Reaksi aglutinasi (dari lat. aglutinasi- perekatan) - perekatan sel darah (bakteri, sel darah merah, dll.) dengan antibodi dengan adanya elektrolit.

Reaksi aglutinasi memanifestasikan dirinya dalam bentuk serpihan atau sedimen yang terdiri dari sel-sel (misalnya, bakteri) yang “direkatkan” oleh antibodi (Gbr. 7.37). Reaksi aglutinasi digunakan untuk: menentukan patogen yang diisolasi dari pasien; penentuan antibodi dalam serum darah pasien; penentuan golongan darah.

Beras. 7.37a,b. Reaksi aglutinasi denganIgM-antibodi (a) danIgG-antibodi (b)

1. Penentuan patogen yang diisolasi dari pasien Perkiraan reaksi aglutinasi pada kaca (Gbr. 7.38). Suspensi bakteri yang diisolasi dari pasien ditambahkan ke setetes serum aglutinasi (pengenceran 1:20). Endapan flokulan terbentuk.

Beras. 7.38.

Reaksi aglutinasi ekstensif dengan patogen yang diisolasi dari pasien (Gbr. 7.39). Suspensi bakteri yang diisolasi dari pasien ditambahkan ke pengenceran serum aglutinasi.

Beras. 52

2. Penentuan antibodi dalam serum darah pasien
Reaksi aglutinasi terperinci dengan serum darah pasien (Gbr. 7.39). Diagnosticum ditambahkan ke pengenceran serum pasien.
- Aglutinasi dengan O-diagnosticum (bakteri dibunuh oleh panas, mempertahankan antigen O) terjadi dalam bentuk aglutinasi berbutir halus.
- Aglutinasi dengan H-diagnosticum (bakteri yang dibunuh oleh formaldehida, mempertahankan antigen H flagellar) berukuran besar dan terjadi lebih cepat.
3. Reaksi aglutinasi untuk menentukan golongan darah Reaksi aglutinasi untuk menentukan golongan darah digunakan untuk membentuk sistem ABO (Tabel b) dengan menggunakan aglutinasi eritrosit dengan antibodi serum imun terhadap antigen golongan darah A (I), B (III). Kontrolnya adalah: serum yang tidak mengandung antibodi, mis. golongan darah serum AB (IV); antigen yang terkandung dalam sel darah merah golongan A (II), B (III). Kontrol negatif tidak mengandung antigen, yaitu menggunakan eritrosit golongan O (I).

Tabel 7.6. Penentuan golongan darah ABO

Hasil reaksi		Kelompok
		termasuk
		diteliti darah
sel darah merah dengan	serum (plasma)
standar	dengan standar
serum

Reaksi aglutinasi (RA) adalah adhesi dan pengendapan mikroba atau sel lain di bawah pengaruh antibodi dengan adanya elektrolit. Endapan yang dihasilkan disebut aglutinat.

RA digunakan:

1. Untuk mendeteksi antibodi pada serum darah pasien (serodiagnosis).

2. Menentukan jenis dan serovar kultur murni mikroorganisme patogen yang diisolasi dari pasien (serotyping).

Reaksi aglutinasi digunakan untuk mengetahui antibodi dalam serum darah pasien, misalnya pada demam tifoid dan demam paratifoid (reaksi Vidal), brucellosis (reaksi Wright, Heddleson), tularemia, leptospirosis dan lain-lain. penyakit menular, serta untuk menentukan patogen yang diisolasi dari pasien ( infeksi usus, batuk rejan, dll). RA digunakan untuk menentukan golongan darah, faktor Rh, dll.

Reaksinya memerlukan komponen-komponen berikut:

1. Antigen (aglutinogen) harus berbentuk sel, yaitu suspensi mikroorganisme hidup atau mati (diagnostik m), eritrosit atau sel lain. Biasanya, kultur harian mikroorganisme yang ditumbuhkan pada agar miring digunakan. Kultur dicuci dengan 3 - 4 ml larutan isotonik, dipindahkan ke tabung steril, dan kepadatannya ditentukan. Suspensi harus homogen dan mengandung hingga 3 miliar sel mikroba per 1 ml. Penggunaan suspensi mikroba yang terbunuh - diagnostikum - memfasilitasi pekerjaan (disiapkan dalam produksi).

2. Antibodi (aglutinin) ditemukan dalam serum pasien (selama serodiagnosis) atau dalam serum aglutinasi (selama serotipe). Serum aglutinasi diperoleh dengan mengimunisasi kelinci dengan bakteri yang telah dibunuh.

Titer aglutinasi serum disebut pengenceran tertinggi, di mana ia bereaksi dengan antigen yang sesuai dalam kondisi percobaan tertentu.

Serum aglutinasi dapat bersifat asli (tidak teradsorpsi) dan teradsorpsi. Serum asli dalam pengenceran kecil berinteraksi tidak hanya dengan jenis mikroorganisme yang hewan tersebut diimunisasi untuk memperoleh serum, tetapi juga dengan jenis mikroorganisme terkait, karena mengandung antibodi kelompok (antibodi terhadap mikroorganisme yang memiliki antigen yang sama). Serum asli digunakan untuk reaksi aglutinasi terperinci (untuk serodiagnosis), yang tidak hanya memperhitungkan adanya reaksi, tetapi juga dinamika peningkatan titer antibodi.

Jika antibodi kelompok diekstraksi (diadsorpsi) dari serum asli melalui interaksi dengan bakteri terkait yang memiliki antigen kelompok, diperoleh serum yang teradsorpsi. Sera yang teradsorpsi dapat bersifat monoreseptor (atau tipe spesifik), mengandung antibodi terhadap satu reseptor antigen saja.Sera polivalen terdiri dari campuran beberapa serum yang teradsorpsi atau tidak teradsorpsi. Serum yang teradsorpsi digunakan untuk reaksi aglutinasi kaca.

Ketika hewan diimunisasi dengan bakteri motil dengan antigen H, diperoleh serum H-aglutinasi yang mengandung antibodi H (misalnya, serum aglutinasi H monoreseptor Salmonella). Dengan imunisasi dengan antigen-O, diperoleh serum penggumpalan O yang mengandung antibodi-O (misalnya, serum penggumpalan O yang teradsorpsi oleh kelompok Salmonella, serum penggumpalan O antikolera). Dengan imunisasi antigen H dan O, diperoleh serum dengan antibodi H dan O.

Selain itu, aglutinin O menghasilkan aglutinat berbutir halus, dan aglutinin H menghasilkan sedimen berbutir kasar.

3. Elektrolit - larutan NaCl isotonik (larutan natrium klorida 0,9% dibuat dalam air suling).

Ada dua metode utama untuk melakukan reaksi aglutinasi: reaksi pada kaca (kadang-kadang disebut reaksi indikatif atau reaksi pelat) dan reaksi terperinci (dalam tabung reaksi)

Menyiapkan reaksi aglutinasi pada kaca. Dua tetes serum dan setetes larutan natrium klorida isotonik diteteskan pada kaca objek bebas lemak. Serum aglutinasi diagnostik diambil dalam satu pengenceran, yang tergantung pada titernya, adalah 1:10, 1:25, 1:50 atau 1:100. Kultur mikroorganisme yang diteliti ditambahkan ke dalam satu tetes serum dan setetes larutan isotonik menggunakan loop dan diaduk rata. Setetes natrium klorida dengan mikroorganisme adalah kontrol antigen, setetes serum tanpa mikroorganisme adalah kontrol serum. Anda tidak dapat memindahkan kultur dari setetes serum ke setetes NaCl. Reaksi berlangsung pada suhu kamar selama 1-3 menit. Jika kontrol serum tetap jernih, kekeruhan seragam terlihat pada kontrol antigen, dan serpihan aglutinat muncul pada tetesan tempat kultur dicampur dengan serum, maka hasilnya dianggap positif. Jika terdapat kekeruhan yang seragam pada tetesan serum dan antigen, maka ini merupakan hasil negatif. Reaksinya lebih jelas terlihat pada latar belakang gelap.

Serum

1. pengendalian antigen

2. kontrol serum

Reaksi imun. Penerapan reaksi imun dalam diagnostik penyakit menular.

RENCANA:

Jenis reaksi imun.

Kondisi untuk melakukan reaksi serologis.

Persyaratan serum.

Konsep hasil positif dan negatif.

ISI UTAMA:

Jenis reaksi imun.

Reaksi imunologis – Ini adalah interaksi antigen dengan antibodi, yang ditentukan oleh interaksi spesifik pusat aktif antibodi (paratope) dengan epitop antigen.

Klasifikasi umum reaksi imunologi:

reaksi serologis – reaksi antara antigen (Ag) dan antibodi (Ig)

secara in vitro ;

reaksi seluler dengan partisipasi sel imunokompeten;

tes alergi – deteksi hipersensitivitas.

Reaksi serologis: 1) definisi, 2) fase, 3) tujuan, 4) klasifikasi umum.

1) Definisi

Metode serologis penelitian (dari bahasa Latin Serum - serum dan logos - pengajaran) menggunakan reaksi antigen-antibodi.

