Ang imbensyon ay nauugnay sa genetic engineering, biotechnology, gamot, pharmacology. Isang bagong recombinant multicopy plasmid DNA pSX50, na naka-encode ng synthesis ng human leukocyte alpha-2b interferon, ang pagpapahayag nito ay nasa ilalim ng kontrol ng lactose at tryptophan promoters at isang transcription terminator. Bilang resulta ng pagbabagong-anyo ng mga cell ng recipient strain E. coli BL21 na may recombinant plasmid DNA pSX50, nakuha ang strain E. coli SX50 - isang producer ng recombinant leukocyte human alpha-2b interferon na may produktibidad na hanggang 0.9-1.0 g ng alpha-2b interferon mula sa 1 litro ng medium ng kultura. Ang pamamaraan para sa paggawa ng recombinant alpha-2b interferon ay batay sa paggamit ng isang nilikhang recombinant strain ng E. coli SX50 at kinabibilangan ng malalim na paglilinang nito sa isang nutrient medium na may pinababang nilalaman tryptophan na may tuluy-tuloy na pagdaragdag ng mga nutrient substrates sa proseso ng biosynthesis, mekanikal na pagkasira ng mga cell ng microorganism na may altapresyon, paglusaw ng pinagsama-samang protina sa isang puro solusyon ng guanidine hydrochloride, na sinusundan ng renaturation ng interferon sa mga solusyon sa physiological buffer sa pagkakaroon ng mga chaotropic agent at ang pagdalisay nito gamit ang tatlong yugto ng chromatographic purification ng interferon sa Chelating Sepharose Fast Flow type resins immobilized with Cu +2 ions, ion exchange chromatography sa SM type ion exchange resins Sephsrose Fast Flow at gel filtration chromatography sa Superdex 75 type resins. Ginagawang posible ng pamamaraan na makakuha ng interferon substance na higit sa 99% purity ayon sa electrophoresis sa pagbabawas at non- pagbabawas ng mga kondisyon kapag ang paglamlam ng mga gel na may pilak at higit sa 98% ayon sa RF HPLC at hindi naglalaman ng mga pyrogens (LAL test ) sa dami ng hindi bababa sa 400-800 mg bawat 1 litro ng medium ng kultura. 3 n. at 3 posisyon sa suweldo, 6 na may sakit.
Mga guhit para sa RF patent 2242516
Ang imbensyon ay nauugnay sa mga genetically engineered na gamot na nakuha sa biotechnologically, katulad ng mga pamamaraan industriyal na produksyon recombinant human leukocyte interferon alpha-2b mga layuning medikal(mula dito ay tinutukoy bilang interferon), pati na rin sa mga recombinant na gumagawa ng mga strain ng Escherichia coli (E.coli) at plasmid DNA na naka-encode sa synthesis ng interferon.
Ang mga interferon ay mga molekula ng protina na may molekular na timbang na 15,000 hanggang 21,000 dalton na ginawa at itinago ng mga selula bilang tugon sa impeksyon sa viral o iba pang mga pathogen. Mayroong tatlong pangunahing grupo ng mga interferon: alpha, beta at gamma. Ang mga grupong ito mismo ay hindi homogenous at maaaring maglaman ng iba't ibang molekular na species ng interferon. Kaya, higit sa 14 genetic varieties ng interferon alpha ay natukoy, na kung saan ay interesado at mahanap malawak na aplikasyon sa medisina bilang antiviral, antiproliferative at immunomodulatory agent.
May mga kilalang pamamaraan para sa pagkuha ng interferon ng leukocyte ng tao mula sa mga leukocytes ng dugo ng donor ng tao na dulot ng mga virus at iba pang inducers (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873).
Ang pangunahing kawalan ng mga pamamaraang ito para sa paggawa ng mga interferon ay ang posibilidad ng kontaminasyon ng panghuling produkto sa mga virus ng tao, tulad ng hepatitis B at C virus, immunodeficiency virus, atbp.
Sa kasalukuyan, ang paraan ng paggawa ng interferon sa pamamagitan ng microbiological synthesis ay kinikilala bilang mas promising, na ginagawang posible upang makuha ang target na produkto na may makabuluhang mas mataas na ani mula sa medyo murang mga panimulang materyales. Ginagawang posible ng mga diskarte na ginamit dito na lumikha ng mga variant ng isang structural gene na pinakamainam para sa pagpapahayag ng bacterial, pati na rin ang mga elemento ng regulasyon na kumokontrol sa pagpapahayag nito.
Ang mga panimulang mikroorganismo na ginamit ay iba't ibang disenyo mga strain ng Pichia pastoris, Pseudomonas putida at Escherichia coli.
Ang kawalan ng paggamit ng P. pastoris bilang isang tagagawa ng interferon (J.N. Garcia, J.A. Aguiar et. al. //Mataas na antas ng pagpapahayag ng tao IFN-2b sa Pichia pastoris.//Biotecnologia Aplicada, 12(3),152-155, 1995 ), Ang mga kondisyon ng pagbuburo ng ganitong uri ng lebadura ay lubhang mahirap, ang pangangailangan upang mahigpit na mapanatili ang konsentrasyon ng inducer, sa partikular na methanol, sa panahon ng proseso ng biosynthesis. Ang kawalan ng paggamit ng Ps. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) ay ang pagiging kumplikado ng proseso ng pagbuburo sa mababang antas ng pagpapahayag (10 mg ng interferon bawat 1 litro ng medium ng kultura). Mas produktibo ang paggamit ng Escherichia coli strains (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3 Suppl. 9): S9-41-S9-51).
Ang isang malaking bilang ng mga plasmids at E. coli strains na nilikha sa kanilang batayan na nagpapahayag ng interferon ay kilala: E. coli strains ATCC 31633 at 31644 na may plasmids Z-pBR322 (Psti) HclF-11-206 o Z-pBR 322(Pstl)/ HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli strain pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli strain pINF-F-Pa (AU 1312962), E. Coli strain SG 20050 na may plasmid p280/21FN (Kra.vchenko) at iba pa. Bioorganic chemistry, 1987, v. 13, no. 9, pp. 1186-1193), strain E. Coli SG 20050 na may plasmid pINF14 (SU 1703691), strain E. coli SG 20050 na may plasmid pINF16 (0 at iba pa. Ang kawalan ng mga teknolohiya batay sa paggamit ng mga strain na ito ay ang kanilang kawalang-tatag, pati na rin ang hindi sapat na antas ng interferon expression.
Kasama ang mga katangian ng mga strain na ginamit, ang kahusayan ng proseso ay higit na nakasalalay sa teknolohiyang ginamit para sa paghihiwalay at paglilinis ng interferon.
Mayroong isang kilalang paraan para sa paggawa ng interferon, na kinabibilangan ng pag-culture ng mga Ps cells. putida, pagkasira ng biomass, paggamot na may polyethylenimine, fractionation na may ammonium sulfate, hydrophobic chromatography sa phenylsilochrome C-80, pH fractionation ng lysate, konsentrasyon at diafiltration nito, ion exchange chromatography sa cellulose DE-52, elution sa pH gradient, ion exchange chromatography ng nagresultang eluent sa cellulose SM -52, konsentrasyon sa pamamagitan ng pagpasa sa isang filter cassette at gel filtration sa Sephadex G-100 (SU 1640996). Ang kawalan ng pamamaraang ito, bilang karagdagan sa kumplikadong multi-stage fermentation, ay ang multi-stage na proseso sa pagkuha ng pangwakas na produkto.
Mayroon ding isang kilalang paraan para sa paggawa ng interferon, na kinabibilangan ng paglilinang ng E. coli strain SG 20050/pIF16 sa LB na sabaw sa mga flasks sa isang thermostated shaker, centrifuging ang biomass, paghuhugas nito gamit ang buffer solution at ultrasonic treatment para sirain ang mga cell. Ang resultang lysate ay centrifuged, hugasan ng isang 3M urea solution sa buffer, dissolved sa isang solusyon ng guanidine chloride sa buffer, ginagamot sa ultrasound, centrifuged, oxidative sulfitolysis, dialysis laban sa 8 M urea, renaturation at final two-stage chromatography sa CM- 52 cellulose at Sephadex G-50 ( RU 2054041). Ang mga disadvantages ng pamamaraang ito ay ang relatibong mababang produktibidad ng mga pangunahing yugto ng proseso ng paghihiwalay at paglilinis. Nalalapat ito lalo na sa ultrasonic na paggamot ng produkto, dialysis at oxidative sulfitolysis, na humahantong sa kawalang-tatag sa pagpapalabas ng interferon, pati na rin ang imposibilidad ng paggamit ng paraang ito para sa industriyal na produksyon interferon.
