Գյուտը վերաբերում է գենային ինժեներիան, կենսատեխնոլոգիա, բժշկություն, դեղագիտություն։ Նոր ռեկոմբինանտ բազմապատճենային պլազմիդ ԴՆԹ pSX50, որը կոդավորում է մարդու լեյկոցիտային ալֆա-2b ինտերֆերոնի սինթեզը, որի էքսպրեսիան գտնվում է լակտոզայի և տրիպտոֆանի պրոմոտորների և տրանսկրիպցիոն տերմինատորի հսկողության տակ: E. coli BL21 ստացող շտամի բջիջների փոխակերպման արդյունքում ռեկոմբինանտ պլազմիդային ԴՆԹ-ի pSX50-ով ստացվել է E. coli SX50 շտամը` մինչև 0,9-1,0 գ արտադրողականությամբ ռեկոմբինանտ լեյկոցիտ մարդու ալֆա-2b ինտերֆերոնի արտադրող: ալֆա-2բ ինտերֆերոն 1 լիտր մշակութային միջավայրից: Ռեկոմբինանտ ալֆա-2b ինտերֆերոնի արտադրության մեթոդը հիմնված է E. coli SX50-ի ստեղծված ռեկոմբինանտ շտամի օգտագործման վրա և ներառում է դրա խորը մշակումը սնուցող միջավայրի վրա կրճատված բովանդակությունտրիպտոֆան՝ կենսասինթեզի գործընթացում սննդանյութերի սուբստրատների շարունակական ավելացմամբ, միկրոօրգանիզմների բջիջների մեխանիկական ոչնչացմամբ. բարձր արյան ճնշումագրեգացված սպիտակուցի տարրալուծում գուանիդինի հիդրոքլորիդի խտացված լուծույթում, որին հաջորդում է ինտերֆերոնի վերածումը ֆիզիոլոգիական բուֆերային լուծույթներում քաոտրոպային նյութերի առկայության դեպքում և դրա մաքրումը ինտերֆերոնի եռաստիճան քրոմատոգրաֆիկ մաքրման միջոցով Chelating Sepharose Fast Flow տեսակի խեժերի վրա: +2 իոններ, իոնափոխանակման քրոմատոգրաֆիա SM տիպի իոնափոխանակման խեժերի վրա Sephsrose Fast Flow և գելային ֆիլտրացիոն քրոմատոգրաֆիա Superdex 75 տիպի խեժերի վրա։Մեթոդը հնարավորություն է տալիս ստանալ ավելի քան 99% մաքրությամբ ինտերֆերոն նյութ՝ ըստ էլեկտրոֆորեզի՝ վերականգնող և ոչ։ նվազեցնում է պայմանները, երբ գելերը ներկում են արծաթով և ավելի քան 98%՝ համաձայն ՌԴ HPLC-ի և չի պարունակում պիրոգեններ (LAL թեստ)՝ առնվազն 400-800 մգ 1 լիտր կուլտուրայի համար: 3 n. եւ 3 աշխատավարձային հաստիք, 6 հիվանդ.
Գծագրեր ՌԴ արտոնագրի համար 2242516
Գյուտը վերաբերում է կենսատեխնոլոգիայով ստացված գենետիկորեն մշակված դեղամիջոցներին, մասնավորապես՝ մեթոդներին արդյունաբերական արտադրությունմարդկային ռեկոմբինանտ լեյկոցիտային ինտերֆերոն ալֆա-2բ բժշկական նպատակներով(այսուհետ՝ ինտերֆերոն), ինչպես նաև Escherichia coli-ի (E.coli) և ինտերֆերոնի սինթեզը կոդավորող պլազմիդային ԴՆԹ-ի ռեկոմբինանտ արտադրող շտամներին։
Ինտերֆերոնները սպիտակուցային մոլեկուլներ են, որոնց մոլեկուլային զանգվածը կազմում է 15000-21000 դալտոն, որոնք արտադրվում և արտազատվում են բջիջների կողմից՝ ի պատասխան վիրուսային վարակի կամ այլ պաթոգենների: Ինտերֆերոնների երեք հիմնական խումբ կա՝ ալֆա, բետա և գամմա։ Այս խմբերն իրենք միատարր չեն և կարող են պարունակել ինտերֆերոնի մի քանի տարբեր մոլեկուլային տեսակներ: Այսպիսով, հայտնաբերվել են ինտերֆերոն ալֆայի ավելի քան 14 գենետիկական սորտեր, որոնք հետաքրքրություն են ներկայացնում և գտնում են. լայն կիրառությունբժշկության մեջ որպես հակավիրուսային, հակապրոլիֆերատիվ և իմունոմոդուլացնող միջոցներ։
Հայտնի են վիրուսների և այլ ինդուկտորների կողմից առաջացած մարդու դոնորի արյան լեյկոցիտներից մարդու լեյկոցիտային ինտերֆերոնի ստացման մեթոդներ (SU1713591, RU 2066188, RU 2080873):
Ինտերֆերոնների արտադրության այս մեթոդների հիմնական թերությունը վերջնական արտադրանքի վարակման հավանականությունն է մարդու վիրուսներով, ինչպիսիք են հեպատիտ B և C վիրուսները, իմունային անբավարարության վիրուսը և այլն:
Ներկայումս մանրէաբանական սինթեզի միջոցով ինտերֆերոնի արտադրության մեթոդը ճանաչվել է ավելի խոստումնալից, ինչը հնարավորություն է տալիս համեմատաբար էժան սկզբնական նյութերից ձեռք բերել թիրախային արտադրանքը զգալիորեն ավելի բարձր եկամտաբերությամբ: Այստեղ օգտագործվող մոտեցումները հնարավորություն են տալիս ստեղծել կառուցվածքային գենի տարբերակներ, որոնք օպտիմալ են բակտերիաների արտահայտման համար, ինչպես նաև կարգավորող տարրեր, որոնք վերահսկում են դրա արտահայտումը:
Օգտագործված մեկնարկային միկրոօրգանիզմներն են տարբեր նմուշներ Pichia pastoris, Pseudomonas putida և Escherichia coli շտամներ:
P. pastoris-ը որպես ինտերֆերոն արտադրող օգտագործելու թերությունը (J.N. Garcia, J.A. Aguiar et. al. //Մարդկային IFN-2b-ի բարձր մակարդակի արտահայտություն Pichia pastoris-ում://Biotecnologia Aplicada, 12(3),152-155, 1995 թ. ), Այս տեսակի խմորիչի խմորման պայմանները չափազանց բարդ են, կենսասինթեզի գործընթացում ինդուկտորի, մասնավորապես մեթանոլի կոնցենտրացիան խստորեն պահպանելու անհրաժեշտություն։ Ps-ի օգտագործման թերությունը. putida (SU1364343, SU1640996, SU1591484, RU1616143, RU2142508) ֆերմենտացման գործընթացի բարդությունն է արտահայտման ցածր մակարդակում (10 մգ ինտերֆերոն 1 լիտր կուլտուրայի համար): Ավելի արդյունավետ է Escherichia coli շտամների օգտագործումը (Semin. Oncol., 1997, Iun; 24 (3 Suppl. 9): S9-41-S9-51):
Հայտնի են մեծ թվով պլազմիդներ և E. coli շտամներ, որոնք ստեղծվել են դրանց հիման վրա, որոնք արտահայտում են ինտերֆերոնը. HclN SN 35 -AHL6 (SU 1764515), E. coli շտամ pINF-AP2 (SU 1312961), E. coli շտամ pINF-F-Pa (AU 1312962), E. Coli շտամ SG 20050 պլազմիդով p2F-NV.rav. և ուրիշներ Bioorganic chemistry, 1987, հ. 13, թիվ 9, էջ 1186-1193), շտամ E. Coli SG 20050 պլազմիդով pINF14 (SU 1703691), շտամ E. coli SG 20050 SG 20050 պլազմիդով 20050 RU101 (p2051 պլազմիդ) և այլն: Այս շտամների օգտագործման վրա հիմնված տեխնոլոգիաների թերությունը նրանց անկայունությունն է, ինչպես նաև ինտերֆերոնի արտահայտման անբավարար մակարդակը:
Օգտագործված շտամների բնութագրերի հետ մեկտեղ, գործընթացի արդյունավետությունը մեծապես կախված է ինտերֆերոնի մեկուսացման և մաքրման համար օգտագործվող տեխնոլոգիայից:
Ինտերֆերոնի արտադրության հայտնի մեթոդ կա, որը ներառում է Ps բջիջների մշակումը։ պուտիդա, կենսազանգվածի ոչնչացում, պոլիէթիլենիմինով մշակում, ամոնիումի սուլֆատով ֆրակացիա, ֆենիլսիլոքրոմ C-80 հիդրոֆոբ քրոմատոգրաֆիա, լիզատի pH ֆրակցիան, դրա կոնցենտրացիան և դիաֆիլտրացիան, իոնափոխանակման քրոմատոգրաֆիա ցելյուլոզայի DE-52 էգրադիումի վրա, Ստացված էլուենտի փոխանակման քրոմատագրություն ցելյուլոզային SM-52-ի վրա, կոնցենտրացիան՝ անցնելով ֆիլտրի ձայներիզով և գելային զտում Sephadex G-100-ի վրա (SU 1640996): Այս մեթոդի թերությունը, բացի բարդ բազմափուլ խմորումից, վերջնական արտադրանքի ստացման բազմափուլ գործընթացն է։
Գոյություն ունի նաև ինտերֆերոնի արտադրության հայտնի մեթոդ, որը ներառում է E. coli շտամի SG 20050/pIF16 մշակումը LB արգանակի մեջ կոլբայի մեջ թերմոստատացված թափահարիչի մեջ, ցենտրիֆուգավորում է կենսազանգվածը, այն լվացվում բուֆերային լուծույթով և ուլտրաձայնային բուժում՝ բջիջները ոչնչացնելու համար: Ստացված լիզատը ցենտրիֆուգվում է, լվանում բուֆերային միզանյութի 3 մ լուծույթով, լուծվում է գուանիդինի քլորիդի լուծույթում բուֆերում, մշակվում է ուլտրաձայնով, ցենտրիֆուգվում, օքսիդատիվ սուլֆիտոլիզի միջոցով, դիալիզ 8 մ միզանյութի դեմ, ռենատուրացիա և վերջնական երկու փուլով C- մատոգրաֆիա: 52 ցելյուլոզ և Sephadex G-50 (RU 2054041): Այս մեթոդի թերությունները մեկուսացման և մաքրման գործընթացի հիմնական փուլերի համեմատաբար ցածր արտադրողականությունն են: Սա հատկապես վերաբերում է արտադրանքի ուլտրաձայնային բուժմանը, դիալիզի և օքսիդատիվ սուլֆիտոլիզի վրա, ինչը հանգեցնում է ինտերֆերոնի արտազատման անկայունության, ինչպես նաև այս մեթոդի օգտագործման անհնարինությանը: արդյունաբերական արտադրությունինտերֆերոն.