2) Fase

2 fase interaksi:

SAYA. Spesifik (terlihat) – terjadi dengan cepat, antibodi bergabung dengan antigen yang sesuai. Selama fase ini, kelompok antigen determinan (AG) dan pusat antibodi aktif (AT) berinteraksi.

Gaya-gaya yang terlibat dalam pembentukan kompleks AG+AT adalah:

liontin;

van der Waals

Ikatan hidrogen.

Tidak ada perubahan yang terlihat tidak dalam fase ini. Mikroskop elektron menunjukkan kompleks AG+AT dalam bentuk kisi.

II. Tidak spesifik – terjadi perlahan, kompleks antigen-antibodi yang dihasilkan bereaksi dengan faktor tambahan nonspesifik dari lingkungan di mana reaksi terjadi, dan ini terlihat oleh mata – perekatan, pelarutan, pengendapan serpihan sedimen, dll. Dengan adanya elektrolit , muatan berkurang, kelarutan menurun, terbentuk konglomerat yang terlihat, mengendap (mengaglutinasi).

3) Menetapkan tujuan :

a) untuk mengidentifikasi antigen (antibodi yang diketahui serum diagnostik):

• dalam bahan patologis (diagnostik cepat);

  dalam budaya murni:

  1. identifikasi serologis (identifikasi spesies);

     serotyping (penentuan serovar) – penentuan strain;

b) untuk mendeteksi antibodi (Ig) (dikenal antigen-diagnosticum):

• kehadiran (reaksi kualitatif);

  kuantitas (peningkatan titer - metode “serum berpasangan”).

4) Klasifikasi umum reaksi serologis :

a) sederhana (2 komponen: Ag+Ig):

Reaksi aglutinasi RA (dengan antigen sel darah);

Reaksi presipitasi PR (dengan antigen terlarut);

b) kompleks (3 komponen: Ag+Ig+C);

c) menggunakan tag.

Varian reaksi aglutinasi dan presipitasi

Reaksi aglutinasi :

Reaksi aglutinasi (RA) merupakan reaksi imun terhadap interaksi suspensi antigen (eritrosit, bakteri) dengan antigen dalam larutan fisiologis.

Selama aglutinasi, partikel AT saling menempel membentuk sedimen flokulan.

Reaksi hemaglutinasi pasif(RPGA) adalah jenis reaksi aglutinasi yang menggunakan antibodi atau antigen diagnostik eritrosit (eritrosit dengan AT atau AG teradsorpsi pada permukaannya).

Sel darah merah bertindak sebagai pembawa pasif dalam reaksi ini.

Evaluasi hasil RPGA dilakukan sebagai berikut:

- pada reaksi positif sel darah merah yang menempel secara pasif menutupi bagian bawah lubang berbentuk U atau V pada lapisan rata dengan tepi bergerigi (“payung”);

- pada reaksi negatif (jika tidak ada aglutinasi), sel darah merah menumpuk di bagian tengah lubang, membentuk “tombol” kompak dengan tepi yang tegas.

Tes penghambatan hemaglutinasi (HAI) digunakan dalam diagnosis infeksi virus. Beberapa virus mengandung protein yang disebut hemaglutinin pada permukaannya, yang merekatkan sel darah merah. Penambahan antibodi antivirus spesifik memblokir hemaglutinin virus - tidak ada hemaglutinasi.

Reaksi hemaglutinasi tidak langsung (IRHA), atau reaksi Coombs, digunakan untuk menentukan antibodi yang tidak lengkap. Penambahan serum antiglobulin (AT terhadap Ig manusia) meningkatkan hasil reaksi. RNGA digunakan untuk menentukan faktor Rh.

Untuk melakukan reaksi aglutinasi (RA), diperlukan tiga komponen:

1) antigen (aglutinogen) AG;

2) antibodi(aglutinin) DI;

3) elektrolit (larutan natrium klorida isotonik).
Ag + AT + elektrolit = aglutinasi

Aglutinasi (dari bahasa Latin aglutinatio - perekatan) - perekatan sel darah (bakteri, sel darah merah, dll.) dengan antibodi dengan adanya elektrolit - natrium klorida.

RA memanifestasikan dirinya dalam bentuk serpihan atau sedimen yang terdiri dari sel-sel (misalnya bakteri, sel darah merah) yang “direkatkan” oleh antibodi.

RA digunakan untuk:

Reaksi aglutinasi mikroba langsung (RA).

Dalam reaksi ini, antibodi (aglutinin) secara langsung mengaglutinasi antigen sel (aglutinogen).

Mereka biasanya diwakili oleh suspensi mikroorganisme yang tidak aktif (reaksi aglutinasi mikroba).

Untuk menentukan jenis mikroorganisme, gunakanaglutinasi diagnostik standar serum ( AT yang terkenal ).

Yang paling umum adalah RA pipih (perkiraan) dan diperluas.

Pelat RA diletakkan di atas kaca. Gunakan sebagai metode dipercepat deteksi antibodi atau identifikasi mikroorganisme.

Komponen:

1. serum aglutinasi diagnostik standar (AT);

2. kultur murni yang diteliti dari pasien;

3. larutan garam.

Dalam kultur murni yang diteliti, antigen (AG) berbentuk partikel (sel mikroba, eritrosit, dan antigen sel darah lainnya), yang direkatkan oleh antibodi dan mengendap.

Contoh:

Memanggungkan indikatif reaksi aglutinasi (RA ) di atas kaca untuk tujuan mengidentifikasi bakteri koliform.

Oleskan tetes ke slide kaca:

1 disentri ;
2 -Drop ke-th : - Mengaglutinasi serum terhadap patogendemam tifoid ;

(1-2 serum diagnostik)
3 -tetesan : - larutan garam (kontrol).
Tambahkan kultur bakteri murni yang telah diuji ke setiap tetes. Mengaduk.

Hasil : positif - adanya serpihan aglutinasi,
negatif - tidak adanya serpihan aglutinasi
Kesimpulan:Bakteri yang diteliti adalah agen penyebab demam tifoid (antigen ditentukan).

Untuk menentukan AT dalam serum pasien (diagnosis serologis), mikroba standardiagnostikum , mengandung suspensiterkenal mikroba atau antigennyaAG .

Penentuan golongan darah ABO (reaksi hemaglutinasi (HRA)) – mengaglutinasi sel darah merah.

Komponen reaksi:

1. AG (sel darah merah) tes darah

2. AT (eritrotes - zoliclones)

Kumpulan zoliclon:

Reagen koliklon anti-A (merah muda)

Reagen koliklon anti-B (biru)

Reagen Tsoliklon anti-AV (tidak berwarna)

3. elektrolit (larutan garam)

Teknik penentuan:

1 .

Satu tetes (0,1 ml) zolicone anti-A, anti-B dan anti-AB dioleskan ke lubang tablet (untuk kontrol).

2.

Di samping setiap tetes reagen, setetes kecil (0,05-0,01 ml) darah yang diuji diteteskan.

Kemudian setetes zoliclone dicampur dengan setetes darah menggunakan batang kaca bersih.

3.

Reaksi aglutinasi terjadi selama 3-5 detik pertama ketika pelat diayun perlahan.

Hasil reaksi diperhitungkan 2,5 - 3 menit setelah pencampuran tetes. Dari kiri ke kanan di dalam sumur terdapat anti-A, anti-B, anti-AB.

Hasil positifnya adalah munculnya endapan granular (aglutinasi).

RA positif (+)

Negatif - tidak ada sedimen.

RA negatif(-)

4.

Analisis hasil.

HAI(SAYA) α β – tidak ada aglutinasi

A(II) β – aglutinasi dengan anti-A

B(AKU AKU AKU) α – aglutinasi dengan anti-B

AB(IV)O – aglutinasi dengan anti-A, dengan anti-B

Representasi skema aglutinasi.

Antigen Ag pada eritrosit (terdeteksi) + antibodiPADA(zoliklon) serum diagnostik

Akuntansi untuk aglutinasi dalam tablet

Reaksi presipitasi:

Reaksi presipitasi merupakan reaksi imun dari interaksi antigen dalam keadaan larut dengan antigen dalam larutan fisiologis.

Selama presipitasi, kompleks imun makromolekul terbentuk, yang dimanifestasikan oleh transisi larutan koloid transparan menjadi suspensi buram, atau endapan.

Jumlah kedua reagen harus dalam proporsi yang ditentukan secara ketat, karena kelebihan salah satu reagen akan mengurangi hasilnya.

Ada berbagai cara mengatur reaksi pengendapan.

1. Reaksi pengendapan cincin dilakukan dalam tabung pengendapan dengan diameter kecil. Serum imun ditambahkan ke tabung reaksi dan antigen terlarut dilapisi dengan hati-hati. AG dan AT bercampur karena pergerakan termal molekul, dan mereka berinteraksi. Pada hasil positif sebuah cincin endapan buram terbentuk pada batas kedua larutan.

2. Reaksi imunodiffusi ganda Ouchterlony dilakukan dalam gel agar, ke dalam sumur yang ditambahkan larutan AG atau larutan AT sesuai skema. AG dan AT berdifusi ke dalam gel satu sama lain dan, jika reaksinya positif, membentuk kompleks imun yang terlihat sebagai garis presipitasi.

