Aglutinační reakce pro stanovení anti-Rhesus protilátek ( nepřímá reakce Coombs)aplikovat u pacientů s intravaskulární hemolýzou. U některých z těchto pacientů jsou detekovány protilátky anti-Rhesus, které jsou neúplné a monovalentní. Specificky interagují s Rh-pozitivními erytrocyty, ale nezpůsobují jejich aglutinaci. Přítomnost takových neúplných protilátek je stanovena nepřímým Coombsovým testem. K tomu se do systému anti-Rh protilátek + Rh-pozitivních erytrocytů přidává antiglobulinové sérum (protilátky proti lidským imunoglobulinům), které způsobí aglutinaci erytrocytů. Pomocí Coombsovy reakce jsou diagnostikovány patologické stavy spojené s intravaskulární lýzou erytrocytů imunitního původu, např. hemolytické onemocnění novorozence: erytrocyty Rh pozitivního plodu se spojují s nekompletními protilátkami proti Rh faktoru kolujícímu v krvi, které mají prošel placentou od Rh negativní matky.
Mechanismus. Obtížnost identifikace nekompletních (monovalentních) protilátek je způsobena tím, že tyto protilátky při vazbě na epitopy specifického antigenu netvoří mřížkovou strukturu a reakce mezi antigeny a protilátkami není detekována ani aglutinací, precipitací, ani aglutinací, precipitací, precipitací, precipitací, srážlivostí, srážlivostí a podobně. nebo jiné testy. K identifikaci vytvořených komplexů antigen-protilátka je nutné použít další testovací systémy. Pro detekci nekompletních protilátek, např. proti Rh antigenu erytrocytů v krevním séru těhotné ženy, se reakce provádí ve dvou fázích: 1) erytrocyty obsahující Rh antigen se přidají k dvojnásobným ředěním testovaného séra a uchovávají se při 37 °C po dobu jedné hodiny; 2) králičí anti-lidské antiglobulinové sérum (v předem titrovaném pracovním ředění) se přidá k erytrocytům důkladně promytým po první fázi. Po inkubaci po dobu 30 minut při 37 °C se výsledky hodnotí podle přítomnosti hemaglutinace (pozitivní reakce). Je nutné kontrolovat složky reakce: 1) antiglobulinové sérum + červené krvinky, o kterých je známo, že jsou senzibilizované specifickými protilátkami; 2) erytrocyty ošetřené normálním sérem + antiglobulinovým sérem; 3) Rh-negativní erytrocyty ošetřené testovaným sérem + antiglobulinovým sérem.
50. Pasivní hemaglutinační reakce. Mechanismus. Komponenty. Aplikace.
Nepřímá (pasivní) hemaglutinační reakce(RNGA, RPGA) je založena na použití erytrocytů (nebo latexu) s antigeny nebo protilátkami adsorbovanými na jejich povrchu, jejichž interakce s odpovídajícími protilátkami nebo antigeny krevního séra pacientů způsobuje slepení erytrocytů a jejich vypadávání na dno krevního séra. zkumavka nebo buňka ve formě vroubkovaného sedimentu.
Komponenty. K provedení RNGA lze použít erytrocyty z ovcí, koní, králíků, kuřat, myší, lidí a dalších, které jsou uloženy pro budoucí použití ošetřením formaldehydem nebo glutaraldehydem. Adsorpční kapacita erytrocytů se zvyšuje, když jsou ošetřeny roztoky taninu nebo chloridu chromitého.
Antigeny v RNGA mohou být polysacharidové antigeny mikroorganismů, extrakty bakteriálních vakcín, antigeny virů a rickettsie, ale i další látky.
Červené krvinky senzibilizované hypertenzí se nazývají erytrocytární diagnosticum. Pro přípravu erytrocytárního diagnostica se nejčastěji používají ovčí erytrocyty, které mají vysokou adsorpční aktivitu.
aplikace. RNGA se používá k diagnostice infekčních onemocnění, stanovení gonadotropního hormonu v moči při zakládání těhotenství, k identifikaci přecitlivělosti na léky, hormony a v některých dalších případech.