Որպես ամենամոտ անալոգ (նախատիպ) կարող է նշվել մարդու լեյկոցիտային ինտերֆերոնի ստացման մեթոդը, որը բաղկացած է E. coli-ի ռեկոմբինանտ շտամի մշակումից, ստացված կենսազանգվածի սառեցումից -70°C-ից ոչ ավելի ջերմաստիճանում, հալեցնելուց, միկրոօրգանիզմների բջիջների ոչնչացումից: լիզոզիմով, հեռացնելով ԴՆԹ-ն և ՌՆԹ-ն՝ ներմուծելով ԴՆԹ-ի լիզատ և մաքրելով ինտերֆերոնի մեկուսացված չլուծվող ձևը՝ լվացող միջոցներով բուֆերային լուծույթով լվանալով, գուանիդինի հիդրոքլորիդի լուծույթում լուծարելով ինտերֆերոնի նստվածքը, ռենատուրացիան և մեկ քայլով մաքրումը: փոխանակման քրոմատոգրաֆիա. Որպես արտադրող օգտագործվում է E. coli SS5 շտամը, որը ստացվել է ռեկոմբինանտ pSS5 պլազմիդի միջոցով, որը պարունակում է երեք խթանողներ՝ P lac, P t7 և P trp, և ալֆա-ինտերֆերոնի գենը՝ ներմուծված նուկլեոտիդային փոխարինումներով:
Այս պլազմիդ պարունակող E. coli SS5 շտամի կողմից ինտերֆերոնի արտահայտումը վերահսկվում է երեք խթանիչների կողմից՝ P lac, P t7 և P trp: Ինտերֆերոնի արտահայտման մակարդակը կազմում է մոտ 800 մգ 1 լիտր բջջային կախույթի համար (RU 2165455):
Այս մեթոդի թերությունը բջիջների, միկրոօրգանիզմի ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի ֆերմենտային ոչնչացման և ինտերֆերոնի մեկ քայլով քրոմատոգրաֆիական մաքրման օգտագործման ցածր տեխնոլոգիական արդյունավետությունն է: Սա անկայունություն է առաջացնում ինտերֆերոնի արտազատման գործընթացում, հանգեցնում է դրա որակի նվազմանը և սահմանափակում վերը նշված սխեմայի օգտագործման հնարավորությունը ինտերֆերոնի արդյունաբերական արտադրության համար: Այս պլազմիդի և դրա վրա հիմնված շտամի թերությունները E. coli BL21 շտամում (DE3) T7 ֆագի ուժեղ չկարգավորվող պրոմոտորի պլազմիդում օգտագործելն է, որում T7 ՌՆԹ պոլիմերազի գենը գտնվում է պրոմոտորի տակ։ լակ օպերոնը և որը միշտ «հոսում է»։ Հետևաբար, բջջում շարունակաբար տեղի է ունենում ինտերֆերոնի սինթեզ, ինչը հանգեցնում է պլազմիդի տարանջատման և շտամի բջիջների կենսունակության նվազմանը, իսկ արդյունքում՝ ինտերֆերոնի ելքի նվազմանը։
Այս գյուտի նպատակն է կառուցել E. coli-ի ռեկոմբինանտ արդյունաբերական արտադրող շտամ՝ օգտագործելով նոր ռեկոմբինանտ պլազմիդ ԴՆԹ, որն ունի ինտերֆերոնի կենսասինթեզի բարձր մակարդակ, և մշակել արդյունավետ արդյունաբերական տեխնոլոգիա՝ բժշկական օգտագործման համար համապատասխան ինտերֆերոնային նյութ արտադրելու համար: որակով ինտերֆերոն ալֆա-2b նյութի «Եվրոպական դեղագրքին»:
Այս խնդիրը լուծվել է ստեղծելով ռեկոմբինանտ պլազմիդային ԴՆԹ pSX50 և Escherichia coli շտամը SX50, որոնք պահվել են Գենետիկայի դաշնային պետական միավորումային ձեռնարկությունների պետական գիտահետազոտական ինստիտուտի Արդյունաբերական շտամների համառուսական հավաքածուում, համարը VKPM B-8550:
ինչպես նաև ռեկոմբինանտ ալֆա-2b ինտերֆերոնի արտադրության մեթոդ, որը հիմնված է E. coli SX50-ի ռեկոմբինանտ շտամի օգտագործման վրա և ներառում է դրա խորը մշակումը սնուցող միջավայրի վրա՝ տրիպտոֆանի նվազեցված պարունակությամբ՝ գործընթացում սննդանյութերի սուբստրատների շարունակական ավելացմամբ: կենսասինթեզի, բարձր ճնշման տակ միկրոօրգանիզմների բջիջների մեխանիկական ոչնչացում, ագրեգացված սպիտակուցի տարրալուծում գուանիդինի հիդրոքլորիդի խտացված լուծույթում, որին հաջորդում է ինտերֆերոնի վերածումը ֆիզիոլոգիական բուֆերային լուծույթներում քաոտրոպ նյութերի առկայության դեպքում և ինտերֆերոնի եռաստիճան քրոմատոգրաֆիկ մաքրում ռեսինի վրա: որպես Chelate Sepharose Fast Flow, անշարժացված Cu +2 իոններով, իոնափոխանակման քրոմատոգրաֆիա իոնափոխանակման խեժերի վրա, ինչպիսիք են CM Sepharose Fast Flow-ը և գելային ֆիլտրացիոն քրոմատոգրաֆիա խեժերի վրա, ինչպիսին է Superdex 75-ը:
Գյուտի համաձայն՝ առաջարկվում է նոր ռեկոմբինանտ բազմապատճենային պլազմիդ ԴՆԹ pSX50, որը կոդավորում է մարդու լեյկոցիտային ալֆա-2b ինտերֆերոնի սինթեզը, որի էքսպրեսիան գտնվում է լակտոզայի և տրիպտոֆանի պրոմոտորների և տրանսկրիպցիոն տերմինատորի հսկողության տակ։ Պլազմիդ pSX50-ն ունի 3218 բազային զույգ (bp) և բնութագրվում է հետևյալ բեկորների առկայությամբ.
Նուկլեոտիդ 1-ից մինչև նուկլեոտիդ (nt) 176 հաջորդականությունը ներառում է 176 bp ԴՆԹ-ի բեկոր, որը պարունակում է տրիպտոֆան խթանող (P trp);
Հերթականությունը 177 նտ. մինչև 194 n. ներառում է 18 bp սինթետիկ ԴՆԹ բեկոր, որը պարունակում է Shine Delgarno հաջորդականությունը, որը պատասխանատու է թարգմանության մեկնարկի համար.
Հերթականությունը 195 նտ. մինչև 695 ն. ներառում է 501 bp չափի ԴՆԹ-ի հատված, որը պարունակում է ինտերֆերոնի գենի հաջորդականությունը հետևյալ նուկլեոտիդային փոխարինումներով. C, 42 դիրքում, G-ի փոխարինում T-ով, 67-րդ դիրքում, A-ի փոխարինում C-ով, 69-րդ դիրքում, G-ի փոխարինում T-ով, 70-րդ դիրքում, A-ի փոխարինում C-ով, 72-րդ դիրքում, A-ի փոխարինում C-ով. T, դիրքում 96, G-ի փոխարինում A-ով, դիրքում 100, A-ի փոխարինում C-ով, 102-րդ դիրքում, A-ի փոխարինում T-ով, դիրքում 114, A-ի փոխարինում C-ով, դիրքում 120, փոխարինում C-ով. G-ով, 126-րդ դիրքում, G-ի փոխարինում A-ով, 129-րդ դիրքում, G-ի փոխարինում A-ով, 330-րդ դիրքում, C-ով փոխարինում G-ով, 339-րդ դիրքում G-ին փոխարինում A-ով, 342-րդ դիրքում G-ին փոխարինում A-ով, դիրքը 487-ը փոխարինում է A-ին C-ով, 489-րդ դիրքում A-ին փոխարինում է T-ով, 495-րդ դիրքում G-ն փոխարինում է A-ով;
Հերթականություն 696 նտ-ից: համաձայն 713 n. ներառում է 18 bp սինթետիկ ԴՆԹ բեկոր, որը պարունակում է սինթետիկ պոլիկլինկեր;
Հաջորդականությունը 714 nt-ից: մինչև 1138 ն. ներառում է pKK223-3 պլազմիդի ԴՆԹ բեկորը՝ 4129 նտ։ մինչև 4553 n. 425 bp չափի, որը պարունակում է խիստ տառադարձման տերմինատորի հաջորդականությունը rrnBT 1 T 2;
Հերթականություն 1139 բ. մինչև 1229 n. ներառում է pUC19 պլազմիդի ԴՆԹ-ի բեկորը՝ 2487 նտ։ մինչև 2577 n. 91 bp չափով, որը պարունակում է β-lactomase գենի խթանող (ամպիցիլինի դիմադրության գեն - Amp R);
Հաջորդականություն 1230 բ. մինչև 2045 թ. ներառում է pUC4K պլազմիդի ԴՆԹ բեկորը՝ 720 նտ: մինչև 1535 թ 816 bp չափով, որը պարունակում է kan գենի կառուցվածքային շրջան;
2046 թվականի հաջորդականություն բ. դեպի 3218 n. ներառում է pUC19 պլազմիդի ԴՆԹ-ի հատվածը 1625-ից մինչև 453 նտ: 1173 bp չափով, որը պարունակում է պլազմիդի վերարտադրության համար պատասխանատու հաջորդականություն (ori) և lac պրոմոութեր (P lac):
Նկար 1-5-ը ցույց է տալիս դիզայնի դիագրամները և ֆիզիկական քարտեզ pSH50 պլազմիդներ.
Նկար 6-ը ցույց է տալիս pSX50 պլազմիդի համար որոշված ամբողջական նուկլեոտիդային հաջորդականությունը:
Escherichia coli SX50 շտամը ստացվել է Escherichia coli BL21 բջիջները pSX50 պլազմիդի հետ փոխակերպելով՝ օգտագործելով ավանդական գենետիկ ճարտարագիտության տեխնոլոգիա. E.Coli SX50 շտամը բնութագրվում է հետևյալ բնութագրերով.