Reaksi presipitasi –ini adalah formasidan pengendapan kompleks molekul antigen-antibodi yang larut dalam bentuk awan yang disebut endapan. Ini dibentuk dengan mencampurkan antigen dan antibodi dalam jumlah yang setara.

Komponen RA:

serum pencetus (dikenal AT-presipitin);

serum uji (antigen presipitinogen tidak diketahui);

fisik Larutan.

Reaksi pengendapan dilakukan baik dalam tabung reaksi sempit khusus (reaksi pengendapan cincin), atau dalam cawan petri dalam gel, media nutrisi, dll.

Reaksi presipitasi cincin

Pernyataan dan pencatatan hasil reaksicurah hujan cincinuntuk deteksi patogen antraks(Reaksi Ascoli).

Memanggungkan .

1. Bahan yang diteliti (kulit, wol, kain kempa, bulu, kain, daging, tanah, kotoran hewan, dll) direbus dalam larutan garam selama 5-45 menit. untuk memperoleh ekstrak isotonik (ekstrak). Tersaring.

2. Serum anti antraks yang mengendap dituangkan ke dalam tabung reaksi.

3. Lapisi bahan uji (ekstrak) dengan hati-hati ke atasnya.

Akuntansi .

Dalam 10 menit berikutnya. Dalam kasus positif, cincin kekeruhan muncul pada antarmuka antara serum dan ekstrak (cincin pengendapan). Reaksi Ascoli sangat sensitif dan spesifik

Dengan bantuannya, dimungkinkan untuk dengan cepat mengidentifikasi bahan yang terinfeksi antraks.

Reaksi pengendapan dalam agar

Pernyataan dan pencatatan hasilreaksi presipitasi pada agaruntuk menentukan toksigenisitas corynebacteria (agen penyebab difteri)

Memanggungkan

Ditempatkan pada agar pepton fosfat dalam cawan Petri.

1. Letakkan selembar kertas saring steril yang dibasahi di sepanjang bagian tengah cangkir.serum antitoksik.

2. Setelah kering, pada jarak 1 cm dari tepi strip, diunggulkan dengan diameter 10 mm.tanaman yang dipilih.

Dalam satu cangkir Anda bisa menabur 3 hingga 10 tanaman, salah satunyakontrol, harus diketahuiberacun.

Hasil panen ditempatkan di termostat.

Akuntansi

Analisis dilakukan setelah 24-48-72 jam.

Hasil positif - (budayatoksigenik) - agak jauh dari potongan kertas munculgaris endapan, « panah sulur", yang terlihat jelas dalam cahaya yang ditransmisikan.

Gambar tersebut menunjukkan reaksi pengendapan dalam agar untuk menentukan toksigenisitas basil difteri. Kultur medium tidak membentuk “sulur panah”; ini bukan patogen toksikogenik.

Strain agen penyebab difteri dapat bersifat toksigenik (menghasilkan eksotoksin) dan non-toksigenik. Pembentukan eksotoksin bergantung pada keberadaan profag pada bakteri yang membawa gen toks yang mengkode pembentukan eksotoksin.

Jika sakit, semua patogen difteri diuji toksigenisitasnya - produksi eksotoksin difteri menggunakan reaksi pengendapan dalam agar

Reaksi serologis yang kompleks ( 3 komponen: Ag+Ig+C):

Reaksi fiksasi komplemen (CFR).

Reaksinya dilakukan dalam dua tahap.

Pada tahap pertama, AT berinteraksi dengan antigen dan komplemen, pada tahap kedua, indikator ditambahkan - sistem hemolitik (campuran eritrosit dan serum anti-eritrosit).

Jika hasilnya positif, pada tahap pertama antibodi membentuk kompleks imun dengan antigen, yang mengikat komplemen campuran reaksi.

Dalam hal ini, sel darah merah dari sistem hemolitik yang ditambahkan pada tahap kedua tidak dihancurkan.

Jika tidak, komplemen yang tidak terikat menyebabkan lisis sel darah merah indikator.

Untuk melaksanakannya diperlukan lima bahan: AG, AT dan komplemen (sistem pertama), eritrosit domba dan serum hemolitik (sistem kedua) (Gbr. 1).

Reaksi terjadi dalam dua fase (Gbr. 3).

Fase pertama - interaksi antigen dan antibodi selama partisipasi wajib melengkapi.

Kedua - Identifikasi hasil reaksi menggunakan indikator sistem hemolitik (sel darah merah domba dan serum hemolitik). Penghancuran sel darah merah oleh serum hemolitik hanya terjadi jika komplemen ditambahkan ke sistem hemolitik. Jika komplemen sebelumnya teradsorpsi pada kompleks antigen-antibodi, maka hemolisis eritrosit tidak terjadi (Gbr.).

Hasil pengalaman dinilai (Gbr. 2), mencatat ada tidaknya hemolisis di semua tabung. Reaksi dianggap positif ketika hemolisis tertunda sepenuhnya, ketika cairan dalam tabung reaksi tidak berwarna dan sel darah merah mengendap di dasar, negatif - ketika sel darah merah benar-benar lisis, ketika cairan sangat berwarna (darah "pernis"). ).

Derajat keterlambatan hemolisis dinilai tergantung pada intensitas warna cairan dan ukuran endapan sel darah merah di dasar (++++, +++, ++, +).

Beras. 4. Pernyataan dan hasil RSC.

Kesimpulan:Antibodi terdeteksi dalam serum uji.

RSK memungkinkan Anda mendeteksi antibodi terhadap strain apa pun dari serotipe virus yang sama.

Nilai diagnostik Memiliki:

peningkatan empat kali lipat titer antibodi dalam serum berpasangan (selama epidemi influenza);

peningkatan dua kali lipat serum darah pasien dengan gambaran klinis yang khas.

Reaksi menggunakan tag :

Metode-metode ini sangat sensitif. Pewarna, isotop radioaktif, enzim, dll. digunakan sebagai label untuk antigen atau antibodi.

RIF – reaksi imunofluoresensi

Reaksi imunofluoresensi didasarkan pada indikasi cahaya dari kompleks antigen-antibodi

Uji imunosorben terkait.

Tes laboratorium modern yang mencari antibodi spesifik dalam darah atau antigen terhadap penyakit tertentu untuk mengidentifikasi tidak hanya etiologi, tetapi juga stadium penyakit.

Hasil ELISA dapat diberikan secara kualitatif dan kuantitatif.

Saat ini, ELISA digunakan dalam situasi berikut:

1) mencari antibodi spesifik terhadap penyakit menular;

2) mencari antigen penyakit apa pun (menular, kelamin);

3) penelitian status hormonal sabar;

4) pemeriksaan penanda tumor;

5) pemeriksaan adanya penyakit autoimun.

Pada gambar, ELISA fase padat menunjukkan antigen yang diketahui (di sebelah kiri) teradsorpsi pada lubang pelat, (di sebelah kanan) pada lubang pelat antigen yang diketahui

Keuntungan metode ELISA:

1) Spesifisitas dan sensitivitas metode ELISA yang tinggi (lebih dari 90%).

2) Kemampuan mengidentifikasi penyakit dan melacak dinamika prosesnya, yaitu membandingkan jumlah antibodi dalam periode waktu yang berbeda.

3) Ketersediaan diagnostik ELISA di institusi medis mana pun.

Kerugian relatif: Deteksi respons imun (antibodi), tetapi bukan patogen itu sendiri, yang terkonjugasi dengan enzim tag.

Tes ELISA (mekanisme umum):

Dasar dari immunoassay enzim adalah reaksi imun antigen dan antibodi dengan pembentukan kompleks imun: antigen-antibodi, yang mengakibatkan perubahan aktivitas enzimatik pada tanda spesifik pada permukaan antibodi.

Komponen reaksi:

1. AG(AT) diketahui - di bagian atas tablet.

2. AT (AG) sedang dipelajari.

3. AT dengan enzim, spesifik untuk kompleks AT(AG)-AG(AT).

4. substrat kromogenik yang berinteraksi dengan enzim

5. hentikan solusi

Tahapan utama ELISA

1. Pada permukaan lubang pelat terdapat antigen murni dari patogen tertentu. Mereka menambahkan bahan biologis pasien, reaksi spesifik terjadi antara antigen ini dan antibodi yang diinginkan (imunoglobulin). Sebuah kompleks terbentuk.

2. Konjugan ditambahkan – AT dengan enzim. Konjugannya khusus untuk kompleks AT-AG tahap pertama. Enzim diaktifkan.

3. Substrat ditambahkan dan enzim aktif bereaksi dengannya, mengubah warna larutan yang tidak berwarna.

4. Larutan penghenti ditambahkan untuk menghentikan interaksi enzim-substrat.

Akuntansi.

Positif hasilnya adalah perubahan warna, di gambar - kuning.

Analisis imunokromatografi

Metode analisis imunokromatografi (ICA, tes cepat) adalah metode penyaringan awal berkualitas tinggi yang memungkinkan Anda dengan cepat, dalam beberapa menit, melakukan analisis dalam kondisi apa pun, termasuk. "bidang".