Mechanismus. Nepřímý hemaglutinační test (IRHA) má výrazně vyšší senzitivitu a specificitu než aglutinační test. Slouží k identifikaci patogenu podle jeho antigenní struktury nebo k indikaci a identifikaci bakteriálních produktů – toxinů ve studovaném patologickém materiálu. V souladu s tím se používá standardní (komerční) diagnostika erytrocytárních protilátek, získaná adsorpcí specifických protilátek na povrch taninizovaných (taninem ošetřených) erytrocytů. Sériová ředění testovaného materiálu se připraví v jamkách plastových destiček. Poté se do každé jamky přidá stejný objem 3% suspenze červených krvinek s obsahem protilátky. V případě potřeby se reakce provádí paralelně v několika řadách jamek s erytrocyty naloženými protilátkami různých skupinových specif.
Po 2 hodinách inkubace při 37 °C jsou výsledky zohledněny a vyhodnoceny vzhled sediment erytrocytů (bez třepání): s negativní reakcí se na dně jamky objeví sediment ve formě kompaktního disku nebo prstence, s pozitivní reakcí - charakteristický krajkový sediment erytrocytů, tenký film s nerovnými okraji .
Coombsův test je klinická analýza krevní test, který se provádí za účelem zjištění, zda krev obsahuje určité protilátky, které mohou být nebezpečné. Tyto protilátky ulpívají na červených krvinkách a mohou napadnout imunitní systém, stejně jako způsobit škodu jiným způsobem. V lékařské terminologii se tato studie také nazývá antiglobulinový test (AGT).
Typy Coombsových vzorků
Existují dva typy Coombsových testů – přímý a nepřímý.
Přímý Coombsův test, také známý jako přímý (DAT), detekuje autoprotilátky, které se vážou na povrch červených krvinek. Tyto protilátky jsou někdy produkovány v těle v důsledku určitých onemocnění nebo při užívání některých léků, jako je prokainamid, methyldopa nebo chinidin.
Tyto protilátky jsou nebezpečné, protože někdy způsobují anémii ničením červených krvinek.
Tento test je někdy nařízen k diagnostice příčiny žloutenky nebo anémie.
Normálně je Coombsova reakce negativní.
Pozitivní pro:
- hemolytické onemocnění novorozenci;
- autoimunitní hemolýza;
- hemolytické transfuzní reakce;
- imunitní hemolytická anémie vyvolaná léky.
Nepřímý vzorek Coombs, také známý jako , se používá k detekci protilátek proti červeným krvinkám nalezeným v krevním séru (sérum je čirá žlutá tekutina krve, která zůstane po odstranění červených krvinek a koagulantu).
Nepřímý Coombsův test se používá během krevní transfuze k určení, zda krev dárce odpovídá krvi příjemce. To se nazývá test kompatibility a pomáhá předcházet jakékoli nežádoucí reakci na krev dárce. Tato analýza doporučuje se i těhotným ženám. Některé ženy mají protilátky IgG, které mohou procházet placentou do krve plodu a poškodit novorozence, což způsobuje hemolytické onemocnění známé jako hemolytická anémie.
Postup
Krev se odebírá pomocí injekční stříkačky ze žíly, obvykle s zadní strana dlani nebo na ohybu lokte. Před tím se místo vpichu důkladně vydezinfikuje a po odběru krve se přiloží čistá gáza nebo vata.
Výsledná krev se čistí v laboratoři a oddělují se červené krvinky. Vzorek je poté testován postupně pomocí různých sér a Coombsových činidel, které jsou kontrastovány. Pokud nedochází k aglutinaci (shlukování červených krvinek), znamená to pozitivní výsledek.