Մշակութային և ձևաբանական բնութագրերը
Բջիջները փոքր են, ուղիղ, հաստացած ձողաձև, գրամ-բացասական, սպոր չպարունակող։ Բջիջները լավ են աճում պարզ սննդարար միջավայրերի վրա: Difco ագարի վրա աճեցնելիս առաջանում են կլոր, հարթ, ուռուցիկ, ամպամած, փայլուն, հարթ եզրերով մոխրագույն գաղութներ։ Երբ աճեցվում է հեղուկ միջավայրում (նվազագույն միջավայրում՝ գլյուկոզայի կամ LB արգանակի մեջ), ձևավորվում է ինտենսիվ, հավասարաչափ պղտորություն։
Ֆիզիկական և կենսաբանական բնութագրերը
Աերոբ. Աճման ջերմաստիճանի միջակայքը 4-42°C է, օպտիմալ pH 6,5-7,5:
Որպես ազոտի աղբյուր օգտագործվում են ինչպես հանքային աղեր ամոնիումի, այնպես էլ նիտրատային ձևերով, ինչպես նաև. օրգանական միացություններամինաթթուների, պեպտոնի, տրիպտոնի, խմորիչի մզվածքի տեսքով և այլն։
Որպես ածխածնի աղբյուր օգտագործվում են ամինաթթուները, գլիցերինը և ածխաջրերը։ Հակաբիոտիկների դիմադրություն. Բջիջները դիմադրողականություն են ցուցաբերում կանամիցինի նկատմամբ (մինչև 100 մկգ/մլ)։
Escherichia coli 8X50 շտամը ինտերֆերոն արտադրող է:
Լարվածության պահպանման միջավայրի մեթոդը, պայմանները և բաղադրությունը
L-arape-ում 20 մկգ/մլ կոնցենտրացիայով կանամիցինի ավելացմամբ յուղի տակ, L-արգանակում, որը պարունակում է 15% գլիցերին և համապատասխան հակաբիոտիկներ ամպուլներում մինուս 70°C ջերմաստիճանում, լիոֆիլացված վիճակում ամպուլներում +4°C ջերմաստիճան:
Escherichia coli SX50 շտամը ճանաչվել է ըստ Bergey's Guide-ի (1974թ.)՝ որպես Escherichia coli տեսակի շտամ:
Ալֆա-2b ինտերֆերոնի արդյունաբերական արտադրության մեթոդ
Առաջարկվող մեթոդի առանձնահատկությունն այն տեխնոլոգիայի զարգացումն է, որը հնարավորություն է տալիս մեկուսացնել ինտերֆերոնը խմորման ընթացքում կուտակվող անլուծելի ձևից, ինչը հնարավորություն է տալիս զգալիորեն պարզեցնել. տեխնոլոգիական սխեմամեկուսացման գործընթացը և բարձրացնել թիրախային արտադրանքի եկամտաբերությունը:
Մեթոդը ներառում է Escherichia coli SH50 շտամի մշակումը սննդային միջավայրում, սննդանյութերի սուբստրատների, գերադասելիորեն գլյուկոզայի և խմորիչի էքստրակտի մշտական հավելումով, կենսասինթեզի գործընթացում, գերադասելի է տրիպտոֆանի նվազած պարունակությամբ, միկրոօրգանիզմների բջիջների մեխանիկական ոչնչացում բարձր ճնշման տակ։ 700-900 բար, ինտերֆերոնի տարրալուծում բուֆերային գուանիդինի հիդրոքլորիդի լուծույթում, ինտերֆերոնի վերափոխում ֆիզիոլոգիական բուֆերային լուծույթներում քաոտրոպիկ նյութերի առկայության դեպքում, որին հաջորդում է ինտերֆերոնի եռաստիճան քրոմատոգրաֆիկ մաքրումը Chelating Sepharose Fast Flow տեսակի խեժերի վրա՝ անշարժացված +2: իոններ, իոնափոխանակման քրոմատոգրաֆիա CM Sepharose Fast Flow տեսակի իոնափոխանակման խեժերի վրա և գելային ֆիլտրացիոն քրոմատոգրաֆիա խեժերի վրա, ինչպիսին է Superdex 75-ը:
Ինտերֆերոնի արտադրության առանձին փուլերի իրականացման օպտիմալ պայմանները հետևյալն են.
Խմորումն իրականացվում է ենթաշերտերի շարունակական ավելացմամբ ողջ գործընթացի ընթացքում, ինչը որոշում է բարձր մակարդակինտերֆերոնի արտահայտություն;
Բջիջների ոչնչացումը կատարվում է Gaulin տիպի դիսինտեգրատորում 900 բար ճնշման տակ;
Լուծվող բջջային բաղադրիչների (ԴՆԹ, ՌՆԹ, սպիտակուցներ, լիպոպոլիսաքարիդներ և այլն) հեռացումն իրականացվում է ինտերֆերոնի չլուծվող ձևը լվացող միջոցներ պարունակող բուֆերային լուծույթներով (Triton XI00, urea և այլն) լվանալով.
Ստացված ինտերֆերոն պարունակող նստվածքը լուծվում է 6 Մ գուանիդինի հիդրոքլորիդի բուֆերային լուծույթում;
Ինտերֆերոնի վերափոխումն իրականացվում է քաոտրոպիկ նյութեր պարունակող ֆիզիոլոգիական բուֆերային լուծույթում.
Ինտերֆերոնի եռաստիճան քրոմատոգրաֆիկ մաքրումն իրականացվում է սեֆարոզա արագ հոսքով, անշարժացված Cu +2 իոններով, կատիոնափոխանակման խեժով SM Sepharose Fast Flow և գելային ֆիլտրացիոն քրոմատոգրաֆիա Superdex 75 տեսակի խեժի վրա;
Յուրաքանչյուր քրոմատոգրաֆիկ մաքրումից հետո մանրէազերծող ֆիլտրումն իրականացվում է 0,22 մկմ ծակոտկեն չափերով առանց պիրոգեն զտիչների միջոցով:
Նկարագրված մեթոդի կիրառման արդյունքում ինտերֆերոնի եկամտաբերությունը մոտավորապես 400-800 մգ ինտերֆերոն է 1 լիտր կուլտուրայի համար: Ստացված արտադրանքի որակը համապատասխանում է ալֆա-2բ ինտերֆերոն նյութի «Եվրոպական դեղագրքի» ստանդարտներին և պահանջներին:
Առաջարկվող մեթոդի և նախատիպի միջև զգալի տարբերություններն են.
Ավելի բարձր արտադրողականությամբ շտամների նախագծման օգտագործումը, որը հնարավորություն է տալիս կենսասինթեզի ընթացքում 1 լիտր մշակութային միջավայրից ստանալ ավելի մեծ քանակությամբ ինտերֆերոն.
Բջջային կենսազանգվածի արդյունավետ մեխանիկական ոչնչացման օգտագործումը, ինչը հնարավորություն է տալիս ստանալ ինտերֆերոնի չլուծվող ձևի ավելի մաքուր էքստրակտ: կարճ ժամանակ, ավելի քիչ կորուստներով;
Ֆիզիոլոգիական բուֆերային լուծույթների օգտագործումը ռենատուրացիայի ժամանակ քաոտրոպային նյութերի առկայության դեպքում հնարավորություն է տալիս մեծացնել ինտերֆերոնի ճիշտ վերականգնված ձևի եկամտաբերությունը.
Ինտերֆերոնի եռաստիճան քրոմատոգրաֆիկ մաքրումը հնարավորություն է տալիս էլեկտրոֆորեզի համաձայն ստանալ ավելի քան 99% մաքրությամբ ինտերֆերոնային նյութ՝ գելերը արծաթով ներկելիս և ավելի քան 98%՝ ըստ ՌԴ HPLC-ի և գործնականում զերծ պիրոգեններից։ (LAL թեստ):
Հայտարարված գյուտերի խմբի էությունն ու առավելությունները պատկերված են հետևյալ օրինակներով.
Օրինակ 1. Ռեկոմբինանտ պլազմիդի pSH50 կառուցում
pSX50 պլազմիդի կառուցման մեթոդը ներառում է հետևյալ քայլերը.
Վեկտորային պլազմիդի pSX10 կառուցում;
1. pSX3 պլազմիդի կառուցում (2641 bp)
2. վեկտորային պլազմիդի pSX10 (2553 bp) կառուցում
Recombinant պլազմիդի pSX41 (3218 bp) կառուցում;
Recombinant պլազմիդի pSX43 (3218 bp) կառուցում;
Recombinant պլազմիդի pSX45 (3218 bp) կառուցում;
Recombinant պլազմիդի pSX50 (3218 bp) կառուցում։
Վեկտորային պլազմիդի pSX10 կառուցում
Վեկտորային պլազմիդ pSX10-ը pUC19 վեկտոր է, որում բետա լակտոմազի գենի կոդավորող հաջորդականությունը, որն ապահովում է ամպիցիլինի նկատմամբ դիմադրություն, փոխարինվում է kan գենի կոդավորման հաջորդականությամբ և պարունակում է տառադարձման վերջնատորը pKK223-3 պլազմիդից:
Վեկտորային պլազմիդի pSS10 կառուցումն իրականացվում է երկու փուլով.
Պլազմիդի pSX3 (2641 bp) պատրաստում, որը հանդիսանում է pUC19 պլազմիդը, որում amp գենի կոդավորման շրջանը փոխարինվում է kan գենի կոդավորման շրջանով;
Վեկտորային պլազմիդի pSX10 (2553 bp) պատրաստում, որը pSX3 պլազմիդ է, որում ԴՆԹ-ի հատվածը, որը կոդավորում է տրանսկրիպցիոն տերմինատորը rBT 1 T 2, տեղադրվում է BamHI տեղանքի հետևում:
pSX3 պլազմիդ ստանալու համար կատարվում են ԴՆԹ-ի ուժեղացման հինգ փուլեր: PCR մեթոդ(պոլիմերազային շղթայական ռեակցիա): Առաջին փուլի ընթացքում, օգտագործելով pUC19 պլազմիդային ԴՆԹ-ն որպես ձևանմուշ, ուժեղացվում է 1828 bp չափի ԴՆԹ-ի հատվածը: (հատված PU1-PU2) օգտագործելով այբբենարաններ.
Այս և հետագա PCR ռեակցիաներն իրականացվում են հետևյալ պայմաններում՝ 20 մՄ Tis-HCl, pH 8.8, 10 մՄ (NH 4) 2 SO 4, 10 մՄ KCl, 2 tM MgCl 2, 0.1% Triton X100, 0.1 մգ/մլ։ BSA, 0,2 մՄ յուրաքանչյուր dNTP, 1,25 միավոր: Pfu ԴՆԹ պոլիմերազ, 100 նգ ԴՆԹ: Ուժեղացման գործընթացը բաղկացած է հետևյալ փուլերից՝ ջեռուցում 95°C-ում 5 րոպե, 35 PCR ցիկլեր (30 վրկ 95°C, 30 վրկ 56°C, 2 րոպե 72°C) և ինկուբացիա 10 րոպե 72°C ջերմաստիճանում։ Ուժեղացումից հետո (և հետագա ուժեղացումներից հետո) ԴՆԹ-ի բեկորը մաքրվում է էլեկտրոֆորեզով 1% ագարոզայի գելում: Երկրորդ և երրորդ փուլերի ընթացքում, օգտագործելով pUC4K պլազմիդային ԴՆԹ-ն որպես ձևանմուշ, 555 bp ԴՆԹ-ի բեկորն ուժեղացվում է: (հատված KM1-KM2) օգտագործելով այբբենարաններ.
