Reakcja aglutynacji (RA) to adhezja i wytrącanie drobnoustrojów lub innych komórek pod wpływem przeciwciał w obecności elektrolitu. Powstały osad nazywany jest aglutynianem.
RA jest używany:
1. Wykrycie przeciwciał w surowicy krwi pacjenta (serodiagnoza).
2. Określenie typu i serotypu czystej kultury drobnoustrojów chorobotwórczych wyizolowanych od pacjenta (serotypowanie).
Reakcja aglutynacji służy do oznaczania przeciwciał w surowicy krwi pacjentów np. z durem brzusznym i durem paradurowym (reakcja Vidala), brucelozą (reakcja Wrighta, Heddlesona), tularemią, leptospirozą i innymi choroba zakaźna, a także w celu określenia patogenu wyizolowanego od pacjenta (infekcje jelitowe, krztusiec itp.). RA służy do określenia grup krwi, współczynnika Rh itp.
Reakcja wymaga następujących składników:
1. Antygen (aglutynogen) musi być korpuskularny, to znaczy jest zawiesiną żywych lub zabitych mikroorganizmów (diagnostyka m), erytrocytów lub innych komórek. Zazwyczaj stosuje się codzienną hodowlę mikroorganizmów hodowanych na skosach agarowych. Hodowlę zmywa się 3 - 4 ml roztworu izotonicznego, przenosi do sterylnej probówki i określa gęstość. Zawiesina musi być jednorodna i zawierać do 3 miliardów komórek drobnoustrojów w 1 ml. Stosowanie zawiesiny zabitych drobnoustrojów – Diagnosticums – ułatwia pracę (przygotowanej fabrycznie).
2. Przeciwciała (aglutyniny) stwierdza się w surowicy pacjenta (podczas serodiagnostyki) lub w surowicy aglutynującej (podczas serotypowania). Surowice aglutynujące uzyskuje się poprzez immunizację królików zabitymi bakteriami.
Miano aglutynujące surowica nazywana jest jej najwyższym rozcieńczeniem, w którym reaguje z odpowiednim antygenem w określonych warunkach eksperymentalnych.
Surowice aglutynujące mogą być natywne (nieadsorbowane) i adsorbowane. Surowice natywne w małych rozcieńczeniach wchodzą w interakcję nie tylko z rodzajem mikroorganizmów, którymi zwierzę zostało immunizowane w celu uzyskania surowicy, ale także z pokrewnymi typami mikroorganizmów, ponieważ zawierają przeciwciała grupowe (przeciwciała przeciwko mikroorganizmom, które mają wspólne antygeny). Surowice natywne służą do szczegółowej reakcji aglutynacji (do serodiagnozy), która uwzględnia nie tylko obecność odczynu, ale także dynamikę wzrostu miana przeciwciał.
Jeżeli przeciwciała grupowe są ekstrahowane (adsorbowane) z surowicy natywnej w wyniku interakcji z pokrewnymi bakteriami posiadającymi antygeny grupowe, uzyskuje się zaadsorbowane surowice. Zaadsorbowane surowice mogą być monoreceptorowe (lub specyficzne dla typu) i zawierać przeciwciała tylko przeciwko jednemu receptorowi antygenu. Surowice poliwalentne składają się z mieszaniny kilku zaadsorbowanych lub niezaadsorbowanych surowic. Zaadsorbowane surowice wykorzystuje się do reakcji aglutynacji szkła.
Kiedy zwierzęta immunizuje się ruchliwymi bakteriami z antygenem H, otrzymuje się surowice aglutynujące H zawierające przeciwciała H (na przykład surowicę aglutynującą H z monoreceptorem Salmonella). Przez immunizację antygenem O otrzymuje się surowice O-aglutynujące zawierające O-przeciwciała (na przykład surowica O-aglutynująca zaadsorbowana przez grupę Salmonella, surowica O-aglutynująca przeciw cholerze). Przez immunizację antygenami H i O otrzymuje się surowice z przeciwciałami H i O.
Ponadto O-aglutyniny wytwarzają drobnoziarnisty aglutynian, a H-aglutyniny tworzą gruboziarnisty osad.
3. Elektrolit – izotoniczny roztwór NaCl (0,9% roztwór chlorku sodu przygotowany w wodzie destylowanej).
Istnieją dwie główne metody przeprowadzania reakcji aglutynacji: reakcja na szkle (czasami nazywana reakcją wskaźnikową lub reakcją płytkową) i reakcja szczegółowa (w probówkach).
Przygotowanie reakcji aglutynacji na szkle. Na beztłuszczowe szkiełko szklane nanosi się dwie krople surowicy i kroplę izotonicznego roztworu chlorku sodu. Diagnostyczną surowicę aglutynującą pobiera się w jednym rozcieńczeniu, które w zależności od jej miana wynosi 1:10, 1:25, 1:50 lub 1:100. Hodowlę badanego drobnoustroju dodaje się za pomocą ezy do jednej kropli surowicy i kropli roztworu izotonicznego i dokładnie miesza. Kropla chlorku sodu z mikroorganizmami to kontrola antygenowa, kropla surowicy bez mikroorganizmów to kontrola surowicy. Nie można przenosić hodowli z kropli z surowicą do kropli z NaCl. Reakcja zachodzi w temperaturze pokojowej przez 1-3 minuty. Jeśli kontrola surowicy pozostaje klarowna, w kontroli antygenu obserwuje się równomierne zmętnienie, a w kropli w miejscu zmieszania hodowli z surowicą pojawiają się płatki aglutynatu, wówczas wynik uważa się za pozytywny. Jeżeli w kropli występuje równomierne zmętnienie surowicy i antygenu, jest to wynik negatywny. Reakcja jest wyraźniej widoczna na ciemnym tle.
Serum
1. kontrola antygenowa
2. kontrola surowicy
13.1. Reakcje antygen-przeciwciało i ich zastosowania
Po wprowadzeniu antygenu w organizmie powstają przeciwciała. Przeciwciała są komplementarne do antygenu, który spowodował ich syntezę i są w stanie się z nim wiązać. Wiązanie antygenów z przeciwciałami składa się z dwóch faz. Pierwsza faza jest specyficzna, w której następuje szybkie wiązanie determinanty antygenowej z centrum aktywnym fragmentu Fab przeciwciał. Należy zauważyć, że wiązanie wynika z sił van der Waalsa, wodoru i oddziaływań hydrofobowych. Siła wiązania zależy od stopnia zgodności przestrzennej pomiędzy miejscem aktywnym przeciwciała i epitopem antygenu. Po fazie specyficznej rozpoczyna się faza wolniejsza – niespecyficzna, która objawia się widocznym zjawiskiem fizycznym (np. tworzeniem się płatków podczas aglutynacji itp.).