Keunggulan ICA antara lain:

Kecepatan dan kemudahan penggunaan;

Volume sampel kecil, kurangnya persiapan sampel;

Murahnya bagi produsen dan konsumen;

Kemungkinan memproduksi tes dalam volume besar;

Kemudahan membaca dan menafsirkan hasil;

Sensitivitas dan reproduktifitas tinggi;

Kemungkinan penentuan kuantitatif;

Kemungkinan menggunakan pembaca portabel yang kompatibel dengan komputer;

Kemungkinan multi-analisis.

Komponen (diterapkan pada strip tes):

1. Konjugat dengan label emas koloid khusus untuk antigen yang terdeteksi.

2. Jalur uji AT – khusus untuk kompleks AT-AG

3. Abs dari garis kontrol khusus untuk konjugat.

Pengaturan ICA:

1. Terapkan sampel ke area awal strip yang ditentukan.

2. Memperoleh hasil berupa munculnya garis-garis berwarna pada tempat garis uji dan garis kendali.

Akuntansi

Positif – bila garis uji ternoda.

Negatif - jika tidak ada pewarnaan pada garis uji.

Tidak valid – jika garis kontrol tidak ternoda.

Mekanisme umum ICA:

1. Sampel dimasukkan ke bidang awal (pad sampel) dan dikaitkan dengan konjugat (badan tertentu dengan label berwarna), yang terletak pada bantalan konjugat. Akibatnya terbentuk kompleks berwarna.

2. Kompleks imun berwarna yang dihasilkan bergerak di bawah pengaruh gaya kapiler sepanjang membran nitroselulosa Dan berinteraksidengan garis tes AT.Hasilnya adalah satu garis berwarna merah jambu-merah.

3. AT (konjugasi) tidak terikat pada pita yang diujibergerak lebih jauh dan mencapai garis kendali, berkomunikasi dengan AT dari garis kendali.Hasilnya, garis berwarna kedua muncul.Jika analisis dilakukan dengan benar, garis Kontrol akan selalu muncul, terlepas dari keberadaan antigen uji (antibodi) dalam sampel cairan biologis.

2. Kondisi terjadinya reaksi serologis.

1. Kehadiran homolog - antigen dan antibodi yang sesuai satu sama lain.

2. Piring bersih dan kering.

3. Perbandingan obat tertentu (paling sering sama).

4. Wajib adanya elektrolit (larutan NaCl isotonik).

5. pH netral atau mendekati sedikit basa.

6. Suhu +37°C atau suhu ruangan (tentu saja positif).

7. Dilakukan kontrol antigen dan kontrol serum (antibodi).

3 Persyaratan serum

Serum harus benar-benar transparan tanpa campuran sel apa pun.

Mereka biasanya menerimanya pada minggu ke-2 sakit, ketika antibodi sudah tersedia.

Darah diambil sebanyak 3-5 ml saat perut kosong atau 6 jam setelah makan.

Untuk memperoleh serum, darah didiamkan selama 1 jam pada suhu ruangan atau disentrifugasi. Serum disedot dengan sangat hati-hati agar tidak menangkap unsur-unsur yang terbentuk.

Serum imun diperoleh dari darah manusia atau hewan (biasanya kelinci dan kuda), diimunisasi menurut skema tertentu dengan antigen (vaksin) yang sesuai. Serum biasanya disiapkan dalam produksi.

4. Konsep hasil positif dan negatif.

RA.

Dengan reaksi positif, sel darah merah yang direkatkan secara pasif menutupi bagian bawah lubang dalam lapisan rata dengan tepi bergerigi (“payung”); jika tidak ada aglutinasi, sel darah merah menumpuk di bagian tengah lubang, membentuk “tombol” kompak dengan tepi tajam (lihat gambar di atas).

Rp.

Jika hasilnya positif, terbentuklah cincin susu pada antarmuka kedua larutan (lihat gambar di atas).

ELISA.

Perubahan warna larutan terjadi dengan reaksi positif.

RSK.

Hemolisis tertunda - reaksinya positif; jika komplemen bebas, hemolisis diamati - reaksinya negatif(lihat gambar di atas).

Hasil reaksi Wasserman:

a - penundaan total hemolisis (+ + ++);

b - penundaan hemolisis (+++);

c - penundaan sebagian hemolisis (++);

d - sedikit keterlambatan hemolisis (+);

d - hemolisis lengkap (-).

Reaksinya positif dengan penundaan hemolisis parsial, nyata dan lengkap, ditentukan oleh tingkat pewarnaan isi tabung dari merah muda terang menjadi merah terang; eritrosit yang tidak terhemolisis kemudian membentuk endapan merah.

Pekerjaan rumah:

1. Pelajari materinya

Buatlah 3 catatan pada video tersebut

dalam mikrobiologi

"Reaksi aglutinasi dan jenisnya (RA)"

Rencana:

1. Pendahuluan…………………………………………………………………………………..3

2. RA pada kaca………………………………………………………………………………….4

3. Tabung reaksi RA………………………………………………………………………………….5

4. Literatur yang digunakan……………………………………………………………..7

1. Perkenalan.

Interaksi antigen mikroba dan antibodi sangat spesifik dan ditujukan pada tubuh hewan untuk menetralkan patogen dan toksinnya. Interaksi antigen dan antibodi in vitro, dalam kondisi tertentu, disertai dengan fenomena yang terlihat (aglutinasi, presipitasi, lisis imun), yang memungkinkan penggunaan reaksi AG-AT, yang disebut serologis (dari bahasa Latin serum), untuk tujuan praktis. Biofaktor menghasilkan antigen dan serum imun (antibodi) yang diketahui bersifat spesifik (diagnostik). Dengan bantuan serum tersebut, mikroorganisme yang tidak diketahui dapat diidentifikasi melalui reaksi serologis atau, dengan menggunakan antigen yang diketahui, antibodi yang disintesis dalam tubuh sebagai respons terhadap masuknya patogen dapat dideteksi, dan dengan demikian diagnosis dapat dibuat (diagnosis serologis ). Selain itu, reaksi serologis dapat digunakan untuk menilai intensitas respon imun setelah vaksinasi atau penyakit menular.

Reaksi aglutinasi, seperti aglutinasi tidak langsung dan Coombs, didasarkan pada interaksi in vitro antigen sel darah dengan antibodi dan kemampuan kompleks yang dihasilkan untuk mengendap. Sel bakteri atau antigen terlarut yang diekstraksi dari mikroorganisme dan diserap pada sel pembawa: sel darah merah, partikel lateks, dll. digunakan sebagai antigen sel.

Penentu antigenik dari antigen sel secara spesifik berinteraksi dengan antibodi homolog (fase reaksi yang spesifik dan tidak terlihat), dan kemudian kompleks antigen-antibodi membentuk konglomerat besar yang terlihat dengan mata telanjang, yang mengendap - suatu aglutinat (fase reaksi yang tidak spesifik dan terlihat). ). Bentuk mikroba bebas flagellata (Brucellae) menghasilkan aglutinan granular, sedangkan bentuk flagellata (Escherichia, Salmonella) menghasilkan aglutinan kapas besar, yang mengendap di dasar tabung reaksi dalam bentuk payung terbalik dan mudah pecah bila dikocok. Antigen dan antibodi hanya berinteraksi dengan adanya elektrolit (larutan natrium klorida 0,8%). Jalannya reaksi dipengaruhi oleh konsentrasi garam dalam elektrolit, jumlah sel mikroba dalam suspensi, konsentrasi serum, pH, suhu dan faktor lainnya.

Reaksi aglutinasi (ra).

Ada aglutinasi spesifik, yang didasarkan pada interaksi antigen Dengan antibodi homolog , terkandung dalam tubuh hewan yang menerima antigen ini (imunoaglutinasi); nonspesifik (kimia), yang timbul dari perubahan pH lingkungan, konsentrasi elektrolit; spontan, yang diamati ketika bakteri (dalam bentuk R) tersuspensi dalam larutan fisiologis dan ketika dipanaskan, yang berhubungan dengan perubahan keadaan koloid sel bakteri. Antigen , terlibat dalam RA disebut aglutinogen, antibodi disebut aglutinin, dan endapan yang dihasilkan disebut aglutinat. Ketika aglutinat terbentuk, rasio kuantitatif antigen dan antibodi (fenomena optimal) menjadi penting. Dengan kelebihan atau kekurangan antibodi, terjadi penundaan.

Reaksi aglutinasi (RA) adalah salah satu reaksi imunologi pertama yang digunakan dalam praktik mikrobiologi. Untuk pertama kalinya (1895), F. Vidal menggunakan RA untuk mendiagnosis demam tifoid. Kemudian (1897), A. Wright menggunakan reaksi yang sama untuk mendiagnosis brucellosis pada manusia. RA juga telah diterapkan dalam diagnosis pullorosis pada ayam, leptospirosis, aborsi menular pada kuda, serta untuk mengetik kultur mikroba yang tidak diketahui menggunakan serum aglutinasi yang diketahui. RA sangat sensitif; ini dapat digunakan untuk mendeteksi 0,01 μg nitrogen protein antibodi dalam 1 ml.