և 258 bp-ով ԴՆԹ-ի բեկորի ուժեղացում: (KMZ-KM4) այբբենարաններից
PCR-ի հինգերորդ փուլում բեկորները (PU1-PU2) և (KM1-KM4) համակցվում են հետևյալ պայմաններում. 5 րոպե տաքացում 95°C-ում, 5 PCR ցիկլ (30 վրկ 95°C, 30 վրկ 56°C): 10 րոպե 72°C) և ինկուբացիա 10 րոպե 72°C ջերմաստիճանում: Վերջին PCR-ից հետո ստացված ԴՆԹ-ն ուղղակիորեն փոխակերպվում է E. coli շտամի DH5 բջիջների և տեղադրվում է LA միջավայրի վրա, որը պարունակում է 20 մկգ/մլ կանամիցին: 37°C-ում 12 ժամ ինկուբացիայից հետո կլոնները վերացվում են, պլազմիդային ԴՆԹ-ն առանձնացվում է և կատարվում է սահմանափակման անալիզ։ Արդյունքում ստացվում է 2641 bp մեծությամբ պլազմիդ pSX3։
Վեկտորային պլազմիդ pSX10 ստանալու համար կատարվում են ԴՆԹ-ի ուժեղացման երեք փուլ PCR-ի միջոցով: Առաջին փուլում, օգտագործելով pSX3 պլազմիդային ԴՆԹ-ն որպես կաղապար, 2025 bp ԴՆԹ-ի բեկորն ուժեղացվում է: (հատված 10.1-10.2) օգտագործելով այբբենարաններ.
Երկրորդ փուլի ընթացքում, օգտագործելով pKK223-3 պլազմիդի ԴՆԹ-ն որպես ձևանմուշ, ուժեղացվում է 528 bp չափի ԴՆԹ-ի հատվածը: (հատված KK1-KK2) օգտագործելով այբբենարաններ.
ՊՇՌ-ի երրորդ փուլում բեկորները (10.1-10.2) և (KK1-KK2) համակցվում են հետևյալ պայմաններում. 5 րոպե տաքացում 95°C-ում, 5 ՊՇՌ ցիկլ (30 վրկ 95°C, 30 վրկ 56°C): 10 րոպե 72°C) և ինկուբացիա 10 րոպե 72°C ջերմաստիճանում: Վերջին PCR-ից հետո ստացված ԴՆԹ-ն ուղղակիորեն փոխակերպվում է E. coli շտամի DH5 բջիջների և տեղադրվում է LA միջավայրի վրա, որը պարունակում է 20 մկգ/մլ կանամիցին: 37°C-ում 12 ժամ ինկուբացիայից հետո կլոնները վերացվում են, պլազմիդային ԴՆԹ-ն առանձնացվում է և կատարվում է սահմանափակման անալիզ։ Արդյունքում ստացվում է 2553 bp մեծությամբ պլազմիդ pSX10։
Recombinant պլազմիդի pSX41 կառուցում
Recombinant պլազմիդ pSX41-ը վեկտորային պլազմիդի pSX3 (2529 bp) Hind III - BamHI ԴՆԹ-ի հատվածն է, 168 bp-ի Hind III - EcoRI ԴՆԹ-ի հատվածը, որը կոդավորում է E. coli տրիպտոֆան օպերոնի (P trp), EcoRI-XbaI-ի սինթետիկ պրոմոտորը: 20 bp ԴՆԹ-ի հատված, որը կոդավորում է SD հաջորդականությունը (Shine-Delgarno) և 501 bp XbaI-BamHI ԴՆԹ-ի հատված, որը կոդավորում է մարդու ինտերֆերոնի ալֆա 2b գենը:
Վեկտորային պլազմիդի pSX3 (2529 bp) Hind III - BamHI ԴՆԹ բեկոր ստանալու համար pSX3 պլազմիդի ԴՆԹ-ն մշակվում է սահմանափակող ֆերմենտներով HindIII և BamHI, որին հաջորդում է էլեկտրոֆորետիկ մաքրումը 1% ագարոզայի գելում: Hind III EcoRI ԴՆԹ-ի 168 bp հատվածը, որը կոդավորում է տրիպտոֆան օպերոնի խթանիչը (P trp) ստացվում է PCR-ով, օգտագործելով ընդհանուր E. coli ԴՆԹ-ն որպես ձևանմուշ և TRP1 և PRP2 պրայմերներ, որին հաջորդում է ուժեղացված հատվածի մշակումը Hindll և EcoRI սահմանափակումներով: ֆերմենտներ:
EcoRI-Xbal 20 bp սինթետիկ ԴՆԹ-ի բեկոր ստանալու համար, որը կոդավորում է SD հաջորդականությունը (Shine-Delgarno), սինթեզվում են հետևյալ լրացուցիչ օլիգոնուկլեոտիդները.
501 bp չափի XbaI-BamIII ԴՆԹ-ի հատվածը, որը կոդավորում է մարդու ալֆա 2b ինտերֆերոնի գենը, ստացվում է PCR-ի միջոցով՝ օգտագործելով մարդկային ընդհանուր ԴՆԹ-ն որպես ձևանմուշ և IFN1 և IFN2 պրայմերներ, որին հաջորդում է ուժեղացված հատվածի մշակումը Xbal և BamIII սահմանափակող ֆերմենտներով.
Այնուհետև էլեկտրոֆորով մաքրված բեկորները միացվում են, կապվում T4 ֆագ լիգազի ֆերմենտի հետ, ԴՆԹ-ն վերածվում է E. coli DH5 շտամի բջիջների և տեղադրվում LA միջավայրի վրա, որը պարունակում է 20 մկգ/մլ կանամիցին: 37°C-ում 12 ժամ ինկուբացիայից հետո կլոնները վերացվում են, պլազմիդային ԴՆԹ-ն առանձնացվում է, կատարվում է սահմանափակման անալիզ և որոշվում է ԴՆԹ-ի առաջնային կառուցվածքը։ Արդյունքում ստացվում է 3218 bp մեծությամբ պլազմիդ pSX41։ Այնուհետև իրականացվում է ինտերֆերոնի գենի քայլ առ քայլ մուտագենեզ՝ նպատակային արտադրանքի արտահայտման մակարդակը բարձրացնելու համար։ Ինտերֆերոնի գենի մուտագենեզը բաղկացած է եռյակների փոխարինումից, որոնք հազվադեպ են հանդիպում E. coli-ում, կոդավորում են համապատասխան ամինաթթուները, եռյակներով, որոնք հաճախ հանդիպում են E. coli-ում, որոնք կոդավորում են նույն ամինաթթուները: Ինտերֆերոնի գենի ԴՆԹ մուտագենեզն իրականացվում է PCR մեթոդով։
Recombinant պլազմիդի pSX43 կառուցում
Recombinant pSX43 պլազմիդը ստանալու համար ԴՆԹ-ի ամպլիֆիկացիայի մեկ փուլն իրականացվում է PCR-ով, օգտագործելով pSX41 պլազմիդի ԴՆԹ-ն որպես ձևանմուշ և IFN3 և IFN4 պրայմերներ.
ՊՇՌ-ն իրականացվում է հետևյալ պայմաններում՝ տաքացում 95°C-ում 5 րոպե, 20 ՊՇՌ ցիկլ (30 վրկ 95°C, 30 վրկ 56°C, 10 րոպե 72°C) և ինկուբացիա 20 րոպե 72°C ջերմաստիճանում։ PCR-ից հետո ստացված ԴՆԹ-ն ուղղակիորեն փոխակերպվում է E. coli շտամի DH5 բջիջների և տեղադրվում է LA միջավայրում, որը պարունակում է 20 մկգ/մլ կանամիցին: 37°C-ում 12 ժամ ինկուբացիայից հետո կլոնները վերացվում են, պլազմիդային ԴՆԹ-ն առանձնացվում է, կատարվում է սահմանափակման անալիզ և որոշվում է ԴՆԹ-ի առաջնային կառուցվածքը։ Արդյունքում ստացվում է 3218 bp մեծությամբ պլազմիդ pSX43։
Recombinant պլազմիդի pSX45 կառուցում
Recombinant pSX45 պլազմիդը ստանալու համար ԴՆԹ-ի ամպլիֆիկացիայի մեկ փուլն իրականացվում է PCR-ով, օգտագործելով pSX43 պլազմիդի ԴՆԹ-ն որպես ձևանմուշ և IFN5 և IFN6 պրայմերներ.
ՊՇՌ-ն իրականացվում է հետևյալ պայմաններում՝ տաքացում 95°C-ում 5 րոպե, 20 ՊՇՌ ցիկլ (30 վրկ 95°C, 30 վրկ 56°C, 10 րոպե 72°C) և ինկուբացիա 20 րոպե 72°C ջերմաստիճանում։ PCR-ից հետո ստացված ԴՆԹ-ն ուղղակիորեն փոխակերպվում է E. coli շտամի DH5 բջիջների և տեղադրվում է LA միջավայրում, որը պարունակում է 20 մկգ/մլ կանամիցին: 37°C-ում 12 ժամ ինկուբացիայից հետո կլոնները վերացվում են, պլազմիդային ԴՆԹ-ն առանձնացվում է, կատարվում է սահմանափակման անալիզ և որոշվում է ԴՆԹ-ի առաջնային կառուցվածքը։ Արդյունքում ստացվում է 3218 bp մեծությամբ պլազմիդ pSX45։
Recombinant պլազմիդի pSX50 կառուցում:
Recombinant pSX50 պլազմիդը ստանալու համար ԴՆԹ-ի ամպլիֆիկացիայի մեկ փուլն իրականացվում է PCR-ով, օգտագործելով pSX45 պլազմիդի ԴՆԹ-ն որպես ձևանմուշ և IFN7 և IFN8 պրայմերներ.