Reakcje immunologiczne to interakcja między przeciwciałami i antygenami, a reakcje te są specyficzne i mają wysoka czułość. Są szeroko stosowane w praktyka lekarska. Za pomocą reakcji immunologicznych można rozwiązać następujące problemy:
Oznaczanie nieznanych przeciwciał za pomocą znanych antygenów (antigenic Diagnosticum). Zadanie to ma miejsce, gdy konieczne jest oznaczenie przeciwciał przeciwko patogenowi w surowicy krwi pacjenta (serodiagnoza). Znalezienie przeciwciał pozwala potwierdzić diagnozę;
Oznaczanie nieznanych antygenów przy użyciu znanych przeciwciał (surowica diagnostyczna). Badanie to przeprowadza się przy identyfikacji kultury patogenu wyizolowanej z materiału pacjenta (serotypowanie), a także przy wykrywaniu
antygeny drobnoustrojów i ich toksyn we krwi i inne płyny biologiczne. Istnieje wiele rodzajów reakcji immunologicznych, różniących się techniką inscenizacji i zarejestrowanym efektem. Są to reakcje aglutynacji (RA), reakcje strącania (RP), reakcje z udziałem dopełniacza (RSC), reakcje z wykorzystaniem znakowanych składników (RIF, ELISA, RIA).
13.2. Reakcja aglutynacji
Reakcja aglutynacji (RA) to reakcja immunologiczna oddziaływanie antygenu z przeciwciałami w obecności elektrolitów, a antygen jest w stanie korpuskularnym (erytrocyty, bakterie, cząsteczki lateksu z zaadsorbowanymi antygenami). Podczas aglutynacji antygeny korpuskularne sklejają się ze sobą za pomocą przeciwciał, co objawia się tworzeniem kłaczkowatego osadu. Tworzenie się płatków wynika z faktu, że przeciwciała mają dwa centra aktywne, a antygeny są wielowartościowe, tj. mają kilka determinantów antygenowych. RZS służy do identyfikacji patogenu wyizolowanego z materiału pacjenta, a także do wykrycia przeciwciał przeciwko patogenowi w surowicy krwi pacjenta (np. Reakcja Wrighta i Heddlesona na brucelozę, reakcja Widala na dur brzuszny i dur brzuszny).
Najprostszym sposobem zdiagnozowania RZS jest reakcja na szkło; jest to przybliżony RZS, na podstawie którego określa się patogen wyizolowany od pacjenta. Po ustaleniu reakcji na szkiełko nakłada się diagnostyczną surowicę aglutynującą (w rozcieńczeniu 1:10 lub 1:20), a następnie dodaje się hodowlę pobraną od pacjenta. Reakcja jest dodatnia, jeśli w kropli pojawi się kłaczkowaty osad. W pobliżu umieszcza się kontrolę: zamiast surowicy dodaje się kroplę roztworu chlorku sodu. Jeżeli diagnostyczna surowica aglutynująca nie jest zaadsorbowana 1, to należy ją rozcieńczyć (do miana – takiego rozcieńczenia, do jakiego powinna nastąpić aglutynacja), tj. umieszczaj ekspandowany RA w probówkach ze wzrostem
1 Niezaadsorbowana surowica aglutynująca może aglutynować spokrewnione bakterie, które mają wspólne (reagujące krzyżowo) antygeny. Dlatego używajązaadsorbowane surowice aglutynujące, z których usunięto reagujące krzyżowo przeciwciała poprzez adsorpcję na pokrewnych bakteriach. Surowice takie zachowują przeciwciała specyficzne tylko dla danej bakterii.
rozcieńczenia surowicy aglutynującej, do których dodaje się 2-3 krople zawiesiny patogenu wyizolowanego od pacjenta. Aglutynację uwzględnia się na podstawie ilości osadu i stopnia oczyszczenia cieczy w probówkach. Reakcję uznaje się za pozytywną, jeżeli w rozcieńczeniu zbliżonym do miana surowicy diagnostycznej obserwuje się aglutynację. Reakcji towarzyszą kontrole: surowica rozcieńczona izotonicznym roztworem chlorku sodu powinna być przezroczysta, zawiesina drobnoustrojów w tym samym roztworze powinna być jednolicie mętna, bez osadu.
Aby oznaczyć przeciwciała przeciwko patogenowi w surowicy krwi pacjenta, stosuje się RZS na pełną skalę. Podczas jego przygotowania surowicę krwi pacjenta rozcieńcza się w probówkach i do probówek dodaje się równą ilość zawiesiny diagnostycznej (zawiesiny zabitych drobnoustrojów). Po inkubacji określa się najwyższe rozcieńczenie surowicy, przy którym wystąpiła aglutynacja, tj. utworzył się osad (miano surowicy). W tym przypadku reakcja aglutynacji z O-diagnosticum (bakterie zabite przez ciepło, zachowujące termostabilny antygen O) zachodzi w postaci aglutynacji drobnoziarnistej. Reakcja aglutynacji z H-diagnosticum (bakterie zabite przez formaldehyd, zatrzymujące termolabilny antygen wici H) jest szorstka i przebiega szybciej.
Pośrednia (pasywna) reakcja hemaglutynacji(RNGA lub RPGA) to rodzaj RZS. Metoda ta jest bardzo czuła. Za pomocą RNGA można rozwiązać dwa problemy: oznaczenie przeciwciał w surowicy krwi pacjenta, do której dodawany jest antygenowy diagnostyka erytrocytów, czyli erytrocytów, na których adsorbowane są znane antygeny; określić obecność antygenów w materiale testowym. W tym przypadku reakcję nazywa się czasem odwrotną pośrednią reakcją hemaglutynacji (RONHA). W trakcie zabiegu do materiału badawczego dodaje się przeciwciało erythrocyte Diagnosticum (erytrocyty z przeciwciałami zaadsorbowanymi na ich powierzchni). W tej reakcji czerwone krwinki pełnią rolę nośników i biorą bierny udział w tworzeniu agregatów odpornościowych. Przy pozytywnej reakcji biernie sklejone czerwone krwinki pokrywają dno otworu równą warstwą z ząbkowanymi krawędziami („parasol”); przy braku aglutynacji czerwone krwinki gromadzą się w centralnym wgłębieniu otworu, tworząc zwarty „guzik” o ostro określonych krawędziach.