Pokud je ale test negativní, znamená to, že v krvi jsou protilátky, které působí proti červeným krvinkám. To může naznačovat různé nemoci, jako je anémie (přirozená i způsobená užíváním léků), syfilis nebo mykoplazmatická infekce. Po obdržení výsledků ošetřující lékař předepíše vhodnou léčbu.
Video
Antiglobulinový princip. Antierytrocytární protilátky nekompletního typu a molekuly komplementu (C) umístěné na povrchu erytrocytů se detekují - přímým testem - jejich aglutinací v kontaktu se zvířecím sérem obsahujícím protilátky proti lidskému antiglobulinu (antiglobulinové sérum). Zdarma v séru neúplné protilátky se detekují - nepřímým testem - připojením ke směsi normálních erytrocytů skupiny 0, jejichž všechny antigeny patří do známého Rh systému, a následně se aglutinují vlivem antiglobulinového séra.
Materiály, činidla pro Coombsův antiglobulinový test: zkumavky 10/100 ml; odměrné pipety 1,2 ml; Pasteurovy pipety; stativy; nebroušená skleněná sklíčka; 8,5‰ roztok NaCl; červené krvinky. Červené krvinky pacienta, stejně jako ty, které patří do skupiny 0, budou získány z čerstvě odebrané krve pomocí protisrážlivého činidla (roztok EDTA).
Červené krvinky skupiny 0 by měly být vybrány tak, aby pocházely od normálních jedinců a obsahovaly všechny Rh antigeny. Mohou být skladovány až 7 dní v autologní plazmě při + 4°C. V nepřítomnosti červených krvinek skupiny 0 lze použít známou antigenní mozaiku, směs červených krvinek skupiny 0, Rh-pozitivních a Rh-negativních červených krvinek.
Sérum pacient musí být čerstvě vybrán.
Antiglobulinové sérum produkoval Ústav. Dr. I. Cantacuzino, je dostupný v lyofilizované formě v 1 ml ampulích. Po rozpuštění uchovávejte sérum při -20°C.
Coombsova antiglobulinová testovací technika:
A) Přímý Coombsův test: Opláchněte pacientovy červené krvinky 3x roztokem 8,5‰ NaCl.
Naneste velkou kapku ředění antiglobulinového séra na několik podložních sklíček a vedle ní malou kapku erytrocytárního sedimentu pacienta; smíchejte kapky s rohem sklenice. Připravený materiál ponechte na stole 5 minut, poté zkontrolujte přítomnost aglutinátů. Když pozitivní výsledek určit maximální aglutinační titr.
b) Nepřímý Coombsův test: erytrocyty skupiny 0, Rh-pozitivní a Rh-negativní, 3x opláchněte 8,5‰ roztokem NaCl a vystavte pacientovu séru rychlostí 2 kapky erytrocytů na 8-10 kapek séra, poté inkubujte 60 minut při teplotu 37° S. Poté znovu třikrát promyjte červené krvinky a ošetřete je antiglobulinovým sérem podle pokynů pro přímý Coombsův test.
Kdy to přijde o chladově aktivních protilátkách senzibilizovat červené krvinky skupiny 0 po dobu 60 minut. při teplotě + 4°C.
Poznámka 1) Neprovádějte přímý Coombsův test na červených krvinkách skladovaných po dobu jednoho nebo několika dnů při + 4 °C nebo pokojové teplotě, protože výsledky mohou být falešně pozitivní kvůli fixaci neúplných chladově aktivních protilátek přítomných v normálním séru. 2) V případě těžké hyperproteinémie promyjte 4-5x červené krvinky a pomocí kyseliny sulfosalicylové zkontrolujte nepřítomnost sérových proteinů v poslední promývací kapalině.
Možný zbytek 2 μg IgG/ml v sedimentu erytrocytů může neutralizovat antiglobulinové sérum. Coombsův test lze také provést s použitím monospecifických anti-IgG, -IgM, -IgA -C3 a -C4 sér za účelem objasnění typu buněk umístěných na povrchu červených krvinek, například u pacientů trpících autoimunitními hemolytickými anémie.
Naneste 1 velkou kapku séra O(I), A(II), B(III) na misku nebo podložní sklíčko pomocí pipet (různé!). Po zaznamenání času použijte čistou skleněnou tyčinku nebo čistý roh podložního sklíčka ke spojení kapek séra s kapkami krve. Stanovení trvá 5 minut, protřepejte destičku, poté přidejte do každé směsi kapek 1 kapku fyziologického roztoku a vyhodnoťte výsledky. Je lepší, když se sérum dodává ve 2 různých sériích. Výsledky krevních skupin se musí shodovat v obou šaržích séra.
Vyhodnocení výsledků izohemaglutinace:
pokud všechna 3 séra vykazovala negativní reakci, to znamená, že směs je jednotně zbarvená do růžova - jedná se o krevní skupinu O(I);
Li negativní reakce pouze sérum skupiny A(II) dalo a séra O(I) a B(III) dala pozitivní reakci, to znamená, že se objevila zrna - to je krevní skupina A(II);
sérum skupiny B(II) vykázalo negativní reakci a séra skupiny O(I) a A(II) vykázala pozitivní reakci - to je krevní skupina B(III).
isohemaglutinace. Pokud je reakce pozitivní, objeví se ve směsi drobná červená zrnka adhezivních červených krvinek. Zrna se spojují do větších zrn a ta do vloček. Sérum je téměř vybledlé;
pokud je reakce negativní, zůstane směs rovnoměrně zbarvená po dobu 5 minut růžová barva a žádná zrna nejsou nalezena;
Při práci se 3 séry skupin O(I), A(II), B(III) jsou možné 4 kombinace reakcí:
všechna 3 séra dala pozitivní reakce- test krevní skupiny AB(IV). V tomto případě se studie provádí se sérem skupiny AB(IV).
Poznámka! Kapky testované krve by měly být 5-10krát menší než kapky séra.
Isohemaglutinační chyby.
Neschopnost provést aglutinaci tam, kde by měla být, a přítomnost aglutinace tam, kde by neměla být. To může být způsobeno slabým titrem séra a špatnou aglutinací červených krvinek.
Přítomnost aglutinace tam, kde by neměla být žádná- Jedná se o pseudoaglutinaci, kdy hromady červených krvinek tvoří „sloupce mincí“. Zatřesení talířem nebo přidání fyziologického roztoku je ničí.
Panaglutinace, kdy sérum slepí všechny červené krvinky, včetně těch vlastní krevní skupiny. Do 5. minuty známky aglutinace zmizí.
Dochází také k tzv. studené panaglutinaci, kdy se červené krvinky slepí kvůli nízké teplotě vzduchu (pod 15 °C) v místnosti.
Ve všech těchto případech se provádí buď opakovaná reakce, nebo za použití standardních červených krvinek.
Stanovení Rh krve
Ke stanovení stavu Rh, tedy k detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti antigenů systému Rh v lidské krvi, se používají standardní anti-Rh séra (reagenty), lišící se specificitou, tj. obsahující protilátky proti různým antigenům tohoto systému. Pro stanovení Rh 0 (D) antigenu se nejčastěji používá anti-Rhesus sérum s přídavkem 10% roztoku želatiny nebo se používá standardní anti-Rhesus činidlo předem připravené s 33% roztokem polyglucinu. K získání přesnějších výsledků výzkumu, stejně jako k identifikaci antigenů jiných sérologických systémů, se používá Coombsův test (je také velmi citlivý při stanovení kompatibility transfundované krve). Pro výzkum se používá nativní krev nebo krev připravená s nějakým konzervantem. V tomto případě by měla být krev omyta od konzervační látky desetinásobným objemem izotonického roztoku chloridu sodného. Při určování stavu Rh- Rh 0 (D) měly by být použity dva vzorky séra nebo anti-Rhesus reagencie ze dvou různých sérií a současně standardní červené krvinky získané z krve z Rh-pozitivní (Rh +) a Rh-negativní (Rh -) ke kontrole by měli být využíváni jednotlivci. Při stanovení dalších izoantigenů by měly být odpovídajícím způsobem použity kontrolní červené krvinky, které obsahují nebo postrádají antigen, proti kterému jsou protilátky ve standardním séru namířeny.
Parciální tepelné aglutininy jsou nejčastějším typem protilátek, které mohou způsobit rozvoj autoimunitní hemolytické anémie. Tyto protilátky patří k IgG, vzácně k IgM, IgA.
COOMBSOVÝ TEST
Coombsův test: úvod. Coombsův test je laboratorní diagnostická metoda založená na hemaglutinační reakci.
Hlavní metodou pro diagnostiku autoimunitní hemolytické anémie je Coombsův test. Je založena na schopnosti protilátek specifických pro imunoglobuliny (zejména IgG) nebo složky komplementu (zejména S3) aglutinovat erytrocyty potažené IgG nebo S3.
Vazba IgG a C3b na erytrocyty je pozorována u autoimunitní hemolytické anémie a polékové imunitní hemolytické anémie. Přímý Coombsův test. Přímý Coombsův test se používá k detekci protilátek nebo složek komplementu fixovaných na povrchu červených krvinek. Provádí se následovně:
K získání protilátek proti lidským imunoglobulinům (antiglobulinové sérum) nebo komplementu (antikomplementární sérum) je zvíře imunizováno lidským sérem, imunoglobuliny nebo lidským komplementem. Sérum získané ze zvířete je purifikováno od protilátek proti jiným proteinům.
Červené krvinky pacienta se promyjí fyziologickým roztokem, aby se úplně odstranilo sérum, které neutralizuje protilátky proti imunoglobulinům a komplementu a může způsobit falešně negativní výsledek.
Pokud jsou protilátky nebo složky komplementu fixovány na povrchu červených krvinek, přidání antiglobulinu nebo antikomplementového séra způsobí aglutinaci červených krvinek.
Přímý Coombsův test se používá v následujících případech:
Autoimunitní hemolýza.
Hemolytická nemoc novorozenců.
Imunitní hemolytická anémie vyvolaná léky.
Hemolytické transfuzní reakce. Nepřímý Coombsův test. Nepřímý Coombsův test detekuje protilátky proti červeným krvinkám v séru. K tomu se pacientovo sérum inkubuje s červenými krvinkami dárce skupiny 0 a poté se provede přímý Coombsův test.
Nepřímý Coombsův test se používá v následujících případech:
Stanovení individuální kompatibility krve dárce a příjemce.
Detekce aloprotilátek, včetně protilátek, které způsobují hemolytické transfuzní reakce.
Stanovení povrchových erytrocytárních antigenů v lékařské genetice a soudním lékařství.
Potvrzení jednovaječných dvojčat při transplantaci kostní dřeně.
K provedení biologického testu se krev začne podávat co nejrychleji (nejlépe proudem). Po transfuzi 25 ml krve se zkumavka systému upne svorkou. Poté následuje 3minutová pauza, během které je sledován stav příjemce. K provedení biologického testu se třikrát vstříkne 25 ml krve. Na konci testu (po transfuzi prvních 75 ml krve ve zlomkových dávkách 25 ml v intervalech 3 minut) se systém upraví na požadovanou rychlost transfuze. Při transfuzi více než jedné lahve krve pacientovi je nutné vyjmout jehlu ze žíly. V tomto případě se jehla vyjme ze zkumavky lahvičky, ve které vytekla krev, a vloží se do další lahvičky. Systémová trubka (pryžová nebo plastová) je v tomto okamžiku sevřena svorkou. Pokud je během krevní transfuze nutné podat příjemci nitrožilně jakýkoli jiný lék, provede se to propíchnutím pryžové hadičky systému. Proražení plastové trubice je nepřijatelné, protože nespadne. Po každé krevní transfuzi musí být pacient sledován, aby byl identifikován a okamžitě odstraněn možné komplikace, počítaje v to alergické reakce. 2 hodiny po ukončení krevní transfuze by měla být změřena tělesná teplota. Pokud se zvýší, je nutné měření opakovat každou hodinu po dobu následujících 4 hodin. Neméně důležité je sledování močení a složení moči, které umožňuje zjistit přítomnost toxické potransfuzní reakce. Vznik oligurie a anurie po krevní transfuzi, přítomnost krvinek a bílkovin v moči jsou přímým ukazatelem rozvoje posttransfuzní hemolýzy.
