Aglutinační reakce (z lat. aglutinatio- lepení) - lepení tělísek (bakterií, červených krvinek atd.) protilátkami za přítomnosti elektrolytů.
Aglutinační reakce se projevuje ve formě vloček nebo sedimentu složených z tělísek (např. bakterií) „slepených“ protilátkami (obr. 7.37). Aglutinační reakce se používá k: stanovení patogenu izolovaného z pacienta; stanovení protilátek v krevním séru pacienta; stanovení krevních skupin.
Rýže. 7,37 a, b. Aglutinační reakce sIgM-protilátky (a) aIgG- protilátky (b)
1. Stanovení patogenu izolovaného od pacienta Přibližná reakce aglutinace na skle (obr. 7.38). Suspenze bakterií izolovaných z pacienta se přidá ke kapce aglutinačního séra (ředění 1:20). Vytvoří se vločkovitá sraženina.
Rýže. 7.38.
Rozsáhlá aglutinační reakce s patogenem izolovaným z pacienta (obr. 7.39). Suspenze bakterií izolovaných z pacienta se přidá k ředěním aglutinačního séra.
Rýže. 52
2. Stanovení protilátek v krevním séru pacienta
Detailní aglutinační reakce s krevním sérem pacienta (obr. 7.39). Diagnosticum se přidává do ředění pacientova séra.
- Aglutinace pomocí O-diagnosticum (bakterie usmrcená teplem, zadržující O-antigen) probíhá ve formě jemnozrnné aglutinace.
- Aglutinace pomocí H-diagnosticum (bakterie usmrcené formaldehydem, zadržující bičíkový H-antigen) je velká a probíhá rychleji.
3. Aglutinační reakce pro stanovení krevních skupin Aglutinační reakce ke stanovení krevních skupin slouží k založení ABO systému (tab. b) pomocí aglutinace erytrocytů imunitními sérovými protilátkami proti antigenům krevních skupin A (I), B (III). Kontrolou je: sérum, které neobsahuje protilátky, tzn. krevní skupina AB (IV) v séru; antigeny obsažené v červených krvinkách skupin A (II), B (III). Negativní kontrola neobsahuje antigeny, tj. jsou použity erytrocyty skupiny O (I).
Tabulka 7.6. Stanovení krevních skupin ABO
| Výsledky reakce |
Skupina |
|
|
patřící |
||
|
zkoumal |
||
|
červené krvinky s |
sérum (plazma) |
|
|
Standard |
se standardem |
|
|
séra | ||
Detailní aglutinační reakce (RA). Ke stanovení AT v krevním séru pacienta a rozsáhlá aglutinační reakce (RA). K tomu se do řady ředění krevního séra přidává diagnostikum - suspenze usmrcených mikroorganismů nebo částic se sorbovaným Ag. Poskytování maximálního ředění aglutinace Ag se nazývá sérový titr.
Typy aglutinačních reakcí (RA) k průkazu AT - kapkový test na tularémii (s diagnostikem aplikovaným na kapku krve a výskytem viditelných bělavých aglutinátů) a Huddlesonův test na brucelózu (s diagnostickým testem obarveným genciánovou violetí aplikovaným na kapku krve sérum).
Přibližná aglutinační reakce (RA)
K identifikaci izolovaných mikroorganismů se na podložní sklíčka umístí přibližná RA. K tomu se ke kapce standardního diagnostického antiséra (ředěného 1:10, 1:20) přidá kultura patogenu. Na pozitivní výsledek proveďte podrobnou reakci se zvyšujícím se ředěním antiséra.
Reakce za pozitivní, pokud je aglutinace pozorována v ředěních blízkých titru diagnostického séra.
OAS. Somatické O-Ags jsou tepelně stabilní a snesou var 2 hod. Při interakci s AT tvoří jemnozrnné agregáty.
Kobylka. N-Ag (bičíkaté) jsou termolabilní a rychle se rozkládají při 100 °C i vlivem etanolu. Při reakcích s H-antisérem se po 2 hodinách inkubace tvoří volné velké vločky (tvořené slepením bakterií s bičíky).