Reakcja koaglutynacji służy do oznaczania komórek patogenów (antygenów) przy użyciu zaadsorbowanych na nich przeciwciał Staphylococcus aureus, zawierające białko A. Białko A ma powinowactwo do fragmentu Fc immunoglobulin. Dzięki temu przeciwciała wiążą się ze gronkowcami pośrednio poprzez fragment Fc, a fragmenty Fab są zorientowane na zewnątrz i są w stanie oddziaływać z odpowiednimi drobnoustrojami wyizolowanymi od pacjentów. W tym przypadku powstają płatki.
Reakcja hamowania hemaglutynacji (HAI) stosowany w diagnostyce infekcje wirusowe i tylko zakażenia wywołane przez wirusy hemaglutynujące. Wirusy te zawierają na swojej powierzchni białko – hemaglutyninę, która jest odpowiedzialna za reakcję hemaglutynacji (HRA), gdy do wirusów dodawane są czerwone krwinki. RTGA polega na blokowaniu antygenów wirusowych przeciwciałami, w wyniku czego wirusy tracą zdolność do aglutynacji czerwonych krwinek.
Reakcja Coombsa - RA do oznaczania niekompletnych przeciwciał. W przypadku niektórych chorób zakaźnych, takich jak bruceloza, w surowicy krwi pacjenta krążą niekompletne przeciwciała przeciwko patogenowi. Niekompletne przeciwciała nazywane są przeciwciałami blokującymi, ponieważ mają jedno miejsce wiązania antygenu, a nie dwa, jak pełnoprawne przeciwciała. Dlatego po dodaniu diagnostyki antygenowej niekompletne przeciwciała wiążą się z antygenami, ale nie sklejają ich ze sobą. Aby zamanifestować reakcję, dodaje się surowicę antyglobulinową (przeciwciała przeciwko immunoglobulinom ludzkim), co doprowadzi do aglutynacji kompleksów immunologicznych (diagnostyka antygenowa + niekompletne przeciwciała) powstałych w pierwszym etapie reakcji.
Pośrednią reakcję Coombsa stosuje się u pacjentów z hemolizą wewnątrznaczyniową. U niektórych z tych pacjentów wykryto niekompletne monowalentne przeciwciała przeciwko rezusowi. W szczególności oddziałują z erytrocytami Rh-dodatnimi, ale nie powodują ich aglutynacji. Dlatego do układu przeciwciał anty-Rh + erytrocyty Rh-dodatnie dodawana jest surowica antyglobulinowa, co powoduje aglutynację erytrocytów. Do diagnozy służy test Coombsa stany patologiczne, związane z wewnątrznaczyniową lizą erytrocytów pochodzenia immunologicznego, na przykład choroba hemolityczna noworodków spowodowana konfliktem Rh.
RA do oznaczania grup krwi opiera się na aglutynacji erytrocytów przez przeciwciała surowicy odpornościowej przeciwko antygenom grup krwi A(II), B(III). Kontrolę stanowi surowica niezawierająca przeciwciał, tj. grupa krwi AB(IV) i antygeny erytrocytów grupy A(P) i B(III). Jako kontrolę ujemną stosuje się krwinki czerwone grupy 0(I), ponieważ nie zawierają one antygenów.
Do określenia czynnika Rh stosuje się surowice anty-Rh (co najmniej dwie różne serie). Jeśli na błonie badanych erytrocytów znajduje się antygen Rh, następuje aglutynacja tych komórek.
13.3. Reakcja wytrącania
RP jest reakcją immunologiczną polegającą na oddziaływaniu przeciwciał z antygenami w obecności elektrolitów, a antygen jest w stanie rozpuszczalnym. Podczas wytrącania rozpuszczalne antygeny wytrącają się przez przeciwciała, co objawia się zmętnieniem w postaci pasm wytrącania. Gdy obydwa odczynniki zmiesza się w równoważnych proporcjach, obserwuje się powstawanie widocznego osadu. Nadmiar jednego z nich zmniejsza ilość wytrąconych kompleksów immunologicznych. Reakcję strącania można przeprowadzić na różne sposoby.
Reakcja wytrącania pierścienia umieszczone w rurkach opadowych o małej średnicy. Do probówki dodaje się surowicę odpornościową i ostrożnie nakłada się rozpuszczalny antygen. Jeśli wynik jest pozytywny, na styku obu roztworów tworzy się mleczny pierścień. Reakcja wytrącania pierścienia, która służy do określenia obecności antygenów w narządach i tkankach, których ekstrakty gotuje się i filtruje, nazywa się reakcją termoprecypitacji (reakcja Ascoli służąca do oznaczania termostabilnego antygenu wąglika).
Reakcja podwójnej immunodyfuzji Ouchterlony’ego. Reakcję tę prowadzi się w żelu agarowym. W warstwie żelu o jednakowej grubości wycina się w pewnej odległości od siebie studzienki i wypełnia je odpowiednio antygenem i surowicą immunologiczną. Następnie antygeny i przeciwciała dyfundują do żelu, spotykają się ze sobą i tworzą kompleksy immunologiczne, które wytrącają się w żelu i stają się widoczne w postaci precyzyjnych linii.
odżywianie. Reakcję tę można wykorzystać do identyfikacji nieznanych antygenów lub przeciwciał, a także do sprawdzenia podobieństwa między różnymi antygenami: jeśli antygeny są identyczne, linie precypitacji łączą się, jeśli antygeny nie są identyczne, linie precypitacji przecinają się, jeśli antygeny są częściowo identyczne, powstaje ostroga.
Reakcja promienistej immunodyfuzji. Do roztopionego żelu agarowego dodaje się przeciwciała i żel nakłada się równą warstwą na szkło. W żelu wycina się dołki i dodaje do nich standardową objętość roztworów antygenów o różnych stężeniach. Podczas inkubacji antygeny dyfundują promieniowo ze dołka i spotykając przeciwciała, tworzą pierścień strącający. Dopóki w dołku pozostaje nadmiar antygenu, następuje stopniowy wzrost średnicy pierścienia wytrącającego. Metodę tę stosuje się do oznaczania antygenów lub przeciwciał w roztworze testowym (np. do oznaczania stężenia immunoglobulin różnych klas w surowicy krwi).
Immunoelektroforeza. Mieszaninę antygenów rozdziela się elektroforetycznie, następnie do rowka biegnącego wzdłuż kierunku ruchu białka dodaje się wytrącającą surowicę odpornościową. Antygeny i przeciwciała dyfundują do żelu ku sobie; oddziałując ze sobą, tworzą łukowate linie opadów.
Reakcja flokulacji(według Ramona) – rodzaj reakcji strącania, która służy do określenia aktywności antytoksycznej surowicy lub toksoidu. Reakcję prowadzi się w probówkach. W probówce, w której toksoid i antytoksyna znajdują się w równoważnym stosunku, obserwuje się zmętnienie.
13.4. Reakcja wiązania dopełniacza
Przeciwciała, oddziałując z odpowiednim antygenem, wiążą dodany dopełniacz (1. system). Wskaźnikiem wiązania dopełniacza są erytrocyty uwrażliwione surowicą hemolityczną, tj. przeciwciała przeciwko krwinkom czerwonym (2. system). Jeśli uzupełnienie nie jest ustalone w pierwszym systemie, tj. Jeśli nie nastąpi reakcja antygen-przeciwciało, uczulone krwinki czerwone ulegają całkowitej lizie (reakcja ujemna). Kiedy dopełniacz jest wiązany przez kompleksy immunologiczne pierwszego układu po dodaniu uczulonych erytrocytów, dochodzi do hemolizy z
nieobecny (reakcja pozytywna). Reakcję wiązania dopełniacza stosuje się w diagnostyce chorób zakaźnych (rzeżączka, kiła, grypa itp.).
13,5. Reakcja neutralizacji
Drobnoustroje i ich toksyny mają szkodliwy wpływ na narządy i tkanki ludzkiego ciała. Przeciwciała są w stanie wiązać się z tymi szkodliwymi czynnikami i blokować je, tj. zneutralizować. Na tej cesze przeciwciał opiera się diagnostyczna reakcja neutralizacji. Przeprowadza się ją poprzez wprowadzenie mieszaniny antygen-przeciwciało do zwierząt lub do wrażliwych obiektów badawczych (hodowla komórkowa, zarodki). Na przykład, aby wykryć toksyny w materiale pacjenta, zwierzętom z 1. grupy wstrzykuje się materiał od pacjenta. Zwierzętom drugiej grupy wstrzykuje się podobny materiał, wstępnie traktowany odpowiednią surowicą odpornościową. Zwierzęta pierwszej grupy umierają, jeśli w materiale znajduje się toksyna. Druga grupa zwierząt przeżywa; szkodliwe działanie toksyny nie objawia się, ponieważ jest neutralizowane.
13.6. Reakcje z użyciem znakowanych przeciwciał lub antygenów
13.6.1. Reakcja immunofluorescencyjna (RIF, metoda Koonsa)
Metodę tę stosuje się do ekspresowej diagnostyki. Można go stosować do wykrywania zarówno antygenów drobnoustrojów, jak i przeciwciał.
Metoda bezpośrednia RIF- reakcja immunologiczna interakcji przeciwciał z antygenami, a przeciwciała są znakowane fluorochromem - substancją zdolną do emitowania kwantów światła o określonej długości fali pod wpływem światła o określonej długości fali. Specyfiką tej metody jest konieczność usunięcia nieprzereagowanych składników, aby wykluczyć wykrycie niespecyficznej luminescencji. Aby to zrobić, zmyj nieprzereagowane przeciwciała. Wyniki ocenia się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Bakterie w rozmazie potraktowanym takim luminescencyjnym serum świecą na ciemnym tle wzdłuż obwodu komórki.
Pośrednia metoda RIF jest używany częściej niż poprzedni. Reakcję tę przeprowadza się w dwóch etapach. W pierwszym etapie antygeny wchodzą w interakcję
oddziałują z odpowiednimi przeciwciałami, tworząc kompleksy immunologiczne. Wszystkie składniki, które nie przereagowały (tj. nie wchodzą w skład kompleksów immunologicznych) należy usunąć poprzez wypłukanie. W drugim etapie powstały kompleks antygen-przeciwciało wykrywa się za pomocą fluorochromizowanej surowicy antyglobulinowej. W rezultacie powstaje kompleks drobnoustroju + przeciwdrobnoustrojowe przeciwciała królicze + przeciwciała przeciwko immunoglobulinom króliczym, znakowane fluorochromem. Wyniki ocenia się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
13.6.2. Metoda lub test immunoenzymatyczny
ELISA - najczęstsza nowoczesna metoda, stosowany w diagnostyce zakażeń wirusowych, bakteryjnych, pierwotniakowych, w szczególności w diagnostyce zakażenia wirusem HIV, Wirusowe zapalenie wątroby itd.
Istnieje wiele modyfikacji testu ELISA. Powszechnie stosuje się niekonkurencyjny test ELISA na fazie stałej. Przeprowadza się je w 96-studzienkowych płytkach polistyrenowych (faza stała). Podczas przeprowadzania reakcji konieczne jest zmycie nieprzereagowanych składników na każdym etapie. Przy oznaczaniu przeciwciał do dołków, na których sorpcowane są antygeny, dodaje się badaną surowicę krwi, a następnie znakowaną enzymem surowicę antyglobulinową. Reakcję prowadzi się przez dodanie substratu dla enzymu. W obecności enzymu następuje zmiana substratu, a kompleks enzym-substrat dobiera się tak, aby powstały w reakcji produkt był zabarwiony. Zatem przy pozytywnej reakcji obserwuje się zmianę koloru roztworu. W celu oznaczenia antygenów nośnik fazy stałej uczula się przeciwciałami, następnie do antygenów dodaje się kolejno materiał testowy (antygeny) i surowicę znakowaną enzymem. Aby reakcja zaszła, dodaje się substrat dla enzymu. Zmiana koloru roztworu następuje w przypadku reakcji pozytywnej.
13.6.3. Immunoblot
Metoda ta opiera się na połączeniu elektroforezy i testu ELISA. Podczas wykonywania immunoblottingu (blotting z języka angielskiego. plama- plamka) złożoną mieszaninę antygenów poddaje się najpierw elektroforezie w żelu poliakryloamidowym. Powstały frakcjonowany anty-
peptydy genowe są przenoszone na membranę nitrocelulozową. Następnie bloty traktuje się znakowanymi enzymami przeciwciałami skierowanymi przeciwko specyficznemu antygenowi, tj. przeprowadzić blot ELISA. Immunoblotting stosuje się w diagnostyce infekcji, takich jak HIV.
13.6.4. Immunologiczna mikroskopia elektronowa
Metoda polega na mikroskopii mikroskop elektronowy wirusy (rzadziej inne drobnoustroje), poddane wstępnej obróbce odpowiednią surowicą immunologiczną znakowaną preparatami gęstymi elektronowo-optycznie, na przykład ferrytyną, białkiem zawierającym żelazo.
13,7. Cytometrii przepływowej
Komórki krwi różnicuje się na podstawie cytofluorometrii laserowej. W tym celu pożądane komórki barwi się fluorescencyjnymi przeciwciałami monoklonalnymi przeciwko antygenom CD. Próbka krwi po potraktowaniu znakowanymi przeciwciałami przepuszczana jest przez cienką rurkę, przez którą przechodzi wiązka lasera, która wzbudza fluorochrom do świecenia. Intensywność fluorescencji koreluje z gęstością antygenów na powierzchni komórki i można ją zmierzyć ilościowo za pomocą fotopowielacza. Uzyskane wyniki przekształcane są w histogram.
Do określenia służy cytometria przepływowa stan odporności(zawartość głównych populacji limfocytów, zawartość cytokin wewnątrzkomórkowych i zewnątrzkomórkowych, aktywność funkcjonalna komórek NK, aktywność fagocytozy itp.).
BADANIA IMMUNOMIKROBIOLOGICZNE
Metody immunologiczne stosuje się do rozwiązania wielu problemów:
1. Ocena stanu układ odpornościowy osoby (stan odporności) poprzez określenie ilościowe i cechy funkcjonalne komórki układu odpornościowego i ich produkty.
2. Oznaczanie składu i cech tkanek ludzkich: grupy krwi, czynnik Rh, antygeny transplantacyjne.
3. Diagnostyka chorób zakaźnych i odporności na nie poprzez wykrywanie i oznaczanie mian przeciwciał (serodiagnoza), identyfikację antygenów patogenów w organizmie oraz określenie reakcji komórkowych na te antygeny.
4. Identyfikacja seroidowa kultur bakterii i wirusów izolowanych z organizmu ludzi i zwierząt.
5. Wykrywanie w organizmie człowieka iw otoczenie zewnętrzne wszelkie substancje o właściwościach antygenowych lub haptenowych (hormony, enzymy, trucizny, leki, narkotyki itp.).
6. Identyfikacja stanów immunopatologicznych, alergii, reakcji transplantacyjnych i przeciwnowotworowych.
Proces interakcji pomiędzy antygenem i przeciwciałem reakcje serologiczne zachodzi w dwóch fazach:
1) konkretny- faza interakcji, w której następuje komplementarna kombinacja aktywnych centrów przeciwciał (paratopów) i epitopów antygenu. Zazwyczaj ta faza trwa kilka sekund lub minut;
2) niespecyficzny- faza manifestacji, scharakteryzowana znaki zewnętrzne powstawanie kompleksów immunologicznych. Faza ta może trwać od kilku minut do kilku godzin.
Optymalna specyficzna interakcja przeciwciał z antygenem zachodzi w roztworze izotonicznym o pH zbliżonym do obojętnego. Reakcji antygen-przeciwciało w układzie in vitro może towarzyszyć wystąpienie kilku zjawisk
· aglutynacja,
· opad atmosferyczny,
· Liza.
Objawy zewnętrzne reakcje zależą od właściwości fizykochemicznych antygenu (wielkość cząstek, stan fizyczny), klasę i rodzaj przeciwciał (pełne i niekompletne), a także warunki doświadczenia (konsystencja medium, stężenie soli, pH, temperatura).
Wielowartościowość antygenów i przeciwciał zapewnia pojawienie się agregatów widocznych gołym okiem. Dzieje się to zgodnie z teorią tworzenia sieci, zgodnie z którą do powstałego kompleksu antygen-przeciwciało przyłączane są kolejno inne przeciwciała i cząsteczki antygenu. W efekcie powstają struktury sieciowe, które zamieniają się w wytrącające się agregaty. Charakter i nasilenie reakcji zależą od ilościowego stosunku antygenów i przeciwciał. Najbardziej intensywne reakcje zachodzą, gdy odczynniki są w równoważnych proporcjach.
Warunek wstępny tworzenie sieci (sieci) - obecność więcej niż trzech determinant antygenowych dla każdej cząsteczki antygenu i dwóch centrów aktywnych dla każdej cząsteczki przeciwciała. Cząsteczki antygenu są węzłami sieci, a cząsteczki przeciwciał są ogniwami łączącymi. Obszar optymalnych stosunków (strefa równoważności) stężeń antygenu i przeciwciał, gdy po utworzeniu osadu w supernatancie nie wykrywa się ani wolnych antygenów, ani wolnych przeciwciał.
Agregaty, które mogą wytrącać się, powstają, gdy antygeny łączą się z pełnymi przeciwciałami. Przeciwciała niekompletne (jednowartościowe) nie powodują powstawania struktur sieciowych i dużych agregatów. Aby wykryć takie przeciwciała, użyj specjalne metody w oparciu o zastosowanie antyglobulin (reakcja Coombsa).
Testy serologiczne, ze względu na dużą swoistość i czułość, służą do wykrywania i ujęcie ilościowe antygeny i przeciwciała. Ilość immunoodczynników w reakcjach wyraża się mianem miana – maksymalnego rozcieńczenia surowicy lub antygenu, przy którym nadal obserwuje się reakcję.
Reakcje serologiczne w laboratoriach mikrobiologicznych i immunologicznych wykorzystywane są do dwóch celów:
1) do seroidentyfikacji drobnoustrojów, toksyn, antygenów ogólnie przy użyciu znanego przeciwciała (immunologicznej surowicy diagnostycznej),
2) do serodiagnostyki - określenie charakteru przeciwciał w surowicy krwi pacjenta na choroby bakteryjne, wirusowe i rzadziej inne choroby zakaźne przy użyciu znanego antygenu (diagnosticum).
Aby określić rodzaj, gatunek i typ antygenu, wymagane są znane surowice do diagnostyki immunologicznej. Uzyskuje się je poprzez wielokrotne podawanie zwierzętom (najczęściej królikom) w rosnących dawkach zabitych lub żywych mikroorganizmów, produktów ich rozkładu, toksyn zneutralizowanych lub natywnych. Po pewnym cyklu immunizacji zwierząt przeprowadza się masowe upuszczanie krwi lub całkowite wykrwawienie zwierzęcia. Krew pobraną do sterylnego pojemnika umieszcza się najpierw w termostacie w temperaturze 37°C na 4 – 6 godzin w celu przyspieszenia krzepnięcia, a następnie na jeden dzień w lodówce. Powstałą przezroczystą surowicę zasysa się do sterylnego pojemnika, dodaje konserwanty, określa się miano przeciwciał, sprawdza pod kątem sterylności i rozlewa do ampułek.