Beberapa varian reaksi aglutinasi telah dikembangkan, berbeda dalam pelaksanaan metodologi dan tujuan penelitian.

2. Ra di atas kaca.

Pada varian RA ini, subjek tes dapat berupa serum atau antigen, namun opsi ini paling sering digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme.

1. Untuk mengidentifikasi mikroorganisme (m/o), setetes serum yang diketahui dapat menggumpal, misalnya serum Salmonella, dan setetes larutan fisiologis (kontrol) diteteskan secara terpisah pada kaca objek bebas lemak. Kemudian, dengan menggunakan loop bakteriologis, massa bakteri dari kultur yang diteliti diambil dari koloni dalam cawan Petri atau dari permukaan MPA miring dalam tabung reaksi dan disuspensikan secara terpisah dalam serum imun dan larutan fisiologis sampai diperoleh suspensi yang homogen. . Hasilnya diperhitungkan setelah 2...4 menit.

Memperhitungkan hasil: tidak boleh ada perubahan pada sampel kontrol. Jika kultur bakteri secara spesifik cocok dengan serum imun maka akan muncul serpihan aglutinat (hasil positif), jika tidak terjadi fenomena aglutinasi maka disimpulkan bahwa kultur bakteri yang diteliti tidak sesuai dengan serum imun.

2. Mari kita perhatikan deteksi anittel dalam tes serum darah menggunakan contoh tes rose bengal yang digunakan dalam serodiagnosis brucellosis. 0,3 ml serum darah hewan uji dan 0,03 ml antigen brucellosis (sel Brucella bernoda mawar-Bengal) diteteskan pada kaca objek. Komponen tercampur rata dengan mengocok kaca dan hasilnya diperhitungkan setelah 4 menit.

Pencatatan hasil: jika reaksi positif, muncul serpihan aglutinat berwarna merah muda. Reaksi serologis jenis ini tergolong kualitatif, karena dapat digunakan untuk mendeteksi antibodi terhadap patogen dalam serum darah hewan, namun tidak mungkin untuk menilai kandungan kuantitatifnya.

1.1. REAKSI AGLUTINASI (RA)

REAKSI AGLUTINASI (RA)

Karena kekhususannya, kemudahan pelaksanaannya, dan sifatnya yang demonstratif, reaksi aglutinasi telah tersebar luas dalam praktik mikrobiologi untuk diagnosis banyak penyakit menular.

Reaksi aglutinasi didasarkan pada kekhususan interaksi antibodi (aglutinin) dengan seluruh mikroba atau sel lain (aglutinogen). Akibat interaksi tersebut terbentuk partikel dan aglomerat yang mengendap (mengaglutinasi) dalam bentuk serpihan.

Reaksi aglutinasi dapat melibatkan bakteri hidup dan mati, spirochetes, jamur, protozoa, rickettsia, serta sel darah merah dan sel lainnya. Reaksi terjadi dalam dua fase: yang pertama (tidak terlihat) spesifik, kombinasi antigen dan antibodi, yang kedua (terlihat) nonspesifik, perekatan antigen, yaitu. pembentukan aglutinasi.

Aglutinat terbentuk ketika satu pusat aktif dari antibodi divalen bergabung dengan kelompok determinan suatu antigen. Reaksi aglutinasi, seperti reaksi serologis lainnya, terjadi dengan adanya elektrolit.

Secara eksternal, manifestasi reaksi aglutinasi positif bersifat ganda. Pada mikroba berflagel yang hanya memiliki antigen O2 somatik, sel mikroba itu sendiri langsung menempel. Aglutinasi ini disebut berbutir halus. Itu terjadi dalam waktu 18 22 jam. ay

Mikroba flagellata memiliki dua antigen: antigen O2 somatik dan antigen flagellar H2. Jika sel-sel direkatkan oleh flagela, maka akan terbentuk serpihan-serpihan besar yang lepas dan reaksi aglutinasi ini disebut berbutir kasar. Itu terjadi dalam 2 4 jam.

Reaksi aglutinasi dapat dilakukan baik untuk tujuan penentuan kualitatif dan kuantitatif antibodi spesifik dalam serum darah pasien, dan untuk tujuan menentukan spesies patogen yang diisolasi. ay

Reaksi aglutinasi dapat dilakukan baik dalam versi yang diperluas, yang memungkinkan Anda bekerja dengan serum yang diencerkan hingga titer diagnostik, dan dalam varian reaksi indikatif, yang pada prinsipnya memungkinkan untuk mendeteksi antibodi spesifik atau menentukan spesies patogen.

Saat melakukan reaksi aglutinasi terperinci, untuk mendeteksi antibodi spesifik dalam serum darah subjek, serum uji diambil dengan pengenceran 1:50 atau 1:100. Hal ini disebabkan oleh fakta bahwa antibodi normal mungkin terdapat dalam konsentrasi yang sangat tinggi dalam serum utuh atau sedikit encer, dan hasil reaksinya mungkin tidak akurat. Bahan yang diuji dalam reaksi versi ini adalah darah pasien.

Darah diambil saat perut kosong atau paling lambat 6 jam setelah makan (jika tidak, mungkin terdapat tetesan lemak dalam serum darah sehingga keruh dan tidak cocok untuk penelitian). Serum darah pasien biasanya diperoleh pada minggu kedua penyakit, mengumpulkan 3 × 4 ml darah secara steril dari vena cubiti (saat ini jumlah maksimum antibodi spesifik terkonsentrasi). Diagnostikum yang dibuat dari sel mikroba yang dibunuh tetapi tidak dihancurkan dari spesies tertentu dengan struktur antigenik tertentu digunakan sebagai antigen yang diketahui.

Saat melakukan reaksi aglutinasi secara rinci untuk menentukan spesies dan jenis patogen, antigen adalah patogen hidup yang diisolasi dari bahan yang diteliti. Antibodi yang terkandung dalam serum diagnostik imun telah diketahui. ay

Imun serum diagnostik diperoleh dari darah kelinci yang divaksinasi. Setelah menentukan titer (pengenceran maksimum di mana antibodi terdeteksi), serum diagnostik dituangkan ke dalam ampul dengan penambahan bahan pengawet. Serum ini digunakan untuk identifikasi berdasarkan struktur antigenik dari patogen yang diisolasi.

PILIHAN REAKSI AGLUTINASI

Reaksi ini melibatkan antigen dalam bentuk partikel (sel mikroba, sel darah merah dan antigen sel darah lainnya), yang direkatkan oleh antibodi dan mengendap.

Untuk melakukan reaksi aglutinasi (RA), diperlukan tiga komponen: 1) antigen (aglutinogen); 2) antibodi (aglutinin) dan 3) elektrolit (larutan natrium klorida isotonik).

REAKSI AGLUTINASI ORIENTATIF (PIRING) (RA)

Indikatif, atau pelat, RA ditempatkan pada kaca objek pada suhu kamar. Untuk melakukannya, gunakan pipet Pasteur untuk mengoleskan setetes serum secara terpisah dengan pengenceran 1:10 1:20 dan setetes kontrol larutan natrium klorida isotonik ke dalam gelas. Koloni atau kultur bakteri harian (setetes diagnostikum) dimasukkan ke dalam loop bakteriologis dan dicampur secara menyeluruh. Reaksi diperhitungkan secara visual setelah beberapa menit, terkadang menggunakan kaca pembesar (x5). Dengan RA positif, munculnya serpihan besar dan kecil pada setetes serum dicatat, dengan RA negatif, serum tetap keruh secara merata.

REAKSI HEMAGLUTINASI TIDAK LANGSUNG (PASIF) (RNGA, RPGA)

Reaksi yang dilakukan: 1) untuk mendeteksi polisakarida, protein, ekstrak bakteri dan zat lain yang sangat tersebar, rickettsiae dan virus, yang kompleksnya dengan aglutinin tidak dapat dilihat pada RA konvensional, atau 2) untuk mendeteksi antibodi dalam serum pasien terhadap zat-zat yang sangat tersebar dan mikroorganisme terkecil.

Aglutinasi tidak langsung, atau pasif, dipahami sebagai reaksi di mana antibodi berinteraksi dengan antigen yang telah teradsorpsi sebelumnya pada partikel inert (lateks, selulosa, polistiren, barium oksida, dll. atau sel darah merah domba, golongan darah manusia I(0)).

Dalam reaksi hemaglutinasi pasif (RPHA), sel darah merah digunakan sebagai pembawa. Sel darah merah yang mengandung antigen saling menempel di hadapan antibodi spesifik terhadap antigen ini dan mengendap. Eritrosit yang peka terhadap antigen digunakan dalam RPGA sebagai diagnostik eritrosit untuk mendeteksi antibodi (serodiagnosis). Jika sel darah merah mengandung antibodi (diagnostik antibodi eritrosit), sel tersebut dapat digunakan untuk mendeteksi antigen.

Memanggungkan. Serangkaian pengenceran serum secara serial disiapkan di dalam sumur pelat polistiren. Tambahkan 0,5 ml serum yang jelas-jelas positif ke sumur kedua dari belakang dan 0,5 ml larutan fisiologis (kontrol) ke sumur terakhir. Kemudian tambahkan 0,1 ml diagnostik eritrosit encer ke semua sumur, kocok dan masukkan ke dalam termostat selama 2 jam.v

Akuntansi. DI DALAM kasus positif eritrosit mengendap di dasar lubang berupa lapisan sel rata dengan tepi terlipat atau bergerigi (payung terbalik), sebaliknya mengendap dalam bentuk kancing atau cincin.

1.2. REAKSI NETRALISASI. LISIS,
REAKSI OPSONOPHAGOSITIK, REAKSI HIPERSENSITIVITAS

REAKSI NETRALISASI EKSOTOKSIN DENGAN ANTITOXIN (RN)

Reaksinya didasarkan pada kemampuan serum antitoksik untuk menetralkan efek eksotoksin. Ini digunakan untuk titrasi serum antitoksik dan penentuan eksotoksin.

Saat mentitrasi serum, dosis tertentu dari toksin yang sesuai ditambahkan ke pengenceran serum antitoksik yang berbeda. Ketika antigen benar-benar dinetralkan dan tidak ada antibodi yang tersisa, flokulasi awal terjadi. Reaksi flokulasi dapat digunakan tidak hanya untuk titrasi serum (misalnya difteri), tetapi juga untuk titrasi toksin dan toksoid. Reaksi netralisasi toksin dengan antitoksin sangat penting secara praktis sebagai metode untuk menentukan aktivitas serum terapi antitoksik. Antigen dalam reaksi ini adalah eksotoksin sejati.

Kekuatan serum antitoksik ditentukan oleh satuan AE konvensional.

1 AE serum botulinum jumlahnya menetralkan 1000 DLM toksin botulinum. Reaksi netralisasi untuk menentukan spesies atau jenis eksotoksin (untuk diagnosis tetanus, botulisme, difteri, dll) dapat dilakukan secara in vitro (menurut Ramon), dan untuk menentukan toksigenisitas sel mikroba - dalam gel ( menurut Ouchterlony).

Reaksi lisis (RL)

Salah satu sifat pelindung serum imun adalah kemampuannya untuk melarutkan mikroba atau elemen seluler yang masuk ke dalam tubuh.

Antibodi spesifik yang menyebabkan pembubaran sel (lisis) disebut lisin. Tergantung pada sifat antigennya, mereka dapat berupa bakteriolisin, sitolisin, spirochetolysins, hemolysins, dll.

Lisin menunjukkan efeknya hanya dengan adanya faktor pelengkap tambahan. Komplemen sebagai faktor nonspesifik imunitas humoral, ditemukan di hampir semua cairan tubuh, kecuali cairan serebrospinal dan cairan bilik mata depan. Kandungan komplemen yang cukup tinggi dan konstan tercatat dalam serum darah manusia dan banyak terdapat dalam serum darah marmot. Pada mamalia lain, kandungan komplemen dalam serum darahnya berbeda-beda.

Pelengkap adalah sebuah sistem yang kompleks protein whey. Itu tidak stabil dan runtuh pada suhu 55 derajat selama 30 menit. Pada suhu kamar, komplemen dihancurkan dalam waktu dua jam. Sangat sensitif terhadap guncangan berkepanjangan, asam dan sinar ultraviolet. Namun komplemen disimpan dalam waktu lama (sampai enam bulan) dalam keadaan kering pada suhu rendah. Komplemen mendorong lisis sel mikroba dan sel darah merah.

Perbedaan dibuat antara reaksi bakteriolisis dan hemolisis.

Inti dari reaksi bakteriolisis adalah ketika serum imun spesifik bergabung dengan sel mikroba hidup homolog yang sesuai dengan adanya komplemen, terjadi lisis mikroba.

Reaksi hemolisis adalah ketika eritrosit terkena serum spesifik yang kebal terhadapnya (hemolitik) dengan adanya komplemen, terjadi pembubaran eritrosit, yaitu. hemolisis.

Reaksi hemolisis dalam praktek laboratorium digunakan untuk menentukan kisaran komplemen, serta untuk mencatat hasilnya reaksi diagnostik fiksasi komplemen. Titer komplemen adalah jumlah terkecil yang menyebabkan lisis sel darah merah dalam waktu 30 menit dalam sistem hemolitik dalam volume 2,5 ml. Reaksi lisis, seperti semua reaksi serologis, terjadi dengan adanya elektrolit.

REAKSI HIPERSENSITIVITAS (ALERGI)

Bentuk antigen tertentu, setelah kontak berulang kali dengan tubuh, dapat menyebabkan reaksi yang spesifik, tetapi mencakup faktor seluler dan molekuler nonspesifik dari respons inflamasi akut. Ada dua bentuk hipersensitivitas yang diketahui: hipersensitivitas tipe langsung (IHT) dan hipersensitivitas tipe tertunda (DTH). Jenis reaksi pertama terjadi dengan partisipasi antibodi, dan reaksi berkembang selambat-lambatnya 2 jam setelah kontak berulang dengan alergen. Tipe kedua diwujudkan dengan bantuan sel T inflamasi (Tgc) sebagai efektor utama reaksi, memastikan akumulasi makrofag di area peradangan; reaksi muncul setelah 6-8 jam atau lebih.

Perkembangan reaksi hipersensitivitas didahului oleh perjumpaan dengan antigen dan terjadinya sensitisasi, yaitu. munculnya antibodi, limfosit yang tersensitisasi secara aktif dan antibodi sitofilik yang tersensitisasi secara pasif dari leukosit lain (makrofag, granulosit).

Reaksi hipersensitivitas memiliki tiga fase perkembangan: imunologis; patokimia; patofisiologis.

Pada fase pertama, spesifik, alergen berinteraksi dengan antibodi dan (atau) sel yang peka. Pada fase kedua terjadi pelepasan biologis zat aktif dari sel yang diaktifkan. Mediator yang dilepaskan (histamin, serotonin, leukotrien, bradikinin, dll.) menyebabkan berbagai efek perifer yang merupakan karakteristik dari jenis reaksi fase ketiga yang sesuai.

Reaksi hipersensitivitas tipe keempat

Reaksi jenis ini disebabkan oleh interaksi antar sel yang patogen dari sel T-helper yang tersensitisasi, limfosit T sitotoksik (sel T-killer) dan sel teraktivasi dari sistem fagosit mononuklear, yang disebabkan oleh stimulasi berkepanjangan pada sistem kekebalan tubuh oleh antigen bakteri, yang menyebabkan ketidakcukupan relatif sistem kekebalan tubuh untuk dihilangkan lingkungan internal bakteri patogen penyakit menular. Reaksi hipersensitivitas ini menyebabkan rongga paru tuberkulosis, nekrosis kaseosa dan keracunan umum pada pasien tuberkulosis. Granulomatosis kulit pada tuberkulosis dan kusta secara morfopatogenetik sebagian besar terdiri dari reaksi hipersensitivitas tipe keempat.

Paling contoh terkenal reaksi hipersensitivitas tipe keempat ini adalah reaksi Mantoux yang berkembang di tempat injeksi tuberkulin intradermal pada pasien yang tubuh dan sistemnya peka terhadap antigen mikobakteri. Akibat reaksi tersebut, terbentuk papula hiperemik padat dengan nekrosis di tengahnya, yang muncul hanya beberapa jam (perlahan) setelah injeksi tuberkulin intradermal. Pembentukan papula dimulai dengan pelepasan fagosit mononuklear darah yang bersirkulasi dari dasar pembuluh darah ke ruang antar sel. Pada saat yang sama, emigrasi sel polimorfonuklear dari dasar pembuluh darah dimulai. Kemudian infiltrasi oleh neutrofil mereda, dan infiltrasi mulai sebagian besar terdiri dari limfosit dan fagosit mononuklear. Hal ini berbeda dengan reaksi Mantoux dan reaksi Arthus, di mana sebagian besar leukosit polimorfonuklear terakumulasi di lokasi lesi.

Pada reaksi hipersensitivitas tipe 4, stimulasi jangka panjang terhadap limfosit tersensitisasi dengan antigen menyebabkan perubahan patologis jaringan terhadap pelepasan sitokin yang intens dan berkepanjangan secara patologis oleh sel T helper. Pelepasan sitokin yang intens di lokasi kerusakan jaringan menyebabkan hiperaktivasi sel-sel sistem fagosit mononuklear yang terletak di sana, banyak di antaranya, dalam keadaan hiperaktif, membentuk untaian sel epiteloid, dan beberapa bergabung satu sama lain membentuk sel raksasa. Makrofag, yang permukaannya terpapar antigen bakteri dan virus, dapat dihancurkan melalui fungsi Tkillers (pembunuh alami).

Reaksi hipersensitivitas tipe keempat dipicu oleh pengenalan antigen bakteri asing oleh sel T helper yang peka terhadap antigen tersebut. Kondisi yang diperlukan untuk pengenalan adalah interaksi penginduksi dengan antigen yang terpapar pada permukaan sel penyaji antigen setelah endositosis dan pemrosesan imunogen asing oleh fagosit mononuklear. Lain kondisi yang diperlukan paparan antigen dalam kombinasi dengan molekul kelas I dari kompleks histokompatibilitas utama. Setelah pengenalan antigen, sel pembantu yang tersensitisasi melepaskan sitokin dan, khususnya, interleukin2, yang mengaktifkan sel pembunuh alami dan fagosit mononuklear. Fagosit mononuklear yang teraktivasi melepaskan enzim proteolitik dan radikal oksigen bebas, yang merusak jaringan.

Tes alergi kulit menguji untuk mengetahui sensitisasi tubuh terhadap alergen, menentukan tingkat infeksinya, misalnya tuberkulosis, brucellosis, kekebalan kelompok, misalnya, untuk tularemia. Berdasarkan tempat pemberian alergen, terdapat: 1) tes kulit; 2) skarifikasi; 3) intradermal; 4) subkutan. Reaksi klinis terhadap alergen selama tes alergi kulit dibagi menjadi lokal, umum dan fokal, serta segera dan tertunda.

Reaksi lokal tipe mediator GNT terjadi setelah 520 menit, dinyatakan dalam bentuk eritema dan lepuh, hilang setelah beberapa jam, dan dinilai dengan metode plus berdasarkan ukuran eritema, diukur dalam mm. Reaksi HRT lokal terjadi dalam waktu 24-48 jam, berlangsung lama, tampak berupa infiltrasi, kadang disertai nekrosis di bagian tengahnya, dan dinilai berdasarkan ukuran infiltrasi dalam mm, juga menggunakan sistem plus. Dengan jenis HNT sitotoksik dan imunokompleks, hiperemia dan infiltrasi diamati setelah 3-4 jam, mencapai maksimum pada 6-8 jam dan mereda setelah sekitar satu hari. Terkadang reaksi gabungan diamati.

1.3. REAKSI FIKSASI KOMPLEMEN (FFR)

Reaksi ini digunakan dalam penelitian laboratorium untuk mendeteksi antibodi dalam serum darah terhadap berbagai infeksi, serta untuk mengidentifikasi patogen berdasarkan struktur antigeniknya.

Reaksi fiksasi komplemen merupakan reaksi serologis yang kompleks dan sangat sensitif dan spesifik.

Ciri dari reaksi ini adalah perubahan antigen selama interaksinya dengan antibodi spesifik hanya terjadi dengan adanya komplemen. Komplemen hanya teradsorpsi pada kompleks “antibodi antigen”. Kompleks “antigen antibodi” terbentuk hanya jika ada afinitas antara antigen dan antibodi dalam serum.

Adsorpsi komplemen pada kompleks “antibodi antigen” dapat mempunyai efek berbeda terhadap nasib antigen tergantung pada karakteristiknya.

Beberapa antigen mengalami perubahan morfologi yang tajam pada kondisi ini, termasuk disolusi (hemolisis, fenomena Isaev-Pfeiffer, aksi sitolitik). Yang lain mengubah kecepatan gerakan (imobilisasi treponema). Yang lain lagi mati tanpa perubahan destruktif yang tiba-tiba (efek bakterisidal atau sitotoksik). Terakhir, adsorpsi komplemen mungkin tidak disertai dengan perubahan antigen yang mudah diamati.

Menurut mekanisme RSC, hal ini terjadi dalam dua fase:

1. Fase pertama adalah pembentukan kompleks “antibodi antigen” dan adsorpsi pada kompleks komplemen ini. Hasil dari fase ini tidak terlihat secara visual (interaksi antigen dan antibodi dengan partisipasi wajib komplemen).
2. Fase kedua adalah perubahan antigen di bawah pengaruh antibodi spesifik dengan adanya komplemen. Hasil fase dapat terlihat secara visual maupun tidak terlihat (deteksi hasil reaksi menggunakan indikator sistem hemolitik (sel darah merah domba dan serum hemolitik).

Penghancuran sel darah merah oleh serum hemolitik hanya terjadi jika komplemen ditambahkan ke sistem hemolitik. Jika komplemen sebelumnya teradsorpsi pada kompleks antigen-antibodi, maka hemolisis eritrosit tidak terjadi.

Hasil percobaan dinilai dengan mencatat ada tidaknya hemolisis pada seluruh tabung reaksi. Reaksi dianggap positif ketika hemolisis tertunda sepenuhnya, ketika cairan dalam tabung reaksi tidak berwarna dan sel darah merah mengendap di dasar, negatif ketika sel darah merah benar-benar lisis, ketika cairan sangat berwarna (“pernis” darah). Derajat keterlambatan hemolisis dinilai tergantung pada intensitas warna cairan dan ukuran endapan sel darah merah di dasar (++++, +++, ++, +).

Jika perubahan antigen tetap tidak dapat diakses untuk pengamatan visual, maka perlu menggunakan sistem kedua, yang bertindak sebagai indikator, memungkinkan seseorang menilai keadaan komplemen dan menarik kesimpulan tentang hasil reaksi.

Sistem indikator ini diwakili oleh komponen reaksi hemolisis yang meliputi eritrosit domba dan serum hemolitik yang mengandung antibodi spesifik terhadap eritrosit (hemolisin), tetapi tidak mengandung komplemen. Sistem indikator ini ditambahkan ke dalam tabung reaksi satu jam setelah RSC utama dipasang. Jika reaksi fiksasi komplemen positif, maka terbentuk kompleks antigen antibodi, yang menyerap komplemen itu sendiri. Karena komplemen digunakan dalam jumlah yang diperlukan hanya untuk satu reaksi, dan lisis eritrosit hanya dapat terjadi dengan adanya komplemen, maka ketika komplemen tersebut teradsorpsi pada kompleks “antibodi antigen”, lisis eritrosit dalam sistem hemolitik (indikator) akan terjadi. tidak terjadi. Jika reaksi fiksasi komplemen negatif, kompleks “antibodi antigen” tidak terbentuk, komplemen tetap bebas, dan ketika sistem hemolitik ditambahkan, terjadi lisis eritrosit.

1.4. PROBE DNA. REAKSI RANTAI POLIMERASE (PCR),
METODE ENZIM IMUNO (ELISA), METODE ANTIBODI FLUORESCING (FFA)

METODE PROBING GEN

Perkembangan intensif biologi molekuler dan penciptaan landasan metodologis yang sempurna untuk penelitian genetika membentuk dasar rekayasa genetika. Di bidang diagnostik, suatu arah telah muncul dan berkembang pesat untuk menentukan urutan nukleotida spesifik DNA dan RNA, yang disebut penyelidikan gen. Teknik tersebut didasarkan pada kemampuan asam nukleat untuk berhibridisasi dan membentuk struktur beruntai ganda akibat interaksi nukleotida komplementer (AT, GC).

Untuk menentukan urutan DNA (atau RNA) yang diinginkan, apa yang disebut probe polinukleotida dengan urutan basa tertentu dibuat secara khusus. Label khusus dimasukkan ke dalam komposisinya, yang memungkinkan untuk mengidentifikasi pembentukan kompleks.

Meskipun pemeriksaan gen tidak dapat diklasifikasikan sebagai metode analisis imunokimia, prinsip dasarnya (interaksi struktur komplementer) diterapkan secara metodis dengan cara yang sama seperti metode indikator imunodiagnostik. Selain itu, metode penyelidikan gen memungkinkan untuk mengisi kembali informasi tentang agen infeksi tanpa adanya ekspresi fenotipiknya (virus yang tertanam dalam genom, gen “diam”).

Untuk melakukan analisis DNA, sampel didenaturasi untuk mendapatkan struktur untai tunggal yang bereaksi dengan molekul probe DNA atau RNA. Untuk mempersiapkan probe, berbagai bagian DNA (atau RNA) yang diisolasi dari sumber alami (misalnya, mikroorganisme tertentu), biasanya disajikan dalam bentuk urutan genetik dalam plasmid vektor, atau oligonukleotida yang disintesis secara kimia digunakan. Dalam beberapa kasus, preparat DNA genom yang dihidrolisis menjadi fragmen digunakan sebagai probe, terkadang preparat RNA, dan terutama RNA ribosom. Indikator yang sama digunakan sebagai label seperti dalam berbagai jenis analisis imunokimia: isotop radioaktif, fluorescein, biotope (dengan pengembangan lebih lanjut oleh kompleks enzim avidin), dll.

Urutan analisis ditentukan oleh properti probe yang tersedia

Saat ini, peralatan komersial yang berisi semua bahan yang diperlukan semakin banyak digunakan.

Dalam kebanyakan kasus, prosedur analisis dapat dibagi menjadi beberapa tahap berikut: persiapan sampel (termasuk ekstraksi dan denaturasi DNA), fiksasi sampel pada pembawa (paling sering filter membran polimer), prahibridisasi, hibridisasi itu sendiri, pencucian produk yang tidak terikat, deteksi . Jika tidak ada preparasi probe DNA atau RNA standar, maka probe tersebut diperoleh dan diberi label terlebih dahulu.

Untuk menyiapkan sampel, mungkin perlu “menumbuhkan” bahan uji terlebih dahulu untuk mengidentifikasi koloni bakteri individu atau meningkatkan konsentrasi virus dalam kultur sel. Juga dilakukan analisis langsung sampel serum darah, urin, elemen berbentuk darah atau darah utuh untuk mengetahui adanya agen infeksi. Untuk melepaskan asam nukleat dari struktur sel, lisis sel dilakukan, dan dalam beberapa kasus, sediaan DNA dimurnikan menggunakan fenol.