Vi-Ar tyfus je relativně tepelně stabilní (odolává teplotám 60-62 °C po dobu 2 hodin); Při inkubaci s Vi antisérem se vytvoří jemnozrnný aglutinát.
Přímé hemaglutinační reakce
Nejjednodušší z nich reakce - aglutinacečervené krvinky neboli hemaglutinace, používané k určení krevních skupin v systému ABO. Pro určení aglutinace(nebo jejich nedostatek) použijte standardní antiséra s anti-A a anti-B aglutininy. Reakce se nazývá přímá, protože zkoumané Ag jsou přirozené složky červených krvinek.
Společné s přímou hemaglutinaci virová hemaglutinace má mechanismy. Řada virů je schopna spontánně aglutinovat erytrocyty ptáků a savců, jejich přidání do suspenze erytrocytů z nich způsobuje tvorbu agregátů.
Aglutinační reakce Aglutinační reakce
(RA) - metoda identifikace a kvantifikace Ag a At, na základě jejich schopnosti tvořit aglomeráty viditelné pouhým okem. Na oddělení infekčních nemocí. onemocnění nebo pro jiné účely se používá k identifikaci neznámých mikrobů a buněk, ke stanovení přítomnosti a množství Ab v krvi a jiných tekutinách. Princip stanovení je založen na specifičnosti interakce mezi Ag a Ab a spočívá v nalezení známého od neznámého. Existuje mnoho možností pro RA: kvantitativní a kvalitativní, zkumavky a skleněné, objemové a kapkové, konvenční, zrychlené a expresní metody. Pro fázi RA potřebujete: 1) s-ka krev. Ve variantě s určením typu (var) bakterií jsou použity průmyslové aglutinační testy vyrobené imunizací králíků. Ve variantě s určením typu Ab je z testu odebrán vzorek krve. lidí nebo zvířat. Roztok musí být sterilní a bez suspendovaných částic. Připravte základní ředění ve fyziologickém roztoku. Měl by být 2-4krát nižší než diagnostický titr pro toto onemocnění; 2) Ag. Ve verzi reakce s určením typu Ab se používají průmyslové diagnostické soupravy; ve variantě se stanovením Ag se diagnostika připravují sama ve formě suspenze 1-3 miliardy ve fyziologickém roztoku 18-20hodinového agarového (méně často bujónového) testu. mikrob inaktivovaný zahříváním ve vodní lázni při 70 °C po dobu 1 hodiny nebo 24hodinovou inkubací při 37 °C s formaldehydem (konečná koncentrace 0,2 %); 3) elektrolyt ve formě solného roztoku. Inscenační technika objemová sériová trubice RA pro stanovení titru Ab v s-ki: z hlavního ředění s-ki se připraví několik řad pracovních ředění. Počet řádků závisí na počtu diagnostických vyšetření v experimentu, počet a diluční faktory jsou určeny diagnostickým titrem suspektního onemocnění. Série musí obsahovat alespoň ředění odpovídající diagnostickému titru Ab, dvě ředění pod ním a dvě ředění nad ním. je-li například diagnostický titr 1:100, pak s volumetrickou metodou stagingu RA by měly být připraveny následující ředění: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1"400; s kapáním metoda, první ředění (1:25) není potřeba, ale je potřeba další vyšší ředění - 1:800. vědecký výzkum s-ku se titruje na negativní reakce. Ředí se následovně: 0,25 ml fyziologického roztoku se nalije do všech zkumavek kromě 1., kdy se reakce provádí v objemu 0,5 ml, a 0,5 ml, pokud se reakce provádí v objemu 1. ml. Nalijte 0,25 (0,5) ml hlavního ředění do 1. a 2. zkumavky, z 2. zkumavky, do odříznutého objemu a chovný s-k a zvýšené 2x se převede 0,25 (0,5) ml na 3., z 3. na 4. atd. do posledního se z odřezku do všeho nalije 0,25 (0,5) ml, aby se vyrovnaly objemy. Každé ředění se provádí pomocí samostatné pipety. Pokud se do experimentu vezme několik diagnostik, pak se pro každé z nich připraví jeho vlastní