ՊՇՌ-ն իրականացվում է հետևյալ պայմաններում՝ տաքացում 95°C-ում 5 րոպե, 20 ՊՇՌ ցիկլ (30 վրկ 95°C, 30 վրկ 56°C, 10 րոպե 72°C) և ինկուբացիա 20 րոպե 72°C ջերմաստիճանում։ PCR-ից հետո ստացված ԴՆԹ-ն ուղղակիորեն փոխակերպվում է E. coli շտամի DH5 բջիջների և տեղադրվում է LA միջավայրում, որը պարունակում է 20 մկգ/մլ կանամիցին: 37°C-ում 12 ժամ ինկուբացիայից հետո կլոնները վերացվում են, պլազմիդային ԴՆԹ-ն առանձնացվում է, կատարվում է սահմանափակման անալիզ և որոշվում է ԴՆԹ-ի առաջնային կառուցվածքը։ Արդյունքում ստացվում է պլազմիդ pSX50՝ 3218 bp մեծությամբ։
Օրինակ 2. E. coli SX50 շտամի պատրաստում - ինտերֆերոն արտադրող
Ինտերֆերոն արտադրող E. coli SX50 շտամը ստացվում է E. coli շտամի BL21 բջիջները վերափոխելով pSX50 ռեկոմբինանտ պլազմիդով: Ինտերֆերոն արտադրող շտամը աճեցվում է 30 լիտրանոց ֆերմենտատորում մինչև 25.0-30.0 p.u օպտիկական խտություն: M9 միջավայրում, որը պարունակում է 1% կազեին թթվի հիդրոլիզատ (Difco), 1% գլյուկոզա, 40 մկգ/մլ կանամիցին, 38-39°C ջերմաստիճանում: Ֆերմենտացման գործընթացում սնուցող սուբստրատի շարունակական ավելացումն իրականացվում է գրավիմետրիկ կարգավորիչի միջոցով:
Օրինակ 3. E. coli SX50 շտամից ինտերֆերոնի մեկուսացման մեթոդ
Ինտերֆերոնը ստացվել է 4 փուլով.
Փուլ 1. E. coli շտամի SX50 աճեցում:
Փուլ 2. Ինտերֆերոնի չլուծվող ձևի մեկուսացում և մաքրում:
Փուլ 3. Ինտերֆերոնի տարրալուծում և վերածնում:
Փուլ 4. Ինտերֆերոնի քրոմատոգրաֆիկ մաքրում.
Փուլ 1. E. coli շտամի SX50 աճեցում
E. coli SX50 շտամի աճեցված պատվաստումը 3 լիտր հարուստ LB միջավայրում 12 ժամ 26°C ջերմաստիճանում ասեպտիկ կերպով ներմուծվում է 27 լիտր ստերիլ միջավայր, որը պարունակում է M9, 1% կազեին թթվի հիդրոլիզատ, 1% գլյուկոզա, 1 mM MgCl 2, 0.1 mM CaCl 2, 40 մգ / մլ կանամիցին: Ֆերմենտատորում մշակումն իրականացվում է 38-39°C ջերմաստիճանում՝ պահպանելով 7±0,15 pH՝ 40% նատրիումի հիդրօքսիդի լուծույթով ավտոմատ տիտրման միջոցով։ Լուծված թթվածնի կոնցենտրացիան (50±10)% հագեցվածության միջակայքում պահպանվում է հարիչի արագությունը 100-ից 800 պտ/րոպե և օդի մատակարարումը 1-ից 15 լ/րոպե փոխելու միջոցով: Ենթաշերտերի կոնցենտրացիան, մասնավորապես գլյուկոզայի և խմորիչի էքստրակտը, չափվում է խմորման ընթացքում, և դրանց կոնցենտրացիան պահպանվում է՝ փոփոխելով խտացված լուծույթների մատակարարման արագությունը պարիստալտիկ պոմպերի միջոցով՝ օգտագործելով ծանրաչափական կարգավորիչ:
Անլուծելի ձևով ինտերֆերոնի կուտակումը վերահսկվում է ֆազային կոնտրաստային մանրադիտակի, 15% պոլիակրիլամիդ գելային էլեկտրոֆորեզի (SDS-PAAG) և հակադարձ փուլային բարձր արդյունավետության քրոմատոգրաֆիայի (RF HPLC) միջոցով: Խմորումը դադարեցվում է, երբ հասնում է առավելագույն օպտիկական խտությունը (~ 25-30 p.u.) և դադարում է ինտերֆերոնի սինթեզը: Ֆերմենտացման վերջում մշակութային հեղուկը ցենտրիֆուգմամբ առանձնացվում է հոսքի ռոտորում՝ 5000-10000 պտ/րոպե արագությամբ։ Կենսազանգվածը փաթեթավորված է պլաստիկ տոպրակներև սառեցվել է մինուս 70°C ջերմաստիճանում:
Փուլ 2. Ինտերֆերոնի չլուծվող ձևի մեկուսացում և մաքրում
300-400 գ E. coli շտամի SX50 սառեցված կենսազանգվածը կասեցվում է 3000 մլ բուֆեր 1-ում (20 մՄ Տրիս-HCl, pH 8,0, 10 մՄ EDTA, 0,1% Triton X100): Կախոցը անցնում է Gaulin տիպի հոսքի համասեռացուցիչի միջով, որը պահպանվում է 900 բար ճնշման տակ և ցենտրիֆուգվում է հոսքի ռոտորում 15000 պտ/րոպում: Ստացված նստվածքը լվանում են նմանատիպ պայմաններում հաջորդաբար բուֆերներով 2 (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 3 M urea) և բուֆեր 3 (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) և վերջապես ինտերֆերոնով: նստվածքը կասեցվում է 200 մլ բուֆեր 3-ում: Այս դեպքում ինտերֆերոնի չլուծվող ձևի մեկուսացման և մաքրման ժամանակը 5 ժամից ոչ ավելի է:
Փուլ 3. Ինտերֆերոնի տարրալուծում և վերածնում
Նախորդ փուլում ստացված ինտերֆերոնի չլուծվող ձևի կասեցմանը ավելացրեք չոր գուանիդինի հիդրոքլորիդ մինչև 6 մ կոնցենտրացիան, ավելացրեք դիթիոթրեիտոլ՝ 50 մՄ կոնցենտրացիայով, Տրիս-HCl pH 8,0 մինչև 50 մՄ կոնցենտրացիան, NaCl՝ 150 մմ կոնցենտրացիան և Triton X100-ը մինչև 0,1% կոնցենտրացիա, ինկուբացնում են սենյակային ջերմաստիճանում 2 ժամ, չլուծված նյութն առանձնացվում է մանրէազերծման միջոցով 0,22 մկմ ծակոտիների տրամագծով թաղանթների միջոցով:
Ինտերֆերոնի վերափոխումն իրականացվում է ստացված լուծույթը դանդաղորեն նոսրացնելով 100-200 անգամ բուֆեր 4-ով (20 մՄ Tris-HCl pH 8.0, 100 մՄ NaCl, 0.1 մՄ EDTA): Այնուհետև ռենատուրացիոն խառնուրդը 12-15 ժամ անընդհատ հարելով ինկուբացնում են 4-8°C ջերմաստիճանում: Այնուհետև մագնեզիումի սուլֆատը ավելացվում է մինչև 1 մՄ կոնցենտրացիա, և ագրեգացված նյութը հանվում է 0,22 մկմ ծակոտի տրամագծով թաղանթային ֆիլտրի միջոցով ստերիլիզացման միջոցով:
Փուլ 4. Ինտերֆերոնի քրոմատոգրաֆիկ մաքրում
Ինտերֆերոնի քրոմատոգրաֆիկ մաքրումն իրականացվում է երեք փուլով.
1. Ստացված վերականգնված ինտերֆերոնը սկզբում մաքրվում է մերձավորության քրոմատոգրաֆիայի միջոցով Chelating Sepharose Fast Flow խեժի վրա (Amersham Biosciences) անշարժացված Cu +2 իոններով: Դա անելու համար ինտերֆերոնի լուծույթը կիրառվում է Cu +2 Chelatating Sepharose Fast Flow սյունակի վրա և ինտերֆերոնը զտվում է 0,1 մ բուֆերով: կիտրոնաթթու pH 2.2.
2. Քրոմատոգրաֆիկ մաքրման երկրորդ փուլում ինտերֆերոնի լուծույթը կիրառվում է CM Sepharose Fast Flow տիպի կատիոնափոխանակման խեժի վրա (Amersham Biosciences) և ինտերֆերոնը զտվում է լուծույթների գրադիենտով (0,0-0,5 M NaCl) 50 մՄ-ում: Na (CH 3 COO) բուֆեր, pH 5.5:
3. Ինտերֆերոնի մոնոմերային ձևի մաքրումը ինտերֆերոնի պոլիմերային ձևերի մնացորդներից իրականացվում է ինտերֆերոնի մաքրման երրորդ փուլում Superdex 75 խեժի վրա գելային զտման միջոցով (Amersham Biosciences): Քրոմատոգրաֆիան իրականացվում է 50 մՄ Na(CH 3 COO), pH 5.0 բուֆերում, որը պարունակում է 0.15 մ NaCl:
Ինտերֆերոնի մեկուսացման և մաքրման նկարագրված մեթոդը հնարավորություն է տալիս 7-10 օրվա ընթացքում 10 լիտր մշակութային միջավայրից ստացված կենսազանգվածից մեկ մեկուսացման ցիկլում ստանալ 4-8 գ բարձր մաքրված ինտերֆերոն: Ստացված ինտերֆերոնի որակը լիովին համապատասխանում է ինտերֆերոն ալֆա-2b նյութի «Եվրոպական դեղագրքի» պահանջներին, մասնավորապես.
Ինտերֆերոնի կոնցենտրացիան ոչ պակաս, քան 2×10 8 IU/ml;
Ինտերֆերոնի հատուկ ակտիվությունը 2,0×10 8 IU/mg-ից ոչ պակաս է;
Դեղամիջոցի էլեկտրոֆորետիկ մաքրությունը նվազագույնը 99% է նվազեցնող և չնվազեցնող պայմաններում գելերը արծաթով ներկելիս.
Մեկուսացված ինտերֆերոնի իզոէլեկտրական կետը գտնվում է pH 5,8-6,3 շրջանում;
Մեկուսացված ինտերֆերոնի պեպտիդային քարտեզը սկզբունքորեն չի տարբերվում եվրոպական ստանդարտ ինտերֆերոնի ալֆա 2b CRS-ի պեպտիդային քարտեզից.