Są używane nieadsorbowane I zaadsorbowany surowice diagnostyczne. Niezaadsorbowane serum mają wysokie miana przeciwciała, ale są zdolne do wywoływania reakcji grupowych (krzyżowych).
Zaadsorbowane surowice charakteryzują się ścisłą swoistością działania (reagują jedynie z antygenem homologicznym). Nazywa się surowice zawierające przeciwciała tylko przeciwko jednemu specyficznemu antygenowi monoreceptor.
Produkują także surowice znakowane fluorochromami, enzymami i radioizotopami, które umożliwiają wykrycie nawet śladów antygenu z dużą dokładnością.
Zawiesiny żywych lub zabitych bakterii, produktów ich rozkładu, toksyn i wirusów stosuje się jako antygeny (diagnosticums) w reakcjach serologicznych. W niektórych przypadkach stosuje się ekstrakty lub chemicznie izolowane antygeny z mikroorganizmów i tkanek zwierzęcych.
Wszystkie metody immunomikrobiologiczne można podzielić na 3 grupy:
1) na podstawie bezpośrednie oddziaływanie antygenu z przeciwciałem(zjawiska aglutynacji, wytrącania, hemaglutynacji, immobilizacji itp.);
2) na podstawie pośrednie oddziaływanie antygenu z przeciwciałem(reakcje hemaglutynacja pośrednia, koaglutynacja, aglutynacja lateksowa, aglomeracja węgla, aglutynacja bentonitu, wiązanie dopełniacza itp.);
3) używanie znakowane przeciwciała lub antygeny(metoda fluorescencyjna, immunoenzymatyczna i radioimmunologiczna oraz inne metody).
REAKCJE Aglutynacji
Reakcje te obejmują antygeny w postaci cząstek (komórki drobnoustrojów, krwinki czerwone i inne antygeny korpuskularne), które są sklejane ze sobą przez przeciwciała i wytrącają się.
Aby przeprowadzić reakcję aglutynacji(RA) potrzebne są trzy składniki: 1) antygen (aglutynogen);
2) przeciwciało (aglutynina)
3) elektrolit (izotoniczny roztwór chlorku sodu).
Przybliżona reakcja aglutynacji (RA)
Wskaźnikowy lub płytkę RA umieszcza się na szkiełku w temperaturze pokojowej. W tym celu za pomocą pipety Pasteura nanieść na szybę kroplę surowicy w rozcieńczeniu od 1:10 do 1:20 i oddzielnie kroplę kontrolną izotonicznego roztworu chlorku sodu. Do obu pętli bakteriologicznych wprowadza się kolonie lub codzienną hodowlę bakterii (kropla Diagnostyka) i dokładnie miesza. Reakcje ocenia się wizualnie po kilku minutach, czasami przy użyciu szkła powiększającego (x5). W przypadku dodatniego RA obserwuje się pojawienie się dużych i małych płatków w kropli surowicy; w przypadku ujemnego RA surowica pozostaje jednolicie mętna.
Szczegółowa reakcja aglutynacji w celu określenia miana swoistych przeciwciał u pacjenta.
Pełnoobjawowe RZS do celów serodiagnostyki przeprowadza się w surowicy pacjentów. Rozcieńcza się go także w izotonicznym roztworze chlorku sodu w proporcjach 1:50 – 1:100 do 1:800 lub 1:1600. Ponieważ niższe miana surowicy mogą zawierać normalne aglutyniny występujące w zdrowi ludzie lub pacjenci z inną diagnozą (miano diagnostyczne). Jako antygen w tej reakcji stosuje się środki diagnostyczne – znane zawiesiny, zwykle zabitych bakterii.
Do probówek aglutynacyjnych wlewa się najpierw 1 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu. Do pierwszego z nich dodaje się 1 ml surowicy rozcieńczonej 1:100, po wymieszaniu 1 ml przenosi się do drugiego, z drugiego do trzeciego itd. Do otrzymanych dwukrotnych rozcieńczeń surowic (od 1:100 do 1:1600 lub więcej) dodaje się 1-2 krople zawiesiny bakteryjnej zawierającej 3 miliardy ciał drobnoustrojów w 1 ml. Probówki wytrząsa się i umieszcza w termostacie w temperaturze 37°C na 2 godziny, następnie utrzymuje w temperaturze pokojowej na 24 godziny.
Szczegółową reakcję aglutynacji uwzględnia się oceniając kolejno każdą probówkę, zaczynając od kontrolnej, delikatnie potrząsając. W probówkach kontrolnych nie powinno występować aglutynacja. Intensywność reakcji aglutynacji oznacza się następującymi znakami: ++++ - aglutynacja całkowita (aglutynacja płatków w całkowicie przezroczystej cieczy); +++ - niepełna aglutynacja (płatki w lekko opalizującej cieczy); ++ - częściowa aglutynacja (płatki są wyraźnie widoczne, płyn jest lekko mętny); + - słaba, wątpliwa aglutynacja - ciecz jest bardzo mętna, zawarte w niej płatki są słabo rozróżnialne; - - brak aglutynacji (płyn jest jednolicie mętny).