série ředění stejným způsobem. Diagnosticum se přidává do každého ředění zkumavky v objemu rovném objemu zkumavky, v důsledku čehož se ředění v každé zkumavce zdvojnásobí. Experiment odpovídá kontrole s-ki (0,25 - 0,5 ml hlavního ředění s-ki a stejné množství fyziologického roztoku) a kontrole Ag (0,25 - 0,5 ml diagnostika a stejné množství fyziologického roztoku). Pokud je v experimentu použito několik diagnostických prostředků, pak má každý svou vlastní antigenní kontrolu. Stojan se zkumavkami se dobře protřepe a umístí na 4 hodiny do termostatu při 37 °C a poté se nechá při pokojové teplotě do druhého dne, poté se zaznamená PA na základě množství sedimentu a stupně vyjasnění. kapalina. Stanovení těchto indikátorů v závislosti na povaze aglutinátů se provádí pouhým okem na tmavém pozadí, v aglutinoskopu nebo přes konkávní povrch zrcátka mikroskopu. Počítání začíná kontrolami: kontrola C by měla být průhledná, Ag by mělo být rovnoměrně zakalené (po protřepání zkumavky). Pokud jsou kontroly dobré, zjistěte přítomnost a stupeň aglutinace ve všech zkumavkách, které jsou označeny plusy: velký sediment a úplné vyčeření kapaliny - 4 plusy; velký sediment a neúplné čištění kapaliny - 3 plusy; znatelný sediment a znatelné čištění kapaliny jsou 2 plusy. Poté se stanoví titr: nejvyšší ředění s intenzitou aglutinace alespoň 2 plusy. Výzkum titru s-ki jsou porovnány s diagnostickým titrem pro toto onemocnění. Pokud se vyšetřuje titr. s-ki je 2x nižší než diagnostická hodnota, reakce je hodnocena jako pochybná; pokud je titr stejný diagnostika - jak slabě pozitivní; je-li 2-4krát vyšší, považuje se za kladný, je-li 8krát a vícekrát vyšší, považuje se za ostře pozitivní. S rozšířenou distribucí Ab zdravých lidí K posouzení RA se používá zvýšení titru Ab. Pro určení typu Ar v sériovém RA musí počet řádků odpovídat počtu použitému pro identifikaci diagnostické testy. Z hlavního ředění diagnostického testu se připraví série po sobě jdoucích dvojnásobných ředění stejným způsobem jako u RA pro stanovení titru Ab. Faktory ředění závisí na titru aglutinačního testu.V experimentu je nutná přítomnost ředění rovného titru testu a také 2, 4, 6, 8 krát nižšího než je. titr diagnostického testu je 1 3200, pak byste měli použít ředění 1 3200, 1 1600, 1 800, 1 400, 1 200 Stejný objem testovaného Ag se přidá do ředění testu, výsledkem je ředění test se zvýší 2krát.Do experimentu se přidají 2 kontroly testu a Ag. Pokud je v experimentu zapojeno několik s-k, pak každý z nich potřebuje svou kontrolu Po dokončení reakce se stojanem silně zatřese a umístí v termostatu při 37 ° C. Výsledky se berou v úvahu, jak je popsáno výše.. Hodnocení reakce má vlastnosti Aby bylo možné vyvodit závěr o souladu studie. Ag vzatý do experimentu musí titr reakce odpovídat alespoň polovině titru standardního diagnostického testu Titry 1 4 a nižší jsou považovány za skupinovou reakci Kapat md staging RA se od volumetrického liší tím, že s-ku se ředí v objemu 1 ml, Ag se používá ve vyšší koncentraci (10 miliard/ml) a přidává se 1 - 2 kapky do zkumavky Ředění léčiva po přidání Ag se považuje za nezměněné Jinak je způsob nastavení, zaznamenávání a vyhodnocení obdobný jako u objemové metody
(Zdroj: Slovník pojmů mikrobiologie)
IMUNOMIKROBIOLOGICKÉ STUDIE
Imunologické metody se používají k řešení mnoha problémů:
1. Posouzení stavu imunitní systém osoba ( imunitní stav) podle definice kvantitativního a funkční charakteristiky buňky imunitního systému a jejich produkty.
2. Stanovení složení a vlastností lidských tkání: krevní skupiny, Rh faktor, transplantační antigeny.
3. Diagnostika infekčních onemocnění a rezistence vůči nim detekcí a stanovením titrů protilátek (sérodiagnostika), identifikací antigenů patogenů v těle a stanovením buněčných reakcí na tyto antigeny.
4. Seroidní identifikace kultur bakterií a virů izolovaných z těla lidí a zvířat.
5. Detekce v lidském těle a v vnější prostředí jakékoli látky s antigenními nebo haptenovými vlastnostmi (hormony, enzymy, jedy, léky, léky atd.).
6. Identifikace imunopatologických stavů, alergií, transplantačních a protinádorových reakcí.
Proces interakce mezi antigenem a protilátkou sérologické reakce probíhá ve dvou fázích:
1) charakteristický- fáze interakce, ve které dochází ke komplementární kombinaci aktivních center protilátek (paratopů) a epitopů antigenu. Tato fáze obvykle trvá několik sekund nebo minut;
2) nespecifické- fáze projevu, charakter vnější znaky tvorba imunitních komplexů. Tato fáze může trvat několik minut až několik hodin.
K optimální specifické interakci protilátek s antigenem dochází v izotonickém roztoku s pH blízkým neutrálnímu. Reakce antigen-protilátka v systému in vitro může být doprovázena výskytem několika jevů
· aglutinace,
· srážky,
· lýza.
Vnější projevy reakce závisí na fyzikálně-chemických vlastnostech antigenu (velikost částic, fyzický stav), třída a typ protilátek (kompletní a neúplné), stejně jako experimentální podmínky (konzistence média, koncentrace soli, pH, teplota).
Polyvalence antigenů a protilátek zajišťuje tvorbu agregátů viditelných pouhým okem. K tomu dochází v souladu s teorií tvorby sítě, podle níž jsou na výsledný komplex antigen-protilátka postupně připojeny další molekuly protilátky a antigenu. V důsledku toho se tvoří síťové struktury, které se mění v agregáty, které se vysrážejí. Povaha a závažnost reakce závisí na kvantitativním poměru antigenů a protilátek. Nejintenzivnější reakce nastanou, když jsou reagencie v ekvivalentních poměrech.
Předpoklad tvorba mřížky (sítě) - přítomnost více než tří antigenních determinant pro každou molekulu antigenu a dvou aktivních center pro každou molekulu protilátky. Molekuly antigenu jsou uzly mřížky a molekuly protilátek jsou spojovací články. Oblast optimálních poměrů (zóna ekvivalence) koncentrací antigenu a protilátek, kdy po vytvoření sedimentu nejsou v supernatantu detekovány volné antigeny ani volné protilátky.
Agregáty, které se mohou vysrážet, se tvoří, když se antigeny spojí s plnými protilátkami. Nekompletní protilátky(monovalentní) nezpůsobují tvorbu síťových struktur a velkých agregátů. K detekci takových protilátek použijte speciální metody založené na použití antiglobulinů (Coombsova reakce).
Sérologické reakce se pro svou vysokou specificitu a senzitivitu používají k průkazu a kvantifikaci antigenů a protilátek. Množství imunoreagentů v reakcích je vyjádřeno titrem - maximálním ředěním séra nebo antigenu, při kterém je ještě pozorována reakce.
Sérologické reakce v mikrobiologických a imunologických laboratořích se používají ke dvěma účelům:
1) pro séroidentifikaci mikroorganismů, toxinů, antigenů obecně pomocí známé protilátky (imunitní diagnostické sérum),
2) pro sérodiagnostiku - stanovení povahy protilátky v krevním séru pacienta na bakteriální, virová a méně často jiná infekční onemocnění pomocí známého antigenu (diagnosticum).
K určení generika, druhu a typu antigenu jsou nutné známé imunitní testy. diagnostická séra. Získávají se opakovaným podáváním zvířatům (nejčastěji králíkům) ve zvyšujících se dávkách usmrcených nebo živých mikroorganismů, produktů jejich rozkladu, neutralizovaných nebo nativních toxinů. Po určitém cyklu imunizace zvířat se provádí masivní prokrvení nebo celkové vykrvení zvířete. Krev odebraná do sterilní nádoby se nejprve umístí do termostatu při teplotě 37°C na 4 - 6 hodin pro urychlení srážení, poté na jeden den do lednice. Vzniklé průhledné sérum se odsaje do sterilní nádobky, přidají se konzervační látky, stanoví se titr protilátek, zkontroluje se sterilita a nalije se do ampulí.
Jsou používány neadsorbovaný A adsorbované diagnostická séra. Neadsorbovaná séra mají vysoké titry protilátky, ale jsou schopny poskytnout skupinové (křížové) reakce.
Adsorbovaná séra se vyznačují přísnou specificitou účinku (reagují pouze s homologním antigenem). Nazývají se séra obsahující protilátky pouze proti jednomu specifickému antigenu monoreceptor.
Produkují také séra značená fluorochromy, enzymy a radioizotopy, které umožňují s vysokou přesností detekovat i stopy antigenu.
Suspenze živých nebo usmrcených bakterií, produktů jejich rozpadu, toxinů a virů se používají jako antigeny (diagnostika) v sérologických reakcích. V některých případech se používají extrakty nebo chemicky izolované antigeny z mikroorganismů a živočišných tkání.
Všechny imunomikrobiologické metody lze rozdělit do 3 skupin:
1) na základě přímá interakce antigenu s protilátkou(jevy aglutinace, precipitace, hemaglutinace, imobilizace atd.);
2) na základě zprostředkovaná interakce antigenu s protilátkou(reakce nepřímá hemaglutinace koagulace, latexová aglutinace, uhlíková aglomerace, bentonitová aglutinace, fixace komplementu atd.);
3) pomocí značené protilátky nebo antigeny(metoda fluorescenčních protilátek, enzymatické imunoanalýzy a radioimunoanalýzy a další metody).
AGLUTINAČNÍ REAKCE
Tyto reakce zahrnují antigeny ve formě částic (mikrobiálních buněk, červených krvinek a dalších korpuskulárních antigenů), které jsou slepeny dohromady protilátkami a vysrážejí se.
K provedení aglutinační reakce(RA) jsou zapotřebí tři složky: 1) antigen (aglutinogen);
2) protilátka (aglutinin)
3) elektrolyt (izotonický roztok chloridu sodného).
Přibližná aglutinační reakce (RA)
Indikativní nebo destička RA se umístí na podložní sklíčko při pokojové teplotě. K tomu použijte Pasteurovu pipetu a naneste odděleně na sklenici kapku séra v ředění 1:10 až 1:20 a kontrolní kapku izotonického roztoku chloridu sodného. Do obou bakteriologických smyček se zavedou kolonie nebo denní kultura bakterií (kapka diagnostica) a důkladně se promísí. Reakce jsou zohledněny vizuálně po několika minutách, někdy pomocí lupy (x5). Při pozitivní RA je v kapce séra zaznamenán výskyt velkých a malých vloček, při negativní RA zůstává sérum rovnoměrně zakalené.
Detailní aglutinační reakce za účelem identifikace titru specifických protilátek u pacienta.
Plně rozvinutá RA pro sérodiagnostiku se provádí v séru pacientů. Ředí se také v izotonickém roztoku chloridu sodného od 1:50 – 1:100 do 1:800 nebo 1:1600, protože nižší sérové titry mohou obsahovat normální aglutininy nalezené u zdravých lidí nebo pacientů s jinou diagnózou (diagnostický titr). Jako antigen v této reakci se používají diagnostická - známé suspenze, obvykle usmrcených bakterií.