Bilang pinakamalapit na analogue (prototype), ang isang paraan para sa pagkuha ng interferon ng leukocyte ng tao ay maaaring ipahiwatig, na binubuo sa paglilinang ng isang recombinant strain ng E. coli, pagyeyelo ng nagresultang biomass sa temperatura na hindi hihigit sa -70 ° C, pagtunaw, pagsira sa mga selula ng microorganism. na may lysozyme, nag-aalis ng DNA at RNA sa pamamagitan ng pagpapasok sa DNAse lysate at paglilinis ng nakahiwalay na hindi matutunaw na anyo ng interferon sa pamamagitan ng paghuhugas gamit ang buffer solution na may mga detergent, pagtunaw ng interferon precipitate sa isang solusyon ng guanidine hydrochloride, renaturation at one-step purification sa pamamagitan ng ion exchange chromatography. Ang E. coli SS5 strain na nakuha gamit ang recombinant plasmid pSS5 na naglalaman ng tatlong promoter: P lac , P t7 at P trp, at ang alpha-interferon gene na may ipinakilala na mga pagpapalit ng nucleotide ay ginagamit bilang producer.
Ang pagpapahayag ng interferon ng E. coli SS5 strain na naglalaman ng plasmid na ito ay kinokontrol ng tatlong promoter: P lac , P t7 at P trp . Ang antas ng interferon expression ay tungkol sa 800 mg bawat 1 litro ng cell suspension (RU 2165455).
Ang kawalan ng pamamaraang ito ay ang mababang teknolohikal na kahusayan ng paggamit ng enzymatic na pagkasira ng mga cell, DNA at RNA ng microorganism at isang hakbang na chromatographic purification ng interferon. Nagdudulot ito ng kawalang-tatag sa proseso ng pagpapalabas ng interferon, humahantong sa pagbaba sa kalidad nito at nililimitahan ang posibilidad ng paggamit ng pamamaraan sa itaas para sa pang-industriyang produksyon ng interferon. Ang mga disadvantages ng plasmid na ito at ang strain batay dito ay ang paggamit sa plasmid ng isang malakas na unregulated promoter ng T7 phage sa E. coli strain BL21 (DE3), kung saan ang T7 RNA polymerase gene ay matatagpuan sa ilalim ng promoter ng ang lac operon at na palaging "umaagos". Dahil dito, ang synthesis ng interferon ay patuloy na nangyayari sa cell, na humahantong sa dissociation ng plasmid at isang pagbawas sa viability ng mga cell ng strain, at bilang isang resulta, isang pagbawas sa ani ng interferon.
Ang layunin ng imbensyon na ito ay bumuo ng recombinant industrial producer strain ng E. coli gamit ang isang bagong recombinant plasmid DNA na may mataas na antas ng interferon biosynthesis, at bumuo ng isang epektibong teknolohiyang pang-industriya para sa paggawa ng interferon substance para sa medikal na paggamit, na katumbas ng kalidad. sa "European Pharmacopoeia" para sa interferon alpha-2b substance.
Ang problemang ito ay nalutas sa pamamagitan ng paglikha ng recombinant plasmid DNA pSX50 at ang Escherichia coli strain SX50, na idineposito sa All-Russian Collection of Industrial Strains ng Federal State Unitary Enterprise State Research Institute of Genetics, numero VKPM B-8550,
pati na rin ang isang paraan para sa paggawa ng recombinant alpha-2b interferon, batay sa paggamit ng isang recombinant strain ng E. coli SX50 at kinasasangkutan ng malalim na paglilinang nito sa isang nutrient medium na may pinababang nilalaman ng tryptophan na may patuloy na pagdaragdag ng nutrient substrates sa proseso. ng biosynthesis, mekanikal na pagkasira ng mga selula ng microorganism sa mataas na presyon, paglusaw ng pinagsama-samang protina sa isang puro solusyon ng guanidine hydrochloride, na sinusundan ng renaturation ng interferon sa physiological buffer solution sa pagkakaroon ng mga chaotropic agent at tatlong yugto ng chromatographic purification ng interferon sa mga resin tulad ng bilang Chelating Sepharose Fast Flow, immobilized na may Cu +2 ions, ion exchange chromatography sa ion exchange resins gaya ng CM Sepharose Fast Flow at gel filtration chromatography sa resins gaya ng Superdex 75.
Ayon sa imbensyon, ang isang bagong recombinant multicopy plasmid DNA pSX50 ay iminungkahi, na nag-encode ng synthesis ng human leukocyte alpha-2b interferon, ang pagpapahayag nito ay nasa ilalim ng kontrol ng lactose at tryptophan promoters at isang transcription terminator. Ang Plasmid pSX50 ay mayroong 3218 base pairs (bp) at nailalarawan sa pagkakaroon ng mga sumusunod na fragment:
Ang pagkakasunud-sunod mula sa nucleotide 1 hanggang sa nucleotide (nt) 176 ay may kasamang 176 bp DNA fragment na naglalaman ng tryptophan promoter (P trp);
Sequence mula sa 177 nt. hanggang 194 n. may kasamang synthetic na DNA fragment na 18 bp na naglalaman ng Shine Delgarno sequence, na responsable para sa pagsisimula ng pagsasalin;
Pagkakasunud-sunod mula sa 195 nt. hanggang 695 n. may kasamang DNA fragment na 501 bp ang laki na naglalaman ng pagkakasunud-sunod ng interferon gene na may mga sumusunod na pagpapalit ng nucleotide: sa posisyon 37, pagpapalit ng A hanggang C, sa posisyon 39, pagpapalit ng G sa T, sa posisyon 40, pagpapalit ng A hanggang C C, sa posisyon 42, pagpapalit ng G sa T , sa posisyon 67, pagpapalit ng A sa C, sa posisyon 69, pagpapalit ng G sa T, sa posisyon 70, pagpapalit ng A sa C, sa posisyon 72, pagpapalit ng A sa T, sa posisyon 96, palitan ng G ng A, sa posisyon 100, palitan ng A sa C, sa posisyon 102, palitan ng A sa T, sa posisyon 114, palitan ng A sa C, sa posisyon 120, palitan ng C may G, sa posisyon 126, palitan ng G ng A, sa posisyon 129, palitan ng G ng A, sa posisyon 330, palitan ng C ng G, sa posisyon 339 palitan ang G ng A, sa posisyon 342 palitan ang G ng A, sa posisyon 487 pinapalitan ang A ng C, sa posisyon 489 pinapalitan ang A ng T, sa posisyon 495 pinapalitan ang G ng A;
Sequence mula sa 696 nt. ayon sa 713 n. may kasamang synthetic na DNA fragment na 18 bp na naglalaman ng synthetic polylinker;
Sequence mula sa 714 nt. hanggang 1138 n. kasama ang isang fragment ng DNA ng plasmid pKK223-3 na may 4129 nt. hanggang 4553 n. 425 bp ang laki, na naglalaman ng pagkakasunud-sunod ng mahigpit na transcription terminator rrnBT 1 T 2;
Pagkakasunod-sunod mula 1139 b. hanggang 1229 n. kasama ang isang fragment ng DNA ng plasmid pUC19 na may 2487 nt. hanggang 2577 n. 91 bp ang laki, na naglalaman ng promoter ng β-lactomase gene (ampicillin resistance gene - Amp R);
Pagkakasunod-sunod mula 1230 b. hanggang 2045 n. kasama ang isang fragment ng DNA ng pUC4K plasmid na may 720 nt. hanggang 1535 AD 816 bp ang laki, na naglalaman ng istrukturang rehiyon ng kan gene;
Pagkakasunod-sunod mula 2046 b. hanggang 3218 n. kasama ang isang fragment ng DNA ng plasmid pUC19 mula 1625 hanggang 453 nt. 1173 bp ang laki, na naglalaman ng sequence na responsable para sa plasmid replication (ori) at lac promoter (P lac).
Ang mga figure 1-5 ay nagpapakita ng mga diagram ng disenyo at pisikal na mapa pSH50 plasmids.
Ipinapakita ng Figure 6 ang kumpletong pagkakasunud-sunod ng nucleotide na tinutukoy para sa plasmid pSX50.
Ang Escherichia coli strain SX50 ay nakuha sa pamamagitan ng pagbabago ng Escherichia coli BL21 cells na may pSX50 plasmid gamit ang tradisyonal teknolohiya ng genetic engineering. Ang E.Coli SX50 strain ay nailalarawan sa pamamagitan ng mga sumusunod na katangian.
Mga katangiang pangkultura at morphological
Ang mga selula ay maliit, tuwid, makapal na hugis baras, gramo-negatibo, walang spore-bearing. Ang mga cell ay lumalaki nang maayos sa simpleng nutrient media. Kapag lumalaki sa Difco agar, bilog, makinis, matambok, maulap, makintab, kulay abong mga kolonya na may makinis na mga gilid ay nabuo. Kapag lumaki sa likidong media (sa minimal na medium na may glucose o sa LB na sabaw), isang matinding, kahit labo ay nabuo.