Ինչպես հետևում է բերված օրինակներից, գյուտերի պահանջվող խումբը հնարավորություն է տալիս ստանալ ինտերֆերոն ալֆա-2b բարձր եկամտաբերությամբ՝ համեմատաբար պարզ և հուսալի տեխնոլոգիայի միջոցով:
ՊԱՀԱՆՋ
1. Ռեկոմբինանտ պլազմիդային ԴՆԹ pSX50, որը կոդավորում է ռեկոմբինանտ մարդկային ալֆա-2b ինտերֆերոնի սինթեզը, բնութագրվում է նրանով, որ այն ունի 3218 բազային զույգ (bp) չափ և բաղկացած է հետևյալ բեկորներից. 1-ից 176 նուկլեոտիդների հաջորդականությունը (bp) ներառում է 176 bp ԴՆԹ-ի բեկոր, որը պարունակում է տրիպտոֆանի խթանիչ (P trp), հաջորդականությունը 177-ից 194 նտ: ներառում է 18 bp չափի սինթետիկ ԴՆԹ բեկոր, որը պարունակում է Shine Delgarno հաջորդականությունը, որը պատասխանատու է թարգմանության մեկնարկի համար, հաջորդականությունը 195-ից 695 nt: ներառում է 501 bp ԴՆԹ բեկոր, որը պարունակում է ինտերֆերոն ալֆա-2b գենը նուկլեոտիդային փոխարինումներով՝ 37 (A>C), 39 (G>T), 40 (A>C), 42 (G>T), 67 (A>): C), 69 (G>T), 70 (A>C), 72 (A>T), 96 (G>A), 100 (A>C), 102 (A>T), 114 (A >С): ), 120 (C>G), 126 (G>A), 129 (G>A), 330 (C>G), 339 (G>A), 342 (G>A), 487 (A> C) , 489 (A>T), 495 (G>A), հաջորդականությունը 696-ից 713 nt. ներառում է 18 bp սինթետիկ ԴՆԹ բեկոր, որը պարունակում է սինթետիկ պոլիկլինկեր, հաջորդականությունը 714-ից 1138 նտ: ներառում է pKK223-3 պլազմիդի ԴՆԹ-ի հատվածը 4129-ից 4553 նտ: 425 bp չափով, որը պարունակում է խիստ տառադարձման տերմինատորի հաջորդականությունը rrnBT 1 T 2, հաջորդականությունը 1139-ից մինչև 1229 nt: ներառում է պլազմիդի pUC19 ԴՆԹ-ի հատվածը 2487-ից մինչև 2577 նտ: 91 bp չափով, որը պարունակում է -lactomase գենի խթանող (ամպիցիլինի դիմադրության գեն -Amp R), հաջորդականությունը 1230-ից մինչև 2045 nt: ներառում է pUC4K պլազմիդի ԴՆԹ բեկորը՝ 720 նտ: մինչև 1535 թ 816 bp չափով, որը պարունակում է kan գենի կառուցվածքային շրջան, հաջորդականություն 2046 bp: դեպի 3218 n. ներառում է pUC19 պլազմիդի ԴՆԹ-ի հատվածը 1625-ից մինչև 453 նտ: 1173 bp չափով, որը պարունակում է պլազմիդի վերարտադրության համար պատասխանատու հաջորդականություն (ori) և lac պրոմոութեր (P lac):
2. Eschcerichia coli SX50 բակտերիալ շտամը, որը փոխակերպվել է ռեկոմբինանտ պլազմիդի հետ, ըստ 1-ին պահանջի, հանդիսանում է մարդկային ռեկոմբինանտ լեյկոցիտային ալֆա-2b ինտերֆերոն արտադրող:
3. Մարդու ինտերֆերոն ալֆա-2b-ի արտադրության մեթոդ, ներառյալ Escherichia coli SX5 շտամի մշակումը ըստ պահանջի 2-ի սննդային միջավայրում՝ կենսասինթեզի գործընթացում սննդանյութերի սուբստրատների մշտական ավելացմամբ, միկրոօրգանիզմների բջիջների մեխանիկական ոչնչացմամբ 700- ճնշման տակ: 900 բար, ինտերֆերոնի լուծարում գուանիդինի հիդրոքլորիդի բուֆերային լուծույթում, ինտերֆերոնի վերածում ֆիզիոլոգիական բուֆերային լուծույթներում քաոտրոպային նյութերի առկայության դեպքում, ինտերֆերոնի եռաստիճան քրոմատոգրաֆիկ մաքրում Chelating Sepharose Fast Flow տեսակի խեժերի վրա՝ անշարժացված Cu +2 իոններով, քրոմատոգրաֆիա CM Sepharose Fast Flow տեսակի իոնափոխանակման խեժերի վրա և գելային ֆիլտրացիոն քրոմատոգրաֆիա Superdex 75 տեսակի խեժերի վրա:
4. Մեթոդը, համաձայն 3-ի պահանջի, որի դեպքում մշակումն իրականացվում է սնուցող միջավայրի վրա, որի պարունակությունը նվազեցված է տրիպտոֆանով, սննդանյութերի ենթաշերտերի, գերադասելիորեն գլյուկոզայի և խմորիչի էքստրակտի անընդհատ ավելացմամբ:
5. Մեթոդը համաձայն 3-րդ պահանջի, որի դեպքում ինտերֆերոնը լուծելուց առաջ այն մաքրվում է բջջային լուծելի բաղադրիչները, ներառյալ ԴՆԹ-ն, ՌՆԹ-ն, սպիտակուցները, լիպոպոլիսախարիդները հեռացնելու միջոցով, լվանալով լվացող միջոցներ պարունակող բուֆերային լուծույթներով, ինչպիսիք են Triton XI 00-ը, միզանյութը:
6. Մեթոդը համաձայն 3-րդ պահանջի, որի դեպքում յուրաքանչյուր քրոմատոգրաֆիկ մաքրումից հետո մանրէազերծող ֆիլտրումն իրականացվում է 0,22 մկմ ծակոտիների չափսերով ֆիլտրերի միջոցով:
Հետ անցկացված կլինիկական հետազոտություններում լայն շրջանակցուցումներով և չափաբաժինների լայն շրջանակով (շաբաթական 6 միլիոն IU/m2-ից՝ մազոտ բջջային լեյկեմիայի դեպքում, մինչև շաբաթական 100 միլիոն IU/m2՝ մելանոմայի դեպքում), առավել հաճախ հանդիպող անբարենպաստ իրադարձություններն էին ջերմությունը, հոգնածությունը, գլխացավ, միալգիա. Ջերմությունը և հոգնածությունը վերացել են դեղամիջոցի դադարեցումից 72 ժամ անց: Չնայած տենդը կարող է լինել գրիպի նման համախտանիշի ախտանիշ, որը հաճախ հանդիպում է ինտերֆերոնային բուժման ժամանակ, պետք է գնահատել մյուսները բացառելու համար: հնարավոր պատճառներըմշտական ջերմություն.
4-ից ստացվել է հետևյալ անվտանգության պրոֆիլը Կլինիկական փորձարկումներքրոնիկ հեպատիտ C-ով հիվանդների մոտ, ովքեր ստացել են Intron A-ն որպես մոնոթերապիա կամ 1 տարվա ընթացքում ռիբավիրինի հետ համատեղ: Բոլոր հիվանդները շաբաթական 3 անգամ ստացել են 3 միլիոն IU Intron A:
Աղյուսակ 2-ը ցույց է տալիս անբարենպաստ իրադարձությունները, որոնք տեղի են ունենում 10%-ից ավելի հաճախականությամբ կամ հավասար են նախկինում չբուժված հիվանդների մոտ, ովքեր ստացել են Ինտրոն Ա (կամ Ինտրոն Ա՝ ռիբավիրինի հետ համատեղ) 1 տարի: Ընդհանուր առմամբ, դիտված անբարենպաստ իրադարձությունները եղել են թեթև կամ չափավոր:
Աղյուսակ 2.
| Անբարենպաստ իրադարձություններ | Ինտրոն A (n=806) | Ինտրոն A + ռիբավիրին (n=1010) |
| Տեղական ռեակցիաներ | ||
| Բորբոքային ռեակցիաներներարկման տեղում | 9–16% | 6–17% |
| Ներարկման վայրի այլ ռեակցիաներ | 5–8% | 3–36% |
| Ընդհանուր ռեակցիաներ | ||
| Գլխացավ | 51–64% | 48–64% |
| Հոգնածություն | 42–79% | 43–68% |
| Սարսուռ | 15–39% | 19–41% |
| Ջերմություն | 29–39% | 29–41% |
| Գրիպի նման համախտանիշ | 19–37% | 18–29% |
| Ասթենիա | 9–30% | 9–30% |
| Կշռի կորուստ | 6–11% | 9–19% |
| Ռեակցիաներ ստամոքս-աղիքային տրակտից | ||
| Սրտխառնոց | 18–31% | 25–44% |
| Անորեքսիա | 14–19% | 19–26% |
| Փորլուծություն | 12–22% | 13–18% |
| Փորացավ | 9–17% | 9–14% |
| Փսխում | 3–10% | 6–10% |
| Մկանային-կմախքային համակարգի ռեակցիաներ | ||
| Միալգիա | 41–61% | 30–62% |
| Արտրալգիա | 25–31% | 21–29% |
| Ցավ ոսկորների և մկանների մեջ | 15–20% | 11–20% |
| Կենտրոնական նյարդային համակարգի արձագանքները | ||
| Դեպրեսիա | 16–36% | 25–34% |
| դյուրագրգռություն | 13–27% | 18–34% |
| Անքնություն | 21–28% | 33–41% |
| Անհանգստություն | 8–12% | 8–16% |
| Կենտրոնանալու ունակության խանգարում | 8–14% | 9–21% |
| Զգացմունքային անկայունություն | 8–14% | 5–11% |
| Մաշկի ռեակցիաներ | ||
| Ալոպեկիա | 22–31% | 26–32% |
| Քոր առաջացում | 6–9% | 18–37% |
| Չոր մաշկ | 5–8% | 5–7% |
| Ցան | 10–21% | 15–24% |
| Արտաքինից արձագանքներ Շնչառական համակարգ | ||
| Ֆարինգիտ | 3–7% | 7–13% |
| հազ | 3–7% | 8–11% |
| Շնչառության շնչառություն | 2–9% | 10–22% |
| Մյուսները | ||
| Գլխապտույտ | 8–18% | 10–22% |
| Վիրուսային վարակ | 0–7% | 3–10% |
Անբարենպաստ իրադարձություններ, որոնք նկատվել են հիվանդների մոտ վիրուսային հեպատիտ C, համապատասխանում են նրանց, որոնք նշվել են Intron A-ի օգտագործման ժամանակ այլ ցուցումների համար՝ զարգացման հաճախականության որոշ դոզան կախված աճով:
Intron A-ն այլ ցուցումների համար օգտագործելիս (կլինիկական և ոչ կլինիկական հետազոտություններում) հազվադեպ է (|1/10000,< 1/1000) или очень редко (.