Za miano surowicy przyjmuje się jej ostatnie rozcieńczenie, w którym intensywność aglutynacji ocenia się na co najmniej dwa plusy (++)
Reakcja aglutynacji Reakcja aglutynacji
(RA) to metoda identyfikacji i oznaczania ilościowego Ag i Ab w oparciu o ich zdolność do tworzenia aglomeratów widocznych gołym okiem. Na oddziale chorób zakaźnych. chorób lub do innych celów służy do identyfikacji nieznanych drobnoustrojów i komórek, do określenia obecności i ilości Ab we krwi i innych płynach. Zasada determinacji opiera się na specyfice oddziaływania Ag i Ab i polega na odnajdywaniu znanego od nieznanego. Istnieje wiele opcji dla RZS: ilościowe i jakościowe, probówkowe i szklane, wolumetryczne i kropelkowe, konwencjonalne, przyspieszone i ekspresowe. Do etapu RA potrzebujesz: 1) s-ka krew. W wariancie z określeniem rodzaju (var) bakterii stosuje się przemysłowe testy aglutynacyjne, otrzymywane w wyniku immunizacji królików. W wariancie z określeniem rodzaju Ab, z badania pobierana jest próbka krwi. ludzie lub zwierzęta. Roztwór musi być sterylny i wolny od zawieszonych cząstek. Przygotować podstawowe rozcieńczenie w roztworze soli. Powinno być 2-4 razy niższe od miana diagnostycznego dla tej choroby; 2) Ag. W wersji reakcji z oznaczeniem typu Ab stosuje się przemysłowe zestawy diagnostyczne; w wariancie z oznaczaniem Ag preparaty diagnostyczne sporządza się samodzielnie w postaci 1-3 miliardowej zawiesiny w roztworze soli 18-20-godzinnego testu agarowego (rzadziej bulionowego). drobnoustrój inaktywowany poprzez ogrzewanie w łaźni wodnej w temperaturze 70°C przez 1 godzinę lub przez 24-godzinną inkubację w temperaturze 37°C z formaldehydem (końcowe stężenie 0,2%); 3) elektrolit w postaci roztworu soli. Technika inscenizacji wolumetryczna rurka szeregowa RA w celu określenia miana Ab w s-ki: z głównego rozcieńczenia s-ki przygotowuje się kilka rzędów rozcieńczeń roboczych. Liczba rzędów zależy od liczby diagnostyk wziętych do doświadczenia; liczba i współczynniki rozcieńczenia zależą od miana diagnostycznego podejrzanej choroby. Seria musi zawierać co najmniej rozcieńczenie odpowiadające miano diagnostycznemu Ab, dwa rozcieńczenia poniżej i dwa rozcieńczenia powyżej. np. jeśli miano diagnostyczne wynosi 1:100, to przy wolumetrycznej metodzie oceny stopnia zaawansowania RZS należy przygotować następujące rozcieńczenia: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; za pomocą kroplówki metody pierwsze rozcieńczenie (1:25) nie jest konieczne, ale wymagane jest kolejne większe rozcieńczenie - 1:800 B. badania naukowe s-ku jest miareczkowane do reakcja negatywna. Rozcieńcza się w następujący sposób: 0,25 ml roztworu soli wlewa się do wszystkich probówek z wyjątkiem pierwszej, gdy reakcję prowadzi się w objętości 0,5 ml i 0,5 ml, gdy reakcję prowadzi się w objętości 1 ml Wlać 0,25 (0,5) ml głównego rozcieńczenia do 1. i 2. probówki, z 2. probówki do odciętej objętości i hodowla s-k i zwiększono 2 razy, 0,25 (0,5) ml przenosi się na 3., z 3. na 4. itd. do końca, z nacięcia wlewa się do wszystkiego 0,25 (0,5) ml, aby zrównoważyć objętości. Każde rozcieńczenie przeprowadza się za pomocą osobnej pipety. Jeśli do doświadczenia zostanie wziętych kilka diagnostyk, to dla każdego z nich w ten sam sposób przygotowuje się własną serię rozcieńczeń. Do każdego rozcieńczenia probówki dodaje się Diagnosticum w objętości równej objętości probówki, w wyniku czego rozcieńczenie w każdej probówce ulega podwojeniu. Doświadczenie odpowiada kontroli s-ki (0,25 - 0,5 ml głównego rozcieńczenia s-ki i taka sama ilość roztworu soli) i kontroli Ag (0,25 - 0,5 ml Diagnosum i taka sama ilość roztworu soli). Jeżeli w eksperymencie wykorzystano kilka środków diagnostycznych, wówczas każdy miał własną kontrolę antygenową. Statyw z probówkami dobrze wytrząsa się i umieszcza w termostacie w temperaturze 37°C na 4 godziny, a następnie pozostawia w temperaturze pokojowej do następnego dnia, po czym rejestruje się PA na podstawie ilości osadu i stopnia oczyszczenia płyn. Oznaczanie tych wskaźników, w zależności od charakteru aglutynianów, przeprowadza się gołym okiem na ciemnym tle, w aglutynoskopie lub nad wklęsłą powierzchnią zwierciadła mikroskopu. Rozliczanie rozpoczyna się od kontroli: kontrola C powinna być przezroczysta, Ag powinna być równomiernie mętna (po wstrząśnięciu probówki). Jeżeli kontrole są dobre, należy ustalić obecność i stopień aglutynacji we wszystkich probówkach, co jest oznaczone plusami: duży osad i całkowite oczyszczenie cieczy - 4 plusy; duży osad i niepełne oczyszczenie cieczy - 3 plusy; zauważalny osad i zauważalne przejaśnienie płynu to 2 plusy. Następnie określa się miano: najwyższe rozcieńczenie o intensywności aglutynacji co najmniej 2 plusy. Badania miana s-ki porównuje się z mianem diagnostycznym tej choroby. Jeśli zbadane zostanie miano. s-ki jest 2 razy mniejsze od wartości diagnostycznej, reakcję ocenia się jako wątpliwą; jeśli miano jest równe diagnostyka - jak słabo pozytywny; jeśli jest 2-4 razy wyższy, uważa się go za dodatni; jeśli jest 8 lub więcej razy wyższy, uważa się go za zdecydowanie dodatni. Jeżeli Ab jest powszechne u zdrowych osób, do oceny RZS wykorzystuje się wzrost miana Ab. Aby określić typ Ar w seryjnym RA, liczba wierszy musi odpowiadać liczbie pobranej do identyfikacji testy diagnostyczne. Z głównego rozcieńczenia testu diagnostycznego przygotowuje się serię kolejnych dwukrotnych rozcieńczeń w taki sam sposób jak w RZS w celu określenia miana Ab. Współczynniki rozcieńczenia zależą od miana testu aglutynującego. W doświadczeniu konieczna jest obecność rozcieńczenia równego miano testu, a także 2, 4, 6, 8 razy mniejsze. Na przykład, jeśli miano testu diagnostycznego wynosi 1 3200, wówczas należy zastosować rozcieńczenia 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 Do rozcieńczeń testu dodaje się tę samą objętość badanego Ag, w efekcie rozcieńczenie test wzrasta 2 razy. Do eksperymentu dodaje się 2 kontrole testu i Ag. Jeśli w eksperymencie bierze udział kilka s-k, wówczas każdy z nich potrzebuje własnej kontroli. Po zakończeniu reakcji stanowisko jest energicznie wstrząśnięte i umieszczone w termostacie w temperaturze 37 ° C. Wyniki są brane pod uwagę w sposób opisany powyżej. Ocena reakcji ma cechy w celu wyciągnięcia wniosku na temat zgodności badania. Ag biorąc pod uwagę doświadczenie, miano reakcji musi odpowiadać co najmniej połowie miana standardowego testu diagnostycznego. Miana 1 4 i mniejsze uważa się za reakcję grupową Kroplówka md Stopień zaawansowania RA różni się od wolumetrycznego tym, że s-ku rozcieńcza się w objętości 1 ml, Ag stosuje się w większym stężeniu (10 miliardów/ml) i dodaje się go 1 - 2 wpada do probówki Rozcieńczenie leku po dodaniu Ag uważa się za niezmienione. W przeciwnym razie sposób ustawiania, rejestrowania i oceny jest podobny do metody wolumetrycznej
(Źródło: Słownik terminów mikrobiologicznych)
Reakcja aglutynacji.
Reakcja aglutynacji to sklejanie i wytrącanie komórek drobnoustrojów lub innych komórek (erytrocytów) pod wpływem przeciwciał w obecności elektrolitu. Widocznym efektem reakcji (zjawiskiem aglutynacji) jest wytrącenie się osadu zwanego aglutynianem.
Reakcja ta służy do serodiagnoza I seroidentyfikacja. RA służy do serodiagnostyki (wykrywania przeciwciał w surowicy krwi pacjentów) dur brzuszny i paratyfus(Reakcja Vidala), bruceloza(reakcja Wrighta) tularemia i leptospiroza. RA służy do seroidentyfikacji (określenia rodzaju patogenu wyizolowanego od pacjenta). infekcje jelitowe, krztusiec, cholera itd.
składnikireakcje:
1. A ntigen (aglutynogen) – są to całe (nie zniszczone) komórki drobnoustrojów lub innych komórek ( korpuskularny, nierozpuszczalny antygen). Aglutynogeny- to jest zawieszenie żywy Lub zabity komórki drobnoustrojów lub inne komórki. Antygeny mogą być nieznane lub znane. Nieznany aglutynogen to kultura drobnoustrojów wyizolowana z organizmu pacjenta, którą należy oznaczyć. Znany antygen – diagnostyka– lek diagnostyczny – zawieszenie zmarłych mikroby znane gatunki w roztworze soli. To zawieszenie mętny (nieprzezroczysty), ponieważ komórki drobnoustrojów nie rozpuszczają się, lecz pozostają nienaruszone. Znany aglutynogen zostanie wykorzystany do wykrycia nieznanych przeciwciał w surowicy krwi pacjentów.
2. Przeciwciało (aglutynina)– występuje w surowicy krwi. Przeciwciała mogą być również nieznane lub znane. W surowicy krwi znajdują się nieznane przeciwciała, które należy oznaczyć chora osoba. Znane przeciwciała występują w odporny surowice diagnostyczne które nazywane są aglutynujące surowice. Służą do seroidentyfikacji, tj. w celu określenia nieznanego antygenu - rodzaj hodowli drobnoustrojów.
3. Elektrolit– 0,9% roztwór chlorku sodu.
Metody oceny stopnia zaawansowania RZS.
1. Przybliżony (lamelarny) RA– wykonane na szkle. Na szkiełko nałożyć 2 krople serum i 1 kroplę roztworu izotonicznego. Hodowlę drobnoustrojów dodaje się w pętli do jednej z kropli surowicy oraz do kropli roztworu izotonicznego i miesza. Kropla roztworu izotonicznego z zarazkami – kontrola antygenu, Kropla serum wolne od zarazków – kontrola przeciwciał, Kropla serum z drobnoustrojami – doświadczenie. Jeśli surowica zawiera przeciwciała odpowiadające antygenom drobnoustrojów, które się z nią mieszają, wówczas przeciwciała i antygeny specyficznie się ze sobą zwiążą i po 1–3 minutach w kropli testowej pojawią się płatki aglutynacji. Kontrola antygenowa powinna być mętna, a kontrola przeciwciał powinna być klarowna. Wyniki reakcji rejestruje się na podstawie pojawienia się płatków aglutynatu . Jeśli wypadną płatki, reakcja jest pozytywna, tj. Antygen odpowiada przeciwciału i antygen można zastosować do określenia przeciwciała lub odwrotnie. Jeżeli zmętnienie utrzymuje się, reakcja jest negatywna.
2. Szczegółowa reakcja aglutynacji - przeprowadzane w probówkach. Najpierw należy przygotować 2-krotne rozcieńczenia surowicy krwi chorego od 1:50 do 1:1600. Do 6 probówek wlewa się 1 ml izotonicznego roztworu chlorku sodu. Do pierwszej probówki dodaje się 1 ml surowicy krwi pacjenta w rozcieńczeniu 1:50, miesza i otrzymuje rozcieńczenie 1:100, następnie do drugiej probówki przenosi się 1 ml w rozcieńczeniu 1:100 i otrzymuje się rozcieńczenie 1:200, itd. Dwie probówki przechowuje się w celu kontroli antygenu i surowicy. Do kontroli surowicy dodać wyłącznie surowicę w rozcieńczeniu 1:50, do kontroli antygenowej – tylko antygen. Do wszystkich pozostałych probówek dodać 0,1 ml antygenu diagnostycznego (O- lub H-) i umieścić wszystkie probówki w termostacie w temperaturze 37°C na 18-20 godzin. Wyniki reakcji rejestruje się w zależności od charakteru, ilości utworzonego osadu (aglutynatu) i stopnia zmętnienia. Rozliczanie przeprowadza się tylko dla następujących wyników w kontrolach: kontrola surowicy – przezroczysta, kontrola antygenu – mętna. O-przeciwciała dają drobnoziarnisty osad. Przeciwciała H – gruboziarniste. Ustala się to na podstawie ostatniej probówki, w której nadal widoczna jest reakcja aglutynacji miano diagnostyczne.
W serodiagnostyce chorób ważne jest nie tylko wykrycie swoistych przeciwciał przeciwko konkretnemu patogenowi, ale także określenie ich ilości, tj. ustalić takie miano przeciwciał, gdy można mówić o obecności choroby wywołanej tym patogenem. Miano to nazywane jest mianem diagnostycznym. Na przykład, aby zdiagnozować dur brzuszny, należy określić miano przeciwciał wynoszące 1:400, ale nie mniej. Jeszcze dokładniejsze wyniki uzyskuje się wykrywając wzrost przeciwciał w sparowanych surowicach. Surowicę pacjenta pobiera się na początku choroby oraz po 3–5 i więcej dniach. Jeśli miano przeciwciał wzrośnie co najmniej 4 razy, możemy mówić o aktualnej chorobie.