Přímý Coombsův test. Tento test se používá k prokázání přítomnosti blokujících protilátek fixovaných v červených krvinkách dítěte. Pozitivní přímý test indikuje senzibilizaci a slouží jako přesvědčivý příznak hemolytického onemocnění novorozence ještě dříve, než se objeví další klinické příznaky. Výjimečně a pouze ve velmi závažných případech může být přímý Coombsův test negativní kvůli již probíhající, téměř úplné hemolýze senzibilizovaných červených krvinek.
Přímý Coombsův test se provádí následovně: 5 kapek krve odebrané z paty dítěte se umístí do zkumavky a přidá se 5 ml fyziologického roztoku. Dobře promíchejte a centrifugujte 10 minut. Čirá kapalina nad sedimentem červených krvinek se oddělí. Poté znovu přidejte 5 ml fyziologického roztoku, promíchejte a odstřeďte. Po trojnásobném smíchání s fyziologickým roztokem se červené krvinky dobře promyjí. Po posledním oddělení supernatantu se sediment erytrocytů v množství 0,1 ml smíchá s 0,9 ml fyziologického roztoku. Naneste 2-3 kapky této směsi na podložní sklíčko a přidejte jednu kapku Coombsova séra. Přítomnost aglutinace naznačuje, že reakce je pozitivní (pozitivní přímý Coombsův test). Studie by měla být provedena při pokojové teplotě nad 16 °C, aby se zabránilo účinku studených aglutininů.
Nepřímý Coombsův test slouží jako důkaz přítomnosti volných protilátek v mateřském séru a provádí se s mateřským sérem.
Hemolytická nemoc u novorozence s Rh inkompatibilitou se obvykle projevuje po druhém těhotenství. První dítě se rodí zdravé, druhé se známkami mírné anémie a teprve po třetím těhotenství se rodí děti s jasné známky hemolytické onemocnění. Pouze presenzibilizované ženy mohou během prvního těhotenství porodit dítě s příznaky hemolytického onemocnění. V některých případech imunizace způsobuje potraty a porody mrtvé děti. Pro vznik a závažnost onemocnění je důležitý stav placenty a délka expozice mateřských aglutininů plodu. Když se aglutininy objeví 10-14 týdnů před narozením, dítě obvykle zažívá subklinické formy. Příčinou je časný výskyt aglutininů, 15-26 týdnů před narozením těžké formy nemocí. U všech forem onemocnění je hlavním procesem hemolýza. Důsledkem reakce antigen-protilátka je hemolýza, poškození jater a mozkových kapilár. V závislosti na tom, která léze převládá, existují také různé tvary nemocí. Nebezpečné jsou i některé anafylaktické jevy. Vedou k tvorbě látek podobných histaminu, způsobujících těžké poškození jaterních buněk a zejména gangliových buněk bazálních ganglií, amonského rohu, prodloužená medulla a dokonce i mozková kůra. Při poškození jaterních buněk se k extrahepatální žloutence přidává jaterní žloutenka. Děti umírají v důsledku závažných příznaků kernicterus. Pokud přežijí, symptomy lézí přetrvávají nervový systém(poruchy extrapyramidového systému s choreoatetickými pohyby, zvláštní taneční chůze, nucené pohyby hlavy, někdy porucha koordinace dobrovolná hnutí s častými pády, zvýšený tón svaly, mentální retardace, tedy se znaky t. zv. encephalopathia posticteria infantum).