Mga katangiang pisikal at biyolohikal
Aerobe. Ang hanay ng temperatura para sa paglaki ay 4-42°C na may pinakamainam na pH na 6.5-7.5.
Bilang isang pinagmumulan ng nitrogen, parehong mineral salts sa ammonium at nitrate form ay ginagamit, pati na rin mga organikong compound sa anyo ng mga amino acid, peptone, tryptone, yeast extract, atbp.
Ang mga amino acid, gliserol, at carbohydrates ay ginagamit bilang pinagmumulan ng carbon. Paglaban sa antibiotic. Ang mga cell ay nagpapakita ng paglaban sa kanamycin (hanggang sa 100 μg / ml).
Ang Escherichia coli strain 8X50 ay isang gumagawa ng interferon.
Paraan, kundisyon at komposisyon ng strain storage medium
Sa L-arape na may pagdaragdag ng kanamycin sa isang konsentrasyon na 20 mcg/ml sa ilalim ng langis, sa L-broth na naglalaman ng 15% gliserol at naaangkop na antibiotic sa mga ampoules sa temperatura na minus 70°C, sa isang lyophilized na estado sa mga ampoules sa isang temperatura ng plus 4°C.
Ang Escherichia coli strain SX50 ay nakilala ayon sa Bergey's Guide (1974) bilang isang strain ng Escherichia coli species.
Paraan para sa pang-industriyang produksyon ng alpha-2b interferon
Ang isang tampok ng iminungkahing pamamaraan ay ang pag-unlad ng teknolohiya na ginagawang posible na ihiwalay ang interferon mula sa isang hindi matutunaw na anyo na naipon sa panahon ng pagbuburo, na ginagawang posible na makabuluhang gawing simple. teknolohikal na pamamaraan proseso ng paghihiwalay at pagtaas ng ani ng target na produkto.
Ang pamamaraan ay binubuo ng paglilinang ng Escherichia coli strain SH50 sa isang nutrient medium, na may patuloy na pagdaragdag ng mga nutrient substrates, mas mabuti ang glucose at yeast extract, sa proseso ng biosynthesis, mas mabuti na may pinababang nilalaman ng tryptophan, mekanikal na pagkasira ng mga selula ng microorganism sa mataas na presyon. 700-900 bar, dissolution ng interferon sa isang buffer guanidine hydrochloride solution, renaturation ng interferon sa physiological buffer solutions sa pagkakaroon ng chaotropic agents, na sinusundan ng tatlong-stage na chromatographic purification ng interferon sa Chelating Sepharose Fast Flow type resins immobilized with Cu +2 ions, ion exchange chromatography sa CM Sepharose Fast Flow type na ion exchange resin at gel filtration chromatography sa mga resin gaya ng Superdex 75.
Ang pinakamainam na kondisyon para sa pagsasagawa ng mga indibidwal na yugto ng paggawa ng interferon ay ang mga sumusunod:
Ang pagbuburo ay isinasagawa kasama ang patuloy na pagdaragdag ng mga substrate sa buong proseso, na tumutukoy mataas na lebel pagpapahayag ng interferon;
Ang pagkasira ng cell ay isinasagawa sa isang disintegrator ng uri ng Gaulin sa presyon na 900 bar;
Ang pag-alis ng mga natutunaw na bahagi ng cellular (DNA, RNA, protina, lipopolysaccharides, atbp.) ay isinasagawa sa pamamagitan ng paghuhugas ng hindi matutunaw na anyo ng interferon na may mga solusyon sa buffer na naglalaman ng mga detergent (Triton XI00, urea, atbp.);
Ang nagresultang precipitate na naglalaman ng interferon ay natunaw sa isang buffer solution ng 6 M guanidine hydrochloride;
Ang interferon renaturation ay isinasagawa sa isang physiological buffer solution na naglalaman ng mga chaotropic agent;
Ang tatlong yugto ng chromatographic purification ng interferon ay isinasagawa sa Chelating Sepharose Fast Flow, immobilized na may Cu +2 ions, sa cation exchange resin SM Sepharose Fast Flow at gel filtration chromatography sa isang Superdex 75 type resin;
Pagkatapos ng bawat chromatographic purification, ang sterilizing filtration ay isinasagawa sa pamamagitan ng mga filter na walang pyrogen na may sukat ng butas na 0.22 microns.
Ang ani ng interferon bilang resulta ng paggamit ng inilarawan na paraan ay humigit-kumulang 400-800 mg ng interferon bawat 1 litro ng medium ng kultura. Ang kalidad ng resultang produkto ay sumusunod sa mga pamantayan at kinakailangan ng "European Pharmacopoeia" para sa sangkap na alpha-2b interferon.
Ang mga makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng iminungkahing pamamaraan at ang prototype ay:
Ang paggamit ng isang disenyo ng strain na may mas mataas na produktibo, na ginagawang posible upang makakuha ng mas malaking halaga ng interferon mula sa 1 litro ng medium ng kultura sa panahon ng biosynthesis;
Ang paggamit ng epektibong mekanikal na pagkasira ng cellular biomass, na ginagawang posible upang makakuha ng isang purer extract ng hindi matutunaw na anyo ng interferon para sa higit pa maikling panahon, na may mas kaunting pagkalugi;
Ang paggamit ng mga solusyon sa physiological buffer sa panahon ng renaturation sa pagkakaroon ng mga chaotropic agent ay ginagawang posible upang madagdagan ang ani ng wastong renatured form ng interferon;
Ang tatlong yugto ng chromatographic purification ng interferon ay ginagawang posible upang makakuha ng interferon substance na higit sa 99% na kadalisayan ayon sa electrophoresis sa pagbabawas at hindi pagbabawas ng mga kondisyon kapag ang paglamlam ng mga gel na may pilak at higit sa 98% ayon sa RF HPLC at halos walang pyrogens (pagsusulit sa LAL).
Ang kakanyahan at mga pakinabang ng inaangkin na pangkat ng mga imbensyon ay inilalarawan ng mga sumusunod na halimbawa.
Halimbawa 1. Konstruksyon ng recombinant plasmid pSH50
Ang pamamaraan para sa pagbuo ng pSX50 plasmid ay kinabibilangan ng mga sumusunod na hakbang:
Konstruksyon ng vector plasmid pSX10;
1. pagbuo ng plasmid pSX3 (2641 bp)
2. pagbuo ng vector plasmid pSX10 (2553 bp)
Konstruksyon ng recombinant plasmid pSX41 (3218 bp);
Konstruksyon ng recombinant plasmid pSX43 (3218 bp);
Konstruksyon ng recombinant plasmid pSX45 (3218 bp);
Konstruksyon ng recombinant plasmid pSX50 (3218 bp).
Konstruksyon ng vector plasmid pSX10
Ang Vector plasmid pSX10 ay isang pUC19 vector kung saan ang coding sequence ng beta lactomase gene, na nagbibigay ng resistensya sa ampicillin, ay pinalitan ng coding sequence ng kan gene at naglalaman ng transcription terminator mula sa pKK223-3 plasmid.
Ang pagtatayo ng vector plasmid pSS10 ay isinasagawa sa dalawang yugto:
Paghahanda ng plasmid pSX3 (2641 bp), na plasmid pUC19, kung saan ang coding region ng amp gene ay pinalitan ng coding region ng kan gene;
Paghahanda ng vector plasmid pSX10 (2553 bp), na isang plasmid pSX3 kung saan ang isang DNA fragment na naka-encode sa transcription terminator rBT 1 T 2 ay ipinasok sa likod ng BamHI site.
Ang limang round ng DNA amplification ay ginaganap upang makuha ang pSX3 plasmid. Paraan ng PCR(polymerase chain reaction). Sa unang pag-ikot, gamit ang pUC19 plasmid DNA bilang isang template, isang fragment ng DNA na 1828 bp ang laki ay pinalaki. (fragment PU1-PU2) gamit ang mga primer:
Ito at ang mga kasunod na reaksyon ng PCR ay isinasagawa sa ilalim ng mga sumusunod na kondisyon: 20 mM Tis-HCl, pH 8.8, 10 mM (NH 4) 2 SO 4, 10 mM KCl, 2 tM MgCl 2, 0.1% Triton X100, 0.1 mg/ml BSA, 0.2 mM ng bawat dNTP, 1.25 unit. Pfu DNA polymerase, 100 ng DNA. Ang proseso ng amplification ay binubuo ng mga sumusunod na yugto: pag-init sa 95°C sa loob ng 5 min, 35 PCR cycle (30 sec 95°C, 30 sec 56°C, 2 min 72°C) at incubation sa loob ng 10 min sa 72°C. Pagkatapos ng amplification (at pagkatapos ng kasunod na mga amplification), ang DNA fragment ay dinadalisay ng electrophoresis sa isang 1% agarose gel. Sa ikalawa at pangatlong pag-ikot, gamit ang pUC4K plasmid DNA bilang isang template, ang isang 555 bp na fragment ng DNA ay pinalaki. (fragment KM1-KM2) gamit ang mga panimulang aklat:
at amplification ng isang fragment ng DNA na 258 bp. (KMZ-KM4) mula sa mga panimulang aklat
Sa ikalimang round ng PCR, ang mga fragment (PU1-PU2) at (KM1-KM4) ay pinagsama sa ilalim ng mga sumusunod na kondisyon: pag-init sa 95°C sa loob ng 5 min, 5 PCR cycle (30 sec 95°C, 30 sec 56°C , 10 min 72°C) at incubation sa loob ng 10 min sa 72°C. Ang DNA na nakuha pagkatapos ng huling PCR ay direktang binago sa mga cell ng E. coli strain DH5 at nilagyan ng LA medium na naglalaman ng 20 μg/ml kanamycin. Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog sa loob ng 12 oras sa 37°C, ang mga clone ay aalisin, ang plasmid DNA ay ihiwalay at ang restriction analysis ay isinasagawa. Bilang resulta, nakuha ang plasmid pSX3 na may sukat na 2641 bp.
Upang makuha ang vector plasmid pSX10, tatlong round ng DNA amplification ang ginaganap gamit ang PCR. Sa unang round, gamit ang pSX3 plasmid DNA bilang isang template, isang 2025 bp DNA fragment ang pinalaki. (fragment 10.1-10.2) gamit ang mga panimulang aklat:
Sa pangalawang pag-ikot, gamit ang DNA ng plasmid pKK223-3 bilang isang template, isang fragment ng DNA na 528 bp ang laki ay pinalaki. (fragment KK1-KK2) gamit ang mga panimulang aklat:
Sa ikatlong round ng PCR, ang mga fragment (10.1-10.2) at (KK1-KK2) ay pinagsama sa ilalim ng mga sumusunod na kondisyon: pagpainit sa 95°C sa loob ng 5 minuto, 5 PCR cycle (30 sec 95°C, 30 sec 56°C , 10 min 72°C) at incubation sa loob ng 10 min sa 72°C. Ang DNA na nakuha pagkatapos ng huling PCR ay direktang binago sa mga cell ng E. coli strain DH5 at nilagyan ng LA medium na naglalaman ng 20 μg/ml kanamycin. Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog sa loob ng 12 oras sa 37°C, ang mga clone ay aalisin, ang plasmid DNA ay ihiwalay at ang restriction analysis ay isinasagawa. Bilang resulta, nakuha ang plasmid pSX10 na may sukat na 2553 bp.
Konstruksyon ng recombinant plasmid pSX41
Ang recombinant plasmid pSX41 ay isang Hind III - BamHI DNA fragment ng vector plasmid pSX3 (2529 bp), Hind III - EcoRI DNA fragment na 168 bp, na naka-encode sa promoter ng E. coli tryptophan operon (P trp), EcoRI-XbaI isang synthetic Ang fragment ng DNA ng 20 bp na pag-encode ng SD sequence (Shine-Delgarno) at isang XbaI-BamHI DNA fragment ng 501 bp na pag-encode ng human interferon alpha 2b gene.
Para makuha ang Hind III - BamHI DNA fragment ng vector plasmid pSX3 (2529 bp), ang DNA ng plasmid pSX3 ay ginagamot ng restriction enzymes HindIII at BamHI, na sinusundan ng electrophoretic purification sa 1% agarose gel. Hind III EcoRI DNA fragment ng 168 bp encoding ang promoter ng tryptophan operon (P trp) ay nakuha ng PCR gamit ang kabuuang E. coli DNA bilang template at mga primer na TRP1 at PRP2, na sinusundan ng paggamot sa amplified fragment na may paghihigpit sa Hindll at EcoRI mga enzyme:
Upang makakuha ng EcoRI-Xbal ng isang sintetikong DNA fragment ng 20 bp na pag-encode ng SD sequence (Shine-Delgarno), ang mga sumusunod na komplementaryong oligonucleotides ay na-synthesize:
Ang XbaI-BamIII DNA fragment na 501 bp ang laki, na naka-encode ng human alpha 2b interferon gene, ay nakuha ng PCR gamit ang kabuuang DNA ng tao bilang template at mga primer na IFN1 at IFN2, na sinusundan ng pagproseso ng amplified fragment na may Xbal at BamIII restriction enzymes:
Susunod, ang mga electrophoretically purified fragment ay pinagsama, na pinagtalian ng T4 phage ligase enzyme, ang DNA ay binago sa mga cell ng E. coli DH5 strain at nilagyan ng LA medium na naglalaman ng 20 μg/ml kanamycin. Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog sa loob ng 12 oras sa 37°C, ang mga clone ay inaalis, ang plasmid DNA ay ihiwalay, ang restriction analysis ay isinasagawa, at ang pangunahing istruktura ng DNA ay tinutukoy. Bilang resulta, nakuha ang plasmid pSX41 na may sukat na 3218 bp. Susunod, ang sunud-sunod na mutagenesis ng interferon gene ay isinasagawa upang mapataas ang antas ng pagpapahayag ng target na produkto. Ang mutagenesis ng interferon gene ay binubuo ng pagpapalit ng mga triplet na bihirang matagpuan sa E. coli, na nag-encode ng kaukulang mga amino acid, na may mga triplet na madalas na matatagpuan sa E. coli, na naka-encode ng parehong mga amino acid. Ang DNA mutagenesis ng interferon gene ay isinasagawa gamit ang paraan ng PCR.
Konstruksyon ng recombinant plasmid pSX43
Upang makuha ang recombinant plasmid pSX43, ang isang round ng DNA amplification ay isinasagawa ng PCR gamit ang DNA ng plasmid pSX41 bilang isang template at mga primer na IFN3 at IFN4:
Isinasagawa ang PCR sa ilalim ng mga sumusunod na kondisyon: pagpainit sa 95°C sa loob ng 5 min, 20 PCR cycle (30 sec 95°C, 30 sec 56°C, 10 min 72°C) at incubation sa loob ng 20 min sa 72°C. Ang DNA na nakuha pagkatapos ng PCR ay direktang binago sa mga cell ng E. coli strain DH5 at nilagyan ng LA medium na naglalaman ng 20 μg/ml kanamycin. Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog sa loob ng 12 oras sa 37°C, ang mga clone ay inaalis, ang plasmid DNA ay ihiwalay, ang restriction analysis ay isinasagawa, at ang pangunahing istruktura ng DNA ay tinutukoy. Bilang resulta, nakuha ang plasmid pSX43 na may sukat na 3218 bp.
Konstruksyon ng recombinant plasmid pSX45
Upang makuha ang recombinant plasmid pSX45, ang isang round ng DNA amplification ay isinasagawa ng PCR gamit ang DNA ng plasmid pSX43 bilang isang template at mga primer na IFN5 at IFN6:
Isinasagawa ang PCR sa ilalim ng mga sumusunod na kondisyon: pagpainit sa 95°C sa loob ng 5 min, 20 PCR cycle (30 sec 95°C, 30 sec 56°C, 10 min 72°C) at incubation sa loob ng 20 min sa 72°C. Ang DNA na nakuha pagkatapos ng PCR ay direktang binago sa mga cell ng E. coli strain DH5 at nilagyan ng LA medium na naglalaman ng 20 μg/ml kanamycin. Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog sa loob ng 12 oras sa 37°C, ang mga clone ay inaalis, ang plasmid DNA ay ihiwalay, ang restriction analysis ay isinasagawa, at ang pangunahing istruktura ng DNA ay tinutukoy. Bilang resulta, nakuha ang plasmid pSX45 na may sukat na 3218 bp.
Konstruksyon ng recombinant plasmid pSX50.
Upang makuha ang recombinant plasmid pSX50, ang isang round ng DNA amplification ay isinasagawa ng PCR gamit ang DNA ng plasmid pSX45 bilang isang template at mga primer na IFN7 at IFN8:
Isinasagawa ang PCR sa ilalim ng mga sumusunod na kondisyon: pagpainit sa 95°C sa loob ng 5 min, 20 PCR cycle (30 sec 95°C, 30 sec 56°C, 10 min 72°C) at incubation sa loob ng 20 min sa 72°C. Ang DNA na nakuha pagkatapos ng PCR ay direktang binago sa mga cell ng E. coli strain DH5 at nilagyan ng LA medium na naglalaman ng 20 μg/ml kanamycin. Pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog sa loob ng 12 oras sa 37°C, ang mga clone ay inaalis, ang plasmid DNA ay ihiwalay, ang restriction analysis ay isinasagawa, at ang pangunahing istruktura ng DNA ay tinutukoy. Bilang resulta, nakuha ang plasmid pSX50 na may sukat na 3218 bp.
Halimbawa 2. Paghahanda ng E. coli SX50 strain - producer ng interferon
Ang interferon-producing strain E. coli SX50 ay nakukuha sa pamamagitan ng pagbabago ng mga cell ng E. coli strain BL21 na may recombinant plasmid pSX50. Ang interferon na gumagawa ng strain ay lumaki sa isang 30 litro na fermenter sa isang optical density na 25.0-30.0 p.u. sa M9 medium na naglalaman ng 1% casein acid hydrolyzate (Difco), 1% glucose, 40 µg/ml kanamycin, sa temperatura na 38-39°C. Sa panahon ng proseso ng pagbuburo, ang patuloy na pagdaragdag ng nutrient substrate ay isinasagawa gamit ang isang gravimetric controller.
Halimbawa 3. Paraan para sa paghihiwalay ng interferon mula sa E. coli strain SX50
Ang interferon ay nakuha sa 4 na yugto:
Stage 1. Paglilinang ng E. coli strain SX50.
Stage 2. Ang paghihiwalay at paglilinis ng hindi matutunaw na anyo ng interferon.
Stage 3. Dissolution at renaturation ng interferon.
Stage 4. Chromatographic na paglilinis ng interferon.
Stage 1. Paglilinang ng E. coli strain SX50
Ang lumago na inoculum ng E. coli strain SX50 sa dami ng 3 litro ng rich LB medium sa loob ng 12 oras sa 26°C ay aseptikong ipinapasok sa isang fermenter na naglalaman ng 27 litro ng sterile medium na naglalaman ng M9, 1% casein acid hydrolyzate, 1% glucose, 1 mM MgCl 2, 0.1 mM CaCl 2, 40 mg/ml kanamycin. Ang paglilinang sa isang fermenter ay isinasagawa sa temperatura na 38-39°C, na pinapanatili ang pH na 7±0.15 sa pamamagitan ng awtomatikong titration na may 40% sodium hydroxide solution. Ang dissolved oxygen concentration sa hanay ng (50±10)% ng saturation ay pinananatili sa pamamagitan ng pagbabago ng stirrer speed mula 100 hanggang 800 rpm at air supply mula 1 hanggang 15 l/min. Ang konsentrasyon ng mga substrate, sa partikular na glucose at yeast extract, ay sinusukat sa panahon ng fermentation at ang kanilang konsentrasyon ay pinananatili sa pamamagitan ng pag-iiba-iba ng rate ng supply ng mga concentrated na solusyon sa pamamagitan ng peristaltic pump gamit ang isang gravimetric controller.
Ang akumulasyon ng interferon sa insoluble form ay sinusubaybayan gamit ang phase contrast microscopy, 15% polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAAG) at reverse phase high performance chromatography (RF HPLC). Hihinto ang pagbuburo kapag naabot ang maximum optical density (~ 25-30 p.u.) at huminto ang synthesis ng interferon. Sa pagtatapos ng pagbuburo, ang kultural na likido ay pinaghihiwalay ng sentripugasyon sa isang rotor ng daloy sa bilis ng pag-ikot na 5000-10000 rpm. Ang biomass ay nakabalot sa mga plastic bag at nagyelo sa minus 70°C.
Stage 2. Paghihiwalay at paglilinis ng hindi matutunaw na anyo ng interferon
Ang 300-400 g ng frozen biomass ng E. coli strain SX50 ay sinuspinde sa 3000 ml ng buffer 1 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 0.1% Triton X100). Ang suspensyon ay ipinapasa sa isang Gaulin-type na homogenizer ng daloy, pinananatili sa isang presyon ng 900 bar at nakasentro sa isang rotor ng daloy sa 15,000 rpm. Ang nagreresultang precipitate ay hinuhugasan sa ilalim ng magkatulad na mga kondisyon nang sunud-sunod na may mga buffer 2 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 3 M urea) at buffer 3 (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) at sa wakas ay ang interferon ang namuo ay sinuspinde sa 200 ML ng buffer 3. Sa kasong ito, ang oras para sa paghihiwalay at paglilinis ng hindi matutunaw na anyo ng interferon ay hindi hihigit sa 5 oras.
Stage 3. Dissolution at renaturation ng interferon
Sa pagsususpinde ng hindi matutunaw na anyo ng interferon na nakuha sa nakaraang yugto, magdagdag ng dry guanidine hydrochloride sa isang konsentrasyon na 6 M, magdagdag ng dithiothreitol sa isang konsentrasyon ng 50 mM, Tris-HCl pH 8.0 sa isang konsentrasyon ng 50 mM, NaCl sa isang konsentrasyon ng 150 mM at Triton X100 sa isang konsentrasyon ng 0.1%, incubate sa temperatura ng silid sa loob ng 2 oras. Ang hindi natunaw na materyal ay pinaghihiwalay sa pamamagitan ng pag-sterilize ng pagsasala sa pamamagitan ng mga lamad na may diameter ng pore na 0.22 microns.
Ang renaturation ng interferon ay isinasagawa sa pamamagitan ng dahan-dahang pagtunaw ng nagresultang solusyon 100-200 beses na may buffer 4 (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA). Pagkatapos nito, ang pinaghalong renaturation ay natupok na may patuloy na pagpapakilos sa loob ng 12-15 oras sa temperatura na 4-8°C. Pagkatapos ay idinagdag ang Magnesium sulfate sa isang konsentrasyon na 1 mM at ang pinagsama-samang materyal ay aalisin sa pamamagitan ng pag-sterilize ng pagsasala sa pamamagitan ng isang filter ng lamad na may diameter ng butas na 0.22 microns.
Stage 4. Chromatographic na paglilinis ng interferon
Ang Chromatographic purification ng interferon ay isinasagawa sa tatlong yugto.
1. Ang resultang renatured interferon ay unang dinadalisay gamit ang affinity chromatography sa isang Chelating Sepharose Fast Flow resin (Amersham Biosciences) na hindi kumikilos gamit ang mga Cu +2 ions. Upang gawin ito, ang interferon solution ay inilapat sa isang column na may Cu +2 Chelating Sepharose Fast Flow at ang interferon ay na-eluted na may 0.1 M buffer sitriko acid pH 2.2.
2. Sa ikalawang yugto ng chromatographic purification, ang interferon solution ay inilapat sa isang CM Sepharose Fast Flow type cation exchange resin (Amersham Biosciences) at ang interferon ay na-eluted na may gradient ng mga solusyon (0.0-0.5 M NaCl) sa isang 50 mM Na(CH 3 COO) buffer, pH 5.5.
3. Ang paglilinis ng monomeric form ng interferon mula sa mga labi ng polymeric forms ng interferon ay isinasagawa sa ikatlong yugto ng interferon purification sa pamamagitan ng gel filtration sa Superdex 75 resin (Amersham Biosciences). Ang Chromatography ay isinasagawa sa isang buffer na 50 mM Na(CH 3 COO), pH 5.0, na naglalaman ng 0.15 M NaCl.
Ang inilarawan na paraan para sa paghihiwalay at paglilinis ng interferon ay ginagawang posible na makakuha ng 4-8 g ng highly purified interferon sa isang isolation cycle sa loob ng 7-10 araw mula sa biomass na nakuha mula sa 10 litro ng medium ng kultura. Ang kalidad ng nagresultang interferon ay ganap na sumusunod sa mga kinakailangan ng "European Pharmacopoeia" para sa interferon alpha-2b substance, lalo na:
Ang konsentrasyon ng interferon ay hindi bababa sa 2×10 8 IU/ml;
Ang partikular na aktibidad ng interferon ay hindi bababa sa 2.0×10 8 IU/mg;
Ang electrophoretic na kadalisayan ng gamot ay hindi bababa sa 99% sa ilalim ng pagbabawas at hindi pagbabawas ng mga kondisyon kapag ang paglamlam ng mga gel na may pilak;
Ang isoelectric point ng nakahiwalay na interferon ay nasa rehiyon ng pH 5.8-6.3;
Ang peptide map ng nakahiwalay na interferon ay hindi pangunahing naiiba sa peptide map para sa European standard interferon alpha 2b CRS;
Tulad ng mga sumusunod mula sa mga halimbawang ibinigay, ginagawang posible ng inaangkin na pangkat ng mga imbensyon na makakuha ng interferon alpha-2b na may mataas na ani gamit ang medyo simple at maaasahang teknolohiya.