Do aglutinačních zkumavek se nejprve nalije 1 ml izotonického roztoku chloridu sodného. Do prvního z nich se přidá 1 ml séra zředěného 1:100 a po jeho promíchání se 1 ml přenese do druhého, z druhého na třetí atd. K výsledným dvojnásobným ředěním sér (od 1:100 do 1:1600 nebo více) se přidají 1-2 kapky bakteriální suspenze obsahující 3 miliardy mikrobiálních tělísek v 1 ml. Zkumavky se protřepou a umístí na 2 hodiny do termostatu při 37 °C, poté se udržují při teplotě místnosti po dobu 24 hodin.
Podrobná aglutinační reakce se zohledňuje postupným vyhodnocením každé zkumavky, počínaje kontrolními, za mírného protřepání. V kontrolních zkumavkách by neměla být žádná aglutinace. Intenzita aglutinační reakce je označena následujícími znaky: ++++ - úplná aglutinace (aglutinace vloček v absolutně průhledné kapalině); +++ - neúplná aglutinace (vločky v mírně opalescentní kapalině); ++ - částečná aglutinace (vločky jsou jasně viditelné, kapalina je mírně zakalená); + - slabá, pochybná aglutinace - kapalina je velmi zakalená, vločky v ní jsou těžko rozlišitelné; - - absence aglutinace (kapalina je rovnoměrně zakalená).
Za titr séra se považuje jeho poslední ředění, ve kterém je intenzita aglutinace hodnocena jako ne méně než dva plusy (++)
Přednáška č. 16
Slovník
PŘÍMO - rovnou další bez ničeho, bez následných odkazů.
NEPŘÍMO– prostřednictvím jiných buněk, nikoli přímo.
SNÍŽENÍ ≠ ZVÝŠENÍ (aktivita buněk).
ODMÍTNOUT – nepřijmout, odmítnout. Tělo transplantovaný orgán odmítá.
Imunitní reakce.
Imunitní reakce jsou reakce specifické interakce (vazby) antigenu a protilátky nebo antigenu a senzibilizovaného T-lymfocytu.
Tyto reakce probíhají in vitro (ve zkumavce) a in vivo (v živém organismu).
Tyto reakce zahrnují sérum (sérum), proto se nazývají sérologické.
Imunitní reakce jsou zvyklé diagnostika infekčních onemocnění. V tomto případě je neznámá složka určena známou složkou, která je založena na specifičnosti interakce antigenu s protilátkou. Li známá protilátka, potom můžeš identifikovat (objevit) neznámý antigen. Li známý antigen, pak jej můžete použít detekovat neznámé protilátky.
Používají se tedy imunitní reakce:
1) pro sérologické diagnostiky(sérodiagnostika) nemocí - průkaz v krevním séru nemocných lidí protilátek proti konkrétnímu původci infekčního onemocnění (známý antigen); pokud jsou v krevním séru nemocné osoby přítomny protilátky proti jakémukoli patogenu, pak je to tento patogen, který to způsobil infekce;
2) pro sérologická identifikace (seroidentifikace) mikrobů - k určení typu patogenu pomocí imunitních diagnostických sér (známé protilátky); pokud se protilátky navážou na patogen izolovaný od nemocné osoby, pak je tento mikrob identický s mikrobem, kterým bylo zvíře imunizováno přijímání imunitní diagnostické sérum .
Imunitní reakce probíhají ve 2 fázích:
1) specifická fáze– spojení aktivního centra protilátky s determinantní skupinou antigenu za vzniku komplexů antigen-protilátka; tato fáze probíhá rychle, ale není viditelný účinek;
2) nespecifická fáze– vzhled viditelný efekt interakce antigenu a protilátky - ztráta návrh(aglutinace) popř oblačnost(srážky), což umožňuje vidět vzdělání komplexy antigen-protilátka a vyvodit závěr o dodržování antigen a protilátka navzájem.
Imunitní reakce zahrnují aglutinační reakce (RA), precipitační reakce (RP), reakce fixace komplementu (CFR).
Aglutinační reakce- jedná se o slepení a precipitaci mikrobiálních nebo jiných buněk (erytrocytů) vlivem protilátek za přítomnosti elektrolytu. Viditelným efektem reakce (aglutinační fenomén) je vznik sraženiny tzv aglutinovat.
Tato reakce se používá pro sérodiagnostika A séroidentifikace. RA se používá pro sérodiagnostiku (detekce protilátek v krevním séru pacientů) břišní tyfus a paratyfus(Vidální reakce), brucelóza(Wrightova reakce), tularémie a leptospirózy. RA se používá k séroidentifikaci (určení typu patogenu izolovaného z pacienta), když střevní infekce, černý kašel, cholera atd.
Komponentyreakce:
1. A ntigen (aglutinogen) – jedná se o celé (ne zničené) mikrobiální nebo jiné buňky ( korpuskulární, nerozpustný antigen). Aglutinogeny- toto je pozastavení naživu nebo zabil mikrobiální buňky nebo jakékoli jiné buňky. Antigeny mohou být neznámé nebo známé. Neznámý aglutinogen je mikrobiální kultura izolovaná z těla pacienta, kterou je třeba určit. Známý antigen - diagnosticum- diagnostický lék - suspendování mrtvých mikroby známé druhy ve fyziologickém roztoku. Toto pozastavení zataženo (neprůhledné), protože mikrobiální buňky se nerozpustí, ale zůstanou neporušené. Známý aglutinogen bude použit k detekci neznámých protilátek v krevním séru pacientů.
2. Protilátka (aglutinin)- nachází se v krevním séru. Protilátky mohou být také neznámé nebo známé. Neznámé protilátky, které mají být stanoveny, jsou v krevním séru nemocný člověk. Známé protilátky se nacházejí v imunitní diagnostická séra které se nazývají aglutinační séra. Používají se pro séroidentifikaci, tzn. k určení neznámého antigenu – typu mikrobiální kultury.
3. Elektrolyt– 0,9% roztok chloridu sodného.
Získání diagnostického testu.
Čistá kultura patogenu známého druhu pěstovaná na šikmém agaru (např. původce břišního tyfu) se smyje 3–4 ml izotonického roztoku, umístí se do sterilní zkumavky, mikroby se usmrtí v některých způsobem (například varem a stanoví se hustota (v 1 ml by měly být 3 miliardy mikrobiálních buněk). Pokud jsou mikrobiální buňky zabity vysoká teplota, pak dostanou O-diagnosticum (O-antigen), ale pokud je ošetřen formaldehydem, pak dostanou H-diagnosticum (H-antigen).
Příklady diagnostiky: salmonella diagnosticum, brucellosis diagnosticum, tularemia diagnosticum.
Příprava aglutinačních sér.
Zvířatům (obvykle králíkům) jsou parenterálně injikovány mikrobiální diagnostické přípravky ve zvyšujících se dávkách 5–7krát v intervalech ( provést hyperimunizaci) a následně je jim odebráno krevní sérum, které obsahuje protilátky proti mikrobům, ze kterých se diagnosticum připravuje. Pokud se imunizace provádí pomocí O-diagnosticum, pak se získají O-aglutinační séra (obsahují O-protilátky), pokud s H-diagnosticem, získají se H-aglutinační séra.
Aglutinační séra mohou být neadsorbovaný nebo nativní a adsorbované.
Neadsorbovaná séra obsahují skupinové protilátky na několik blízce příbuzných druhů mikrobů.
Adsorbovaná séra obsahují protilátky proti jednomu nebo více antigenům jednoho typu mikrobů. Pokud séra obsahují protilátky pouze proti jednomu antigenu, jsou tzv monoreceptor nebo jednomocný, pokud na několik antigenů – skupina adsorbovaná séra .
Příklady aglutinačních sér:Salmonella monoreceptor H-aglutinační sérum, Salmonella skupina adsorbované O-aglutinační sérum, anticholerové O-aglutinační sérum atd..
Titr aglutinační sérum - nejvyšší ředění séra, při kterém je ještě detekována aglutinační reakce s antigenem (titr závisí na množství protilátek v krvi: čím více protilátek, tím vyšší titr séra).
Metody stagingu RA.
1. Přibližná (lamelární) RA– provádí se na skle. Na podložní sklíčko naneste 2 kapky séra a 1 kapku izotonického roztoku. Mikrobiální kultura se přidá ve smyčce do jedné z kapek séra a do kapky izotonického roztoku a promíchá se. Kapka izotonického roztoku s choroboplodnými zárodky – kontrola antigenu, kapka bezmikrobní séra – kontrola protilátek, kapka séra s mikroby – Zkušenosti. Pokud sérum obsahuje protilátky odpovídající mikrobiálním antigenům, které se s ním mísí, pak se protilátky a antigeny na sebe specificky navážou a po 1–3 minutách se v testovací kapce objeví aglutinační vločky. Antigenová kontrola by měla být zakalená a protilátková kontrola by měla být čirá. Výsledky reakce se zaznamenávají na základě výskytu aglutinátových vloček . Pokud vločky vypadnou, je reakce pozitivní, tzn. Antigen odpovídá protilátce a antigen lze použít ke stanovení protilátky nebo naopak. Pokud zákal zůstane, reakce je negativní.
2. Detailní aglutinační reakce - prováděné ve zkumavkách. Nejprve připravte 2-násobné ředění krevního séra nemocného člověka od 1:50 do 1:1600. 1 ml izotonického roztoku chloridu sodného se nalije do 6 zkumavek. Do první zkumavky se přidá 1 ml pacientova krevního séra v ředění 1:50, promíchá se a získá se ředění 1:100, poté se 1 ml v ředění 1:100 přenese do druhé zkumavky a získá se ředění 1:200 atd. Dvě zkumavky jsou uchovávány pro kontrolu antigenu a séra. Ke kontrole séra přidejte pouze sérum v ředění 1:50, ke kontrole antigenu - pouze antigen. Přidejte 0,1 ml antigenu - diagnosticum (O- nebo H-) do všech ostatních zkumavek a vložte všechny zkumavky do termostatu při 37°C na 18-20 hodin. Výsledky reakce se zaznamenávají podle povahy, množství vzniklé sraženiny (aglutinátu) a stupně zákalu. Zaúčtování se provádí pouze s následujícími výsledky v kontrolách: kontrola séra - průhledná, kontrola antigenu - zakalená. O-protilátky poskytují jemnozrnnou sraženinu. H-protilátky – hrubozrnné. Na základě poslední zkumavky, ve které je ještě patrná aglutinační reakce, se stanoví diagnostický titr.
Během sérodiagnostiky onemocnění, je důležité nejen detekovat specifické protilátky proti konkrétnímu patogenu, ale také identifikovat jejich množství, tzn. stanovit takový titr protilátek Kdy můžeme mluvit o přítomnosti onemocnění způsobeného tímto patogenem? . Tento titr se nazývá diagnostický titr. Chcete-li například diagnostikovat břišní tyfus, musíte určit titr protilátek 1:400, ale ne méně. Poskytuje ještě přesnější výsledky detekce zvýšení protilátek v párových sérech. Sérum pacienta se odebírá na počátku onemocnění a po 3 až 5 i více dnech. Pokud se titr protilátek zvýší alespoň 4krát, můžeme tedy mluvit o aktuální nemoc.
Pokud se pro séroidentifikaci provádí podrobná aglutinační reakce, pak se použijí aglutinační diagnostická séra naředěná na titr nebo na polovinu jejich titru. RA je považována za pozitivní, pokud je aglutinace detekována při ředění blízkém titru diagnostického séra.
