia itp. Przeciwciało to surowica pacjenta, a antygen to znany drobnoustrój. Podczas identyfikacji drobnoustrojów lub innych komórek ich zawiesinę stosuje się jako antygen, a znaną surowicę odpornościową stosuje się jako przeciwciało. Reakcja ta jest szeroko stosowana w diagnostyce infekcje jelitowe, krztusiec itp.

Metody oceny stopnia zaawansowania RZS

Przybliżone RA na szkle

Wdrożone RA

(metoda objętościowa)

Reakcja koaglutynacji

Rozłożony RA na szkle (seroidentyfikacja)

Reakcja aglutynacji na szkle. Na beztłuszczowe szkiełko szklane nanosi się dwie krople specyficznej (adsorbowanej) surowicy i kroplę izotonicznego roztworu chlorku sodu. Surowice nieadsorbowane są wstępnie rozcieńczane w stosunku 1:5 – 1:100. Krople należy nakładać na szybę, aby zachować między nimi odległość. Hodowlę dokładnie rozciera się na szkle za pomocą ezy lub pipety, a następnie dodaje do kropli izotonicznego roztworu chlorku sodu i do jednej z kropli surowicy, każdą mieszając mieszając aż do uzyskania jednorodnej zawiesiny. Kontrolą surowicy jest kropla surowicy bez hodowli.

Uwaga! Nie można przenosić hodowli z surowicy do kropli izotonicznego roztworu chlorku sodu, który służy jako kontrola antygenowa. Reakcja zachodzi w temperaturze pokojowej przez 1-3 minuty. Jeżeli kontrola surowicy pozostaje przezroczysta, w kontroli antygenu obserwuje się równomierne zmętnienie, a w kropli w miejscu wymieszania hodowli z surowicą na tle klarownej cieczy pojawiają się płatki aglutynatu, wynik reakcji uważa się za pozytywny.

Diagnostyka fizjologiczna

surowica + roztwór kultury + kultura

Szczegółowa reakcja aglutynacji (metoda objętościowa). Przygotowuje się seryjne, najczęściej dwukrotne rozcieńczenia surowicy. Metodę tę nazywa się wolumetryczną. Aby oznaczyć miano przeciwciał w surowicy krwi, należy pobrać 6 probówek. Do pierwszej probówki wlej 1 ml pierwotnego rozcieńczenia surowicy 1:50 i za pomocą pipety z podziałką dodaj 1 ml roztworu soli do wszystkich 6 probówek. Pierwsza probówka będzie zawierać surowicę o rozcieńczeniu 1:100 o objętości 2 ml. Przenieść 1 ml z pierwszej probówki do drugiej probówki, gdzie rozcieńczenie wynosi 1:200. Zatem wykonaj serię seryjnych rozcieńczeń surowicy w pierwszych 5 probówkach (1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600). Z piątej probówki wlej 1 ml do roztworu środka dezynfekującego. Dodaj 2 krople środka diagnostycznego do wszystkich 6 probówek. Szósta probówka to kontrola posiewu, gdyż zawiera wyłącznie roztwór soli fizjologicznej i diagnostykę.

Taka kontrola jest konieczna, aby wykluczyć samoistną aglutynację hodowli. Probówki wytrząsa się i umieszcza w termostacie w temperaturze 37°C na 2 godziny, a następnie pozostawia na dobę w temperaturze pokojowej, po czym rejestruje wyniki reakcji aglutynacji. Wykonując reakcję aglutynacji z surowicą dzieci w pierwszych miesiącach życia, ze względu na funkcjonalną niższość tworzenia przeciwciał, konieczne jest oznaczenie niższych mian przeciwciał, co uwzględnia się przy rozcieńczaniu surowicy. Początkowe rozcieńczenie surowicy wynosi 1:25. W pierwszej probówce uzyskuje się rozcieńczenie 1:50, następnie 1:100 itd.

Na wynik pozytywny reakcje w probówkach, na tle klarownej cieczy widoczne są lepkie komórki w postaci ziaren lub płatków. Aglutynat stopniowo osiada na dnie w postaci „parasolki”, a ciecz nad osadem staje się klarowna. Kontrola antygenowa jest równomiernie mętna.

W zależności od charakteru osadu wyróżnia się aglutynację drobnoziarnistą i gruboziarnistą (łuszczącą się). Podczas pracy z surowicą O uzyskuje się drobnoziarnistą aglutynację. Gruboziarnisty - gdy ruchliwe drobnoustroje wchodzą w interakcję z wiciowymi surowicami H. Występuje szybciej niż drobnoziarnisty, a powstały osad jest bardzo luźny i łatwo pękający.

Intensywność reakcji wyraża się w następujący sposób:

Wszystkie komórki osiadły, ciecz w probówce jest całkowicie przezroczysta. Wynik reakcji jest wyraźnie pozytywny;

Jest mniej osadu, ciecz nie klaruje się całkowicie. Wynik reakcji jest pozytywny;

Osadu jest jeszcze mniej, ciecz jest bardziej mętna. Wynik reakcji jest wątpliwy;

Na dnie probówki znajduje się niewielki osad, ciecz jest mętna. Wątpliwy wynik reakcji;

Nie ma osadu, ciecz jest równomiernie mętna, jak w kontroli antygenowej. Negatywny wynik reakcji

Reakcja aglutynacji Reakcja aglutynacji

(RA) - metoda identyfikacji i ujęcie ilościowe Ag i At, w oparciu o ich zdolność do tworzenia aglomeratów widocznych gołym okiem. Na oddziale chorób zakaźnych. chorób lub do innych celów służy do identyfikacji nieznanych drobnoustrojów i komórek, do określenia obecności i ilości Ab we krwi i innych płynach. Zasada determinacji opiera się na specyfice oddziaływania Ag i Ab i polega na odnajdywaniu znanego od nieznanego. Istnieje wiele opcji dla RZS: ilościowe i jakościowe, probówkowe i szklane, wolumetryczne i kropelkowe, konwencjonalne, przyspieszone i ekspresowe. Do etapu RA potrzebujesz: 1) s-ka krew. W wariancie z określeniem rodzaju (var) bakterii stosuje się przemysłowe testy aglutynacyjne, otrzymywane w wyniku immunizacji królików. W wariancie z określeniem rodzaju Ab z badania pobierana jest próbka krwi. ludzie lub zwierzęta. Roztwór musi być sterylny i wolny od zawieszonych cząstek. Przygotować podstawowe rozcieńczenie w roztworze soli. Powinno być 2-4 razy niższe od miana diagnostycznego dla tej choroby; 2) Ag. W wersji reakcji z oznaczeniem typu Ab stosuje się przemysłowe zestawy diagnostyczne; w wariancie z oznaczaniem Ag preparaty diagnostyczne sporządza się samodzielnie w postaci 1-3 miliardowej zawiesiny w roztworze soli 18-20-godzinnego testu agarowego (rzadziej bulionowego). drobnoustrój inaktywowany poprzez ogrzewanie w łaźni wodnej w temperaturze 70°C przez 1 godzinę lub przez 24-godzinną inkubację w temperaturze 37°C z formaldehydem (końcowe stężenie 0,2%); 3) elektrolit w postaci roztworu soli. Technika inscenizacji wolumetryczna rurka szeregowa RA w celu określenia miana Ab w s-ki: z głównego rozcieńczenia s-ki przygotowuje się kilka rzędów rozcieńczeń roboczych. Liczba rzędów zależy od liczby diagnostyk przyjętych do doświadczenia, a liczba i współczynniki rozcieńczenia zależą od miana diagnostycznego podejrzanej choroby. Seria musi zawierać co najmniej rozcieńczenie odpowiadające miano diagnostycznemu Ab, dwa rozcieńczenia poniżej i dwa rozcieńczenia powyżej. np. jeśli miano diagnostyczne wynosi 1:100, to przy wolumetrycznej metodzie oceny stopnia zaawansowania RZS należy przygotować następujące rozcieńczenia: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; za pomocą kroplówki metody nie jest potrzebne pierwsze rozcieńczenie (1:25), ale potrzebne jest kolejne większe rozcieńczenie - 1:800. badania naukowe s-ku miareczkuje się do reakcji ujemnej. Rozcieńcza się w następujący sposób: 0,25 ml roztworu soli wlewa się do wszystkich probówek z wyjątkiem pierwszej, gdy reakcję prowadzi się w objętości 0,5 ml i 0,5 ml, gdy reakcję prowadzi się w objętości 1 ml Wlać 0,25 (0,5) ml głównego rozcieńczenia do 1. i 2. probówki, z 2. probówki do odciętej objętości i hodowla s-k i zwiększono 2 razy, 0,25 (0,5) ml przenosi się na 3., z 3. na 4. itd. do końca, z nacięcia wlewa się do wszystkiego 0,25 (0,5) ml, aby zrównoważyć objętości. Każde rozcieńczenie przeprowadza się za pomocą osobnej pipety. Jeśli do doświadczenia zostanie wziętych kilka diagnostyk, to dla każdego z nich w ten sam sposób przygotowuje się własną serię rozcieńczeń. Do każdego rozcieńczenia probówki dodaje się Diagnosticum w objętości równej objętości probówki, w wyniku czego rozcieńczenie w każdej probówce ulega podwojeniu. Doświadczenie odpowiada kontroli s-ki (0,25 - 0,5 ml głównego rozcieńczenia s-ki i taka sama ilość roztworu soli) i kontroli Ag (0,25 - 0,5 ml Diagnosum i taka sama ilość roztworu soli). Jeśli w eksperymencie wykorzystano kilka środków diagnostycznych, wówczas każdy miał własną kontrolę antygenową. Statyw z probówkami dobrze wytrząsa się i umieszcza w termostacie w temperaturze 37°C na 4 godziny, a następnie pozostawia w temperaturze pokojowej do następnego dnia, po czym rejestruje się PA na podstawie ilości osadu i stopnia oczyszczenia płyn. Oznaczanie tych wskaźników, w zależności od charakteru aglutynianów, przeprowadza się gołym okiem na ciemnym tle, w aglutynoskopie lub nad wklęsłą powierzchnią zwierciadła mikroskopu. Rozliczanie rozpoczyna się od kontroli: kontrola C powinna być przezroczysta, Ag powinna być równomiernie mętna (po wstrząśnięciu probówki). Jeżeli kontrole są dobre, należy ustalić obecność i stopień aglutynacji we wszystkich probówkach, co jest oznaczone plusami: duży osad i całkowite oczyszczenie cieczy - 4 plusy; duży osad i niepełne oczyszczenie cieczy - 3 plusy; zauważalny osad i zauważalne przejaśnienie płynu to 2 plusy. Następnie określa się miano: najwyższe rozcieńczenie o intensywności aglutynacji co najmniej 2 plusy. Badania miana s-ki porównuje się z mianem diagnostycznym tej choroby. Jeśli zbadane zostanie miano. s-ki jest 2 razy mniejsze od wartości diagnostycznej, reakcję ocenia się jako wątpliwą; jeśli miano jest równe diagnostyka - jak słabo pozytywny; jeśli jest 2-4 razy wyższy, uważa się go za dodatni, jeśli jest 8 lub więcej razy wyższy, uważa się go za zdecydowanie pozytywny. Wraz z powszechną dystrybucją Ab zdrowi ludzie Do oceny RZS wykorzystuje się wzrost miana Ab. Aby określić typ Ar w seryjnym RA, liczba wierszy musi odpowiadać liczbie pobranej do identyfikacji testy diagnostyczne. Z głównego rozcieńczenia testu diagnostycznego przygotowuje się serię kolejnych dwukrotnych rozcieńczeń w taki sam sposób jak w RZS w celu określenia miana Ab. Współczynniki rozcieńczenia zależą od miana testu aglutynacji.W doświadczeniu konieczna jest obecność rozcieńczenia równego miano testu, a także 2, 4, 6, 8 razy mniejsze.Na przykład, jeśli miano testu diagnostycznego wynosi 1 3200, wówczas należy zastosować rozcieńczenia 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 Do rozcieńczeń testu dodaje się tę samą objętość badanego Ag, w efekcie rozcieńczenie próba wzrasta 2-krotnie.Do doświadczenia dodaje się 2 kontrole testu i Ag.Jeżeli w doświadczeniu bierze udział kilka s-k, to każdy z nich potrzebuje własnej kontroli.Po zakończeniu reakcji stanowisko należy energicznie potrząsać i umieszczać w termostacie w temperaturze 37 ° C. Wyniki uwzględnia się w sposób opisany powyżej. Ocena reakcji ma cechy. Aby wyciągnąć wniosek na temat zgodności badania. Ag wzięte do doświadczenia, miano reakcji musi odpowiadać co najmniej połowie miana standardowego testu diagnostycznego. Miana 1 4 i mniejsze uważa się za reakcję grupową Kroplówka md Stopień zaawansowania RA różni się od wolumetrycznego tym, że s-ku rozcieńcza się w objętości 1 ml, Ag stosuje się w większym stężeniu (10 miliardów/ml) i dodaje się go 1 - 2 wpada do probówki Rozcieńczenie leku po dodaniu Ag uważa się za niezmienione, w przeciwnym razie sposób ustawiania, rejestrowania i oceny jest podobny do metody wolumetrycznej

(Źródło: Słownik terminów mikrobiologicznych)

Reakcja aglutynacji (od łac. aglutynacja- sklejanie) - sklejanie ciałek (bakterii, czerwonych krwinek itp.) przez przeciwciała w obecności elektrolitów.

Reakcja aglutynacji objawia się w postaci płatków lub osadu składającego się z ciałek (na przykład bakterii) „sklejonych” przez przeciwciała (ryc. 7.37). Reakcja aglutynacji służy do: określenia patogenu wyizolowanego od pacjenta; oznaczenie przeciwciał w surowicy krwi pacjenta; oznaczanie grup krwi.

Ryż. 7,37 a, ur. Reakcja aglutynacji zIgM-przeciwciała (a) iIgG-przeciwciała (np)

1. Oznaczenie patogenu wyizolowanego od pacjenta Przybliżona reakcja aglutynacja na szkle (ryc. 7.38). Do kropli surowicy aglutynującej (rozcieńczenie 1:20) dodaje się zawiesinę bakterii wyizolowanych od pacjenta. Tworzy się kłaczkowaty osad.

Ryż. 7.38.

Rozległa reakcja aglutynacji z patogenem wyizolowanym od pacjenta (ryc. 7.39). Do rozcieńczeń surowicy aglutynującej dodaje się zawiesinę bakterii wyizolowanych od pacjenta.

Ryż. 52

2. Oznaczenie przeciwciał w surowicy krwi pacjenta
Szczegółowa reakcja aglutynacji z surowicą krwi pacjenta (ryc. 7.39). Diagnosticum dodaje się do rozcieńczeń surowicy pacjenta.
- Aglutynacja z O-diagnosticum (bakterie zabite przez ciepło, zatrzymujące antygen O) zachodzi w postaci aglutynacji drobnoziarnistej.
- Aglutynacja z H-diagnosticum (bakterie zabite przez formaldehyd, zatrzymujące antygen H wici) jest duża i zachodzi szybciej.
3. Reakcja aglutynacji do oznaczania grup krwi Reakcję aglutynacji w celu określenia grup krwi wykorzystuje się do ustalenia układu ABO (tabela b) na podstawie aglutynacji erytrocytów z przeciwciałami surowicy odpornościowej przeciwko antygenom grup krwi A (I), B (III). Kontrolę stanowi: surowica niezawierająca przeciwciał, tj. grupa krwi AB (IV) w surowicy; antygeny zawarte w czerwonych krwinkach grup A (II), B (III). Kontrola ujemna nie zawiera antygenów, tzn. stosuje się erytrocyty grupy O (I).

Tabela 7.6. Oznaczanie grup krwi ABO