CLAIM
1. Recombinant plasmid DNA pSX50, na naka-encode ng synthesis ng recombinant human alpha-2b interferon, na nailalarawan sa laki nito na 3218 base pairs (bp) at binubuo ng mga sumusunod na fragment: ang sequence mula 1 hanggang 176 nucleotides (bp) ay kinabibilangan isang fragment na DNA na 176 bp ang laki na naglalaman ng tryptophan promoter (P trp), sequence mula 177 hanggang 194 nt. may kasamang synthetic na DNA fragment na 18 bp ang laki na naglalaman ng Shine Delgarno sequence, na responsable para sa pagsisimula ng pagsasalin, sequence mula 195 hanggang 695 nt. may kasamang DNA fragment na 501 bp na naglalaman ng interferon alpha-2b gene na may mga pamalit na nucleotide: 37 (A>C), 39 (G>T), 40 (A>C), 42 (G>T), 67 ( A> C), 69 (G>T), 70 (A>C), 72 (A>T), 96 (G>A), 100 (A>C), 102 (A>T), 114 (A >С ), 120 (C>G), 126 (G>A), 129 (G>A), 330 (C>G), 339 (G>A), 342 (G>A), 487 (A> C) , 489 (A>T), 495 (G>A), sequence mula 696 hanggang 713 nt. may kasamang synthetic na DNA fragment na 18 bp na naglalaman ng synthetic polylinker, sequence mula 714 hanggang 1138 nt. may kasamang DNA fragment ng plasmid pKK223-3 mula 4129 hanggang 4553 nt. 425 bp ang laki, na naglalaman ng sequence ng mahigpit na transcription terminator rrnBT 1 T 2, sequence mula 1139 hanggang 1229 nt. kasama ang isang fragment ng DNA ng plasmid pUC19 mula 2487 hanggang 2577 nt. 91 bp ang laki, na naglalaman ng promoter ng -lactomase gene (ampicillin resistance gene -Amp R), sequence mula 1230 hanggang 2045 nt. kasama ang isang fragment ng DNA ng pUC4K plasmid na may 720 nt. hanggang 1535 AD 816 bp ang laki, na naglalaman ng structural region ng kan gene, sequence na may 2046 bp. hanggang 3218 n. kasama ang isang fragment ng DNA ng plasmid pUC19 mula 1625 hanggang 453 nt. 1173 bp ang laki, na naglalaman ng sequence na responsable para sa plasmid replication (ori) at lac promoter (P lac).
2. Ang bacterial strain na Eschcerichia coli SX50 na binago ng recombinant plasmid ayon sa claim 1 ay isang producer ng recombinant human leukocyte interferon alpha-2b.
3. Isang paraan para sa paggawa ng interferon alpha-2b ng tao, kabilang ang paglilinang ng Escherichia coli SX5 strain ayon sa claim 2 sa isang nutrient medium na may patuloy na pagdaragdag ng nutrient substrates sa panahon ng proseso ng biosynthesis, mekanikal na pagkasira ng microorganism cells sa presyon na 700- 900 bar, dissolving interferon sa isang buffer solution ng guanidine hydrochloride , renaturation ng interferon sa physiological buffer solutions sa presensya ng mga chaotropic agent, tatlong yugto ng chromatographic purification ng interferon sa Chelating Sepharose Fast Flow type resins na hindi kumikilos na may Cu +2 ions, ion exchange chromatography sa CM Sepharose Fast Flow type ion exchange resins at gel filtration chromatography sa Superdex 75 type resins.
4. Ang pamamaraan ayon sa claim 3, kung saan ang paglilinang ay isinasagawa sa isang nutrient medium na may pinababang tryptophan na nilalaman na may patuloy na pagdaragdag ng mga nutrient substrates, mas mabuti ang glucose at yeast extract.
5. Ang pamamaraan ayon sa claim 3, kung saan bago matunaw ang interferon, ito ay dinadalisay sa pamamagitan ng pag-alis ng mga natutunaw na bahagi ng cellular, kabilang ang DNA, RNA, protina, lipopolysaccharides, paghuhugas ng mga solusyon sa buffer na naglalaman ng mga detergent tulad ng Triton XI 00, urea.
6. Ang pamamaraan ayon sa claim 3, kung saan pagkatapos ng bawat chromatographic purification, ang sterilizing filtration ay isinasagawa sa pamamagitan ng mga filter na may sukat ng butas na 0.22 microns.
Sa mga klinikal na pag-aaral na isinagawa sa malawak na saklaw mga indikasyon at may malawak na hanay ng mga dosis (mula sa 6 milyong IU/m2 bawat linggo - para sa mabuhok na cell leukemia; hanggang 100 milyong IU/m2 bawat linggo - para sa melanoma), ang pinakakaraniwang masamang pangyayari ay lagnat, pagkapagod, sakit ng ulo, myalgia. Nalutas ang lagnat at pagkapagod 72 oras pagkatapos ihinto ang gamot. Bagama't ang lagnat ay maaaring isang sintomas ng tulad ng trangkaso na sindrom na kadalasang nahaharap sa interferon na paggamot, dapat na isagawa ang pagsusuri upang maalis ang iba. posibleng dahilan patuloy na lagnat.
Ang sumusunod na profile ng kaligtasan ay nakuha mula sa 4 mga klinikal na pagsubok sa mga pasyente na may talamak na hepatitis C na nakatanggap ng Intron A bilang monotherapy o kasama ng ribavirin sa loob ng 1 taon. Ang lahat ng mga pasyente ay nakatanggap ng 3 milyong IU ng Intron A 3 beses sa isang linggo.
Ang talahanayan 2 ay nagpapakita ng mga salungat na kaganapan na nagaganap sa dalas na mas malaki kaysa sa o katumbas ng 10% sa mga pasyenteng hindi ginagamot dati na tumatanggap ng Intron A (o Intron A kasama ng ribavirin) sa loob ng 1 taon. Sa pangkalahatan, ang mga naobserbahang masamang kaganapan ay banayad o katamtaman.
Talahanayan 2.
| Mga masamang pangyayari | Intron A (n=806) | Intron A + ribavirin (n=1010) |
| Mga lokal na reaksyon | ||
| Mga nagpapasiklab na reaksyon sa lugar ng iniksyon | 9–16% | 6–17% |
| Iba pang mga reaksyon sa lugar ng iniksyon | 5–8% | 3–36% |
| Mga pangkalahatang reaksyon | ||
| Sakit ng ulo | 51–64% | 48–64% |
| Pagkapagod | 42–79% | 43–68% |
| Panginginig | 15–39% | 19–41% |
| Lagnat | 29–39% | 29–41% |
| Flu-like syndrome | 19–37% | 18–29% |
| Asthenia | 9–30% | 9–30% |
| Pagbaba ng timbang | 6–11% | 9–19% |
| Mga reaksyon mula sa gastrointestinal tract | ||
| Pagduduwal | 18–31% | 25–44% |
| Anorexia | 14–19% | 19–26% |
| Pagtatae | 12–22% | 13–18% |
| Sakit sa tiyan | 9–17% | 9–14% |
| sumuka | 3–10% | 6–10% |
| Mga reaksyon mula sa musculoskeletal system | ||
| Myalgia | 41–61% | 30–62% |
| Arthralgia | 25–31% | 21–29% |
| Sakit sa buto at kalamnan | 15–20% | 11–20% |
| Mga reaksyon mula sa gitnang sistema ng nerbiyos | ||
| Depresyon | 16–36% | 25–34% |
| Pagkairita | 13–27% | 18–34% |
| Hindi pagkakatulog | 21–28% | 33–41% |
| Pagkabalisa | 8–12% | 8–16% |
| May kapansanan sa kakayahang mag-concentrate | 8–14% | 9–21% |
| Emosyonal na lability | 8–14% | 5–11% |
| Mga reaksyon sa balat | ||
| Alopecia | 22–31% | 26–32% |
| Nangangati | 6–9% | 18–37% |
| Tuyong balat | 5–8% | 5–7% |
| Rash | 10–21% | 15–24% |
| Mga reaksyon mula sa labas sistema ng paghinga | ||
| Pharyngitis | 3–7% | 7–13% |
| Ubo | 3–7% | 8–11% |
| Dyspnea | 2–9% | 10–22% |
| Ang iba | ||
| Pagkahilo | 8–18% | 10–22% |
| Impeksyon sa viral | 0–7% | 3–10% |
Ang mga salungat na kaganapan ay sinusunod sa mga pasyente na may viral hepatitis C, tumutugma sa mga nabanggit kapag gumagamit ng Intron A para sa iba pang mga indikasyon na may ilang pagtaas sa dosis na umaasa sa dalas ng pag-unlad.
Kapag gumagamit ng Intron A para sa iba pang mga indikasyon (sa mga klinikal at di-klinikal na pag-aaral) ay bihirang (|1/10000,< 1/1000) или очень редко (.
Mula sa katawan sa kabuuan. Napakabihirang - pamamaga ng mukha.
Mga kondisyon ng asthenic (asthenia, karamdaman at pagkapagod), dehydration, palpitations, psoriasis, fungal infection at impeksyon sa bacterial(kabilang ang sepsis).
Mula sa immune system. Napakabihirang - sarcoidosis o paglala nito.