Denaturasi DNA, yaitu transisinya ke bentuk untai tunggal, terjadi ketika diolah dengan alkali. Sampel asam nukleat kemudian difiksasi pada suatu pendukung, membran nitroselulosa atau nilon, biasanya dengan inkubasi selama 10 menit hingga 4 jam pada suhu 80°C dalam ruang hampa. Selanjutnya, dalam proses prahibridisasi, inaktivasi situs pengikatan bebas dicapai untuk mengurangi interaksi nonspesifik antara probe dan membran. Proses hibridisasi memakan waktu 2 hingga 20 jam, tergantung pada konsentrasi DNA dalam sampel, konsentrasi probe yang digunakan, dan ukurannya.

Setelah hibridisasi selesai dan produk yang tidak terikat dihilangkan, kompleks yang terbentuk terdeteksi. Jika probe mengandung label radioaktif, maka untuk menunjukkan reaksinya, membran dipaparkan pada film fotografi (autoradiografi). Untuk label lain, prosedur yang sesuai digunakan.

Yang paling menjanjikan adalah memperoleh probe non-radioaktif (yang disebut dingin). Atas dasar yang sama, teknik hibridisasi sedang dikembangkan, yang memungkinkan untuk menetapkan keberadaan patogen dalam sediaan bagian dan tusukan jaringan, yang sangat penting dalam analisis patomorfologi (hibridisasi in situ).

Sebuah langkah penting dalam pengembangan metode penyelidikan gen adalah penggunaan reaksi amplifikasi polimerase (PCR). Pendekatan ini memungkinkan untuk meningkatkan konsentrasi rangkaian DNA spesifik (yang sudah diketahui sebelumnya) dalam sampel dengan mensintesis banyak salinan secara in vitro. Untuk melakukan reaksi, preparasi enzim DNA polimerase, kelebihan deoksinukleotida untuk sintesis dan apa yang disebut primer ditambahkan ke sampel DNA yang diteliti - dua jenis oligonukleotida dengan ukuran basa 2025 yang sesuai dengan bagian terminal dari DNA. Urutan DNA yang menarik. Salah satu primer harus berupa salinan awal daerah pembacaan untai DNA pengkode pada arah pembacaan 53, dan primer kedua harus berupa salinan ujung berlawanan dari untai non-pengkode. Kemudian, dengan setiap siklus reaksi polimerase, jumlah salinan DNA berlipat ganda.

Untuk mencapai pengikatan primer, perlu dilakukan denaturasi (peleburan) DNA pada suhu 94°C, diikuti dengan membawa campuran ke suhu 40-55°C.

Untuk melaksanakan reaksi, inkubator sampel mikro yang dapat diprogram telah dirancang untuk dengan mudah mengganti perubahan suhu optimal untuk setiap tahap reaksi.

Reaksi amplifikasi dapat secara signifikan meningkatkan sensitivitas analisis selama pemeriksaan gen, yang sangat penting pada konsentrasi agen infeksi yang rendah.

Salah satu keuntungan signifikan dari penyelidikan gen dengan amplifikasi adalah kemampuannya untuk mempelajari sejumlah bahan patologis dalam jumlah submikroskopis.

Fitur lain dari metode ini, yang lebih penting untuk analisis bahan menular, adalah kemampuan untuk mengidentifikasi gen yang tersembunyi (diam). Metode yang terkait dengan penggunaan pemeriksaan gen tentunya akan lebih banyak diterapkan dalam praktik diagnosis penyakit menular karena metode ini menjadi lebih sederhana dan murah.

Metode ELISA dan RIF sebagian besar bersifat kualitatif atau semikuantitatif. Pada konsentrasi komponen yang sangat rendah, pembentukan kompleks antigen-antibodi tidak dapat dideteksi baik secara visual maupun dengan alat sederhana. Indikasi kompleks antigen-antibodi dalam kasus tersebut dapat dilakukan jika label dimasukkan ke dalam salah satu komponen awal antigen atau antibodi , yang dapat dengan mudah dideteksi dalam konsentrasi yang sebanding dengan konsentrasi analit yang ditentukan.

Isotop radioaktif (misalnya 125I), zat fluoresen, dan enzim dapat digunakan sebagai label.

Tergantung pada label yang digunakan, ada metode analisis radioimun (RIA), imun fluoresen (FIA), uji imunosorben terkait-enzim (ELISA), dll. tahun terakhir ELISA telah banyak digunakan secara praktis karena kemampuannya penentuan kuantitatif, sensitivitas tinggi, kekhususan dan otomatisasi akuntansi.

Metode immunoassay enzim adalah sekelompok metode yang memungkinkan deteksi kompleks antigen-antibodi menggunakan substrat yang dibelah oleh enzim dan menghasilkan warna.

Inti dari metode ini adalah menggabungkan komponen reaksi antigen-antibodi dengan label enzim yang diukur. Antigen atau antibodi yang bereaksi diberi label dengan enzim. Berdasarkan transformasi substrat di bawah aksi enzim, seseorang dapat menilai jumlah komponen yang berinteraksi dari reaksi antigen-antibodi. Enzim masuk pada kasus ini berfungsi sebagai penanda reaksi imun dan memungkinkan Anda mengamatinya secara visual atau instrumental.

Enzim adalah penanda yang sangat cocok karena sifat katalitiknya memungkinkannya bertindak sebagai penguat, karena satu molekul enzim dapat mendorong pembentukan lebih dari 1 × 105 molekul produk reaksi katalitik per menit. Penting untuk memilih enzim yang mempertahankan aktivitas katalitiknya untuk waktu yang lama, tidak kehilangannya ketika berikatan dengan antigen atau antibodi, dan memiliki spesifisitas tinggi terhadap substrat.

Metode utama untuk memproduksi antibodi atau antigen dan konjugat berlabel enzim adalah: rekayasa kimia, imunologi, dan genetika. Enzim yang paling sering digunakan untuk ELISA adalah horseradish peroxidase, alkalinephosphatese, galactosidase, dll.

Untuk mendeteksi aktivitas enzim dalam kompleks antigen-antibodi untuk tujuan perekaman reaksi secara visual dan instrumental, substrat kromogenik digunakan, larutan yang awalnya tidak berwarna, selama reaksi enzimatik memperoleh warna, yang intensitasnya sebanding dengan kuantitas. enzim. Jadi, untuk mendeteksi aktivitas peroksidase lobak dalam ELISA fase padat, digunakan asam 5-aminosalisilat, yang menghasilkan warna coklat pekat, dan orto-fenilendiamin, yang menghasilkan warna oranye-kuning, sebagai substrat. Untuk mendeteksi aktivitas alkali fosfatase dan β-galatosidase, masing-masing digunakan nitrofenilfosfat dan nitrofenilgalaktosida.

Hasil reaksi pembentukan produk berwarna ditentukan secara visual atau menggunakan spektrofotometer yang mengukur serapan cahaya dengan panjang gelombang tertentu.

Ada banyak pilihan untuk melakukan ELISA. Ada pilihan yang homogen dan heterogen.

Menurut metode produksinya, metode ELISA kompetitif dan non-kompetitif dibedakan. Jika pada tahap pertama hanya senyawa yang dianalisis dan pusat pengikatannya (antigen dan antibodi spesifik) yang ada dalam sistem, maka metode tersebut non-kompetitif. Jika pada tahap pertama terdapat senyawa yang dianalisis (antigen) dan analognya (antigen berlabel enzim), yang bersaing satu sama lain untuk mengikat pusat pengikatan spesifik (antibodi) yang jumlahnya terbatas, maka metode tersebut kompetitif. Dalam hal ini, semakin banyak antigen uji yang terkandung dalam larutan, semakin sedikit jumlah antigen berlabel yang terikat.

METODE ANTIBODI FLUORESCING (MFA) atau REAKSI IMUNOFLUORESCENCE (RIF)

Metode imunofluoresensi merupakan metode pilihan untuk deteksi cepat dan identifikasi mikroorganisme yang tidak diketahui pada bahan uji.

Ag + AT + elektrolit = kompleks bercahaya dalam sinar UV

Serum mikroba berlabel fluorochrome

Pewarna yang sering digunakan adalah fluorescein isothiocyanate FITC

Saat mempelajari metode ini, mikroskop fluoresen digunakan.

Pementasan RIF

30 μl larutan antibodi berlabel FITC dioleskan pada apusan.

Tempatkan gelas di ruang lembab dan simpan pada suhu kamar selama 20-25 menit, atau dalam termostat pada suhu 37°C selama 15 menit.

Cuci kaca di mesin yang sedang berjalan keran air 2 menit, bilas dengan air suling dan keringkan di udara terbuka.

Setetes cairan yang menempel diteteskan pada apusan kering, apusan ditutup dengan kaca penutup dan dimikroskop menggunakan mikroskop fluoresen atau sambungan fluoresen pada mikroskop optik konvensional.