Ամբողջ մարմնից:Շատ հազվադեպ - դեմքի այտուցվածություն:
Ասթենիկ պայմաններ (ասթենիա, անբավարարություն և հոգնածություն), ջրազրկում, սրտխփոց, պսորիազ, սնկային վարակ և բակտերիալ վարակ(ներառյալ ս sepsis):
Իմունային համակարգից.Շատ հազվադեպ - սարկոիդոզ կամ դրա սրացում:
Տարբեր աուտոիմուն և իմունային համակարգի միջնորդավորված խանգարումներ են արձանագրվել ալֆա ինտերֆերոնների օգտագործմամբ, ներառյալ իդիոպաթիկ կամ թրոմբոցային թրոմբոցիտոպենիկ մանուշակագույնը, ռևմատոիդ արթրիտը, համակարգային կարմիր գայլախտը, վասկուլիտը և Ֆոգտ-Կոյանագի-Հարադա համախտանիշը:
Դեպքեր են արձանագրվել սուր ռեակցիաներգերզգայունություն, ներառյալ եղնջացան, անգիոեդեմա և անաֆիլաքսիա:
Արտաքինից սրտանոթային համակարգիՀազվադեպ - առիթմիա (սովորաբար առաջացել է սրտանոթային համակարգի նախկին հիվանդությունների կամ նախկին կարդիոտոքսիկ թերապիայի հետ կապված հիվանդների մոտ), անցողիկ շրջելի կարդիոմիոպաթիա (նշվում է սրտանոթային համակարգի ծանրաբեռնված պատմության հիվանդների մոտ); շատ հազվադեպ - զարկերակային հիպոթենզիա, սրտամկանի իշեմիա և սրտամկանի ինֆարկտ:
Կենտրոնական նյարդային համակարգից և ծայրամասայինից նյարդային համակարգ. Հազվադեպ - ինքնասպանության միտումներ; շատ հազվադեպ - ագրեսիվ վարքագիծներառյալ այլ մարդկանց, ինքնասպանության փորձեր, ինքնասպանություն, փսիխոզ (ներառյալ հալյուցինացիաներ), խանգարված գիտակցություն, նյարդաբանություն, պոլինևրոպաթիա, էնցեֆալոպաթիա, ուղեղային անոթային իշեմիա, ուղեղի անոթային արյունահոսություն, ծայրամասային նյարդաբանություն, ցնցումներ:
Լսողության օրգանի կողմից.Շատ հազվադեպ - լսողության կորուստ:
Էնդոկրին համակարգից.Շատ հազվադեպ - շաքարային դիաբետ, առկա վիճակի վատթարացում շաքարային դիաբետ.
Ստամոքս-աղիքային տրակտից.Շատ հազվադեպ - պանկրեատիտ, ախորժակի ավելացում, լնդերի արյունահոսություն, կոլիտ:
Լյարդից և լեղուղիներից.Շատ հազվադեպ - հեպատոտոքսիկություն (ներառյալ ճակատագրական).
Ատամների և պարոդոնտիումի փոփոխություններ. Նիտրոն Ա-ի և ռիբավիրինի հետ համակցված թերապիա ստացող հիվանդների մոտ եղել են պաթոլոգիական փոփոխություններատամներից և պարոդոնտիումից. Չոր բերանը երկար ժամանակ համակցված թերապիաՌիբավիրինը և Ինտրոն Ա-ն կարող են նպաստել ատամների և բերանի լորձաթաղանթի վնասմանը: Հիվանդները պետք է խոզանակեն իրենց ատամները օրական երկու անգամ և կանոնավոր ատամնաբուժական զննում անցնեն: Բացի այդ, որոշ հիվանդներ կարող են զգալ փսխում:
Նյութափոխանակության կողմից.Հազվադեպ - հիպերգլիկեմիա, հիպերտրիգլիցերիդեմիա:
Մկանային-կմախքային համակարգից.Հազվադեպ՝ ռաբդոմիոլիզ (երբեմն ծանր), ոտքերի ցավեր, մեջքի ցավեր, միոզիտ:
Մաշկի կողմից.Շատ հազվադեպ - erythema multiforme, Stevens-Johnson սինդրոմ, թունավոր էպիդերմալ նեկրոլիզ, նեկրոզ ներարկման տեղում:
Շնչառական համակարգից.Հազվադեպ - թոքաբորբ; շատ հազվադեպ - թոքային ինֆիլտրատներ, թոքաբորբ:
Միզուղիների համակարգից.Շատ հազվադեպ - նեֆրոտիկ համախտանիշերիկամների ֆունկցիայի խանգարում, երիկամային անբավարարություն.
Արյունաստեղծ համակարգից.Շատ հազվադեպ է, երբ Intron A-ն որպես մոնոթերապիա կամ ռիբավիրինի հետ համատեղ օգտագործելիս նկատվել է ապլաստիկ անեմիա և ամբողջական կարմիր ապլազիա: Ոսկրածուծի.
Տեսողության օրգանի կողմից.Հազվադեպ՝ ցանցաթաղանթի արյունազեղում, ֆոնդում կիզակետային փոփոխություններ, ցանցաթաղանթի զարկերակների և երակների թրոմբոզ, տեսողության սրության նվազում, տեսողական դաշտերի նվազում, նևրիտ։ օպտիկական նյարդ, պապիլեդեմա։
Կլինիկական առումով էական փոփոխություններլաբորատոր պարամետրեր.(ավելի հաճախ նկատվում է, երբ դեղը նշանակվել է ավելի քան 10 միլիոն IU/օր չափաբաժիններով) - գրանուլոցիտների և լեյկոցիտների քանակի նվազում, հեմոգլոբինի մակարդակի և թրոմբոցիտների քանակի նվազում, ալկալային ֆոսֆատազի, LDH ակտիվության բարձրացում: , մակարդակը կրեատինինի եւ շիճուկ urea ազոտի. Արյան պլազմայում ALT-ի և AST-ի ակտիվության աճը նշվում է որպես պաթոլոգիական, երբ օգտագործվում է բոլոր ցուցումների համար, բացառությամբ հեպատիտի, ինչպես նաև քրոնիկ հեպատիտ B-ով որոշ հիվանդների մոտ HBV ԴՆԹ-ի բացակայության դեպքում:
Եթե Intron A-ի օգտագործման ընթացքում անբարենպաստ իրադարձություններ են զարգանում որևէ ցուցումների համար, ապա դոզան պետք է կրճատվի կամ բուժումը պետք է ժամանակավորապես ընդհատվի, մինչև անբարենպաստ իրադարձությունների վերացումը: Եթե համարժեք դեղաչափի ռեժիմի նկատմամբ մշտական կամ պարբերական անհանդուրժողականություն է զարգանում կամ հիվանդությունը զարգանում է, Intron A-ով թերապիան պետք է դադարեցվի: Դեղամիջոցի պարենտերալ ընդունմամբ հնարավոր է դող, ջերմություն, հոգնածություն, գլխացավ, վատթարացում և գրիպի նման համախտանիշ: Այս կողմնակի ազդեցությունները մասամբ ազատվում են պարացետամոլով կամ ինդոմետասինով:
ժամը տեղական դիմումԱչքի լորձաթաղանթի վրա դեղամիջոցի օգտագործումը, կոնյուկտիվային վարակը, աչքի լորձաթաղանթի հիպերմինիան, միայնակ ֆոլիկուլները, ստորին ֆորնիքսի կոնյուկտիվայի այտուցը հնարավոր են:
Դեղը օգտագործելիս հնարավոր են շեղումներ նորմալ լաբորատոր պարամետրերից, որոնք դրսևորվում են լեյկոպենիա, լիմֆոպենիա, թրոմբոցիտոպենիա, ալանին ամինոտրանսֆերազի, ալկալային ֆոսֆատազի մակարդակի բարձրացում: Թերապիայի ընթացքում այդ շեղումների ժամանակին հայտնաբերման համար ընդհանուր կլինիկական թեստերարյան անալիզները պետք է կրկնվեն 2 շաբաթը մեկ, իսկ կենսաքիմիական անալիզները՝ 4 շաբաթը մեկ։ Ընդհանուր առմամբ, այս փոփոխությունները սովորաբար աննշան են, առանց ախտանիշների և շրջելի:
Ինտերֆերոն բետա-ի կողմնակի ազդեցությունները.
Լեյկոպենիա. Թրոմբոցիտոպենիա. Անեմիա. Աուտոիմուն հեմոլիզ. Անորեքսիա. Փորլուծություն. Տրանսամինազների մակարդակի բարձրացում: Հիպոթենզիա. Տախիկարդիա. Շնչառության շնչառություն. Գլխապտույտ. Քնի խանգարումներ. Ցավ ոսկորների և հոդերի մեջ. Ջերմություն. Թուլություն. Միալգիա. Գլխացավ. Սրտխառնոց. Փսխում; երկարատև օգտագործման դեպքում՝ մազաթափություն։Այս բաժինը ներկայացնում է ինտերֆերոնների ալֆա 2b և ալֆա 2ա օգտագործման հրահանգներառաջին սերունդ, որոնք կոչվում են նաև գծային, պարզ կամ կարճատև։ Այս պատրաստուկների միակ առավելությունը նրանց համեմատաբար ցածր գինն է։
Դեռևս 1943 թվականին Վ.-ն և Ջ. Ինտերֆերոնի սկզբնական գաղափարը սա էր. գործոն, որը կանխում է վիրուսների վերարտադրությունը: 1957 թվականին անգլիացի գիտնական Ալիկ Այզեքսը և շվեյցարացի հետազոտող Ժան Լինդենմանը մեկուսացրեցին այս գործոնը, հստակ նկարագրեցին այն և անվանեցին ինտերֆերոն:
Ինտերֆերոնը (IFN) սպիտակուցի մոլեկուլ է, որն արտադրվում է մարդու մարմնում: Մարդու գենետիկական ապարատը կոդավորում է դրա սինթեզի «բաղադրատոմսը» (ինտերֆերոնի գեն): Ինտերֆերոնը ցիտոկիններից մեկն է, ազդանշանային մոլեկուլներ, որոնք խաղում են կարևոր դերիմունային համակարգի գործունեության մեջ.