Ang iba't ibang mga autoimmune at immune system-mediated disorder ay naiulat sa paggamit ng mga alpha interferon, kabilang ang idiopathic o thrombotic thrombocytopenic purpura, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, vasculitis at Vogt-Koyanagi-Harada syndrome.
May naiulat na mga kaso talamak na reaksyon hypersensitivity, kabilang ang urticaria, angioedema at anaphylaxis.
Mula sa labas ng cardio-vascular system: bihira - arrhythmia (karaniwang nangyayari sa mga pasyente na may kasaysayan ng mga nakaraang sakit ng cardiovascular system o sa nakaraang cardiotoxic therapy), lumilipas na nababaligtad na cardiomyopathy (nabanggit sa mga pasyente na walang burdened history ng cardiovascular system); napakabihirang - arterial hypotension, myocardial ischemia at myocardial infarction.
Mula sa central nervous system at peripheral sistema ng nerbiyos. Bihirang - mga tendensya ng pagpapakamatay; napakabihirang- agresibong pag-uugali, kabilang ang mga nakadirekta sa ibang tao, mga pagtatangkang magpakamatay, pagpapakamatay, psychosis (kabilang ang mga guni-guni), may kapansanan sa kamalayan, neuropathy, polyneuropathy, encephalopathy, cerebrovascular ischemia, cerebrovascular hemorrhage, peripheral neuropathy, convulsions.
Mula sa gilid ng organ ng pandinig. Napakabihirang - pagkawala ng pandinig.
Mula sa endocrine system. Napakabihirang - diabetes mellitus, paglala ng umiiral na Diabetes mellitus.
Mula sa gastrointestinal tract. Napakabihirang - pancreatitis, nadagdagan ang gana, dumudugo na gilagid, colitis.
Mula sa atay at mga duct ng apdo. Napakabihirang - hepatotoxicity (kabilang ang nakamamatay).
Mga pagbabago sa ngipin at periodontium. Sa mga pasyente na tumatanggap ng kumbinasyon ng therapy na may Nitron A at ribavirin, mayroong mga pagbabago sa pathological mula sa ngipin at periodontium. Tuyong bibig sa mahabang panahon kumbinasyon ng therapy Ang Ribavirin at Intron A ay maaaring mag-ambag sa pinsala sa ngipin at oral mucosa. Ang mga pasyente ay dapat magsipilyo ng kanilang mga ngipin dalawang beses sa isang araw at magkaroon ng regular na pagpapatingin sa ngipin. Bilang karagdagan, ang ilang mga pasyente ay maaaring makaranas ng pagsusuka.
Mula sa gilid ng metabolismo. Bihirang - hyperglycemia, hypertriglyceridemia.
Mula sa musculoskeletal system. Bihirang - rhabdomyolysis (minsan malubha), binti cramps, sakit sa likod, myositis.
Mula sa gilid ng balat. Napakabihirang - erythema multiforme, Stevens-Johnson syndrome, nakakalason na epidermal necrolysis, nekrosis sa lugar ng iniksyon.
Mula sa respiratory system. Bihirang - pulmonya; napakabihirang - pulmonary infiltrates, pneumonitis.
Mula sa sistema ng ihi. Napakadalang- nephrotic syndrome, disfunction ng bato, kabiguan ng bato.
Mula sa hematopoietic system. Napakabihirang, kapag gumagamit ng Intron A bilang monotherapy o kasama ng ribavirin, naobserbahan ang aplastic anemia at kumpletong pulang aplasia. utak ng buto.
Mula sa gilid ng organ ng pangitain. Bihirang - retinal hemorrhage, mga pagbabago sa focal sa fundus, trombosis ng retinal arteries at veins, nabawasan ang visual acuity, nabawasan ang visual field, neuritis optic nerve, papilledema.
Sa klinika makabuluhang pagbabago mga parameter ng laboratoryo.(mas madalas na sinusunod kapag ang gamot ay inireseta sa mga dosis na higit sa 10 milyong IU / araw) - isang pagbawas sa bilang ng mga granulocytes at leukocytes, isang pagbawas sa mga antas ng hemoglobin at mga bilang ng platelet, isang pagtaas sa aktibidad ng alkaline phosphatase, LDH , ang antas ng creatinine at serum urea nitrogen. Ang pagtaas sa aktibidad ng ALT at AST sa plasma ng dugo ay nabanggit bilang pathological kapag ginamit para sa lahat ng mga indikasyon maliban sa hepatitis, pati na rin sa ilang mga pasyente na may talamak na hepatitis B sa kawalan ng HBV DNA.
Kung ang mga salungat na kaganapan ay nabuo sa panahon ng paggamit ng Intron A para sa anumang indikasyon, ang dosis ay dapat bawasan o ang paggamot ay dapat na pansamantalang maantala hanggang sa maalis ang mga salungat na kaganapan. Kung ang paulit-ulit o paulit-ulit na hindi pagpaparaan sa isang sapat na regimen ng dosis ay bubuo o ang sakit ay umuunlad, ang Intron A therapy ay dapat na ihinto. Sa parenteral na pangangasiwa ng gamot, ang panginginig, lagnat, pagkapagod, sakit ng ulo, karamdaman, at mala-flu na sindrom ay posible. Ang mga side effect na ito ay bahagyang naibsan ng paracetamol o indomethacin.
Sa lokal na aplikasyon ng gamot sa mauhog lamad ng mata, conjunctival infection, hyperemia ng mauhog lamad ng mata, solong follicles, pamamaga ng conjunctiva ng lower fornix ay posible.
Kapag gumagamit ng gamot, posible ang mga paglihis mula sa normal na mga parameter ng laboratoryo, na ipinakita ng leukopenia, lymphopenia, thrombocytopenia, pagtaas ng antas ng alanine aminotransferase, alkaline phosphatase. Para sa napapanahong pagtuklas ng mga paglihis na ito sa panahon ng therapy, pangkalahatan mga klinikal na pagsubok Ang mga pagsusuri sa dugo ay dapat na ulitin tuwing 2 linggo, at ang mga pagsusuri sa biochemical tuwing 4 na linggo. Sa pangkalahatan, ang mga pagbabagong ito ay kadalasang menor de edad, asymptomatic at nababaligtad.
Mga side effect ng Interferon beta.
Leukopenia. Thrombocytopenia. Anemia. Autoimmune hemolysis. Anorexia. Pagtatae. Tumaas na antas ng transaminase. Hypotension. Tachycardia. Dyspnea. Pagkahilo. Sakit sa pagtulog. Sakit sa buto at kasukasuan. Lagnat. kahinaan. Myalgia. Sakit ng ulo. Pagduduwal. suka; na may pangmatagalang paggamit - pagkawala ng buhok.Ang seksyong ito ay nagpapakita mga tagubilin para sa paggamit ng interferon alpha 2b at alpha 2a unang henerasyon, na tinatawag ding linear, simple o panandalian. Ang tanging bentahe ng mga paghahanda na ito ay ang kanilang medyo mababang presyo.
Noong 1943, natuklasan nina V. at J. Heile ang tinatawag na interference phenomenon. Ang unang ideya ng interferon ay ito: isang kadahilanan na pumipigil sa pagpaparami ng mga virus. Noong 1957, ang Ingles na siyentipiko na si Alik Isaacs at ang Swiss researcher na si Jean Lindenman ay naghiwalay sa kadahilanang ito, malinaw na inilarawan ito at tinawag itong interferon.
Ang Interferon (IFN) ay isang molekula ng protina na ginawa sa katawan ng tao. Ang genetic apparatus ng tao ay nag-encode ng "recipe" para sa synthesis nito (interferon gene). Ang interferon ay isa sa mga cytokine, na nagse-signal ng mga molekula na naglalaro mahalagang papel sa paggana ng immune system.
Sa loob ng kalahating siglo mula nang matuklasan ang IFN, dose-dosenang mga katangian ng protina na ito ang napag-aralan. Mula sa isang medikal na pananaw, ang mga pangunahing ay antiviral at antitumor function.
Ang katawan ng tao ay gumagawa ng mga 20 uri - isang buong pamilya - ng mga interferon. Ang IFN ay nahahati sa dalawang uri: I at II.
Type I IFNs - alpha, beta, omega, theta - ay ginawa at itinago ng karamihan sa mga cell ng katawan bilang tugon sa pagkilos ng mga virus at ilang iba pang mga ahente. Kasama sa Type II IFN ang interferon gamma, na ginawa ng mga selula ng immune system bilang tugon sa pagkilos ng mga dayuhang ahente.
Sa una, ang mga paghahanda ng interferon ay nakuha lamang mula sa mga selula ng dugo ng donor; Tinawag sila na: leukocyte interferon. Noong 1980, nagsimula ang panahon ng recombinant, o genetically engineered, interferon. Ang paggawa ng mga recombinant na gamot ay naging makabuluhang mas mura kaysa sa paggawa ng mga katulad na gamot mula sa dugo ng donor ng tao o iba pang biological na hilaw na materyales; hindi ginagamit sa kanilang produksyon donor ng dugo na maaaring magsilbi bilang isang mapagkukunan ng impeksyon. Mga recombinant na gamot hindi naglalaman ng mga banyagang impurities at samakatuwid ay may mas kaunti side effects. Ang kanilang potensyal sa pagpapagaling ay mas mataas kaysa sa mga katulad na natural na gamot.
Para sa paggamot ng mga sakit na viral, sa partikular na hepatitis C, ang interferon alpha (IFN-α) ay pangunahing ginagamit. May mga "simple" ("maikli ang buhay") interferon alpha 2b at alpha 2a at pegylated (peginterferon alfa-2a at peginterferon alfa-2b). Ang mga "simple" na interferon ay halos hindi ginagamit sa EU at USA, ngunit sa ating bansa, dahil sa kanilang paghahambing na mura, madalas silang ginagamit. Sa paggamot ng hepatitis C, ang parehong anyo ng "maikling" IFN-α ay ginagamit: interferon alpha-2a at interferon alpha-2b (naiiba sa isang amino acid). Ang mga iniksyon na may mga simpleng interferon ay karaniwang ginagawa tuwing ibang araw (na may mga peginterferon - isang beses sa isang linggo). Ang pagiging epektibo ng paggamot sa mga panandaliang IFN kapag pinangangasiwaan tuwing ibang araw ay mas mababa kaysa sa mga peginterferon. Inirerekomenda ng ilang mga eksperto ang pang-araw-araw na iniksyon ng "simple" na IFN, dahil ang bisa ng AVT ay bahagyang mas mataas.
Ang hanay ng mga "maiikling" IFN ay medyo malawak. Pinakawalan sila ng iba't ibang mga tagagawa sa ilalim iba't ibang pangalan: Roferon-A, Intron A, Laferon, Reaferon-EC, Realdiron, Eberon, Interal, Altevir, Alfarona at iba pa.
Ang pinaka-pinag-aralan (at samakatuwid ay mahal) ay ang Roferon-A at Intron-A. Ang pagiging epektibo ng paggamot sa mga IFN na ito kasama ng ribavirin, depende sa genotype ng virus at iba pang mga kadahilanan, ay umaabot mula 30% hanggang 60%. Listahan ng mga pangunahing mga tatak Ang mga tagagawa ng mga simpleng interferon at ang kanilang mga paglalarawan ay ibinibigay sa talahanayan.
Ang lahat ng mga interferon ay dapat na naka-imbak sa ref (mula sa +2 hanggang +8 degrees Celsius). Hindi sila dapat pinainit o nagyelo. Huwag kalugin o ilantad ang gamot upang idirekta sinag ng araw. Kinakailangang magdala ng mga gamot sa mga espesyal na lalagyan.
sangkap-solusyon: mga pakete Reg. No.: LSR-007009/08
Klinikal at pharmacological na grupo:
Form ng paglabas, komposisyon at packaging
sangkap -solusyon.
mga bote (1) - mga pakete ng karton.
Paglalarawan ng mga aktibong sangkap ng gamot " Interferon alpha-2b»
epekto ng pharmacological
Interferon. Ito ay isang highly purified recombinant protein na may molekular na timbang na 19,300 daltons. Nakuha mula sa isang Escherichia coli clone sa pamamagitan ng pag-hybrid ng bacterial plasmids na may human leukocyte gene na naka-encode sa synthesis ng interferon. Hindi tulad ng interferon, ang alpha-2a ay may arginine sa posisyon 23.
Mayroon itong antiviral effect, na dahil sa pakikipag-ugnayan sa mga partikular na receptor ng lamad at induction ng RNA synthesis at, sa huli, mga protina. Ang huli, sa turn, ay pumipigil sa normal na pagpaparami ng virus o paglabas nito.
Mayroon itong aktibidad na immunomodulatory, na nauugnay sa pag-activate ng phagocytosis, pagpapasigla ng pagbuo ng mga antibodies at lymphokines.
May antiproliferative effect sa mga selula ng tumor.
Mga indikasyon
talamak na hepatitis B, talamak na hepatitis B, talamak na hepatitis C.
Hairy cell leukemia, talamak na myeloid leukemia, renal cell carcinoma, Kaposi's sarcoma dahil sa AIDS, cutaneous T-cell lymphoma (mycosis fungoides at Sézary syndrome), malignant melanoma.
Regimen ng dosis
Pinangangasiwaan nang intravenously o subcutaneously. Ang dosis at regimen ng paggamot ay itinakda nang paisa-isa, depende sa mga indikasyon.
Side effect
Mga sintomas tulad ng trangkaso: madalas - lagnat, panginginig, pananakit ng buto, kasukasuan, mata, myalgia, sakit ng ulo, pagtaas ng pagpapawis, pagkahilo.
Mula sa labas sistema ng pagtunaw: posibleng pagkawala ng gana, pagduduwal, pagsusuka, pagtatae, paninigas ng dumi, kaguluhan panlasa ng mga sensasyon, tuyong bibig, pagbaba ng timbang, banayad na pananakit ng tiyan, kaunting pagbabago sa mga pagsusuri sa pag-andar ng atay (karaniwan ay normalize pagkatapos ng paggamot).
Mula sa central nervous system at peripheral nervous system: bihira - pagkahilo, pagkasira ng aktibidad ng pag-iisip, pagkagambala sa pagtulog, kapansanan sa memorya, pagkabalisa, nerbiyos, pagiging agresibo, euphoria, depression (pagkatapos ng pangmatagalang paggamot), paresthesia, neuropathy, panginginig; sa ilang mga kaso - mga tendensya ng pagpapakamatay, pag-aantok.
Mula sa cardiovascular system: posible - tachycardia (na may lagnat), arterial hypotension o hypertension, arrhythmia; sa ilang mga kaso - mga karamdaman ng cardiovascular system, coronary artery disease, myocardial infarction.
Mula sa respiratory system: bihira - sakit sa dibdib, ubo, bahagyang igsi ng paghinga; sa ilang mga kaso - pneumonia, pulmonary edema.
Mula sa hematopoietic system: posibleng bahagyang leukopenia, thrombocytopenia, granulocytopenia.
Mga reaksyon ng dermatological: posibleng pangangati, nababaligtad na alopecia.
Iba pa: bihira - paninigas ng kalamnan; sa mga nakahiwalay na kaso - mga antibodies sa natural o recombinant na interferon.
Contraindications
Mabigat mga sakit sa cardiovascular, decompensated liver cirrhosis, matinding depression, psychosis, pagkagumon sa alkohol o droga, nadagdagan ang pagiging sensitibo sa interferon alpha-2b.
Pagbubuntis at paggagatas
Ang paggamit sa panahon ng pagbubuntis ay posible lamang kung ang inaasahang benepisyo ng therapy para sa ina ay mas malaki kaysa sa potensyal na panganib sa fetus.
Hindi alam kung ang interferon alfa-2b ay inilihim mula sa gatas ng ina. Kung kinakailangan na gamitin ito sa panahon ng paggagatas, ang isyu ng pagtigil sa pagpapasuso ay dapat na magpasya.
Ang mga kababaihan ng edad ng panganganak ay dapat gumamit ng maaasahang pagpipigil sa pagbubuntis sa panahon ng paggamot.
Gamitin para sa dysfunction ng atay
Contraindicated sa decompensated liver cirrhosis. Gamitin nang may pag-iingat sa mga pasyente na may kapansanan sa paggana ng atay.
Gamitin para sa renal impairment
Gamitin nang may pag-iingat sa mga pasyente na may kapansanan sa pag-andar ng bato.
mga espesyal na tagubilin
Gumamit nang may pag-iingat sa mga pasyenteng may kapansanan sa bato, atay, bone marrow hematopoiesis, o may posibilidad na sumubok ng pagpapakamatay.
Sa mga pasyente na may mga sakit ng cardiovascular system, posible ang arrhythmia. Kung ang arrhythmia ay hindi bumaba o tumaas, ang dosis ay dapat bawasan ng 2 beses o ang paggamot ay dapat itigil.
Sa panahon ng paggamot, kinakailangan ang pagsubaybay sa kalagayan ng neurological at mental.
Sa mga kaso ng matinding pagsugpo sa bone marrow hematopoiesis, kinakailangan ang regular na pagsusuri sa komposisyon ng peripheral blood.
Ang interferon alfa-2b ay may nakapagpapasiglang epekto sa immune system at dapat gamitin nang may pag-iingat sa mga pasyenteng madaling kapitan ng sakit sa autoimmune dahil sa mas mataas na panganib ng mga reaksiyong autoimmune.
Interaksyon sa droga
Interaksyon sa droga
Pinipigilan ng interferon alfa-2b ang metabolismo ng theophylline at binabawasan ang clearance nito.