IFN-ի հայտնաբերումից հետո կես դարի ընթացքում ուսումնասիրվել են այս սպիտակուցի տասնյակ հատկություններ: Բժշկական տեսանկյունից հիմնականը հակավիրուսային և հակաուռուցքային գործառույթներն են։
Մարդու մարմինը արտադրում է ինտերֆերոնների մոտ 20 տեսակ՝ մի ամբողջ ընտանիք։ IFN-ը բաժանված է երկու տեսակի՝ I և II:
I տիպի IFN-ները՝ ալֆա, բետա, օմեգա, թետա, արտադրվում և արտազատվում են մարմնի բջիջների մեծ մասի կողմից՝ ի պատասխան վիրուսների և որոշ այլ գործակալների գործողության: Տիպ II IFN-ը ներառում է ինտերֆերոն գամմա, որն արտադրվում է իմունային համակարգի բջիջների կողմից՝ ի պատասխան օտար գործակալների գործողության:
Սկզբում ինտերֆերոնի պատրաստուկները ստացվում էին միայն դոնորային արյան բջիջներից. Նրանք այդպես էին կոչվում՝ լեյկոցիտային ինտերֆերոններ։ 1980 թվականին սկսվեց ռեկոմբինանտ կամ գենետիկորեն մշակված ինտերֆերոնների դարաշրջանը։ Ռեկոմբինանտ դեղերի արտադրությունը զգալիորեն էժանացել է, քան մարդկային դոնորի արյունից կամ այլ կենսաբանական հումքից նմանատիպ դեղամիջոցներ արտադրելը. չեն օգտագործվում դրանց արտադրության մեջ դոնորի արյունորը կարող է ծառայել որպես վարակի աղբյուր։ Ռեկոմբինանտ դեղերչեն պարունակում օտար կեղտեր և, հետևաբար, ունեն ավելի քիչ կողմնակի ազդեցություն. Նրանց բուժիչ ներուժը ավելի բարձր է, քան նմանատիպ բնական դեղամիջոցները:
Վիրուսային հիվանդությունների, մասնավորապես հեպատիտ C-ի բուժման համար հիմնականում օգտագործվում է ինտերֆերոն ալֆա (IFN-α): Կան «պարզ» («կարճատև») ինտերֆերոններ ալֆա 2b և ալֆա 2ա և պեգիլացված (պեգինտերֆերոն ալֆա-2ա և պեգինտերֆերոն ալֆա-2բ): «Պարզ» ինտերֆերոնները գործնականում չեն օգտագործվում ԵՄ-ում և ԱՄՆ-ում, սակայն մեր երկրում համեմատական էժանության պատճառով դրանք բավականին հաճախ են օգտագործվում։ Հեպատիտ C-ի բուժման ժամանակ օգտագործվում են «կարճ» IFN-α-ի երկու ձևերն էլ՝ ինտերֆերոն ալֆա-2ա և ինտերֆերոն ալֆա-2b (տարբերվում է մեկ ամինաթթվի մեջ): Պարզ ինտերֆերոններով ներարկումները սովորաբար կատարվում են ամեն օր (պեգինտերֆերոններով՝ շաբաթը մեկ անգամ): Կարճատև IFN-ներով բուժման արդյունավետությունը, երբ դրանք կիրառվում են ամեն օր, ավելի ցածր է, քան պեգինտերֆերոններով: Որոշ փորձագետներ խորհուրդ են տալիս «պարզ» IFN-ի ամենօրյա ներարկումներ, քանի որ AVT-ի արդյունավետությունը մի փոքր ավելի բարձր է:
«Կարճ» IFN-ների շրջանակը բավականին լայն է: Նրանք ազատ են արձակվել տարբեր արտադրողների կողմիցտակ տարբեր անուններ Roferon-A, Intron A, Laferon, Reaferon-EC, Realdiron, Eberon, Interal, Altevir, Alfarona և այլն:
Առավել ուսումնասիրված (և հետևաբար թանկ) են Roferon-A-ն և Intron-A-ն: Այս IFN-ներով բուժման արդյունավետությունը ռիբավիրինի հետ համատեղ, կախված վիրուսի գենոտիպից և այլ գործոններից, տատանվում է 30%-ից մինչև 60%: Հիմնական ցուցակը ապրանքանիշերՊարզ ինտերֆերոնների արտադրողները և դրանց նկարագրությունները տրված են աղյուսակում:
Բոլոր ինտերֆերոնները պետք է պահվեն սառնարանում (+2-ից +8 աստիճան Ցելսիուս): Նրանք չպետք է տաքացվեն կամ սառեցվեն: Մի թափահարեք կամ մի դրեք դեղը ուղիղ ազդեցության տակ արեւի ճառագայթները. Անհրաժեշտ է դեղերը տեղափոխել հատուկ տարաներով։
նյութ-լուծույթ՝ փաթեթներկանոն. համար՝ LSR-007009/08
Կլինիկական և դեղաբանական խումբ.
Թողարկման ձևը, կազմը և փաթեթավորումը
նյութ - լուծում.
շշեր (1) - ստվարաթղթե տուփեր:
Դեղամիջոցի ակտիվ բաղադրիչների նկարագրությունը » Ինտերֆերոն ալֆա-2բ»
դեղաբանական ազդեցություն
Ինտերֆերոն. Այն բարձր մաքրված ռեկոմբինանտ սպիտակուց է՝ 19300 դալտոն մոլեկուլային քաշով: Ստացված է Escherichia coli-ի կլոնից՝ բակտերիալ պլազմիդների հիբրիդացման միջոցով մարդու լեյկոցիտների գենի հետ, որը կոդավորում է ինտերֆերոնի սինթեզը: Ի տարբերություն ինտերֆերոնի, ալֆա-2ա-ն ունի արգինին 23-րդ դիրքում:
Այն ունի հակավիրուսային ազդեցություն, որը պայմանավորված է հատուկ թաղանթային ընկալիչների հետ փոխազդեցությամբ և ՌՆԹ-ի սինթեզի և, ի վերջո, սպիտակուցների ինդուկցիայով: Վերջիններս էլ իրենց հերթին կանխում են վիրուսի բնականոն վերարտադրությունը կամ դրա ազատումը։
Այն ունի իմունոմոդուլացնող գործունեություն, որը կապված է ֆագոցիտոզի ակտիվացման, հակամարմինների և լիմֆոկինների ձևավորման խթանման հետ։
Ունի հակապրոլիֆերատիվ ազդեցություն ուռուցքային բջիջների վրա։
Ցուցումներ
Սուր հեպատիտ B, քրոնիկ հեպատիտ B, քրոնիկ հեպատիտ C.
Մազոտ բջջային լեյկոզ, քրոնիկ միելոիդ լեյկոզ, երիկամային բջջային քաղցկեղ, ՁԻԱՀ-ով պայմանավորված Կապոսի սարկոմա, մաշկային T-բջջային լիմֆոմա (mycosis fungoides և Sézary syndrome), չարորակ մելանոմա:
Դոզավորման ռեժիմ
Կառավարվում է ներերակային կամ ենթամաշկային: Դոզան և բուժման ռեժիմը սահմանվում են անհատապես՝ կախված ցուցումներից։
Կողմնակի ազդեցություն
Գրիպի նման ախտանիշներ: հաճախ - ջերմություն, դող, ոսկորների, հոդերի, աչքերի ցավ, միալգիա, գլխացավ, քրտնարտադրության ավելացում, գլխապտույտ:
Արտաքինից մարսողական համակարգը: հնարավոր է ախորժակի կորուստ, սրտխառնոց, փսխում, փորլուծություն, փորկապություն, խանգարում համի սենսացիաներչոր բերան, քաշի կորուստ, որովայնի թեթև ցավ, լյարդի ֆունկցիայի թեստերի աննշան փոփոխություններ (սովորաբար նորմալանում են բուժումից հետո):
Կենտրոնական նյարդային համակարգից և ծայրամասային նյարդային համակարգից.հազվադեպ - գլխապտույտ, մտավոր գործունեության վատթարացում, քնի խանգարում, հիշողության խանգարում, անհանգստություն, նյարդայնություն, ագրեսիվություն, էյֆորիա, դեպրեսիա (հետո երկարատև բուժում), պարեստեզիա, նյարդաբանություն, ցնցում; որոշ դեպքերում՝ ինքնասպանության հակումներ, քնկոտություն։
Սրտանոթային համակարգից.հնարավոր է - տախիկարդիա (ջերմությամբ), զարկերակային հիպոթենզիա կամ հիպերտոնիա, առիթմիա; որոշ դեպքերում՝ սրտանոթային համակարգի խանգարումներ, կորոնար շնչերակ հիվանդություն, սրտամկանի ինֆարկտ։
Շնչառական համակարգից.հազվադեպ - կրծքավանդակի ցավ, հազ, թեթև շնչառություն; որոշ դեպքերում՝ թոքաբորբ, թոքային այտուց։
Արյունաստեղծ համակարգից.հնարավոր է թեթև լեյկոպենիա, թրոմբոցիտոպենիա, գրանուլոցիտոպենիա:
Մաշկաբանական ռեակցիաներ.հնարավոր է քոր առաջացում, շրջելի ալոպեկիա:
Մյուսները:հազվադեպ - մկանների կոշտություն; մեկուսացված դեպքերում - հակամարմիններ բնական կամ ռեկոմբինանտ ինտերֆերոնների նկատմամբ:
Հակացուցումներ
Ծանր սրտանոթային հիվանդություններ, լյարդի դեկոմպենսացված ցիռոզ, ծանր դեպրեսիա, փսիխոզ, ալկոհոլային կամ թմրամոլություն, ավելացել է զգայունությունըինտերֆերոն ալֆա-2b-ին:
Հղիություն և լակտացիա
Հղիության ընթացքում օգտագործումը հնարավոր է միայն այն դեպքում, եթե մոր համար թերապիայի ակնկալվող օգուտը գերազանցում է պտղի համար հնարավոր ռիսկը:
Անհայտ է, թե արդյոք ինտերֆերոն ալֆա-2b-ից արտազատվում է կրծքի կաթ. Եթե անհրաժեշտ է օգտագործել այն լակտացիայի ժամանակ, ապա պետք է որոշվի կրծքով կերակրման դադարեցման հարցը։
Վերարտադրողական տարիքի կանայք բուժման ընթացքում պետք է օգտագործեն հուսալի հակաբեղմնավորիչներ:
Օգտագործեք լյարդի դիսֆունկցիայի դեպքում
Հակացուցված է լյարդի դեկոմպենսացված ցիռոզի դեպքում: Զգուշությամբ օգտագործեք լյարդի ֆունկցիայի խանգարում ունեցող հիվանդների մոտ:
Օգտագործեք երիկամների անբավարարության դեպքում
Զգուշությամբ օգտագործեք երիկամների ֆունկցիայի խանգարում ունեցող հիվանդների մոտ:
հատուկ հրահանգներ
Զգուշությամբ օգտագործեք երիկամների, լյարդի, ոսկրածուծի հեմատոպոեզի խանգարումներով կամ ինքնասպանության փորձերի հակված հիվանդների մոտ:
Սրտանոթային համակարգի հիվանդություններով հիվանդների մոտ հնարավոր է առիթմիա։ Եթե առիթմիան չի նվազում կամ ավելանում, ապա դոզան պետք է կրճատել 2 անգամ կամ դադարեցնել բուժումը։
Բուժման ժամանակահատվածում անհրաժեշտ է նյարդաբանական և հոգեկան վիճակի մոնիտորինգ:
Ոսկրածուծի արյունաստեղծության խիստ ճնշման դեպքում անհրաժեշտ է ծայրամասային արյան բաղադրության պարբերական հետազոտություն։
Ինտերֆերոն ալֆա-2b-ն խթանող ազդեցություն ունի իմունային համակարգի վրա և պետք է զգուշությամբ օգտագործվի աուտոիմուն հիվանդությունների հակված հիվանդների մոտ՝ աուտոիմուն ռեակցիաների բարձր ռիսկի պատճառով:
Դեղերի փոխազդեցություններ
Դեղերի փոխազդեցություններ
Ինտերֆերոն ալֆա-2b-ն արգելակում է թեոֆիլինի նյութափոխանակությունը և նվազեցնում դրա մաքրումը:
